Système nerveux
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Etude de l’effet antidépresseur du LSD chez le rat et la souris: rôle de la médiation des récepteurs 5-HT2B et 5-HT1A
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Rats : 240
Cinq semaines d'hébergement en isolement, des chocs électriques répétés et jusqu'à trois injections sur animal vigile : 240 rats et 120 souris vont être utilisés dans des procédures allant de la souffrance modérée à sévère, soixante d'entre eux étant anesthésiés puis tués sans reprendre conscience. Les tests comportementaux mesurent l'anxiété, l'apathie, le désespoir et la perte de goût pour le sucre, autant d'états provoqués délibérément avant l'administration de LSD. Le projet cherche à comprendre par quels récepteurs le LSD produit un effet antidépresseur rapide. Le porteur justifie le choix des rongeurs par le fait qu'il s'agit des plus petits mammifères dont le cerveau reste assez proche de celui de l'être humain, et reconnaît calibrer ses effectifs aussi pour éviter "tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication".
Objectifs
La dépression majeure concerne environ 17 % de la population française, ce qui en fait le trouble psychiatrique le plus fréquent. La classe d’antidépresseur prescrite en première intention sont les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, mais 50% des patients déprimés ne répondent pas correctement à ce type de traitement, d'où l'importance de chercher des molécules capables de potentialiser leur effet. L’acide lysergique diéthylamide (LSD) est une substance psychédélique qui induit des états de conscience altérés caractérisés par des changements dans la perception sensorielle et l’humeur. De manière intéressante, à faible dose, il a été montré qu’une seule injection de LSD a un effet antidépresseur pouvant durée un mois. Toutefois, l’interaction du LSD avec presque tous les récepteurs 5-HT souligne sa pharmacologie assez complexe. Le LSD est un agoniste de la plupart des récepteurs de la sérotonine. Notre projet est de rechercher les modalités d'action du LSD pour mieux discerner sa nouvelle propriété d'antidépresseur à action rapide et sa susceptibilité à augmenter la réponse antidépressive des antidépresseurs classiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de notre étude est de mieux comprendre les raisons pour lesquelles de nombreux antidépresseurs couramment utilisés produisent une rémission des symptômes dépressifs chez seulement un tiers des patients. Notre projet vise à identifier les mécanismes par lesquels le LSD aurait un impact majeur sur l’humeur et la réponse antidépressive. La perspective à plus long terme sera de proposer de nouveaux traitements anxiolytiques et/ou antidépresseurs plus efficaces que ceux actuellement disponibles.
Procédures
Les animaux subiront des administrations systémiques de substances actives sur animal vigile : 1 à 3 injections avec une contention d'environ 10 à 20 secondes. Les animaux seront soumis à des stimulations électriques (4 secondes) répétés ou non. Certains subiront 5 semaines d’hébergement en individuel lors du modèle stress répété suivi des tests comportementaux et 1 à 3 injections (10-20 secondes). Les tests comportementaux utilisés ont pour finalité l’évaluation des conséquences de type anxieux (1 test de 5 min), d’apathie (10 min), dépressif (1 test de 6 min) et d’anhédonie (3 jours) chez des modèles de dépression.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Les animaux subiront des administrations de substances actives comme le LSD entrainant des ébrouements. 2) Certains animaux recevront des injections de substance active induisant une inflammation. 3) Certains animaux seront exposés au modèle de stress répété pharmaco-résistant qui induit un stress important pendant 6 minutes. 4) Certains animaux seront soumis à un hébérgement individuel, à des injections intrapéritonéales répétées (contention de 10-20 secondes), à des stimulations électriques entrainant un l’émission d’ultrasons.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expérimentations. Ayant subi un protocole pharmacologique et/ou de stress chronique, les animaux ne peuvent pas être réutilisés dans une autre étude pour éviter tous biais.
Remplacement
L'objectif de ce projet est la mise au point de nouveaux traitements antidépresseurs destinés à être utilisés chez l'homme. L'étude préclinique doit prévoir une administration sur l'animal entier, d'autant que leurs effets comportementaux ne peuvent être évalués que chez l'animal vigile, tandis que leurs effets sur l'activité électrique neuronale résultent de l'intégration de nombreux signaux émis par une variété de régions cérébrales différentes. En termes de bénéfice/risque, notre étude pharmacologique chez le rat anesthésié reste plus appropriée que chez le rat vigile. Des approches in vitro sont déjà réalisées au laboratoire (évaluation de la neurogénèse, électrophysiologie in vitro). Cependant, l'utilisation de modèles complexes, i.e. d'animaux vivants, est incontournable afin d'analyser les réponses antidépressives dans des modèles de dépression pharmaco-résistants.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance suffisante pour les analyses statistiques. Pour les analyses comportementales nous comptons donc 15 animaux par groupe pour pouvoir en inclure au moins 13 dans l'analyse, sachant que les différences interindividuelles sont plus fortes dans les analyses comportementales. Afin de limiter le nombre d'animaux, les symptômes de dépression seront étudiés sur les mêmes individus en prenant soin de limiter le nombre total de tests à 2. Pour les expériences d'électrophysiologie, nous comptons 10 animaux par groupe pour pouvoir en inclure au moins 8-9 dans l'analyse. Le nombre d'animaux est réduit à une valeur minimale (test statistique PS de Dupont et Plummer) permettant d'une part d'atteindre une significativité statistique pour la validation et l'évaluation des réponses mesurées et d'autre part d'éviter tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. Pour pallier à l'hébergement individuel de certains animaux, facteur indispensable à l’induction du modèle de résistance, plusieurs enrichissements sont apportés dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton, igloo et buchette). Pendant une dizaine de jours, ils feront l’objet d’une attention particulière afin de vérifier le bon développement du modèle. Un monitoring du poids sera entrepris. En cas de problème d’alimentation, les animaux auront accès à de la blédine directement dans une coupelle dans la cage. L’observation des animaux sera effectuée quotidiennement et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci (une grille de score et des points limites seront mis en place).
Choix des espèces
Les rongeurs sont choisis car il s'agit des plus petits mammifères ayant un cerveau encore suffisamment homologue à celui de l'homme pour mener des études expérimentales en neuropsychiatrie. Ce rôle sera notamment déterminé dans deux modèles de dépression, l'un d'origine inflammatoire et l'autre induit par des stress répétés afin d’évaluer l'impact de l'étiologie sur la thérapeutique. Le modèle de stress répété, validé chez la souris, présente la particularité de conduire à une résistance aux traitements antidépresseurs conventionnels. Enfin, le modèle d’anxiété par émission d’ultrason n’a été validé/utilisé que chez le rat par notre équipe. Des animaux adultes seront utilisés car chez l'homme, les antidépresseurs sont majoritairement prescrits chez l'adulte. De plus, nous envisageons l’utilisation d’un modèle de résistance aux antidépresseurs chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines.
Etude de l’implication des cellules gliales dans le développement d’une hypersensibilité cutanée faciale dans la migraine chez le rat femelle
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- Oncologie
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Injectées tous les deux jours pendant neuf jours avec une molécule qui déclenche une crise migraineuse, 320 rates subissent ensuite l'application d'un filament sur la face pour mesurer leur hypersensibilité à la douleur. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les rates sont tuées sous anesthésie profonde pour prélever leurs tissus nerveux. L'objectif porte sur le rôle des astrocytes dans le déclenchement de l'allodynie, avec la perspective annoncée de nouvelles cibles contre la douleur chez l'être humain. Les nuisances attendues sont estimées à partir de travaux menés sur des rats mâles, alors que le projet porte sur des femelles.
Objectifs
La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades. L’allodynie correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à une inflammation. En temps normal, les informations tactiles et douloureuses n’aboutissent pas au même niveau de la moelle épinière ou du tronc cérébral, les deux modalités sensorielles (tact et douleur) sont donc normalement séparées. En conditions pathologiques, par exemple lors d’une allodynie, l’information tactile devient capable d’activer des neurones nociceptifs, grâce à un circuit qui implique plusieurs cellules. Le tact va alors devenir douleur (allodynie mécanique). Ce processus va provoquer l'activation de plusieurs populations neuronales et implique également une population spécifique de cellules gliales, les astrocytes. Cependant, peu de choses sont connues sur ces cellules et leur implication dans le déclenchement de l’allodynie .L’objectif de ce projet va consister à étudier l’implication des astrocytes et plus précisément des canaux potassiques astrocytaires dans un modèle de migraine chronique .Ce projet combinera des études comportementales et d’expression protéique. Il présente donc un intérêt fondamental, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les douleurs pathologiques chez l’homme.
Bénéfices attendus
La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques.
Procédures
Les injections intra péritonéales (fréquence: 1 injection tous les 2j pendant 9j/ durée: 30s) et les perfusions (fréquence: 1/ durée 30min/ sans réveil) seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal. Après une phase d'habituation, des tests comportementaux (test d'allodynie suite à l'application d'un filament au niveau de la face) seront réalisés (habituation+test: 35min/ test de la face tous les 2 jours).
Impact sur les animaux
Les résultats obtenus des travaux des autres laboratoires avec le modèle NTG ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux autre que la développement d'une allodynie. Ce modèle a été réalisé sur des rats mâles, dont les nuisances sont le développement de l'allodynie mécanique au niveau de la zone péri orbitale après l'application de filament de vF (modérée). Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.
Devenir
A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une quantification protéique ou une analyse immunohistochimique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de NTG.
Réduction
Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales et moléculaires est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux par groupe: habituation, injection,comportement, prélèvements et préparation des échantillons. C'est un modèle que le laboratoire veut mettre en place, donc, pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05. Les groupes non stimulés (NS) seront réalisés en priorité; si les résultats obtenus sont significatifs, nous ne réaliserons pas les groupes stimulés (St).
Raffinement
Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats seront préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie. Si au cours de l’expérimentation, l’animal a de grosses difficultés à se déplacer, se relever pour se nourrir, l’animal sera euthanasié par dose létale de pentobarbital.
Choix des espèces
La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 7-10 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.
Test de l’effet neuroprotecteur de la kétamine dans des modèles murins d’encéphalite auto-immune
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des anticorps prélevés chez des patients sont injectés dans le cerveau de rats, par une chirurgie de trente minutes qui pose aussi une pompe délivrant un traitement en continu pendant dix à quinze jours. 480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des études histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'exposition est répétée à trois stades, au douzième jour de gestation, au douzième jour après la naissance et à l'âge adulte, pour voir si la kétamine protège des convulsions et des troubles du comportement provoqués par ces anticorps. Le porteur écrit que les tests comportementaux employés "ne provoquent pas de douleurs et sont peu contraignants", sans en nommer un seul, alors qu'ils servent à mesurer des convulsions et des séquelles.
Objectifs
Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour assurer la sécurité de l’organisme et lutter contre les infections. Malheureusement, dans certaines situations, la production par le système immunitaire d’anticorps anormaux qui attaquent des protéines présentes à la surface des neurones entraînent des maladies neurologiques et psychiatriques graves. L’expression aberrante d’anticorps s’attaquant aux certains récepteurs du glutamate est par exemple la cause d’une forme très sévère encéphalite (inflammation du cerveau). Ces anticorps provoquent de l’épilepsie, des maladies mentales, et de l’autisme chez l’enfant. Ils peuvent entraîner des séquelles irréversibles. La prise en charge actuelle de cette maladie repose sur l’administration d’immunosuppresseurs et d’antiépileptiques qui restent malheureusement peu efficaces. L’administration de kétamine, un anesthésique qui bloque ces mêmes récepteurs, pourrait représenter un traitement prometteur de cette maladie grâce à son activité antiépileptique et ses effets contre l’anticorps lui-même. Malheureusement, les mécanismes d’action de la kétamine et son efficacité dans le traitement des encéphalites sont encore mal connus. L’objectif de ce travail est d’étudier à différents stades du développement neurologique, l’effet protecteur potentiel de la kétamine sur les convulsions et les troubles du comportement causés par les auto-anticorps. Pour mimer la maladie, nous allons exposer le cerveau de rats à des anticorps de patients à trois stades différents du développement cérébral: au 12ème jour de gestation pendant le développement embryonnaire (correspondant au 2ème trimestre de grossesse chez l’Homme), au 12ème jour postnatal pendant la période critique du développement cérébral, et à l’âge adulte après le 60ème jour post-natal. L’administration de kétamine en parallèle permettra de tester son effet protecteur potentiel. Nous analyserons pour cela l’impact des anticorps et les bénéfices escomptés de l’administration conjointe de kétamine sur le comportement et la survenue de convulsions chez les animaux traités. Les approches comportementales de ce projet pour mesurer les séquelles nécessitent d’utiliser des animaux.
Bénéfices attendus
La prise en charge actuelle de cette maladie repose sur l’administration d’immunosuppresseurs et d’antiépileptiques qui restent malheureusement peu efficaces. L’administration de kétamine, un anesthésique qui bloque ces mêmes récepteurs, pourrait représenter un traitement prometteur de cette maladie grâce à son activité antiépileptique et ses effets contre l’anticorps lui-même.
Procédures
Injection dans le péritoine d’anticorps (5minutes) et de traitements(21 jours). 1 chirurgie d’injection Intra-cérébrale et implantation d’un système de délivrance de traitement en continu.1 chirurgie (durée 30 min) d’injection Intra-cérébrale et implantation d’un système de délivrance de traitement en continu (delivrance pendant 10 à 15 jours).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie 2/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental
Devenir
Mise à mort à l'issue des procédures pour effectuer les études histologiques
Remplacement
L’objectif du projet est de comprendre le rôle néfaste joué par les anticorps dirigés contre des protéines présentes à la surface des neurones, et d’évaluer l’effet protecteur de la kétamine sur les symptômes causés par ces anticorps. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d’administration intracérébrales et sous-cutanées, avec des tests comportementaux, des enregistrements cérébraux, et de l’imagerie et l’activité des neurones. Le recours à l’animal est indispensable pour répondre à ces objectifs.
Réduction
La règle des 3R a été mise en place dans la conception de notre projet et une planification précise des expériences a été établie afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, tout en ayant des groupes suffisamment importants pour obtenir des statistiques solides. Nous proposons ainsi un projet portant sur 480 rats (réduction), avec un nombre de 12 animaux par groupe
Raffinement
Une attention permanente sera portée au bien-être des animaux avant et tout au long des protocoles (raffinement), notamment en assurant un enrichissement adéquat de leur milieu: papier tressé pour les mères, tunnels en carton dans des cages d’hébergement conçues pour qu’ils puissent exprimer leur comportement naturel. Ils seront surveillés quotidiennement par des personnels compétents et formés. Les douleurs consécutives à la chirurgie seront soulagées à l’aide des molécules les plus adaptées au protocole et à l'état des animaux. Aucune des données recueillies sur les molécules à visée thérapeutique injectées par voie intrapéritonéale ne prédisent que ces injections seront douloureuses. Néanmoins, l’état des animaux sera particulièrement surveillé durant le temps de ces injections et des mesures adaptées seront prises dans la cas contraire. Les tests comportementaux utilisés dans ce projet ne provoquent pas de douleurs et sont peu contraignants pour les animaux. Des points limites suffisamment prédictifs sont définis pour limiter la souffrance tout au long de la vie de l'animal. En cas de souffrance ou de détresse persistante, les animaux seront mis à mort dans des conditions qui évitent souffranc
Choix des espèces
Le rat est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. L’impact des anticorps contre une population des protéines à la surfaces des neurones excitatrices et le potentiel protecteur de la kétamine seront évalués à trois stades du développement cérébral: - entre le 10ème et le 18ème jour de gestation, correspondant au 2ème trimestre de grossesse chez l’Homme où se forment les réseaux neuronaux. - entre le 10ème et le 15ème jour post-natal, correspondant à une fenêtre critique du développement cérébral chez l’enfant. - chez l’adulte de plus de 60 jours, à un stade ou le cerveau est arrivé à maturité. Les conséquences de ces expositions seront systématiquement caractérisées à l’aide de tests comportementaux appropriés à l’âge adulte.
Etude de l’efficacicité d’un traitement neuroprotecteur dans le cadre de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à l'issue pour des analyses biochimiques et immunohistochimiques du cerveau, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces souris portent des mutations humaines qui leur font surproduire une protéine toxique et développer les marques précoces de la maladie d'Alzheimer, hyperactivité neuronale puis plaques séniles. Elles reçoivent une injection quotidienne dans l'abdomen, dès le quatorzième jour après la naissance et jusqu'à l'âge de trois mois, d'une molécule dont une première étude préclinique a déjà été menée sur le même modèle. Le porteur indique que la revendication a été brevetée et attend de ces travaux qu'ils confirment une stratégie susceptible d'"intéresser les industriels pharmaceutiques".
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une évolution lente mais progressive de l'atteinte neuronale affectant les capacités de mémorisation des patients réduisant progressivement leur autonomie. Cette pathologie complexe est liée à un dysfonctionnement des connections entre neurones qui aboutit à la dégénérescence des neurones de l'hippocampe (structure du cerveau impliquée dans la mémoire) puis de l'ensemble du cerveau. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cérébrales puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Nous avons récemment identifié un stade auquel on peut stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes impliqués dans cette efficacité et nous souhaitons également tester d'autres inhibiteurs de la même famille afin de confirmer que ce traitement pourrait se révéler être une nouvelle stratégie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer et intéresser les industriels pharmaceutiques. Les molécules testées diffusent dans le cerveau et peuvent être injectées par voie périphérique à l'animal. Dans ce projet, nous allons étudier les effets d'un traitement quotidien sur les marqueurs précoces de la pathologie (hyperactivité neuronale) et intermédiaires (présence des plaques séniles et inflammation).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'un candidat médicament sur la mise en place de la maladie d'Alzheimer. Cette revendication a été brevetée et une première étude pré-clinique réalisée sur ce même modèle animal a évalué la pertinence de cette approche. Pour valider cette stratégie thérapeutique nous devons poursuivre l'étude des mécanismes associés à l'efficacité thérapeutique chez la souris et tester l'efficacité d'autres substances de la même famille.
Procédures
Les animaux recevront une injection quotidienne d'une substance pharmacologique au niveau abdominal. L'injection dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’injection peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et un inconfort pour l’animal.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour des études biochimiques ou immunohistochimiques.
Remplacement
Notre approche méthodologique permet d'avoir accès à l’activité d’une structure dans un réseau complexe au sein du cerveau. Ce modèle ne peut être remplacé par des modèles de culture cellulaire ou d’autres approches in vitro. De plus, la souris permet d’avoir accès à des lignées transgéniques modèles de la pathologie humaine. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémoire chez la souris en fait un modèle de choix pour ce projet.
Réduction
Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
L’injection dans l'abdomen peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et une gêne pour l’animal. Pour prévenir cela, nous utilisons des seringues microfines pour induire le moins de lésion et de douleur possible. Les seringues sont changées tous les deux animaux pour prévenir l'émoussement des aiguilles. Le côté d'injection (doite-gauche) sera alterné chaque jour. Les animaux sont habitués à la préhension la semaine précédent le début des injections. A l’issue de la procédure, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal. Lors des expériences de perfusion intracardiaque, une couverture analgésique et anesthésique est mise en place pour éviter tout ressenti douloureux. Les animaux seront également hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Les animaux transgéniques sont stabulés à l’animalerie depuis leur naissance.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans notre cas, l'existence de modèles transgéniques murins exprimant des mutations humaines de deux protéines impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie et responsables d’une surproduction d'une protéine toxique, permet de mimer la maladie d’Alzheimer et de l'étudier dès les stades précoces (sans symptomes). Cette lignée permet l’utilisation de contrôles issus de la même portée. De plus, la similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémorisation, notamment l’hippocampe, en fait un modèle de choix pour ce projet. Les animaux seront injectés dès 14 jours post-natal et jusqu’à 3 mois post-natal.
Effet du stress prénatal sur le développement et la fonction des mécanorécepteurs à bas seuil d’activation
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
222 souris gestantes sont immobilisées sous une lumière vive, trois fois par jour, trente minutes par séance, six jours de suite. 4 002 souris vont être utilisées, 2 304 dans des procédures menées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 698 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec prélèvement de fœtus à E15 et E18,5 puis mise à mort des souriceaux à plusieurs âges. La plupart des souris de la première génération sont tuées pour prélever les organes, les géniteurs non stressés étant proposés à d'autres équipes puis tués si personne ne les reprend, le tout pour mesurer l'effet du stress maternel sur les neurones du toucher affectif. 1 008 souris passent des tests d'anxiété, d'état dépressif et de sensibilité mécanique qualifiés de non invasifs, sans qu'aucun soit nommé, celui de l'état dépressif durant trois heures.
Objectifs
Le toucher est un sens qui comprend non seulement la perception tactile de son environnement, mais également une composante émotionnelle et motivationnelle appelée toucher affectif. Cette composante est notamment très importante pour le développement social des individus. Dans la peau, cette composante émotionnelle de l'information tactile est dépendante de l'activation d'une population de neurones sensitifs spécialisée appelée les fibres C mécanoréceptrices à bas seuil d'activation ou C-LTMRs. Chez l'homme une altération de ce toucher affectif peut aboutir à des comportement d'isolement social (trouble du spectre autistique) associés à des états anxieux et/ou dépressifs. Il a été montré chez la souris que l'activation spécifiques des C-LTMRs est suffisante pour engendrer une augmentation des interactions sociales. Le développement des C-LTMRs intervient chez la souris entre le jour embryonnaire E13, où les précurseurs neuronaux commencent à se différencier, pour se poursuivre jusqu'à plusieurs jours après la naissance. La période prénatale est une période critique durant laquelle tous les systèmes physiologiques, y compris le système nerveux, développent leurs fonctions spécifiques et apprennent à s'adapter aux éventuels stimuli déclencheurs. Nous avons récemment mis en évidence chez la souris qu’un stress prénatal (c'est à dire subit par la mère durant la gestation) entraine à la fois une hypersensibilité mécanique, mais aussi une modification transcriptomique profonde dans les neurones sensitifs, notamment de gènes spécifiques des C-LTMRs. Nous émettons donc l'hypothèse que le stress prénatal pourrait induire une perturbation du développement des cLTMRs chez la descendance, et donc perturber le sens du toucher et donc le développement des interactions sociales chez les souris nées de mères stressées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de possiblement mettre en évidence l'effet du stress prénatal sur la susceptibilité des individus à développer des troubles du comportement anxieux/dépressif, ainsi que des troubles du comportement social. Il explorera également pour la première fois les mécanismes biologiques sous-jacents, en se concentrant sur le développement des neurones sensoriels périphériques, notamment les c-LTMRs. Il apportera donc des informations cruciales sur les effets du stress subit par la mère durant sa grossesse sur le développement des organes sensoriels de l'enfant, et sur le remodelage des comportements qui pourraient en découler.
Procédures
Procédure 1 : Modèle de stress prénatal Les souris seront mises en stress de contention sous une lumière vive, 3 fois par jour, 30 minutes par session, sur 6 jours consécutifs (222 animaux) . Procédure 2, 5 et 6 : Les animaux subiront des tests comportementaux (1008 animaux) non invasifs visant à évaluer l'état d'anxiété (durée des tests, 10 minutes et 30 minutes), l'état dépressif (durée du test, 3h) , et la sensibilité mécanique (stimulation de 1s maximum). Procédure 5 : les nouveaux nés seront injectés sous anesthésie par le froid et par voie intrapéritonéale (durée de l'injection, 3 secondes maximum) . A l’âge adulte ils seront injectés par voie intrapéritonéale (576 animaux). Procédure 6 : Les souris seront injectées en intra-péritonéal (durée de l'injection, 2 secondes maximum) avant chaque session de stress, voire trois fois par jour, sur 6 jours consécutifs (36 animaux)
Impact sur les animaux
Dans le projet proposé, les souris subiront des tests pas ou peu invasifs. Bien que nous n’ayons pas observé de nuisance qui perturberaient le comportement soit de la mère stressée, soit de la descendance dans les expériences que nous avons déjà fait en accord avec le protocole éthique précédent utilisant ce modèle, les souris seront accompagnées et suivies et observées régulièrement (au moins une fois par jour), pour détecter la présence de comportements anormaux (prostration, isolement, absence de nettoyage). L'injection de l'inhibiteur de corticosterone sera également contrôlée (fréquence, dose, etc.) d’autant que la corticostérone joue un rôle clé durant la gestation. Nous utiliserons des doses déjà validées dans la littérature et suivront attentivement l'état des souris et souriceaux.
Devenir
La plupart des animaux de la 1ère génération (F1) sera euthanasiée à l'issu des procédures, pour récupérer les organes d'intérêt. Les souris mâles, et femelles non stressées ayant servi de géniteurs seront proposés à la communauté, et euthanasié si non utilisés.
Remplacement
Ce projet vise à identifier les mécanismes biologiques induits par l'exposition au stress durant la gestation. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire qui peut remplacer l'usage d'animaux pour investiguer cette thématique. La substitution par l'humain n'est pas évidente, étant donné d’une part que le niveau de stress est relatif à chaque personne (ce qui sera source de variabilité pour notre étude), et l'accès à des neurones sensoriels de foetus ou de mamans durant la gestation n'est pas possible. Le modèle murin est donc un élément clé et incontournable pour étudier l'effet du stress prénatal sur le développement des neurones sensoriels et sur les comportements associés.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans le modèle de stress prénatal (protocoles éthiques obtenus précédemment) et la présence de data préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 12 mères par groupe, par génotype, réparties entre contrôle et stress. Ce nombre pourra éventuellement varier à la hausse ou à la baisse (+/- 3 animaux par groupe) en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. Ces femelles seront accouplées avec 8 mâles aux génotypes correspondants, pour un rapport 2 mâles / 3 femelles . Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées, . L’utilisation de vecteur viraux pour permettre l’expression de gènes d’intérêt dans les souris permettra également d’éviter le recours à des lignées de souris transgéniques supplémentaires.
Raffinement
Jusqu'à présent, le taux de mortalité lors des expériences proposées n'atteint pas les 0.1%. Lors de la mise en place des procédures expérimentales, l’état clinique des animaux sera monitoré tous les jours. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, les souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Lors du suivi quotidien des souris, nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels qu’un comportement anormal (mouvement stéréotypés, isolement du groupe), la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Nous examinerons également la présence de problèmes visibles (plaies cutanées étendues, dents longues, prolapsus anal). Si nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien un comportement apathique, des plaies trop importantes ou la présence de dents longues ou de prolapsus, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines, surtout l'inflammation de la peau (taux de similarité important). En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués transgéniques, qui dans notre cas, permettront l'étude du rôle des C-LTMRS et l'effet du stress sur ces cellules. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sont déjà disponibles dans le laboratoire. L'utilisation de méthodes alternatives (ex. avoir recours à des biopsies humaines, etc. sera d'un grand intérêt mais cependant limite le projet, étant donné que les niveaux de stress sont relatifs à la personne en question, ce qui apportera une variabilité dans nos analyses. Trois stades/périodes de développement seront d'intêret durant notre projet: Jour embryonnaire (E) 13 à E18 : Cette période de gestation sera la période durant laquelle les sessions de stress seront conduites. Cette période correspond également à la période de développement des neurones Jour embryonnaire E15, E18,5: Les souris gestantes seront euthanasiées et les foetus prélevés, euthanasiés et analysés pour nos études, pour évaluer l’impact du stress sur la différenciation neuronale in utero. Jour post-natal P0, P5, P21 et P56 : Les souriceaux ou souris adultes de premieère génération seront euthanasiées à ces différents temps pour étudier l’impact du stress sur la maturation des neurones cLTMRs innervant la peau qui se déroule durant cette periode (P0 à P21) puis à l’age de jeune adulte (P56) .
Analyse des interactions entre cellules cancéreuses et les neurones dans un modèle d’épilepsie tumorale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des femelles gestantes subissent une chirurgie de quarante-cinq minutes pour que leurs embryons, à 14,5 jours de développement, reçoivent une injection puis une électroporation destinées à faire naître une tumeur cérébrale. 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 128 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 16 un niveau modéré. Les souriceaux sont tués à cinq ou vingt jours de vie pour analyser les propriétés électriques de leurs tumeurs et comprendre comment les connexions entre neurones et cellules cancéreuses provoquent l'épilepsie. Le porteur affirme qu'aucun symptôme n'est attendu, les signes cliniques apparaissant après la date prévue de prélèvement, et ne justifie pas l'effectif, se bornant à indiquer que "les effectifs seront déterminés" avec des tests statistiques adaptés.
Objectifs
Le cerveau est composé de differents types de cellules et la mise en place de connexions entre elles au cours du développement embryonaire est indispensable à son bon fonctionnement. L’altération de ces connexions est à l’origine de l‘épilepsie dans des pathologies cancéreuses. L’objectif de se projet est de comprendre comment les tumeurs se dévellopent et comment les connexions entre neurones et cellules cancéreuses induisent de l’epilepsie.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est d’identifier de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de certaines tumeurs cérébrales et souffrant d'épilepsie. Ce type d’épilepsie est souvent reistant aux traitements existants. Donc, la découverte de nouveaux mécanismes dans ces tumeurs peut fournir de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Chirugie avec analgésie et anesthésie – 45 min, une fois. Injection sous-cutanées, 30 sec, cinq fois. Inj intra-cerebrale, 5 sec, une fois.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut être source de douleur et de stress. Dans le modèle de tumeur cérébrale, les symptômes apparaissent après le délai fixé pour le prélèvement des tissus, de sorte qu'aucun symptôme n'est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront utilisés pour le prélèvement d'organes et l'analyse phénotypique.
Remplacement
Cette étude nécessite l'utilisation de différents types de cellules au cours d'une période embryonnaire spécifique, ce qui ne peut être fait qu'avec des animaux.
Réduction
Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés
Raffinement
Nous veillerons en continu au bien-être des animaux par l’utilisation d’analgésiques et d’anesthésiques lors de la procédure opératoire et par un enrichissement de leur environnement dans les cages d’hébergement.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le fonctionnement des circuits neuronaux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. Des femelles adultes gestantes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées pour l'électroporation d'embryons. Les embryons sont électroporés à E14.5 et seront utilisés pour le prélèvement de tissus à l'âge postnatal 5 ou 20 afin d'étudier les caractéristiques électrophysiologiques des néoplasmes à deux stades du développement tumoral.
Etude de l’impact de mutations Nr2f1 sur le développement du cerveau et des yeux chez des modèles de souris du syndrome d’atrophie optique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les femelles gestantes porteuses d'embryons mutés sur leurs deux copies du gène Nr2f1 sont tuées avant la mise bas, faute de savoir, pour deux des trois lignées, si les souriceaux survivraient. 2 214 souris vont être utilisées, 600 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 554 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 un niveau léger. Il s'agit de comprendre comment des mutations du gène NR2F1 perturbent le développement du cerveau et des yeux dans le syndrome d'atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf, en injectant des traceurs fluorescents dans le cerveau ou dans l'œil des animaux, puis en les tuant dix jours après pour analyser leurs tissus. 60 souris sont transférées vers d'autres procédures, les autres tuées pour prélever cerveau, œil et gonades.
Objectifs
Le syndrome d’atrophie optique de Bosch-Boonstra-Schaaf (BBSOAS) est une maladie génétique qui touche le développement du cerveau et des yeux. Les personnes atteintes de ce syndrome rencontrent des problèmes de vue ainsi que des difficultés d'apprentissage, parfois associées à un retard cognitif. Cette maladie est causée par des variations dans un gène spécifique appelé NR2F1. Ces variations, appelées mutations, perturbent le fonctionnement normal du gène et peuvent entraîner des anomalies dans le développement du système nerveux central. Pour mieux comprendre comment ces mutations génétiques conduisent à la maladie, nous utilisons des modèles de souris génétiquement modifiées. Ces souris possèdent des mutations similaires à celles observées chez les patients atteints de BBSOAS. En étudiant ces modèles animaux, nous pourrons observer les effets des mutations sur le développement du cerveau et des yeux. Les objectifs principaux de ce projet sont de : 1. Identifier comment chaque mutation du gène NR2F1 contribue aux défauts observés dans le développement du système nerveux central. Certaines mutations pourraient affecter certaines parties du cerveau plus que d'autres, ce qui pourrait expliquer les variations de symptômes observées chez les patients. 2. Déterminer quelles cellules du système nerveux central sont impactées par les différentes mutations. Comprendre quelles régions du cerveau sont affectées et quelles cellules sont impliquées peut aider à mieux cibler les recherches sur de nouveaux traitements. 3. Comprendre comment ces mutations altèrent les mécanismes du développement du système nerveux central. Comprendre ces mécanismes peut fournir des informations cruciales sur les processus biologiques perturbés dans la maladie et aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. En comprenant mieux les mécanismes sous-jacents à la maladie et en identifiant les cellules et les processus biologiques impliqués, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements et thérapies pour améliorer la prise en charge des personnes atteintes de BBSOAS.
Bénéfices attendus
De précédentes études ont déjà révélées des similitudes entre un modèle de souris et les jeunes patients atteints du BBSOAS, notamment une atrophie du nerf optique, des problèmes de myélinisation (l'enveloppe protectrice des nerfs) et des défauts dans la prolifération et la différenciation de certains types de cellules du cerveau. Pour approfondir notre compréhension de cette maladie, nous utilisons plusieurs modèles de souris ayant différentes mutations du gène NR2F1, similaires à celles observées chez les patients. Ces mutations ont été choisies pour représenter la diversité des altérations génétiques observées chez les patients. En étudiant ces modèles, nous pourrons examiner les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les symptômes spécifiques liés à chaque mutation. À moyen terme, cette approche devrait nous permettre de mieux anticiper les symptômes chez les jeunes patients en fonction de leur mutation génétique, ce qui pourrait améliorer leur prise en charge précoce. À long terme, nous espérons identifier des cibles thérapeutiques pour contrer les effets néfastes des mutations sur le développement du cerveau et des yeux, afin d'améliorer les soins et le bien-être des jeunes patients.
Procédures
Afin de suivre le comportement des cellules dans le cerveau et les yeux à différents stades de développement post natal, nous injecterons des traceurs fluorescent dans le cerveau ou les yeux des animaux. Ces interventions ne dépasseront pas 15 minutes et seront réalisées sous anesthésie générale. Après la chirurgie, les animaux recevront une injection sous cutanée d’antalgique et d’antibiotique répétée toutes les 24h sur 3 jours. Chaque animal ne subira qu’une seule injection et sera sacrifié 10 jours après pour analyser ses tissus. Pour suivre la prolifération cellulaire nous injecterons des nucléotides modifiés à différents stades de développement. L’injection unique, réalisée sur animal vigile sous contention, durera moins d’une minute. Si aucun signe de douleur ou d’inconfort n’est constaté dans les 15 minutes post injection, les animaux seront euthanasiés entre 2 et 24h après l’injection pour analyser leurs tissus.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, nous utiliserons 3 lignées de souris transgéniques portant des mutations du gène Nr2f1, similaires à celles trouvées chez les patients atteints du syndrome d’atrophie optique. Pour la première lignée, dont la mutation entraîne la perte d’expression de Nr2f1, l'absence de phénotype dommageable chez les souris porteuses de cette mutation sur une seule des deux copies du gène (souris hétérozygotes) a été montré par de précédentes études. Pour les deux autres lignées étudiées, l'absence de phénotype dommageable chez les souris hétérozygotes est attestée par ceux ayant généré ces lignées. Nous savons, pour la première lignée, que l’absence totale de Nr2f1 (mutation présente sur les deux copies du gène) entraîne la mort des souris dans les 7 premiers jours de vie, mais aucune information n'est disponible pour les deux autres mutations étudiées. Par mesure de précaution, nous ne ferons naitre aucune souris portant des mutations sur les 2 copies du gène Nr2f1 et les femelles gestantes susceptibles d’avoir de tels embryons seront prélevées avant la mise bas. Ces trois lignées pourront être croisées avec une lignée rapportrice, dont l'expression du marqueur GFP n'affecte pas le phénotype des animaux. Les animaux pourront être impliqués dans diverses procédures nécessitant des injections ou interventions chirurgicales. Pour les animaux subissant une stéréotaxie, une douleur ou un inconfort au niveau de l’incision de la peau du crane peut persister après la chirurgie jusqu'à la cicatrisation complète. Dans le cas de l'injection intravitréale, l'utilisation d'une aiguille fine et de volumes de liquide très faibles minimise le risque de lésions ou de pression intraoculaire gênantes. De plus, les traceurs injectés ne devraient pas la physiologie de l'œil ou du cerveau. L'injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur aiguë transitoire due à la piqûre, mais cette sensation disparaît rapidement. Pour les femelles gestantes, une attention particulière sera accordée à la surveillance post-injection, car leur état peut entraîner une douleur accrue, des saignements ou des contractions. Par mesure de sécurité, aucune injection ne sera administrée à des femelles ayant dépassé 16 jours de gestation.
Devenir
A la fin des procédures procédures tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir récupérer leur tissus (cerveau, oeil, gonades) et les analyser pour notre étude.
Remplacement
Afin de limiter autant que possible les expériences sur animaux vivants, nous utilisons, en parallèles des lignées de souris, des cultures cellulaires in vitro. Cependant, la détermination du programme de chaque cellule ne dépend pas seulement des facteurs génétiques. Les cellules communiquent entre elles et s’adaptent à leur environnement. Par conséquent, les facteurs spatiaux et temporels jouent un rôle crucial dans le bon développement du système nerveux central et sont impossibles à reproduire de manière identique in vitro. C’est pourquoi le recours à un modèle animal reste indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques qui mènent aux symptômes observés chez les patients. Les modèles animaux nous permettent de prendre pleinement en compte la complexité des interactions cellulaires et des influences environnementales dans le développement et la progression des maladies neurologiques, ce qui est essentiel pour notre compréhension globale de ces troubles et pour le développement de traitements efficaces.
Réduction
Nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d'utiliser tous les animaux générés, indépendamment de leur sexe, réduisant ainsi le nombre total d'animaux produits. Pour optimiser au mieux l’utilisation de chaque animal, nous prélèverons systématiquement plusieurs organes (cerveau, yeux, gonades), et nous effectuerons une analyse complète des échantillons. Les protocoles utilisés ont été soigneusement choisis afin de réduire au maximum le nombre et l’ampleur des interventions pratiquées sur les animaux sans en compromettre l’efficacité.
Raffinement
Toutes nos interventions seront réalisées par des utilisateurs compétents et formés, réduisant ainsi le temps de manipulation et le stress pour les animaux. Les chirurgies seront effectuées sous anesthésie générale administrée par injection intrapéritonéale d'un mélange permettant à la fois une anesthésie générale, un bon relâchement musculaire et une couverture analgésique générale jusqu'à 24h après l'injection grâce à une combinaison d’un analgésique et d’un anti-inflammatoire. Pour les animaux maintenus en vie pendant et après la chirurgie, un protocole supplémentaire de prise en charge de la douleur sera mis en place. Ainsi, une anesthésie locale au niveau du site de la chirurgie sera administrée par une injection sous-cutanée pour les chirurgies crâniennes ou par l'application de collyre pour les injections dans les yeux. De plus, pour prévenir les infections post-opératoires, les animaux recevront un traitement antibiotique juste après la chirurgie. Ce traitement sera adapté à la nature spécifique de la chirurgie effectuée. Pour ce faire, une injection sous-cutanée de gentamicine ou l'application de crème ophtalmique antibiotique seront utilisées. Ces médicaments ont été choisis pour leur efficacité dans la prévention des infections et leur compatibilité avec les procédures chirurgicales réalisées. Enfin, un suivi quotidien des animaux en procédure sera assuré pour détecter tout signe de douleur avec une mise en place de points limites impliquant un arrêt immédiat de la procédure si la douleur ou l'inconfort détecté ne peut être soulagé dans les 24h.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris en raison de sa grande similarité génétique avec l'homme, ce qui en fait un modèle précieux pour étudier les gènes impliqués dans le développement du système nerveux central. De plus, les mécanismes neurodéveloppementaux que nous souhaitons étudier sont identiques chez la souris et l’homme et il existe déjà des lignées de souris transgéniques portant des mutations du gène Nr2f1 retrouvées chez les patients atteints du syndrome d’atrophie optique qui sont d’excellents modèles pour étudier cette maladie génétique. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment différentes mutations du gène Nr2f1 affectent le développement du cerveau et des yeux. Ces mutations peuvent entraîner des dysfonctionnements dans le développement de ces organes, conduisant aux symptômes observés chez les patients. Dans ce but, nous analyserons différents stades de développement embryonnaires et postnataux chez des modèles de souris de cette maladie. Nous commencerons notre étude à 10,5 jours embryonnaires où, chez la souris, les bases du cortex cérébral et des yeux sont établies. Puis nous progressons à travers plusieurs autres stades embryonnaires (12.5 ; 14.5 ; 16.5 et 18 jours embryonnaire) où les structures cérébrales et oculaires continuent à se former et à se différencier. Chez les souris, tout comme chez les humains, le système nerveux central continue à se développer et à mûrir après la naissance, notamment par la myélinisation des fibres nerveuses. Pour cette raison, nous étudierons également plusieurs stades postnataux, jusqu'à ce que le processus de myélinisation soit complet. L’expression de Nr2f1 étant maintenue à l’âge adulte, nous analyserons aussi des souris adultes pour voir l’impact des mutations étudiées sur un système nerveux central pleinement mature.
Etude des récupérations sensorimotrices chez le rat après lésion de la moelle épinière et implantation d’une matrice contenant des cellules souches issues du tissu adipeux.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à une contusion de la moelle épinière au niveau thoracique, 125 rats mâles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, cinq autres étant anesthésiés et tués sans réveil pour prélever la graisse dont sont tirées les cellules souches implantées. Tous sont tués à l'issue. Après l'opération, chaque rat est testé quinze minutes par semaine pendant trois mois sur sa récupération sensorimotrice, puis soumis à un enregistrement électrophysiologique d'une heure. Le porteur décrit des troubles de la miction imposant des massages manuels de la vessie, des douleurs pouvant persister trois semaines et, rarement, de l'automutilation. L'effectif reste ouvert entre 25 et 130 animaux selon les premières vagues, le porteur prévoyant d'abandonner l'étude s'il ne parvient pas à dégager de différence entre les groupes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de cellules souches issues du tissu adipeux et mises en culture sur un support 3D. Il s’agira d’étudier chez le rat mâle Sprague Dawley, une nouvelle stratégie thérapeutique consistant, après une contusion spinale thoracique, à réparer ou préserver la moelle épinière à l’aide d’un hydrogel contenant des cellules souches. L’objectif principal étant de réduire les déficits post-traumatiques et d’entraîner une récupération sensori-motrice la plus complète possible. A terme, ces résultats pourraient être transférés aux bénéfices des patients ayant subi des dommages de la moelle épinière. L’évaluation qui portera sur la récupération sensorimotrice et l’activité électrophysiologique (réflexe H : réflexe spinal monosynaptique entre les fibres afférentes proprioceptives Ia et les fibres motrices efférentes issues des motoneurones-α, activité des fibres nerveuses, ajustements ventilatoires) sera complétée par des analyses histologiques et biochimiques.
Bénéfices attendus
Dans le domaine de la réparation de la moelle épinière, malgré une recherche intensive depuis les cinquante dernières années, à ce jour aucune stratégie thérapeutique n’a été proposer afin de limiter la progression des déficits fonctionnels post-lésionnels et d’entraîner des récupérations sensori-motrices suffisantes permettant une récupération de l’autonomie des patients. Des études récentes très prometteuses ont montré que les cellules souches issues du tissu graisseux semblent entraîner une récupération fonctionnelle, une neurogenèse et une neuroprotection après lésion de la moelle épinière. Les cellules souches apparaissent comme une alternative prometteuse pour préserver et réparer la moelle épinière endommagée. Toutefois, ces études n’ont pas permis d’obtenir des résultats suffisamment marqués pour envisager une application chez des patients blessés médullaires car les cellules prélevées étaient mises en culture sur un support matriciel 2D ne permettant pas d’exprimer toutes leurs potentialités. Notre étude pré-clinique vise à tester l’efficacité thérapeutique de cellules souches mises en culture sur un support 3D en vue de proposer une thérapie transférable à l’Homme. Elle représente donc une étape très importante avant un transfert vers la clinique humaine.
Procédures
Chirurgie lésionnelle : n=1, durée : 1h ; Test sensorimoteurs : 1 fois par semaine pendant 3 mois, durée : 15 min ; Enregistrements électrophysiologiques : n=1, durée : 1h
Impact sur les animaux
La contusion spinale thoracique entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels, ainsi que des troubles végétatifs, notamment en ce qui concerne la miction. Des douleurs peuvent également être présentes, ainsi qu’une perte de poids, une déshydratation ou une dénutrition. La littérature scientifique et notre expérience indiquent que les troubles végétatifs et les douleurs liées à la chirurgie peuvent persister jusqu’à 3 semaines selon le type et l’importance de la lésion spinale, ce qui nécessite une évaluation quotidienne des animaux. Toutefois, il faut noter que les lésions nerveuses centrales peuvent rarement conduire à de l’autophagie. Les autres nuisances éventuelles pouvant être rencontrées chez les animaux sont les infections liées à la chirurgie, les effets secondaires post-anesthésie, les douleurs liées aux injections intrapéritonéales, le stress liés à leur manipulation (pour anesthésie, mesure périodique du poids…) ou lors des tests comportementaux.
Devenir
A l'issu des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Les études in vivo n’utilisant pas des mammifères ou celles in vitro réalisées à partir de cellules issues de mammifères livrent une quantité́ infime d’informations au regard de ce qu’il pourrait se passer chez l’Homme. Notre projet vise donc à proposer une nouvelle stratégie de préservation et/ou réparation de la moelle épinière directement transférable vers la clinique humaine. Pour cette raison, l’utilisation de mammifères est absolument indispensable et nécessaire. Il n’existe pas d’alternative au modèle animal in vivo. Pour cela, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière.
Réduction
Un à cinq animaux seront nécessaires pour prélever de la graisse à partir de laquelle les cellules souches seront isolées pour être mises en culture. Afin de mener à bien notre projet, nous devrons constituer 5 groupes expérimentaux. Ces groupes seront constitués de rats males Sprague Dawley d’environ 250 g (environ 2 mois d’âge) lors de la chirurgie initiale. Des males seront choisis en raison de l’absence d’importants cycles hormonaux mensuels pouvant introduire une grande variabilité dans les résultats attendus. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, chaque animal opéré sera engagé dans les 3 étapes expérimentales successives décrites dans la chronologie du protocole. Dans la mesure où la comparaison des résultats entre les groupes sera réalisée avec des tests statistiques paramétriques (analyse de la variance), nous prévoyons, au regard de nos expériences passées, d’inclure initialement dans chaque groupe au maximum 25 (+ 5 pour l’extraction des cellules souches) animaux, soit un total de 125 (+ 5 pour l’extraction des cellules souches) animaux. Toutefois, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous enrôlerons, dans un premier temps, 5 (+ 1 pour l’extraction des cellules souches) animaux par groupe, soit un total de 25 (+ 1 pour l’extraction des cellules souches) animaux. A l’issue de cette première vague expérimentale, nous calculerons, au regard des résultats obtenus et de la variabilité intergroupe, d’une puissance de 80% et d’un seuil de significativité de 5%, avec un test statistique approprié, les effectifs nécessaires pour pouvoir montrer une différence entre le groupe traité et ceux non-traités. Si le calcul indique que les effectifs nécessaires sont supérieurs à ceux envisagés initialement ou qu’aucune différence intergroupe ne peut être dégagée pour un nombre d’animaux par groupe inférieur ou égal à celui initialement prévu, nous abandonnerons l’étude et conclurons à l’inefficacité du traitement thérapeutique.
Raffinement
Du gel ophtalmique sera utilisé au cours de la chirurgie afin d’éviter l’assèchement de la cornée. Une injection d’antalgique sera réalisée avant les chirurgies et une injection de sérum physiologique glucosée permettra de réhydrater les animaux en fin de chirurgie. Une couverture antibiotique (dans l’eau de boisson renouvelée toutes les 12h), ainsi qu’un traitement antalgique seront administrés au cours de la semaine suivant la chirurgie afin de réduire les éventuelles infections et douleurs post-chirurgicales. L’observation détaillée quotidienne (7j/7) de l’état de santé des animaux (à l’aide de la grille d’évaluation jointe en Annexe) et l’évaluation de l’expression faciale permettront de prendre l’ensemble des mesures destinées à réduire la douleur et le stress. En cas de trouble de la miction, des massages seront réalisés afin de vidanger la vessie jusqu’à reprise d’une miction naturelle. Les animaux atteignant le point limite seront euthanasiés selon la procédure réservée aux animaux éveillés. Au cours des 7 jours suivant la chirurgie, les animaux seront placés seuls dans une cage le temps que les plaies cicatrisent afin d’éviter les blessures et réouverture des plaies que pourraient occasionner les congénères. Toutefois, même si les animaux sont placés seuls dans leur cage enrichie avec des objets (tubes en polycarbonate rouge, morceaux de carton, papier, petites pièces de bois en peuplier…), ils ne seront pas à l’isolement. Leurs cages seront placées sur des portoir de cages à côté des cages des autres animaux. De l’eau et de la nourriture seront données ad libitum. A l’issue de cette période critique, ils seront replacés avec leurs congénères dans des cages enrichies avec des objets (tubes en polycarbonate rouge, morceaux de carton, papier, petites pièces de bois en peuplier…) et de l’eau et de la nourriture données ad libitum. L’hébergement des animaux sera réalisé dans l’animalerie du laboratoire. Nous nous efforcerons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins et des gestes adaptés.
Choix des espèces
Les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre chez les mammifères après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Par ailleurs, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière et dont la littérature scientifique est très pauvre en ce qui concerne l’utilisation de ces genres. De plus, nous disposons de plateformes d’analyse du mouvement et des dispositifs d’enregistrement électrophysiologiques uniquement destinés aux genres Mus et Rattus. Les animaux seront des jeunes adultes de 250 g, c’est-à-dire de 2 mois d’âge environ. Afin d'étudier les processus régénératifs et la plasticité nerveuse, il est impératif d'utiliser des jeunes adultes.
Rôle de la signalisation ocytocinergique dans la modulation des comportements douloureux lors d’une interaction sociale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés deux heures sous anesthésie puis injectés d'une substance inflammatoire dont la douleur n'est pas soulagée, parce qu'elle est l'objet même de l'étude, 1 760 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement. Les chirurgies peuvent provoquer inflammation, infection des points de suture, hypothermie et perte de poids. Le projet cherche à savoir si la présence d'un congénère atténue la douleur, et par quels circuits neuronaux l'ocytocine y participe. Les tests comportementaux, deux par animal et vingt minutes chacun, ne sont désignés que par ce terme, sans qu'aucun ne soit nommé.
Objectifs
Notre but sera de mieux comprendre les interactions entre les relations sociales et l'atténuation de la douleur. Pour ce faire, notre stratégie de recherche s'articule autour de deux objectifs successifs et complémentaires : Dans un premier temps, nous analyserons l’activité des réseaux neuronaux impliqué dans ces interactions puis, nous étirons la relation entre les interactions entre les relations sociale et la douleur grâce à différents tests comportementaux.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à décrypter les mécanismes et les circuits neuronaux qui relient la modulation émotionnelle de la douleur par l'intermédiaire des interactions sociales, en mettant l'accent sur un modulateur endogène : l'ocytocine. La douleur chronique touche près de 8 % de la population mondiale, ce qui en fait un fardeau majeur dans notre société moderne. Il a été prouvé que l'ocytocine est au cœur des dysfonctionnements sociaux, ce qui a un impact sur les patients souffrant de douleur chronique et vice versa. Cependant, les circuits neuronaux médiant la régulation émotionnelle du comportement douloureux vis-à-vis des interactions sociales sont largement inconnus. Le bénéfice scientifique de ce projet est de fournir une compréhension détaillée des circuits neuronaux et des mécanismes permettant cette régulation émotionnelle de la douleur et des comportements sociaux..
Procédures
Les animaux seront soumis à principales intervention : 1. Une chirurgie de 2 heures sous anesthésie générale et analgésie générale et locale. 2. Une injection de subtance inflammatoire sur un animal anesthésié et analgésié d’une durée de 5 minutes. 3. Des tests comportementaux de 20 minutes (au maximum de 2 par animal) avec un intervalle de 1 jour entre chaque tests.
Impact sur les animaux
Le modèle inflammatoire ne peut être soulagé étant l’objet de l’étude. L’objectif de la recherche est d’évaluer si l’interaction sociale peut atténuer la douleur. Les chirurgies induisent des douleurs modérées et transitoires. Elles peuvent induire des inflammations, des infections notamment au niveau des points de suture mais aussi une perte de masse de l’animal. Une hypothermie des animaux est également attendue lors des chirurgies. La manipulation des animaux peut induire un léger stress, normalement atténué par la période d’habituation systématiquement appliquée, tant à l’expérimentateur qu’au geste technique effectué
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort pour prélèvement post-mortem afin de réaliser des analyses.
Remplacement
Pour étudier l'aspect complexe, sensoriel et émotionnel de la douleur, sa relation avec les interactions sociales et les mécanismes des circuits cérébraux sous-jacents, l'utilisation d'animaux dotés d'un cortex développé est indispensable. Il n'est donc pas possible d'utiliser des modèles in vitro tels que la culture cellulaire ou un modèle mathématique complet. À cette fin, les rongeurs sont les modèles animaux les plus appropriés en raison des conditions d'élevage et de la possibilité de comparer et de confronter les résultats obtenus avec la littérature et les données cliniques.
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au minimum selon les règles statistiques de façon à garantir des enregistrement fiables exploitables statistiquement. Les résultats seront comparés avec des tests statistiques appropriés permettant d’émettre en évidence le rôle de l’ocytocine dans le comportement douloureux en lien avec les interactions sociales
Raffinement
Pour répondre aux besoins comportementaux des animaux, ils seront hébergés en cages collectives (groupes sociaux) enrichies (bâtons, frisure, tunnel en carton) permettant ainsi aux animaux d’exprimer leur comportement naturel. Les animaux seront préalablement acclimatés à leur environnement (2 semaines avant l’expérimentation) et habitué à la présence de l’expérimentateur, aux différents tests le cas échéant, et à la contention. Les approches invasives seront réalisées sou anesthésie analgésie. La température corporelle de l’animal sera garantie par des tapis chauffant thermostaté et le dessèchement de la cornée sera prévenu par application d’un gel oculaire hydratant. Pour faciliter la récupération post-opératoire de l’animal un traitement analgésique sera mis en place et de la nourriture gélifiée appétante sera ajoutée sur le sol de la cage. L’état de santé des animaux sera évalué à l’aide d’une grille de score et des points limites précoces permettant d’interrompre les procédures et de mettre fin à la souffrance animal ont été définis.
Choix des espèces
Le recours à l’animal est nécessaire dans l’étude des phénomènes complexes d’interactions douleur et interactions sociales ; à ce jour aucune approche alternative n’est existante. Le modèle expérimental chez le rat est un standard pour ce type d’expériences et comporte une série de symptôme superposable avec la pathologie humaine (syndrome de Pradder-Willy, anxiété chronique, douleurs inflammatoires …). De nombreuses études sont réalisées concernant les réseaux neuronaux ocytocinergiques chez les rats : les outils sont donc bien validés sur cette espèce, ce qui concourt à assurer la fiabilité des résultats obtenus, leur interprétation ainsi que leur comparaison avec la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 8 semaines. lorsque l’encéphale et donc les circuits neuronaux sont parfaitement mâtures.
Activité neuronale oscillatoire dans les circuits des ganglions de la base pendant le mouvement normal et pathologique: Au-delà des gammes de fréquences (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux chirurgies crâniennes de trois à cinq heures chacune, des injections quotidiennes de neurotoxine pendant six mois au maximum, puis une séance d'enregistrement d'une heure par jour cinq jours sur sept pendant douze mois : 6 macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Le MPTP leur provoque un syndrome parkinsonien permanent, avec rigidité musculaire, tremblements au repos, posture anormale et, selon la sévérité, des difficultés à s'alimenter, une perte de poids et des escarres. Chaque animal est capturé au collier dans sa volière et habitué à rester assis dans une chaise de contention, son cerveau étant retiré du crâne après sa mort pour localiser les sites d'enregistrement. Le porteur précise que le choix entre macaque à longue queue et macaque rhésus dépendra des possibilités d'approvisionnement, dans un contexte qu'il décrit comme une pénurie de singes pour la recherche.
Objectifs
Dans la maladie de Parkinson, le ralentissement et l’absence de mouvements volontaires s’accompagnent d’activités oscillatoires anormales dans un réseau de structures localisées sous le cortex cérébral, aussi appelé les ganglions de la base. Néanmoins, le lien entre ces activités oscillatoires pathologiques et les troubles moteurs caractéristiques de la maladie de Parkinson reste flou malgré des décennies de recherche. D'une part, la concomitance entre la réduction/abolition de ces activités oscillatoires suite à des traitements pharmacologiques et/ou à des procédures chirurgicales et l'amélioration clinique des troubles moteurs suggère un lien de causalité entre ces oscillations neuronales et la planification, le contrôle et la coordination des mouvements. D'autre part, il a été démontré que le ralentissement et l’absence de mouvements volontaires peuvent apparaître avant l'émergence des activités oscillatoires dans les ganglions de la base. De plus, les caractéristiques de ces oscillations neuronales peuvent varier en fonction des différentes structures qui composent le réseau des ganglions de la base. Notre plan de recherche est structuré en trois objectifs complémentaires. Le projet vise à (i) caractériser comment ces activités oscillatoires se produisent et comment elles se propagent dans les différentes structures des ganglions de la base chez des singes parkinsoniens effectuant des mouvements de bras volontaires en direction d’une cible; (ii) identifier le lien entre les caractéristiques de ces oscillations neuronales dans différentes structures du réseau des ganglions de la base et les mouvements normaux/anormaux; (iii) développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant une inversion rapide et robuste des changements neuronaux et comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer des approches thérapeutiques innovantes pour la maladie de Parkinson qui diffèrent significativement des thérapies actuellement disponibles et qui ne peuvent être développées sans une profonde compréhension mécanistique et quantitative de la façon dont le cerveau remplit ses fonctions ainsi que des mécanismes qui sous-tendent ses dysfonctionnements. Ce projet permettra de comprendre les mécanismes de génération et de propagation des activités oscillatoires anormales observées dans les ganglions de la base chez des singes après induction d’un syndrome parkinsonien et révèlera le lien avec les symptômes moteurs parkinsoniens. Ce projet sera donc extrêmement intéressant pour les personnes souhaitant développer de protocoles thérapeutiques originaux visant à restaurer le fonctionnement normal du cerveau. A terme, ce projet aidera à soulager les troubles moteurs des patients souffrant de la maladie de Parkinson tout en minimisant l'apparition d'effets secondaires et donc participera à améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Chaque animal subira une IRM pour obtenir une image morphologique 3D du cerveau (30min de transport jusqu'à l'IRM et 180min de procédure). Chacun des animaux sera également soumis à deux chirurgies d'une durée de 3à 5h chacune. La première chirurgie permettra l'injections de particules virales inactivées dans le cerveau visant à modifier les caractéristiques des neurones, et l'implantation d'électrodes d'enregistrements pour recueillir l'activité de ces neurones. La seconde chirurgie permettra l'implantation d'électrodes permettant de délivrer différentes intensités de courant électrique dans le cerveau pour restaurer son fonctionnement normal. Chaque animal subira également une injection intramusculaire quotidienne d'une substance chimique inerte et sans danger pour l'animal visant à manipuler l'activité des neurones dont les caractéristiques ont été modifiées préalablement (une injection par jour d'environ 20 à 30s, 5 jours par semaines durant 3 à 6 mois environ). L'induction du syndrome parkinsonien chez les animaux se fera grâce à des injections quotidiennes intramusculaires (une injection par jour d'environ 20 à 30s pendant n jours) d'une neurotoxine (appelé MPTP) qui provoque des symptômes permanents de la maladie de Parkinson. Le nombre de jours d'injection et le dosage de cette neurotoxine dépendra de la progression du syndrome (mais n'excédera pas plus de 6 mois). Enfin, chaque animal participera à une séance quotidienne d'enregistrements électrophysiologiques de l'activité neuronale (une séance d'environ 1h par jour, 5 jours par semaine durant 12 mois environ).
Impact sur les animaux
La phase précoce de conditionnement et de l'entrainement (c'est-à-dire la capture de l'animal dans la volière à l'aide d'un colier, l'entrainement de l'animal dans la tâche comportemental) peut stresser les animaux. Au cours de la procédure IRM, les nuisances sont essentiellement liées à l'anesthésie qui peut entrainer une baisse de la température corporelle, des troubles respiratoires et/ou cardiaques. Durant le transport à l'IRM, il faut également être très prudent afin que l'animal ne se blesse pas (par exemple plaies/coupures ) avec la cage de transport. De plus, des douleurs et infections peuvent survenir suite aux interventions chirurgicales . Enfin, l'induction du syndrome parkinsonien provoquera l'apparition de symptômes moteurs (c'est-à-dire des difficultés à effectuer des mouvements, une rigidité musculaire, une posture anormale et des tremblements au repos). Par ailleurs, selon la sévérité de ces symptômes parkinsoniens, les animaux pourront présenter des difficultés à s'alimenter et à bouger pouvant donc entrainer une perte de poids et l'apparition d'escarres.
Devenir
Une fois la procédure terminée, les animaux seront profondément anesthésiés et euthanasiés afin de pouvoir effectuer des analyses histochimiques post-mortem qui sont indispensables pour localiser les sites d'enregistrements de l'activité neuronale et l'aspect du cerveau après l’induction du syndrome parkinsonien. Après constatation de la mort de l’animal, le cerveau sera retiré du crâne, congelé pour procéder aux analyses histologiques.
Remplacement
Notre projet a pour but de caractériser les dysfonctionnements qui se produisent dans le cerveau après induction d'un syndrome parkinsonien et de déterminer les conséquences sur le comportement afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce type de projet ne peut donc pas être effectué via des approches in silico, in vitro ou ex vivo et l'approche in vivo est indispensable. De plus, les singes ont un cerveau et des comportements semblables à l'homme ce qui permet de développer des tâches comportementales complexes et susceptibles de refléter les comportements humains. L'utilisation de rongeurs ou d’autres espèces de vertébrés n'est donc pas appropriée et nous sommes obligés d'utiliser des primates non-humains.
Réduction
Notre objectif est de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour la recherche. Nous y parvenons en planifiant soigneusement et en maximisant les données obtenues chez chaque animal. Ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui diminuera par deux le nombre total d’animaux utilisé pour ce projet. Le nombre d'animaux a été choisi en fonction des pratiques standards qui combinent l'étude de l'activité neuronale et l'étude du comportement chez les primates non-humains. Enfin, notre stratégie de libre accès aux données sera essentielle non seulement pour les avancées scientifiques, mais aussi pour des raisons éthiques. En effet, il n'est pas nécessaire de réaliser davantage d'expériences sur les animaux si les données sont déjà disponibles quelque part dans le monde.
Raffinement
En début de protocole et durant 3 mois, l’expérimentateur habituera les animaux à sa présence (15-30min par jour, 5 jours par semaine). L’expérimentateur apprendra à l’animal à se laisser attraper par son collier à l’aide d’une canne et à rester calmement assis dans une chaise de travail (5 jours par semaine). Pendant la durée totale des expériences, les animaux seront maintenus en groupe et bénéficieront d'un environnement enrichi (jouets, musique). Le transport de l’animal vers la plateforme de bio imagerie située à 200m de l’animalerie se fera à l’aide d’une boîte de transport dédiée mise sur un chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. L’animal anesthésié sera maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte. Au total, la durée de l'examen sera de 30min de transport et 180min de procédure. Les chirurgies seront réalisées de façon stérile et sous anesthésie profonde. Une couverture antalgique en pré- et post-opératoire sera utilisée pour limiter la douleur de l’animal après l’intervention chirurgicale. Enfin, pour limiter la douleur que peuvent engendrer les incisions cutanées, nous administrons un anesthésique local avant incision. Pour le contrôle de la température, avant l’induction de l’anesthésie, une sonde sera insérée dans le rectum des animaux. De plus, durant la totalité de la chirurgie, les animaux seront placés sous une couverture (électrique) chauffante qui est régulée en fonction de la température corporelle. Suite aux chirurgies, les animaux seront quotidiennement observés durant 5 à 7 jours post-chirurgie par le personnel de l'animalerie sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition etc. Une attention toute particulière sera porté aux risques d'infections, d'abcès, d'œdèmes et d'inflammation. Durant l'induction du syndrome parkinsonien, les animaux seront également quotidiennement observés pour évaluer la sévérité de la maladie et induire un syndrome parkinsonien stable et modéré. Si les symptômes s'accentuent (difficultés à s'alimenter et à bouger, pouvant entrainer une perte de poids et l'apparition d'escarres), l'animal sera immédiatement sorti du protocole et séparé des autres animaux, de façon à sécuriser son hébergement et éviter qu’il se blesse. De plus, des précautions particulières seront prises telles que l'utilisation de matelas moelleux/alèses et de fréquents changements de position pour éviter les chocs et le développement d'escarres.
Choix des espèces
Contrairement à d'autres espèces de vertébrés (e.g., rongeurs), le macaque possède une organisation du cerveau semblable à celle de l'homme. De plus, le macaque possède un répertoire de comportements plus large et plus proche de celui de l'homme ce qui nous permet de développer des tâches comportementales complexes et susceptibles de refléter les comportements humains. L'utilisation du primate non-humain permettra donc de plus facilement transposer nos résultats à l’homme et reste donc indispensable dans le cadre de cette étude. De plus, les animaux utilisés pour ce projet seront âgés d’au moins 36-48 mois. A cet âge, on peut considérer que le développement du système nerveux central à atteint sa maturité. Ce paramètre est important à respecter puisqu’il nous permettra de comparer plus aisément les résultats obtenus chez ces animaux avec les caractéristiques observés chez l’homme à l’âge adulte. Notons que dans le contexte (européen et mondial) actuel de pénurie de singes pour la recherche scientifique, le choix du singe cynomolgus ou du singe rhésus dans ce projet dépendra des possibilités d'approvisionnement. Quoiqu'il en soit, nous n'attendons pas de différences majeures entre ces deux espèces.
Etude des changements d’efficacité de la communication entre les neurones dans un contexte d’addiction.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cathéter veineux posé sous anesthésie, puis dix séances de six heures d'auto-administration de cocaïne ou vingt-cinq séances de trois heures pour la nicotine, six semaines d'abstinence, une chirurgie cérébrale de deux heures trente : 960 rats enchaînent ce protocole, isolés en cage individuelle pendant 57 ou 81 jours. Les 1 088 rats du projet finissent par trois heures d'enregistrement de l'activité de leurs neurones sous anesthésie générale, 128 d'entre eux n'étant pas réveillés, les 960 autres relevant d'un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour analyser leur cerveau. Le porteur annonce que ces travaux pourraient mettre en évidence une nouvelle approche thérapeutique pour les personnes dépendantes, quand l'isolement de 57 à 81 jours et la prise chronique de cocaïne figurent, eux, parmi les nuisances attendues.
Objectifs
Le cerveau est en permanence soumis à des phénomènes de plasticité, c’est-à dire à des changements de l’efficacité de la communication entre des neurones, permettant l’encodage de nouvelles informations. L’exposition chronique à des drogues d’abus est connue pour induire de tels phénomènes, ce qui pourrait constituer une mémoire de la drogue et faire partie du processus pathologique menant à l’addiction et aux épisodes de rechute. Ce projet vise à étudier le rôle du cholestérol cérébral dans ces processus de changement d’efficacité synaptique induits par les drogues d’abus telles que la cocaine et la nicotine chez le rat.
Bénéfices attendus
La conduite de ce projet devrait permettre d’identifier les mécanismes par lesquels la manipulation du métabolisme du cholestérol cérébral modifie la recherche de drogue et la rechute (nouvelle consommation) chez des rats addicts. Ces expériences pourraient mettre en évidence une nouvelle approche thérapeutique, en ciblant le cholestérol cérébral chez les patients addicts pour les aider dans leur désir d’abstinence.
Procédures
Tous les rats (1088) seront pesés 2 fois par semaine. 960 rats auront une injection d’un antalgique et immédiatement après suivront une chirurgie sous anesthésie générale (15 minutes) afin d’implanter un cathéter veineux Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 960 rats seront hébergés seuls dans leur cage (57 jours pour les rats sous cocaïne et leurs contrôles (480 rats), 81 jours pour les rats sous nicotine et leurs contrôles (480 rats)). L'auto-administration de drogue se fera avec ces 960 rats pendant 10 sessions pour la cocaïne (480 rats) ou 25 sessions pour la nicotine (480 rats) à raison d’une session par jour (durée d'une session : 6 heures pour la cocaïne ou 3 heures pour la nicotine) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles ils sont libres de leur mouvement. Ces rats (960) seront ensuite placés en abstinence dans leur cage d’hébergement (6 semaines). Parmi les 1088 rats, 640 rats auront une injection d’un antalgique et immédiatement après une chirurgie cérébrale permettant l’injection d’un produit modifiant le cholestérol dans une région précise du cerveau (2h30 sous anesthésie générale gazeuse). Tous les rats (1088) seront soumis à des enregistrements de l’activité des neurones (3 heures sous anesthésie générale gazeuse).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques pendant et après la chirurgie et inconfort transitoire au réveil. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. -Auto-administration : La prise chronique de cocaine (bien que volontaire) peut causer un stress modéré et transitoire chez certains individus (poil hérissé, irritabilité) -La Période d’abstinence : peut causer un léger stress. -Isolement : stress modéré (57 jours pour les rats en auto-administration de cocaïne et leurs contrôles ; 81 jours pour les rats en auto-administration de nicotine et leurs contrôles)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de procéder à des analyses sur le cerveau.
Remplacement
Ce type de recherche, qui vise à mesurer le changement d’efficacité synaptique cérébrale chez l’animal anesthésié suite à une exposition volontaire à la cocaïne ou à la nicotine, implique d’utiliser des modèles d’animaux vivants. L’étude des processus de changement d’efficacité synaptique cérébrale nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et des méthodes de substitution à l’animal entier ne peuvent être utilisés.
Réduction
Pour étudier les changements d’efficacité synaptique cérébrale en réponse à la consommation volontaire de cocaïne ou de nicotine, nous progresserons pas à pas en utilisant un arbre décisionnel de type Go/noGo pour étudier plusieurs protocoles de stimulation permettant d’induire ces changements. Dans la procédure1, nous avons choisi de tester 4protocoles d'enregistrement/stimulation/enregistrement pour chacune des 4régions cérébrales ciblées, et d’utiliser 8animaux maximum par protocole. Chaque animal sera son propre contrôle et nous comparerons les changements d’efficacité synaptique avec les différents protocoles. L’ordre des protocoles testés dans chaque région cérébrale sera basé sur la littérature scientifique. Dès qu’un protocole entrainera un changement d’efficacité synaptique, il sera retenu pour la région cérébrale et les autres protocoles ne seront pas testés. Si aucun changement d’efficacité pour une région, alors elle ne sera pas étudiée dans les procédures suivantes et la région cérébrale suivante sera étudiée avec le même cheminement. Lorsqu’un protocole induira des changements d’efficacité synaptique, nous étudierons si la consommation de cocaïne ou nicotine impacte cette efficacité. Si aucun effet des drogues n’est observé, alors cette région ne sera pas étudiée dans l'étude de l'effet du cholésterol. Pour réduire le nombre d’animaux et faire des analyses statistiques, le nombre d’animaux requis par groupe expérimental a été calculé par une méthodedite de puissance qui tient compte de la variabilité des mesures.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux et des pesées 2 fois par semaine. Selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans la décision d’intervention et d’arrêt. En effet, des points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoce dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal, atteignant un point limite défini nécessitant une intervention, sera pris en charge sans délai par l’expérimentateur. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale et de l’administration d’antalgiques. Un maintien de la température grâce à un tapis chauffant et une hydratation régulière des tissus seront assurés pendant les chirurgies.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Les rats ont des réponses aux drogues similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec d’autres espèces. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, ce qui limite le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rat en phase d’adolescence (juvéniles).
Caractérisation de nouveaux modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, dont 1 248 opérées sous anesthésie sans jamais reprendre conscience, 1 934 souris vont être utilisées pour caractériser quatre nouveaux modèles génétiques de la maladie de Huntington. Les 686 autres relèvent d'un niveau de souffrance léger. Certaines lignées sont maintenues jusqu'à onze mois pour que des symptômes neurologiques et moteurs apparaissent, symptômes que le porteur dit jamais handicapants, avant une série de tests comportementaux d'une semaine au maximum puis une chirurgie terminale. Ces tests, présentés comme très fins et seuls capables de révéler les symptômes en question, ne sont nommés nulle part dans le résumé.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Afin de pouvoir répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes de cette maladie, quatre nouveaux modèles murins génétiquement modifiés ont été développés. Cependant, avant de pouvoir les utiliser en recherche, une description complète de leur comportement est indispensable. De plus, il faut également analyser si les modifications génétiques ne perturbent pas le développement des animaux afin de valider la fiabilité de ces nouveaux modèles. Cette étape est primordiale pour s'assurer que de futurs projets de recherche dans lesquels ces modèles seront utilisés ne seront pas biaisés.
Bénéfices attendus
Les différents modèles murins déjà existants pour étudier la maladie de Huntington ne permettent pas d’étudier et de visualiser directement et à l'état normal les protéines défaillantes et responsables de la maladie. Pour cela, il faut utiliser des intermédiaires cellulaires permettant de tracer et marquer les protéines. Cependant, l'ajout de ces intermédiaires peut engendrer des modifications cellulaires indésirables et fausser certains des résultats. Ainsi, ces nouveaux modèles murins vont être de précieux outils pour atteindre les objectifs des projets qui visent à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et à aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie et/ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Ainsi, la caractérisation du développement, du comportement et des fonctions physiologiques de ces souris est essentielle.
Procédures
Parmi les animaux de ce projet, certains développent un phénotype dommageable avec l'âge. Tous les animaux effectueront une seule série de tests comportementaux pendant une durée maximale d'une semaine, puis une chirurgie terminale sera réalisée.
Impact sur les animaux
Certains des nouveaux modèles présentés ici peuvent développer avec l’âge des symptômes légers de la maladie de Huntington. Ces symptômes neurologiques et moteurs associés au modèle ne sont observés que lors de tests comportementaux très fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive ni une perte d'autonomie. Il est possible d’identifier 3 nuisances légères potentielles : 1) un stress léger pendant leur transport d'une animalerie vers l'autre. 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements et pendant la réalisation des tests comportementaux. 3) un stress léger d'une femelle ayant mis bas lorsque les animaux seront prélevés.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin des procédures. Leurs tissus cérébraux ainsi que d'autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés et conservés afin de réaliser des expériences ultérieurement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, les nouveaux modèles murins de la maladie de Huntington qui ont été développés vont permettre d'étudier le rôle de plusieurs protéines impliquées dans le développement de la maladie en conditions physiologiques et/ou pathologiques sans devoir utiliser des intermédiaires pouvant biaiser les résultats. Le modèle murin est indispensable pour comprendre le rôle de la protéine huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre total d’animaux pour ce projet a été calculés en considérant que les expérimentations doivent être validées avec au minimum deux groupes de souris afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Dans une démarche de réduction, les souris utilisées vont permettrent de faire plusieurs études et de répondre à différentes questions fondamentales. De plus, à la fin de chaque étude, les tissus cérébraux ainsi que d’autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés. Ceci permettra d’obtenir du matériel biologique précieux sans devoir générer des animaux supplémentaires.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez ces animaux. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées et équipées d’une litière stérile ainsi que de la paille permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. De plus, différents matériaux pour divertir les rongeurs seront ajoutés dans la cage avec une rotation chaque semaine pour que les animaux aient chaque semaine un nouveau divertissement. Ces cages seront changées toutes les semaines. L’accès à l’eau et à la nourriture sera illimité. Les biberons d'eau et les croquettes seront également changés toutes les semaines. Le transport des animaux d’une animalerie à l’autre sera effectué en cages occultées avec au moins un matériau de divertissement et des croquettes mouillées à disposition. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. L’état de santé des animaux sera surveillé toutes les semaines ou tous les jours si besoin jusqu'à la fin de leur vie. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la maladie de Huntington. Certaines souris seront utilisées au stade de jeunes adultes, c'est-à-dire entre 8 et 12 semaines, d’autres devront atteindre l’âge de 11 mois afin qu'elles développent les symptômes légers de la maladie de Huntington et permettre que l’étude soit pertinente. Concernant les études développementales, les animaux seront utilisés à différents stades de développement cérébrale car cette période est fondamentale pour la mise en place des tissus cérébraux. En outre, de plus en plus d'études montrent que des dyfonctionnements cérébraux s’installent très tôt, bien avant l'apparition des symptômes de la maladie de Huntington.