Système nerveux

Pour vérifier si la mutation d'un gène repérée dans deux familles de personnes scoliotiques déforme la colonne vertébrale, trois lignées de poissons-zèbres mutants sont créées. 780 poissons-zèbres vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, répartis sur trois générations par lignée. Chacun subit sous anesthésie un prélèvement de quelques millimètres de nageoire caudale pour identifier sa mutation, et 180 d'entre eux passent trois séances de micro-scanner à huit, douze et seize semaines, avec un transport pouvant durer trente minutes avant chaque séance. Les 600 autres sont tués dès la lignée stabilisée, et les 180 restants après la dernière imagerie, le retour à l'aquarium principal étant exclu pour raison sanitaire.

Objectifs

La scoliose, dite idiopathique, qui touche près de 3% des sujets selon les régions géographiques, comporte une composante génétique. Cependant, les modalités exactes de transmission ne sont pas clairement établies. L’hypothèse sous-tenant le projet « scoliose et génétique » est que s’il existe des gènes de prédisposition à la scoliose « idiopathique », une analyse génétique poussée de familles scoliotiques présélectionnées par leur arbre généalogique permettra de détecter de nouvelles mutations spécifiquement associées à la pathologie par comparaison entre patients atteints et apparentés « sains ». Cette analyse a permis de découvrir une mutation d’un gène codant une protéine impliquée dans la transcription de l’ADN chez plusieurs personnes atteintes de scoliose idiopathique dans deux familles indépendantes. Chez le poisson-zèbre, il existe trois gènes qui pourraient être l’homologue de ce gène chez l’homme. Nous allons donc inactiver ces trois gènes indépendamment afin de générer trois lignées de mutants poissons-zèbres. Les mutants poissons-zèbres ainsi générés seront par la suite analysés cliniquement par l’imagerie afin de vérifier l’absence ou la présence de scoliose chez ces animaux. De ce fait, nous souhaitons utiliser le poisson-zèbre comme modèle animal pour étudier le rôle fonctionnel de cette protéine, et son implication dans la physiopathologie de la scoliose idiopathique. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est la validation du gène exploré dans la genèse de la scoliose idiopathique. Cette hypothèse serait renforcée par le développement de scolioses chez les mutants ainsi créés. La validation de ce variant permettrait d’avancer dans la compréhension de la genèse des scolioses idiopathiques (physiopathologie) et éventuellement à long terme d’avancer dans la prédiction de progression des courbures scoliotiques découvertes. En effet, la progression de l’identification des mécanismes génétiques causaux à la scoliose dite « idiopathique » permettrait de pouvoir proposer aux patients chez qui une scoliose est découverte un séquençage exomique précoce de manière à avoir une meilleure connaissance du risque et donc d’adapter le traitement des patients (agressivité du traitement orthopédique par corset, nécessité de chirurgie correctrice).

Procédures

EU1 : Afin d’identifier le type de mutation porté par les poissons, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale sera réalisé sous anesthésie générale afin de minimiser la souffrance des animaux. Un seul prélèvement de quelques millimètre sera effectué par animal, la manipulation dure 1-2 minutes. Cette intervention n’entraîne pas de séquelles impactant la nage ou les capacités d’alimentation. EU2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (UE1) jusqu’au laboratoire d’imagerie (EU2) pour la réalisation d’une imagerie micro-scanner à 8,12 et 16 semaines de vie. La durée est de 30 minutes maximum par trajet. L’analyse par imagerie micro-scanner, anesthésie incluse aura une durée totale de 3 à 4 minutes. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Concernant la création d’une lignée mutante, le phénotype (Ensemble des caractères apparents d'un individu) attendu causerait éventuellement une déformation de la colonne vertébrale, il ne devrait pas y avoir d’impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter (classe légère). L’inactivation d’un gène codant pour une protéine qui est impliquée dans la synthèse des neurotransmetteurs pourrait entrainer des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance et leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer, bien qu’ils puissent être de taille plus petite ou avoir un axe corporel incurvé ou déformé. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique est une petite plaie de quelques millimètres suivie ensuite d’un processus cicatriciel, indolore et capable de se regénérer en quelques jours. Le transport jusqu’au lieu du scanner ainsi que la réalisation des imageries peuvent être source de stress ou d’angoisse pour les poissons. Le protocole d’imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin de maintenir les poissons immobiles, ce qui peut entrainer un risque anesthésique. Les animaux sont placés en quarantaine jusqu’à la fin du protocole d’imagerie puis euthanasiés afin d’éviter toute contamination par d’éventuels pathogènes de l’aquarium principal.

Devenir

Nous générons au total 780 animaux, 180 animaux porteurs d’une mutation des gènes cibles seront conservés à l’animalerie. Les autres animaux (soit 600 animaux) seront euthanasiés une fois la génération d’une lignée de mutation de troisième génération, stable sur le plan génétique soit établie. Ces 180 animaux seront euthanasiés après la procédure d’imagerie micro-scanner, un retour de quarantaine au système principal de l'animalerie étant impossible par sécurité sanitaire.

Remplacement

Les études sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la colonne vertébrale en entier et de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de leur forme longitudinale, permettant une torsion axiale de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) sont un modèle de choix pour l’étude des scolioses.

Réduction

Nous n’avons pas de résultats préliminaires nécessaires pour effectuer des tests statistiques. Les expériences sont réalisées sur des poissons juvéniles puis adultes. Nous limitons le nombre minimal au maintien d’une lignée, dont 20 poissons/aquarium. Nous élèverons 20 poissons pour la première génération (F0), puis 120 poissons (homozygotes, hétérozygotes et les sauvages à identifier) pour la deuxième generation (F1), 120 poissons (homozygotes et hétérozygotes à identifier) pour la troisième génération (F2). Nous avons besoin de 3 générations, de ce fait nous aurons au total 260 individus (20 F0 + 120 F1 + 120 F2) pour chaque lignée. Nous aurons 780 (260 x 3) individus pour les trois lignées de mutants (3 gènes homologues à celui de l’Homme chez le poisson-zèbre). La population adulte de poissons utilisée pour produire les embryons est ainsi restreinte pour limiter le nombre d’animaux mais suffisamment développée pour assurer des conditions de reproduction efficaces pour les études envisagées. Concernant la réalisation des scanners : nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Ce nombre permettra d’effectuer des analyses statistiques comparatives ainsi qu’une analyse de variabilité inter-observateurs avec une puissance suffisante (score kappa de Fleis attendu : >0.8 ; alpha

Raffinement

Pour assurer le bien-être des animaux une densité de 20 poissons/aquarium de 3.5L sera appliquée. Nous nous appliquerons à réduire la souffrance, la douleur et l’angoisse. L’alimentation sera composée d’aliments secs et de proies vivantes adaptés au stade développemental des poissons-zèbre afin de leur permettre d’exprimer leur comportement naturel de prédateur. Les animaux ne seront jamais hébergés seuls. Dans le cas de l’identification d’un poisson-zèbre exprimant notre mutation d’intérêt, alors nous mettrons en place un enrichissement social en introduisant dans l’aquarium d’autres congénères. Les poissons présentant des anomalies qui les empêcheraient d'appréhender leur milieu normalement seront euthanasiés. De même pour préserver l'ensemble des poissons hébergés et le maintien d'un certain statut sanitaire, une limite d'âge de 18 mois est appliqué pour éviter la propagation d’infections par des animaux vieillissants. Les manipulations nécessitant une immobilisation et les prélèvements de nageoire caudal, seront conduites sur animaux anesthésiés. Nous surveillerons les animaux après le prélèvement de la nageoire caudale pour vérifier qu’il n’y ait pas de saignement et que dans les jours qui suivent la régénération de la plaie se met en place. Dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une mise à mort.

Choix des espèces

Le modèle poisson-zèbre partage 71% de son génome avec celui de l’homme et celui-ci est facilement modifiable par des techniques de biologie moléculaire. De plus, son élevage et sa reproduction sont rapides et aisés. Dans le cas de notre étude sur la scoliose qui est une déformation en trois dimensions de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont de mauvais modèles d’étude car la présence d’appui sur les pattes avant leur permet de compenser et d’empêcher l’évolutivité d’une telle déformation. Les poissons-zèbres cependant constituent un bon modèle pour ces déformations vertébrales, leur colonne vertébrale comportant de grandes similarités avec l’espèce humaine : une structure vertébrale longitudinale, constituée d’éléments osseux mobiles et de disques intervertébraux, organisée en 4 segments. L’analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par micro scanner chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études précédentes. Nous analyserons les images issues du scanner micro-CT avec un logiciel dédié. Grâce à ces images, nous mesurerons les courbures de la colonne vertébrale des mutants par comparaison avec celle de poissons sauvages. Les animaux seront étudiés du point de vue phénotypique (apparition de scoliose) à 3 points cinétiques à 8, 12 et 16 semaines, qui correspondent respectivement à une période de forte croissance, au stade juvénile (parallèle avec l’aggravation pubertaire des scolioses humaines) et une analyse finale au stade adulte. Ceci permettra de suivre l’évolution de la scoliose dans le temps lors de sa phase de constitution puis une analyse finale à l’âge adulte

Tuées si leur génotype n'est pas celui attendu, ou une fois qu'elles ont servi à la reproduction, les souris de cet élevage qui portent le bon génotype partent vers d'autres projets. 30 600 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque nouveau-né est maintenu une minute pendant qu'on lui tatoue un ou deux coussinets et qu'on lui prélève un bout de queue, et des mâles peuvent être hébergés seuls jusqu'à trois semaines. Le porteur justifie l'effectif en une phrase, indiquant que les accouplements ont été calculés d'après ses expériences antérieures pour produire un nombre suffisant d'animaux, sans autre élément sur ces 30 600 individus.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent la formation du cortex cérébral dans le contexte normal mais aussi pathologique. L’utilisation de modèles souris génétiquement modifiées nous aident à mieux caractériser notamment les mécanismes de génération, de migration et de mise en place de l’identité cellulaire des différents types neuronaux.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est d’augmenter la connaissance scientifique sur la formation du cerveau en condition normale ou pathologique.

Procédures

Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle un ou deux coussinet des pattes seront tatoués et une biopsie de queue sera prélevée. Des mâles pourront être hébergés individuellement pendant un maximum de 3 semaines.

Impact sur les animaux

La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress et une légère souffrance chez l’animal. L’hébergement individuel des mâles peut entrainer un stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure si leur génotype n'est pas celui attendu ou après accouplement, les autres seront utilisés dans des projets scientifiques.

Remplacement

Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent pas être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.

Réduction

Les stratégies d’accouplements ont été calculés selon nos expériences antérieurs pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien à nos expériences.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social tout au long de leur vie. Les nouveau-nés sont séparés de leur mère pendant 5 minutes maximum et sont surveillés après l’intervention pour vérifier qu’ils sont bien ré-acceptés par leur mère.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le developpement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme.

Porteuses de mutations qui provoquent la maladie de Charcot, deux lignées de souris sont élevées pour fournir des lots à deux autres projets déjà autorisés. 375 souris à phénotype dommageable vont être utilisées sur trois ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réduites pour l'essentiel à une biopsie de queue pour génotypage. Le porteur décrit la maladie comme paralysante, incurable et fatale, et indique que les animaux partent vers le site utilisateur à 70 ou 90 jours, avant les premiers signes moteurs, le stade terminal survenant à 170 jours pour la première lignée. Les souris qui n'ont pas le génotype attendu seront tuées, tout en pouvant servir d'animaux de compagnie aux autres pour éviter les cages solitaires.

Objectifs

La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, mortelle, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière, responsables de la contraction des muscles striés. Environ 7000 patients en France sont touchés par la maladie de Charcot. La maladie commence généralement entre 50 et 70 ans avec une faiblesse musculaire qui évolue rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire entrainant le décès dans les 2 à 3 ans suivant l'apparition des symptômes. Les modèles de souris de la maladie de Charcot permettent d’explorer des pistes thérapeutiques. Notre objectif est d’élever deux lignées de souris génétiquement modifiées présentant une diminution de leur capacités motrices. Les animaux sont produits dans le but de répondre à des objectifs scientifiques centrés sur deux modèles d’étude complémentaires de la maladie de Charcot. La production des animaux a pour objectif de constituer des lots expérimentaux pour deux projets déjà validés par le ministère de l’enseignement, de la recherche et de l’innovation. Cette présente demande d’autorisation de projet élevage permet de faire suite à la précédente et nous permettra d’assurer une continuité d’élevage. Les lots expérimentaux sont produits pour répondre à deux études thérapeutiques des deux projets connexes. La règle des 3R est appliquée à ce projet dans son ensemble. Nous avons fixé une durée du projet de 3 années pour correspondre aux projets connexes. Ces souris porteuses de mutation causant la maladie de Charcot, issues de cet élevage, sont transférées à l’établissement utilisateur avant l’apparition des symptômes, puis sont incluses dans le cadre des projets expérimentaux.

Bénéfices attendus

L’élevage de deux modèles génétiques différents de la maladie permettra à terme d'évaluer deux approches thérapeutiques ciblant deux mécanismes distincts lorsque les souris seront utilisées en étude dans le cadre d'un autre projet. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux contextes génétiques différents. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet. L’élevage sur un site de deux lignées de souris porteuses d'une mutation causant la maladie de Charcot pour générer des lots expérimentaux qui sont étudiés sur un autre site utilisateur permet d’optimiser les espaces des sites utilisateurs. Le maintien de ces deux lignées sur deux sites permet également de réduire tout risque de perte d’une lignée et donc éviter de devoir générer des animaux en plus pour reconstituer une colonie. Les souris porteuses de la mutation (environ 50% de chaque descendance) sont transférées à un âge où aucun symptôme ne se déclare. La gestion du phénotype dommageable sur le second site se fait donc avec un personnel et un cadre spécifique au suivi de ce phénotype.

Procédures

Les animaux des deux lignées décrites seront transférés sur le deuxième site d’expérimentation avant l’apparition du phénotype dommageable. Cependant un suivi quotidien par équipe de zootechnie permet de rendre compte de tout signe lié à la pathologie qui pourrait se manifester de manière inhabituelle : tels que la boiterie d’un membre postérieur chez un premier modèle de la maladie de Charcot ou les tremblements d’un membre postérieur chez le deuxième modèle de la maladie. En examinant rétrospectivement les autorisations précédentes aucun problème lié à la pathologie n’a été signalé dans le délai de transfert que nous proposons. La biopsie pour le génotypage ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable et fatale. Les modèles souris que nous utilisons ont été très bien phénotypés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation des 3Rs. Le transfert des animaux du site d’élevage se fait à un stade qui exclut toute déclaration de premiers signes moteurs chez les deux lignées. Le trait commun de la pathologie chez ces deux lignées est la diminution sélective des capacités motrices. Ces modèles présentent donc une atteinte motrice variable. Le génotypage des animaux requiert un prélèvement qui peut occasionner une gêne de très courte durée.

Devenir

Les individus sont produits uniquement à des fins d’élevage afin de générer des cohortes qui seront transférées dans d’une utilisation continue sur un autre site. Les animaux qui ne sont pas du bon génotype ou encore des animaux qui ont atteint un point limite seront euthanasiés.

Remplacement

L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système intégrant la complexité des interactions entre les neurones moteurs touchés dans la maladie et d’autres types cellulaires qui peuvent être très distants. Une telle interaction se met en place durant des mois et implique de nombreux autres types cellulaires autres que ceux ciblés ici. Notre premier objectif est de développer une approche thérapeutique utilisant des anticorps (immunothérapie) ciblant cette population de globules blancs. L’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est indispensable. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle intégratif physiologique complet que seul l’animal offre. La barrière hémato-encéphalique et les méninges, qui sont les lieux où s’effectuent des échanges entre les cellules du système immunitaire et le système nerveux, illustrent la complexité de cette physiologie que l’on ne peut récapituler pleinement in vitro. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique vers la clinique. Notre second objectif est d’explorer une approche thérapeutique ciblant certaines populations de cellules du cervelet. Ces réseaux neuronaux très distants entre la moelle épinière et le cervelet ne peuvent pas être mimés in vitro. Seuls les modèles expérimentaux mammifères présentent la diversité des interactions dynamiques et plastiques entre ces différentes populations de cellules. Les modèles souris de la maladie de Charcot sont donc les seuls modèles qui permettent d’explorer le potentiel thérapeutique des interactions aussi distantes qui peuvent exister dans cette pathologie. La validation d’une approche thérapeutique ciblant des interactions aussi distantes nécessite des modèles animaux. Cependant, afin d’explorer la pertinence des cibles thérapeutiques, nous développons des systèmes de co-cultures in vitro entre les cellules immunitaires et les neurones moteurs purifiés ainsi que des cultures organotypiques du cervelet.

Réduction

Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 3 années, un nombre total de 375 souris avec phénotype dommageable. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la maladie de Charcot chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement. Afin de minimiser le nombre d’animaux, les animaux qui ont servi à la reproduction sont inclus dans les cohortes expérimentales. La stratégie d’élevage que nous avons permet de produire le juste nombre d’animaux qui répond aux besoins de réduction précédemment validées dans les saisines connexes à cette demande. Nous avons suffisamment de recul sur la gestion des animaux pour assurer une production de lots expérimentaux définis sur le site d’élevage. Nous utilisons également pour nos lots expérimentaux des cohortes mixtes mâle et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage.

Raffinement

Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différents jalons de la maladie et donc d’optimiser l’élevage est éviter que le phénotype dommageable survienne lors de l’élevage. Les animaux sont transférés bien avant la possible apparition de premiers signes moteurs. De façon rétrospectives avec nos précédents élevages aucun phénotype dommageable n’a pu être signalé en suivant l’âge limite pour lequel les animaux sont systématiquement transférés sur le second site utilisateur. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur, d’infection et de déambulation anormale compte tenu de l’âge est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. L’utilisation de mâles pour la reproduction permet d’avoir des portées plus robustes, plus nombreuses et de réduire de potentielles faiblesses car les femelles transgéniques sont connues commle étant de mauvaises reproductrices. Les animaux qui n'ont pas le génotype attendu pourront toujours servir d'animaux compagnons pour éviter tout animal isolé.

Choix des espèces

Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité et valorisation des résultats : début précoce ou tardif, progression lente ou rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. Nous évaluons deux protocoles thérapeutiques ciblant deux cibles cellulaires distinctes. Le protocole d’immunothérapie et de thérapie génique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la pathologie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie thérapeutique. La complexité des interactions entre le système nerveux, le système immunitaire et des réseaux neuronaux distants et requiert un modèle mammifère à la physiologie complexe qui se rapproche de celle de l’homme. Les modèles de souris de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits dans la littérature. Les souris sont élevées sur le premier site puis transférées avant l’apparition des symptômes sur un deuxième site où elles seront prises en charge pour l’expérimentation. Pour le premier modèle le début de la maladie se situe à 110 j et le stade terminal à 170 j. Les souris sont transférées à l’âge de 70 j. Pour le deuxième modèle, un défaut de réponse à une sollicitation motrice est détectable à 60 j, mais à cet âge les souris ne présentent pas de défauts moteurs spontanés et prennent plus de poids que les souris contrôles (+15%). A partir de 290 j, stade où des tremblements des pattes postérieures sont présents, c’est le stade symptomatique. La survie des souris n’est pas altérée. Ces souris sont transférées du site d’élevage à l’âge de 90 j vers le site d’expérimentation dans le cadre de l’utilisation continue.