Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Traitement de l’encéphalopathie par administration de produits sous forme de dialyse péritonéale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Vocalises spontanées, difficultés respiratoires, incapacité à se retourner, absence de réflexe pupillaire, ptôse palpébrale avec larmoiement : ces signes déclenchent la mise à mort anticipée des rats en phase de décompensation. 3 374 rats vont être utilisés au total, 1 368 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 1 356 un niveau modéré et 650 un niveau léger, tous tués pour l'analyse histologique du foie, des reins et du cerveau. Chacun reçoit jusqu'à 32 administrations de tétrachlorure de carbone, deux par semaine pendant seize semaines, ou subit une laparotomie avec ligature des voies biliaires, avant que des injections de lipopolysaccharide bactérien ou douze administrations d'éthanol ne déclenchent la défaillance hépatique. Le porteur écrit que la décompensation peut inéluctablement conduire l'animal à la mort, et n'appuie l'effectif de 3 374 rats sur aucun calcul.
Objectifs
L'encéphalopathie hépatique (EH) est un syndrome d'altération des fonctions cérébrales dû à une maladie hépatique aiguë ou chronique. Les manifestations peuvent aller de troubles psychiatriques, neurologiques subcliniques jusqu’au coma. Ce syndrome est associé à une morbidité, à un taux de mortalité élevé et nécessite des soins importants. La principale cause de cette pathologie est la cirrhose hépatique qui est caractérisée par la présence de tissus cicatriciels au niveau du foie en réponse à une agression répétée de l’organe.
Bénéfices attendus
La prévalence de l’encéphalopathie hépatique (EH) clinique concerne 30 à 45 % des patients cirrhotiques avec une incidence de 20 % par an. La prévalence de l’EH minime est plus difficilement estimable mais elle pourrait toucher plus de 2/3 des malades. La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). La survenue d’une EH constitue un facteur majeur de mauvais pronostic. En effet, le développement d’un premier épisode d’EH au cours de la cirrhose est un facteur de risque indépendant de mortalité avec un taux de survie cumulée à 1 an et 3 ans de respectivement 42 % et 23 %. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit à la mise en place de l’encéphalopathie hépatique et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).
Procédures
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 32 administrations de CCl4 (tétrachlorure de carbone, agent fortement hépatotoxique) à raison de 2 par semaines pendant 16 semaines (15 secondes) ou Chirurgie avec laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale et couverture analgésique (durée 15’) Pour les études pilotes : un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Pour les études avec produits : un prélèvement de sang intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Décompensation provoquée selon les procédures : Entre 18 et 20 administrations de CCl4 à raison de 2 par semaines pendant 9 ou 10 semaines (15 secondes) Ou Chirurgie avec laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale et couverture analgésique (durée 15’) un prélèvement de sang intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Déclenchement de la décompensation : Soi 4 administrations de LPS (Lipopolysaccharide: fragment de la paroi bactérienne entrainant une réaction inflammatoire à l'identique de celle rencontrée lors d'une infection) (15 secondes) à raison d’une administration journalière pendant 4 jours avec ou sans anesthésie selon la voie retenue soi 12 administrations d’éthanol à raison de 3 administrations par jour pendant 4 jours (15 secondes) un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Si procédure avec produit à étudier ajouter: 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes).
Impact sur les animaux
Les modèles d’étude ne présentent pas de douleur ou d’inconfort pendant la phase d’induction de la fibrose ou de la cirrhose. Sur cette phase, le seul inconfort serait l’intervention chirurgical associée à la ligature des voies biliaires, celui-ci est géré par l’utilisation préventif d’un analgésique et en curatif pendant les deux jours qui suivent la période post-opératoire. L’encéphalopathie est une pathologie très lourde pouvant conduire au décès du patient. La décompensation qu’elle soit « spontanée » en prolongeant l’induction soit dans l’épisode aigu associé à l’administration de l’agent précipitant à un stade plus précoce de la cirrhose compensée peut inéluctablement le conduire à la mort, c'est par définition la caractéristique du modèle étudié dans ce projet. Nous reproduisons ces évènements qui surviennent chez les patients cirrhotiques qui décompensent qui dans le cadre d’une ACLF (décompensation ou aggravation d’une décompensation rapide et brutale par un agent précipitant - infection, absorption massive d’alcool, intoxication médicamenteuse, …- chez des patients souffrants d’une maladie chronique du foie) peuvent avoir une survie estimée à 28 jours dans 70% des cas. Des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires (dyspnée), une incapacité à se retourner (sauf dans le cadre du binge drinking où les pertes d’équilibres peuvent aller jusqu’à l’incapacité à se retourner), une absence de réflexe pupillaire, une ptose palpébrale avec larmoiement et une pâleur prononcée pourront être observés chez les animaux en phase de décompensation. Ils constitueront un point d’arrêt et une mise à mort des animaux par anticipation.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Les modèles développés et décrits dans ce projet tentent de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation aigue ou chronique. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus jouant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc.)
Réduction
Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatiques. Le nombre initial de certaines procédures permettra l’élimination d’animaux sous ou sur-répondants, ce afin d’avoir une meilleure homogénéité après réponse à l’agent précipitant et donc in fine de réduire les groupes d’étude finaux. L’estimation du nombre d’animaux des groupes finaux a pour but de permettre une analyse robuste et fiable de l’effet des composés sur la pathologie. Les procédures de caractérisation des modèles permettront d’ajuster au mieux ce nombre d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet thérapeutique de composés.
Raffinement
L’encéphalopathie hépatique est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne de nombreux décès dans un délai de 1 à 3 ans. Le modèle expérimental s’avère donc lui aussi sévère sur la phase finale de la procédure (prolongation de l’agent inducteur ou administration de l’agent précipitant). Nous avons établi une liste de signes cliniques de manière à ne pas conserver des animaux ayant atteint ces points limites. La liste de ces points limites pourra être réajustée après les procédures de caractérisation des modèles et afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel ou igloo et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. L’insuffisance hépatique qui conduit à l’encéphalopathie étant une pathologie multi-organe, l’étude de la maladie requiert l’utilisation d’animaux et ne peut être remplacée par des expérience in vitro.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce Rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l'arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans: "Phenobarbitone induced enlargement of the liver : its relationship to carbon tetrachloride induced cirrhossis -Br. J.Exp.Pathol. 1981 Jun;62(3):283-8 », c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gfr environ que le ratio du poids du foie et le plus favorable, de même que l’expression du cytochrome P450 qui est plus stable.
Analyse de la connectivité cérébrale dans l’addiction à l’alcool à long terme
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune hébergée seule et en cycle inversé pendant les neuf semaines du protocole. Pendant sept semaines, elles ont le choix entre une bouteille d'eau et une bouteille d'alcool, accès que le porteur qualifie de volontaire et non forcé. Suivent un examen IRM de 56 minutes sous anesthésie et un prélèvement de 300 microlitres de sang, soit 15 % du volume sanguin total, puis la mise à mort et le prélèvement des organes. Le porteur reconnaît que l'isolement peut stresser les souris et qu'une consommation excessive d'alcool peut les déshydrater, et attend de l'étude une vue globale du connectome susceptible de servir à de futurs travaux translationnels.
Objectifs
Le trouble de consommation de l’alcool induit des modifications cérébrales complexes, se caractérisant par plusieurs stades associés à des adaptations spécifiques. En effet, une exposition prolongée et répétée à l’alcool peut être à l’origine d'altérations dans la communication entre les différentes régions du cerveau. Par ailleurs, des différences dans la vulnérabilité à la dépendance et à la toxicité de l'alcool entre les sexes ont déjà été mises en évidence à la fois chez l'Homme et dans des modèles de rongeurs. Ainsi l'objectif de cette étude est d'identifier par IRM dans quelle mesure les altérations de la communication cérébrale dépendent du sexe lors d'une consommation excessive et à long terme d'alcool. C'est pourquoi, après une consommation chronique de 7 semaines, des souris mâles et femelles sous exposition volontaire à l'alcool seront caractérisées par IRM multimodale afin de detecter les modification de la communication cérébrale. Ce projet tend donc à répondre aux questions suivantes ; quelles modifications cérébrales sont induites par la consommation d'alcool à long terme, quelles sont les différences d'altérations entre les sexes, et comment ces modifications peuvent être liées ou même prédire un comportement addictif ?
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude devraient contribuer à mieux comprendre les conséquences au niveau de la connectivité cérébrale dans l'addiction à l'alcool à long terme;, et l'influence du sexe dans les modifications observées. Ce projet devrait apporter une vue globale de la réorganisation du connectome chez les souris exposées à l’alcool, tout en permettant de cibler les aires cérébrales présentant des altérations spécifiques, et pouvant servir de cibles pour de futurs études translationnelles.
Procédures
Les animaux seront soumis à : 1) un protocole volontaire d'accès intermittent au choix entre 2 bouteilles : alcool versus eau pendant 7 semaines. 2) un examen IRM sous anesthésie incluant : un séquence d'IRM fonctionnel (16 minutes), une séquence d'IRM anatomique (10 minutes) et une séquence d'IRM de diffusion (30 minutes). 3) Un prélèvement sanguin de 300 µl maximum (15 % du volume sanguin total) réalisé sous anesthésie. Par ailleurs, les souris seront hébergées individuellement et en cycle inversé pour toute la durée du protocole, c'est-à-dire 9 semaines.
Impact sur les animaux
Le protocole de préférence de consommation de la solution d'alcool par rapport à l'eau par les souris est basée sur une action volontaire et non forcée. Des études précédentes chez la souris ont montré que le protocole induit une augmentation de la consommation après 2-3 semaines d’exposition. Cette consommation se stabilisent par la suite mais sa chronicité pendant 7 semaines reproduit le passage vers l’addiction à l’alcool, comme observées chez l’homme. Le protocole ne teste pas l’état de sevrage des souris car l’exposition à l’alcool n’est pas arrêté de manière prolongé, limitant ainsi les possibles nuisances. Les souris peuvent cependant présenter un état de déshydratation suite à la consommation excessive d’alcool. Ce protocole exige par ailleurs que les souris soient isolées ce qui peut induire un stress chez les animaux.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements d’organes d’intérêts.
Remplacement
Le modèle animal est, pour le moment, le seul modèle qui permet d’étudier dans son ensemble les phénomènes complexes mis en oeuvre dans l'addiction à l'alcool au niveau cérébrales à l'échelle du connectome. En effet ces atteintes sont multifactorielles, nécessitant un grand nombre d’acteurs, et toutes les conditions ne sont pas reproductibles fidèlement dans un modèle de culture cellulaire. L'utilisation de modèles murins pour le dévéloppement du projet est crucial. L'alcoolisme est une pathologie hétérogène qui implique une grande variabilité des profils symptomatiques. L'étude chez l'animal permet un suivi au cours du temps (du développement du modèle à l'établissement du phénotype de consommation excessive d'alcool) et un contrôle de l'historique de consommation incluant les niveaux de consommation, ses caractéristiques temporelles, ainsi que de l'environnement de l'exposition. Ce suivi est crucial pour l'identification et la caractérisation des phénotypes de consommation d'alcool et pour identifier les facteurs déterminants dans le passage à la consommation compulsive. Ces informations phénotypiques seront corrélées aux informations sur la connectivité cérébrale, mais également aux analyses cellulaires et moléculaires du tissu cérébral, ce qui nous apportera des informations sur les mécanismes de pathologie liées à la consommation excessive d'alcool. Ces questions ne peuvent être évaluées de manière contrôlées que dans des études chez l'animal. Chez l'humain le suivi historique non biaisé est impossible, cette évaluation étant basée sur la consommation d'alcool auto-déclarée. De plus, les facteurs environnementaux (stress, début de la consommation, comorbidités) sont des facteurs difficilement intégrables dans les études chez l'homme. Il n'est pas non plus possible de réaliser des prélèvements tissulaires chez l'humain. Le lien, entre des variables spécifiques (comme la quantité de consommation d'alcool), les phénotypes (comme le comportement de consommation compulsive) et les caractéristiques de la connectivité, permet la découverte de médicaments pour cibler des caractéristiques temporelles et catégorielles spécifiques de l'alcoolisme, dans le but de diminuer la consommation et éviter le passage vers l'addiction. Les médicaments ciblant l'alcoolisme pourraient influencer les jours d'abstinence, les niveaux d'alcool ou les changements de profils, qui ne peuvent être évalués avec précision que dans un cadre longitudinal et contrôlé.
Réduction
Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaires afin d’assurer l’efficacité des tests et obtenir des résultats fiables en fonction des expériences réalisées. Le nombre d’animaux pour l’analyse des résultats a été calculé à l’aide de tests statistiques et notre expérience montrant une forte variabilité des phénotypes de consommation d’alcool, amenant à 50 souris par groupe nécessaires pour analyser les résultats d'expérience IRM, conduisant à un total de 200 animaux
Raffinement
Le stress potentiellement engendré par la pratique expérimentale sera limité au maximum. A leur arrivée à l’animalerie, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement de 2 semaines. Dans les cages d'hébergement, l'environnement sera enrichi par des carrés de coton pour l’édification du nid, des morceaux de bois pour que les animaux usent leurs dents, et des tubes pour fournir un abri. Pour limiter l’impact lié à l’isolement des animaux, les cages seront placées l’une à côté de l’autre pour maintenir les contacts olfactifs et visuels. Afin d’habituer les souris à la consommation d’alcool, le protocole d’accès intermittent au choix entre deux bouteilles comprend d’abord un accès pendant la première semaine à des bouteilles contenant un pourcentage croissant d’alcool. Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d'un anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. Les yeux des animaux seront protégés du dessèchement grâce à l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM. Il sera alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Pour ce projet nous utiliserons des souris mâles et femelles. Cette souche de souris est la plus utilisée dans l'étude du comportement lié à l'alcool. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, étant l'équivalent de l'âge adulte chez l'homme. A cet âge, les souris ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleure reproductibilité des résultats.
Ocytocine et espace social chez le macaque
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteurs pour une partie d'entre eux de récepteurs à l'ocytocine génétiquement modifiés, 12 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une à trois neurochirurgies d'une journée sous anesthésie générale, pour l'injection de marqueurs intracrâniens, l'implantation d'électrodes puis leur retrait, ainsi que deux IRM, un scanner et quatre examens de tomographie par émission de positons, tous sous anesthésie. Ils reçoivent en plus une injection intramusculaire trois fois par semaine pendant dix semaines, avant des séances d'observation en volière portant sur des intrusions dans leur territoire. Le porteur prévoit des micro-lésions cérébrales dues à la présence des électrodes, annonce la mise à mort de 4 macaques à des fins scientifiques et présente les 8 autres comme candidats à la reproduction en centre de primatologie, ou à défaut au placement en sanctuaire, sous réserve de l'évaluation rétrospective.
Objectifs
L'espace est une ressource limitée pour de nombreuses espèces, les poussant à délimiter et à défendre leur territoire. L’objet de ce projet est de comprendre les mécanismes neuronaux qui régulent le comportement territorial. Ce comportement est à la source de nombreux conflits, chez l’humain comme chez l’animal, lorsqu’un individu franchit les frontières d'un territoire. Nous faisons l’hypothèse que l'ocytocine (OT), un neuropeptide hypothalamique connu pour son rôle de régulation sociale chez les mammifères, module l'activité neuronale dans les zones clés liées à la perception de l’espace dans le processus d'appropriation et de défense territoriale. Notre étude se concentre sur le macaque dont les systèmes neuronaux et comportementaux sont proches de ceux des humains. Des données préliminaires suggèrent que la distribution des récepteurs d'ocytocine diffère considérablement entre les rongeurs et les primates, ce qui justifie notre choix du macaque comme modèle. De plus, la régulation territoriale chez le macaque repose davantage sur des indices visuels et des règles sociales hiérarchiques que sur des indices olfactifs, comme c'est le cas chez les rongeurs. Nous analyserons comment les neurones spatiaux et émotionnels réagissent aux changements territoriaux tels que l’approche d’un intrus sous l'influence de l'ocytocine. Comprendre ces mécanismes pourrait éclairer les conflits territoriaux humains et les moyens de les résoudre.
Bénéfices attendus
1. Le projet apportera une connaissance approfondie de l'anatomie du système oxytocinergique chez le primate, de son effet sur l’activité neuronale au sein du complexe amygdalo-hippocampique, Ces données sont impossibles à obtenir chez l'humain du fait de l'impossibilité de faire des marquages pré mortem qui seront révélés dans l'anatomie post mortem. 2. Ce projet renseignera sur les systèmes neuronaux qui contrôlent les comportements sociaux et territoriaux ainsi que leur modulation par l’action de l'ocytocine. 3. Le projet permettra d'apporter des éléments sur la faisabilité et l'action potentielle des approches pharmaco-génétiques pour agir sur le comportement et l'activité neuronale chez le primate non humain. Cette étape est essentielle au développement d’outils pharmaco-génétiques dans une perspective translationnelle. De fait, le projet vise à ouvrir la voie à la possibilité de manipulation pharmacologique ciblant des zones spécifiques du cerveau humain afin de bénéficier à des patients ayant des troubles psychiatriques.
Procédures
Les animaux des deux premier lots seront soumis trois procédures chirurgicales sous anesthésie générale d’une journée : une première destinée à l’administration de marqueur intracrânien, une deuxième destinée à l'implantation d'électrode et la dernière à retirer les implants. Les animaux seront aussi soumis à 2 examens d'imagerie par résonnance magnétique et de CT scan d’une durée d’une ½ chacun, et 4 examens de tomographie par émission de positon, couplés à des prises de sang pour des dosages hormonaux (1/2 journée). Les animaux seront mis sous anesthésie générale pour ces 1examens. Les animaux recevront une injection intramusculaire par jour de ligands pharmacogénétiques 3x par semaine pendant 10 semaines avant des sessions de mesures comportementales en volière. Les animaux du deuxième lot seront soumis à un examen sous anesthésie générale d’une ½ journée et une chirurgie d’une journée.
Impact sur les animaux
Les animaux seront tous soumis à 1 ou 3 neuro-chirurgies (selon les lots) effectuées sous anesthésie générale. La chirurgie suscitera un inconfort post-opératoire passager. A terme, des micro-lésions cérébrales sont à prévoir, dûes à la présence d’électrodes dans le cerveau. Les aninaux recevront des injections intramusculaires qui peuvent génèrer une douleur localisée mais passagère. Nous nous attendons à ce que le produit injecté modifie le comportement territorial pour induire moins de compétition territoriale. Les animaux seront testés sans mise en conflit, mais plutôt en observant des intrusions dans leur territoire. Ces situations peuvent générer un stress passager, mais équivalent à un stress naturel. Les animaux seront aussi soumis à des examens d'imagerie par résonnance magnétique, radio (Tomographie à émission de positon) et les prises de sang capillaire à l’oreille pour des dosages, pour lesquels ils seront mis sous anesthésie générale, ce qui provoquera également un inconfort au réveil.
Devenir
A la fin du protocole, 8 des animaux subiront une chirurgie de dés-implantation et seront candidats à une réutilisation pour de la reproduction en centre de primatologie si l'évaluation rétrospective le permet. En cas contraire, ils seront candidats pour un replacement en sanctuaire. Par ailleurs, notre protocole nécessite l'euthanasie de 4 des animaux pour des fins scientifiques.
Remplacement
Dans notre cas, le remplacement des primates par d'autres espèces vertébrées ou non vertébrées, voire par d'autres espèces de primates n'est pas encore possible. Les humains ne peuvent pas être utilisés en raison de la nature invasive des méthodes expérimentales. Il est impossible d'injecter des marqueurs en prémortem pour effectuer du traceur anatomique et ni d’injecter des vecteurs viraux permettant de cibler les circuits anatomies précis chez l'homme et d'en vérifier les effets des manipulations sur le comportement. De même une approche in silico, ne permet pas d'appréhender ni la complexité des circuits anatomiques ni le comportement. Phylogénétiquement, le modèle d’étude pré-clinique (macaque) est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Aucun autre modèle animal ne présente ces caractéristiques.
Réduction
La taille de la cohorte a pour but d'utiliser le moins d'animaux possible permettant d’obtenir des résultats significatifs et généralisables. Nous déterminerons les effets de la manipulation du système ocytocynergiques en comparant les effets obtenus d’un agent activateur (ligand) chez des animaux porteurs de récepteurs modifiés de l’ocytocine (groupe test, n=6) et chez les animaux contrôle (n=4). L’utilisation du groupe contrôle permet de vérifier que notre effet est bien le fruit d’une activation des récepteurs modifiés et non, un simple effet du ligand. C’est pourquoi, la condition sans stimulation du groupe test ne peut être son propre contrôle. De plus, les résultats électrophysiologiques du groupe contrôle sont intéressants en soi car ils permettront d’établie une physiologie de base. Le nombre d’animaux a été déterminé selon une approche statistique conservatrice et, mais les expériences n’engageront pas 10 animaux simultanément. Nous procéderons au test d’une première cohorte, puis les données seront évaluées et complétées afin d’atteindre une significativité en procédant par étape, notamment en évaluant l’expression des récepteurs modifiés grâce à l’examen TEP (tomographie à émission de positon) chez le groupe test et la caractérisation de l’activité neuronale chez le groupe contrôle. Comme indiqué, les résultats du groupe contrôle seront traités même si le groupe test n’est pas continué, et complétés au fur et à mesure.
Raffinement
Plusieurs éléments de raffinement sont mis en œuvre : Recours à l’imagerie (IRM et TEP), qui se substitue pour la plupart des animaux à l’histologie post-mortem et permet d’envisager leur replacement en sanctuaire à l'issue des expériences. Utilisation de microélectrodes chroniques à contacts multiples de supprimer la phase de manipulation des électrodes et de réduire à minima les moments d’immobilisation de la tête. Les expériences seront conduites en conditions semi-éthologiques sans contrainte physique. Pré-entraînement par renforcement positif des animaux en salle de stabulation visant à réduire le temps et le stress induit par les prélèvements buccaux ou les injections. Nous utilisons des analgésiques, et anesthésiants pendant et après les chirurgies. La douleur et le comportement de l’animal sont scorés en post chirurgical, et le bien-être de l’animal est scoré de façon quotidienne. Enfin, les point limites stricts et spécifiques du projet sont déterminés et un score quotidien ou hebdomadaire est obtenu en fonction des étapes, et permet de mener les actions adéquates en fonction du score obtenu.
Choix des espèces
Notre projet utilise des singes macaques car certaines parties de leur cerveau et certains comportements sociaux que nous étudions ne se trouvent pas chez les rongeurs. Par exemple, les macaques utilisent principalement la vue pour comprendre leur environnement et montrent leurs émotions à travers leurs expressions faciales. Contrairement aux rongeurs, les macaques ont un système cérébral plus développé pour reconnaître les visages, les expressions faciales et interpréter le regard, ce qui est important pour réguler leur territoire. En utilisant des singes, nous pouvons mieux comprendre comment le cerveau traite ces informations. De plus, notre projet se concentre sur l'impact de l'ocytocine sur le comportement territorial. Chez les primates, les récepteurs de l'ocytocine sont présents dans plusieurs parties du cerveau liées à la vision et à l'attention, ce qui n'est pas le cas chez les souris. Nous allons également utiliser des techniques génétiques et pharmacologiques qui ont été efficaces chez les souris, mais qui nécessitent encore des tests chez les singes avant d'être appliquées chez l'homme. Nous travaillons avec des singes adultes car c'est à cet âge qu'ils développent un comportement territorial. Chez les macaques, les deux sexes participent à la défense du territoire. Ils vivent en groupes où plusieurs femelles cohabitent avec un mâle dominant, qui tolère quelques autres mâles. Les disputes territoriales ne sont pas seulement une question de hiérarchie, mais aussi de rivalité entre les groupes. En laboratoire, nous pouvons recréer cette situation en délimitant des "territoires" différents pour chaque groupe dans les volières.
Caractérisation d’analgésiques non-opioïdes sur un modèle inflammatoire induit par les UV
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Dépilées sur le dos sous anesthésie puis exposées vingt minutes aux ultraviolets, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer une inflammation de la peau du dos, une perte de poids et des modifications de comportement. L'objectif est de caractériser des candidats analgésiques non-opioïdes en suivant l'action des cellules immunitaires de la peau et des neurones sensoriels. Les 30 souris ajoutées aux 270 calculées le sont pour parer à une éventuelle mauvaise qualité des ARN extraits, et les tests de sensibilité mécanique pratiqués sur animaux vigiles ne sont pas nommés.
Objectifs
Les solutions actuelles pour soulager la douleur des patients ont une efficacité limitée (effet de tolérance) et des effets secondaires graves. Actuellement les traitements disponibles pour les douleurs modérées et sévères/persistantes comme les opioïdes présentent de nombreux inconvénients. Ainsi, le développement de nouveaux médicaments pouvant traiter les douleurs aiguës est donc très important et s'avère d'une utilité publique majeure. C’est dans ce contexte que nous développons plusieurs nouveaux composés pharmaceutiques qui combleraient une lacune sur le marché de la douleur. Le rôle de ces composés ont déjà été démontré dans la gestion de la douleur, ainsi que dans la réparation des tissus. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les mécanismes moléculaires mis en jeu par ces composés pour moduler l’action des cellules immunitaires dans la régulation des voies de la douleur. La peau représente la première barrière physique contre les menaces extérieures et son intégrité est orchestrée par des cellules immunitaires résidentes spécialisées réparties dans les différentes couches qui la composent. La peau contient également un réseau dense de neurones sensoriels impliqués dans la perception du touché léger et de la douleur. De récentes études montrent également que le système nerveux sensoriel peut influencer l’activité des cellules immunitaires et ainsi optimiser les défenses contre une agression extérieure. Ainsi, pour répondre a ces questions nous avons choisis le modèle de lésions cutanés induite par une exposition aux ultraviolets (UV). Nous étudierons l’activité des cellules immunitaires de la peau et des neurones du système sensoriel (DRG) dans ces souris après exposition aux UV, traités ou non avec les différents composés pour déterminer l’impact du traitement sur la réponse immunitaire et la sensibilité mécanique.
Bénéfices attendus
La douleur est un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment TAFA4 module le système immunitaire dans les processus de mise en place de la douleur est primordial pour améliorer à terme le confort des patients atteints de douleurs chroniques et approfondir la compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour le traitement de la douleur inflammatoire sans effet secondaire. Des études précliniques réglementaires de toxicologie et de sécurité ont déjà été réalisées avec un composé utilisant le même mode d’action sans mettre en évidence d’effets secondaires, ni de phénomène d’accoutumance : problèmes majeurs des analgésiques actuellement sur le marché (opioïdes, paracétamol, etc...).
Procédures
Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux UV pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons également des études de comportement pour tester la sensibilité mécanique induite par l’exposition aux UV sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux UV qui pourraient induire une perte de poids, des modifications de comportement en plus d'une inflammation de la peau du dos. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. De plus une observation approfondie est effectuée quotidiennement à l’aide de la grille d’observation (Annexe) après la mise en place du modèle inflammatoire afin de prévenir toute complication.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.
Remplacement
TAFA4 a déjà été testé pour son activité analgésique dans différents modèles de douleurs. Le recours à l’utilisation d’animaux est nécessaire pour appréhender l’effet analgésique sur ce modèle post-ultraviolets dans son contexte physiologique mettant en jeu le système immunitaire et le système nerveux sensoriel. De plus la douleur ne peut être dissociée du système biologique global de l’animal, ainsi l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Pour répondre convenablement aux réponses scientifiques soulevées, nous estimons le nombre minimal de souris nécessaires à 270 animaux, auquel nous ajoutons une marge de 30 animaux au cas où il serait nécessaire d’ajouter des animaux pour compléter l’étude (par exemple, si certains ARNs purifiés à partir des tissus prélevés n’étaient pas d’assez bonne qualité pour pouvoir réaliser l’analyse transcriptionnelle). Un total de 300 animaux est prévu pour cette étude. Ce chiffre a été déterminé après l’utilisation d’outils statistiques (logiciel GraphPad) permettant d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires avec une différence significative (p
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements complexes pour leur permettre de se comporter normalement. Les animaux sont élevés en présence d’objets permettant le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages et ainsi tous les jours l’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé. De plus, le week-end, la personne en charge du projet sera d’astreinte pour le suivi des animaux. D’autre part, le recours aux analgésiques est prévu dans le cas où l’état sanitaire des animaux le demandera (annexe grille de suivi). Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Une planification fine des procédures expérimentale sera effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation et dans l’animalerie) permettant de diminuer le stress des animaux et favoriser la validité des expériences. Notamment lors du test de la sensibilité mécanique, les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant d’effectuer les mesures afin de diminuer leur niveau de stress. Enfin l’établissement des points limites selon la grille en annexe avec un suivi quotidien consistera en une vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux avant de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids initial sera systématiquement euthanasiée. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la souris et l’Homme. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et une maturité développementale du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine
Maintenance et reparation de la myéline centrale: role d’ADAM10
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 402 souris vont être utilisées dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère, toutes tuées au plus tard deux mois après la chirurgie pour prélever leurs tissus. Chacune subit un prélèvement à la queue entre le septième et le dixième jour de vie, un traitement pharmacologique, des tests de mémorisation et de locomotion de dix minutes, et pour une partie d'entre elles une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie destinée à provoquer une lésion de la myéline. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes. Le porteur chiffre le lot expérimental entre 1 152 et 2 304 souris, sans expliquer d'où viennent les 5 402 déclarées.
Objectifs
La myéline est une substance qui entoure le prolongement des neurones et qui est responsable de la conduction nerveuse et donc de la transmission des commandes initiées par le système nerveux. La myéline est produite par des cellules appelées oligodendrocytes, localisés dans le cerveau et la moelle épinière. La perte de myéline ou d’oligodendrocytes peut survenir dans le cas de pathologies appelées maladies démyélinisantes (telle que la sclérose en plaques) ou lors de traumatismes (par ex. accidents de la route), et peuvent mener à de lourds handicaps. La formation de la myéline (myélinisation) et sa réparation (remyélinisation) sont des processus complexes qui font intervenir de nombreux mécanismes dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est de comprendre l’implication d’une protéine particulière en recherchant (1) son rôle dans la maintenance des gaines autour des prolongements neuronaux et (2) son rôle dans la réparation de la myéline chez la souris en mimant une lésion par perte myélinique. Ce projet s’appuie sur des études précédentes montrant que l’activation de ce type de molécule est capable de protéger la myéline. Pour étudier l’implication de cette protéine uniquement dans les oligodendrocytes, nous caractériserons les individus d’un point de vue macroscopique (locomotion, cognition) mais aussi microscopique (état des tissus, organes, cellules). Le projet proposé nous permettra de mieux comprendre le rôle de notre protéine dans ces maladies démyélinisantes et son potentiel régénératif. Ce projet permettra d’ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutique pour les maladies démyélinisantes, pour lesquelles il n’existe actuellement pas de traitements efficaces chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes.
Procédures
- Un prélèvement à la queue sera réalisé à l’âge de P7-10 sur l’ensemble des souris afin de vérifier leur génotype (lien de leur parenté). - Les souris seront traitées par un composé pharmacologique afin de pouvoir étudier notre protéine d’intérêt dans le processus de réparation du système neveux. - Les souris réaliseront des expériences de comportement afin de vérifier leur capacités cognitives et motrices (mémorisation, locomotion). Ces expériences sont non-invasives et non douloureuses. Elles se feront sur animal vigile et dureront chacune maximum 10 min. - Une chirurgie sera réalisée sur des souris sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. L’ensemble des animaux sera mis à mort, 2 mois maximum après la chirurgie afin de récupérer les tissus d’intérêt pour les analyser.
Impact sur les animaux
- Stress de contention dû à la préhension de l’animal lors du traitement - Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie – Troubles moteurs suite à la chirurgie (de la nourriture humide sera placée dans la cage pour éviter les déplacements de l’animal).
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue des expérimentations de chaque procédure afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
Le modèle animal que nous utilisons permet de mimer certains aspects des pathologies que nous étudions (telle que la sclérose en plaques), et pour lesquelles il n’existe pas de traitement. Ce modèle est donc nécessaire pour mieux comprendre ces maladies. Les processus de myélinisation et de réparation de la myéline impliqués dans les maladies démyélinisantes que nous étudions induisent des processus biologiques et physiologiques complexes qui nécessitent l’intervention de multiples acteurs cellulaires. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet. Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer l’inflammation et la démyélinisation, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal.
Réduction
Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique suffisante nécessaire à l’interprétation des résultats. Ce nombre a été évalué́ à partir d’études précédentes (les expériences histologiques et biochimiques nécessitent au moins 6 animaux et les expériences comportementales en nécessitent au moins 10). Ces précautions permettent de limiter les variations inter-individuelles et d’aboutir à des conclusions rigoureuses. Les animaux issus des études comportementales seront ensuite utilisés pour les études des tissus prélevés, nous évitant ainsi d’avoir recours à de nouveaux lots de souris dédiés à cette analyse. De plus, plusieurs tissus d’intérêt seront prélevés sur chaque souris, permettant encore de réduire le nombre d’animal utilisé. Dans le cas où nos premiers résultats ne montreraient pas d’effet d’OLA10 dans la réparation de la myéline, la procédure serait abandonnée. Nous envisageons donc de commencer par des expériences pilotes avec un nombre réduit de souris. Si les résultats sont concluants, les données seront complétées et approfondies en utilisant la totalité des groupes expérimentaux prévus. Ainsi, le lot expérimental serait constitué d’un minimum de 1152 souris, et d’un maximum de 2304. Les animaux contrôles utilisés dans nos procédures sont indispensables pour établir des comparaisons fiables et tirer des conclusions précises. Ces animaux nous permettront de contrôler les variables externes, d’éliminer les biais et de mesurer les effets de nos traitements en les comparant aux groupes expérimentaux. Ils renforcent ainsi la validité de nos conclusions.
Raffinement
Un suivi particulier du bien-être des animaux soumis à la chirurgie sera mis en place et une prise en charge de la douleur sera utilisée si nécessaire. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique post-chirurgical et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà̀ du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité́, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisément d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec l’Homme, en particulier au niveau génétique et neurologique. Elles constituent des modèles de choix pour (1) étudier les mécanismes des pathologies neurologiques humaines et (2) explorer des traitements potentiels de manière pertinente pour ces maladies. Les souris sont des organismes modèle bien établis en recherche biomédicale, et offrent une capacité élevée de reproduction et de cohérence dans les résultats expérimentaux, permettant des interprétations fiables et de tirer des conclusions robustes. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de notre molécule d’intérêt et l’état de la myéline (affectée dans la pathologie étudiée) sont très bien adaptées chez la souris. Les animaux sont utilisés à l’âge d’au moins 7 semaines car il est connu que le processus de myélinisation est terminé à cet âge, ce qui nous permet d’étudier la maintenance de la myéline une fois les gaines achevées autour des prolongements de neurones. De plus, la perte de myéline survient principalement chez le jeune adulte, que ce soit lors de maladies démyélinisantes telle que la sclérose en plaques, ou lors de traumatismes mécaniques type accident de la voie publique. L’âge choisi pour notre modèle permettra donc de mimer au mieux les lésions médullaires survenant chez l’Homme et d’en étudier le processus de réparation. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de ce modèle animal, et ce à l’âge choisi.
Etude de l’impact d’une exposition fœto-maternelle au chlordécone sur le système nerveux nigro-strié de la souris et lien avec les syndromes Parkinsoniens – EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Seize heures sans nourriture avant un test d'olfaction de dix minutes : 96 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance légère, toutes tuées par perfusion intracardiaque pour prélever leur système nerveux central. Quarante-huit subissent trois tests comportementaux nommés, motricité fine, olfaction, anxiété et motricité générale, le premier répété jusqu'à six fois. Les quarante-huit autres partent vers un second établissement pour une heure d'imagerie cérébrale sous anesthésie, dont six minutes de stimulation visuelle et trente-cinq minutes de stimulation pharmacologique. Le projet cherche à savoir si le chlordécone, insecticide interdit dans les années 90 mais toujours présent aux Antilles, favorise les syndromes parkinsoniens, le porteur écartant les organoïdes qu'il juge "prometteurs mais pas encore développés au laboratoire".
Objectifs
Le chlordécone est un insecticide organochloré utilisé aux Antilles pour lutter contre le charançon noir, un insecte ravageant les bananeraies. Compte tenu notamment de sa neurotoxicité à des doses élevées cet insecticide a été interdit dans les années 90. Malheureusement, cet insecticide est très persistant et a contaminé durablement l’environnement, les animaux et la population Antillaise. Pour l’heure les effets neurologiques éventuels d’une exposition à long terme sont mal connus. Toutefois, plusieurs éléments suggérant un effet délétère existent, notamment sur le neuro-développement chez les jeunes garçons nés de mères exposées. De plus, l’heptachlore, un autre insecticide organochloré à l’origine d’une contamination environnementale et humaine à Hawaï a un effet délétère chez la souris dans les régions du cerveau atteintes lors de la maladie de Parkinson et a été associé à des lésions cérébrales chez l’homme. L’objectif scientifique du projet est l’étude de l’effet sur la viabilité et la physiologie des neurones du système nerveux central chez des souris après une exposition au chlordécone par voie alimentaire chez la souris adulte d’une part et d’autre part après une exposition au chlordécone au cours de la période foeto-maternelle. Il s’agit d’un projet multisite qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La finalité de ces approches est d’évaluer un lien potentiel entre une exposition au chlordécone et le déclenchement ou l’accélération de la maladie de Parkinson et de documenter les évènements physiopathologiques associés à ce mode d’exposition.
Procédures
Dans l’établissement utilisateur 2 : l’Imagerie cérébrale est réalisée une fois sur 48 animaux : elle est réalisée sous anestésie générale. La procédure complète dure environ 1 heure et comprends 6 minutes de stimulation visuelle et 35 minutes de stimulation pharmacologique via une injection intra-péritonélae. Dans l’établissement utilisateur 1 : les 48 autres animaux sont soumis à trois tests comportementaux : le premier test mesurant la motricité fine dure 10 minutes et est répété 6 fois (3 habituations et 3 tests) ou 2 fois (1 habituation et 1 test) selon le groupe d’étude, le second test évaluant les capacités d’olfaction dure 10 minutes (après une privation de nourriture de 16 heures) et est répété 2 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude et le dernier test mesurant l’anxiété et la motricité générale dure 15 minutes et est répété 3 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude.
Impact sur les animaux
Une procédure expérimentale similaire a déjà été mise en oeuvre au laboratoire sur une durée de 4 mois mais à l’aide d’une exposition par injection intrapéritonéale et aucun signe de souffrance n’a été détecté, pas de perte de poids ni de décès chez les souris mâles exposées. Les modalités d’exposition sont présumées ne pas induir d’effets indésirables. L’ensemble des interventions sont susceptibles d’engendrer des nuisances de classes légères aux animaux : -Les tests comportementaux peuvent potentiellement induir un stress pour les animaux -Les perfusions intra-cardiaque représentent un risque de souffrance lors de l’injection des produits anésthésiants -Le transport des animaux vers le second etablissement utilisateur peut induir un stress -L’anesthésie, la contention et la stimulation chimique lors de la réalisation de l’imagerie cérébrale peuvent induir à la fois un stress de l’animal et de la souffrance
Devenir
L'objectif de ce projet est l'étude de l'effet neurotoxique du chlordécone, pour ce faire il est nécessaire d'euthanasier les animaux afin de disposer du système nerveux central.
Remplacement
A ce jour, le remplacement complet de ce modèle d’étude n’est pas envisageable. Il existe des modèles d’étude utilisant des lignées de cellules neuronales mais ces derniers ne permettent pas d’étudier l’effet d’une exposition sur les interconnexions neurales ou l’impact sur les cellules gliales. Des travaux plus récent proposent l’utilisation d’organoïdes, ces approches sont prometteuses mais pas encore dévelopées au laboratoire.
Réduction
Le nombre de souris est réduit jusqu’au nombre d’animaux minimal permettant d’attendre des résultats statistiquement significatifs dans les différentes approches proposées.
Raffinement
Conformément aux exigences de raffinement, les expérimentations ont été optimisées afin de réduire la douleur au minimum, les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans un environnement enrichi. En début de procédure, à la réception des animaux au laboratoire, un temps d’acclimatation d’environ 2 semaines est respecter. Un temps d’acclimatation est également respecté lors du transfert des animaux dans le second établissement utilisateur. Pour les animaux soumis aux tests comportementaux une étape d’habituation est également prévue. De plus, le personnel est attentif à la planification de ces tests afin de ne pas soliciter plus de 3 fois les animaux dans la même semaine. Cette alimentation supplémentée en Chlordécone n’a jamais été utilisée dans notre laboratoire en conséquence la quantité de nourriture ingérée par cage chaque semaine sera monitorée en plus du suivi du poids des animaux afin d’identifier le plus tôt possible un défaut d’appétence des croquettes
Choix des espèces
Les souris utilisées sont des souris conventionnelles C57Bl/6, cette lignée de souris est fréquemment utilisée dans les études du système dopaminergique. En effet, la physiologie de cette population neuronale est proche de celle de l’espèce humaine et la taille de sa population autorise des dénombrements précis. Par ailleurs cette lignée a déjà été utilisée dans notre laboratoire, nous pourrons ainsi comparer les résultats obtenus avec nos premiers résultats après deux et quatre mois d’exposition par injection intra-péritonéale. Le projet prévoit d’utiliser des souris adultes à l’âge de 2 mois au début du protocole d’exposition, ceci nous permettra de comparer les résultats de cette voie d'exposition avec notre projet précédent dans lequel les souris avaient subi une exposition similaire mais par voie intrapéritonéale. Le deuxième groupe d'animaux est constitué de souris exposées tout au long de la période de gestation et maintenues soit jusqu’à la fin de la période de sevrage soit jusqu'à l'âge de 2 mois. Cette partie du projet permettra d'obtenir des données quant à l'effet d'une exposition au chlordécone au cours de cette période du dévellopement.
Etude de la mitophagie dans un modèle murin de SLA/DFT
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Baguées à l'oreille et biopsiées à la queue dès le plus jeune âge, 1 122 souris porteuses d'une mutation de sclérose latérale amyotrophique avec démence frontotemporale sont ensuite laissées vieillir sans autre intervention, dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère. Leur prise de poids décroche dès trois mois. Entre dix et quatorze mois apparaissent la perte de poids, la baisse de mobilité et les tremblements, jusqu'au stade que le porteur retient comme final. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, le seuil déclenchant la mise à mort étant une perte de poids supérieure à 15 % ou l'incapacité à se retourner sur soi en moins de quinze secondes.
Objectifs
La maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique) et la démence frontotemporale sont des maladies neurodégénératives conduisant à la mort des motoneurones (= neurones situés dans la moelle épinière, innervant et commandant les fibres musculaires). Ces deux pathologies présentent un spectre clinique commun, 50% des patients atteints de sclérose latérale amyotrophique développent une démence frontotemporale, 15% des patients atteints de démence frontotemporale présentent des signes de sclérose latérale amyotrophique. Précédemment, une mutation sur le gène d'une protéine de la mitochondrie (= petit organite qui a un rôle essentiel dans les processus énergétiques cellulaires) a été identifiée chez des patients souffrant d'une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale. Parmi tous les facteurs impliqués dans le processus conduisant à la sclérose latérale amyotrophique, un dysfonctionnement des mitochondries a toujours été envisagé comme un acteur majeur de cette pathologie. Mais, l'identification d'une mutation dans un gène codant pour une protéine de la mitochondrie fut la 1ère preuve génétique démontrant le rôle primaire des mitochondries dans des atteintes du motoneurone. L'objectif général de notre projet de recherche est de comprendre comment la mutation de ce gène codant pour une protéine de la mitochondrie conduit à la mort des motoneurones. Pour cela, nous devons caractériser la séquence des évènements reliant l'atteinte des mitochondries à la mort des motoneurones. L'étude du modèle murin présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale suggérait une implication du processus de mitophagie (processus de mort permettant l'élimination des mitochondries anormales) dans différents organes. Ces souris ont été croisées avec des souris permettant de quantifier la mitophagie (la mitophagie est visualisée sous forme de points rouges en microscopie). Nous avons ainsi pu observer une augmentation de la mitophagie dans différents organes chez ces souris comparées à leurs souris contrôles. La poursuite de ce projet aura pour objectifs de 1/ caractériser le rôle de la mitophagie dans l'atteinte du motoneurone et 2/ établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans la séquence des évènements conduisant à la mort des motoneurones.
Bénéfices attendus
Actuellement, la maladie de Charcot et la démence frontotemporale ne présentent pas d'option thérapeutique, il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail permettra de déterminer si le ciblage du processus de mitophagie peut être une piste thérapeutique intéressante dans le traitement des atteintes du motoneurone associées à un dysfonctionnement mitochondrial.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, l'identification des animaux nécessitera la pose d'une bague à l'oreille et d'une biopsie au niveau de la queue ou de l'oreille. Pour les procédures 1 et 2, les animaux seront élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement et ne seront soumis à aucune autre intervention avant la mise à mort des animaux. Pour la procédure 3 (240 animaux), les animaux seront également élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement. Au moment de la mise à mort des animaux, une injection intrapéritonéale d'une solution analgésique sera effectuée, suivie 15 minutes plus tard d'une deuxième injection intrapéritonéale d'une solution anesthésique. Deux injections en intrapéritonéales seront donc réalisées pendant la durée de vie de la souris.
Impact sur les animaux
Les souris présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale présenteront un phénotype dommageable conduisant à la mort des animaux. Les animaux présenteront : - une prise de poids diminée par rapport aux souris contrôles dès l'âge de 3 mois, - une diminution du poids et/ou une diminution de la mobilité des animaux et/ou la présence de tremblements à un stade plus avancé de la vie de l'animal (autour de 10 à 14 mois). L'identification des animaux (pose d'une bague et biopsie) entrainera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Les animaux étudiés présentent un phénotype de maladie neurodégénérative (sclérose latérale amyotrophique et démence frontotemporale) nécessitant la mise à mort des animaux afin de prélever les organes pour les analyser.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences in vitro ont été réalisées précédemment sur des cellules en culture à partir de fibroblastes primaires issus des patients porteurs de la mutation d'intérêt et à partir de motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites exprimant la mutation d'intérêt. Des expériences sur les motoneurones continueront à être menées. Néanmoins, bien que ces modèles cellulaires issus des patients présentent un potentiel important pour rempacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant une pathologie touchant plusieurs organes, seul un modèle animal permettra d'étudier les conséquences multiples du processus de mitophagie dans les différents organes et surtout d'établir une cinétique (à des âges différents) permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones.
Réduction
Dans un but de réduction, nous utiliserons des modèles cellulaires (notamment des motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites) pour étudier le rôle de la mitophagie dans la mort des motoneurones. Ces expériences nous permettront de répondre à certaines questions scientifiques et ainsi de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet. Afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs, nous aurons besoin de 15 animaux par expérience et par génotype.
Raffinement
Dans un but de raffinement, un suivi hebdomadaire du poids sera réalisé et une fiche de score sera utilisée pour assurer un suivi optimal de chaque animal. Cette fiche de score a été établit en lien avec le phénotype attendu de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et a été précédemment utilisée pour le suivi de ces souris. Les animaux seront observés hebdomadairement, ce qui permettra d'identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant associé à une perte de poids, les animaux seront pesés une fois par semaine. Lorsqu'une perte de poids sera observée, une surveillance accrue de l'animal sera réalisée (2 fois par semaine ou tous les jours suivant le pourcentage de perte de poids), de l'eau et de la nourriture gélifiée seront également ajoutés dans la cage. Lors de cette surveillance hebdomadaire, une attention particulière sera portée sur la mobilité (affaiblissement des membres inférieurs ou tremblements) et sur le comportement des animaux. L'environnement de l'animal sera enrichi par ajout d'un igloo en papier mâché et de carrés de ouate ou de tissu compressé (pour permettre à l'animal de se faire un nid à l'abri de la lumière), ainsi que de batonnets en bois (pour permettre à l'animal de ronger) dans chaque cage.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) présente des similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, permettant dans la mesure du possible d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. De plus, elle présente un cycle de vie court et un cycle de reproduction avec une natalité importante. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser les analyses protéique, génomique et histologique nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, les modèles murins utilisés sont des modèles spécifiques déjà établis et caractérisés (modèle de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et modèle permettant de quantifier la mitophagie in vivo). Aucun autre modèle ne peut donc être utilisé. Les animaux seront utilisés à 4 stades de développement : - stade correspondant à l'atteinte finale de la maladie (= soit perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution de poids, soit un affaiblissement partiel de l'extension des pattes ou tremblements, associé à une incapacité pour la souris de se retourner sur elle-même lorsqu'elle est sur le flanc en moins de 15 secondes) - stade d'apparition des 1ers signes cliniques = 3 mois de vie - stade intermédiaire = 6 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones) - stade intermédiaire = 9 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones)
Sensibilité ghréline chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
652 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever tissus et sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Cent douze d'entre eux subissent une immobilisation forcée quatre heures par jour pendant six jours consécutifs pour reproduire un syndrome dépressif, cent douze autres reçoivent des injections répétées d'une substance psychoactive pour reproduire une addiction, quatre cent quarante-huit sont saignés à l'état vigile et quatre-vingts passent sur la table d'opération. Le porteur qualifie le modèle animal d'"incontournable" pour étudier l'exposome, au motif que le comportement et la physiologie intégrée ne s'observent pas in vitro. Le bénéfice avancé se limite à la possibilité de proposer un jour une stratégie thérapeutique agissant sur la ghréline.
Objectifs
La ghréline est une hormone produite par l’estomac capable d’influencer notre métabolisme ou le fonctionnement de notre cerveau. En particulier, cette hormone semble jouer un rôle prépondérant suite à l’expositions chronique à différents types de stress de notre environnement (stress, physiques, sociaux, chimiques ou nutritionnels), notre « exposome ». Or l’exposome est connu pour favoriser le développement de nombreuses maladies communes de cerveau ou du métabolisme. Ainsi, modifier génétiquement les effets de la ghréline chez l’animal pourrait être un moyen de tester la vulnérabilité des animaux à différents types de stress chroniques. Notre stratégie qui s’appuie sur des approches génétiques et pharmacologiques vise à raffiner les connaissances sur les moyens de moduler les effets de la ghréline sur le cerveau et à tester les liens entre effets ghréline et vulnérabilité de l’organisme à différents types d’exposomes.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de clarifier les mécanismes mis en jeu par une hormone, la ghréline, au cours de l’exposition d’un organisme à différents types de stress chroniques. Enfin, ce travail pourrait permettre de proposer une stratégie thérapeutique pour moduler les effets de la ghréline au bénéfice de la santé mentale.
Procédures
80 rats auront une procédure chirurgicale de 20-30 mins sous une anesthésie générale de 45 mins. 448 rats recevront des prélèvements de sang à l’état vigile. 112 rats seront soumis à un protocole de d’injections répétées par substance psychoactive (4 injections sur 8 jours). 112 rats seront soumis à un protocole de stress répété (4h par jour pendant 6 jours consécutifs). Enfin 320 rats recevront des injections répétées d’analogues de la ghréline sur deux semaines et 108 rats recevront des injections répétées pour évaluer leur homéostasie glucidique.
Impact sur les animaux
Tous les rats de l’étude subiront l’inconfort et des douleurs légères liés à des injections et des prélèvements de gouttes de sang. De plus, un groupe de rats sera soumis à une approche chirurgicale, les possibles douleurs post-opératoires seront pris en charge par un protocole adapté : injections d'anti-inflammatoire et une récupération post-chirurgicale sous surveillance pour détecter toute perte de poids ou d'autres problèmes de santé ou de bien-être. Un groupe de rats développera une souffrance psychique suite à l’injection répétée d’une substance psychoactive pour mimer une addiction. Enfin, un dernier groupe de rats subira un stress d’immobilisation forcée répété plusieurs jours pour mimer un syndrome dépressif.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l’issue des procédures pour des prélèvements de tissus et de sang pour mener des études moléculaires et hormonales.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, qui vise à modéliser l’émergence de pathologies humaines en lien avec l’Exposome, l’usage d’un modèle animal est incontournable. En effet, ce type de projet ne peut en aucun cas être remplacé par des expériences in vitro puisque nous avons besoin d’examiner des paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. A cet égard, l’allèle muté utilisé chez le rat remplit tout les critères requis pour le projet.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Lorsque cela a été possible, des protocoles croisés d’injections de composés/doses ou des injections séquentielles ont été prévus, ce qui a permis de réduire considérablement le nombre d’animaux requis. Enfin, nos résultats non publiés décrivent des réponses ghréline exagérées chez les rats mutants des deux sexes. En conséquence, les groupes expérimentaux de notre projet comportent des lots d’expérimentaux d’effectifs plus petits car composés de rats des deux sexes.
Raffinement
Notre projet d’étude porte sur la vulnérabilité aux stress environnementaux de tout type à travers le prisme de la signalisation ghréline. En conséquence le soin apporté aux animaux, requis éthiquement l’est également au plan scientifique. En conséquence, le bien être animal de l’élevage à la constitution des lots expérimentaux jusqu’à l’exécution des protocoles expérimentaux est déterminant. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par un tunnel et la vie en communauté. Le contrôle de l’approvisionnement en eau et nourriture et assuré par les zootechniciens agréés. Lorsque le protocole expérimental est lancé, l’équipe de recherche prend le relais et le suivi de chaque rat se fait plus intense selon le protocole (manipulation régulières, suivi du poids corporel) qui permettent d’individualiser le suivi de chaque animal tout au long du protocole jusqu’à la mise à mort. Ainsi, toute altération de l’état d’un animal attendue (post-chirurgical) ou inopinée est prise en charge selon les point limites établis pour discriminer un évènement transitoire d’un évènement plus rare qui s’aggrave et qui conduira à une sortie du protocole et à l’euthanasie. Au total, ce type de suivi permet de combiner bien-être animal avec résultats scientifiques valides.
Choix des espèces
L’ensemble des procédures seront basées sur ce modèle unique de gain de fonction dans le récepteur ghréline chez le rat. Le rat possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. Il est idéal pour les études physiologiques du fait de sa volémie plus élevée que celle de la souris (prélèvement sanguins répétés). Enfin, le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés et ainsi modéliser des maladies du cerveau. Les animaux utilisés seront des rats adolescents ou de jeunes adultes (6-10 semaines).
Effet de l’exercice physique sur la neurodégénérescence chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la queue sur tous les souriceaux, six à huit injections intrapéritonéales, deux injections sous-cutanées, une à deux chirurgies intracrâniennes de quarante minutes à une heure trente, et la coupe des moustaches pendant les périodes d'enregistrement : 1 656 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Une partie l'est plus tôt, faute de porter le génotype recherché. Le projet cherche à comprendre comment l'activité neuronale et l'exercice physique, volontaire ou avec apprentissage moteur, favorisent la production de myéline. Sur la réduction, le porteur écrit limiter le nombre d'animaux "au strict minimum" sans donner de calcul, et l'effectif de 1 656 ne reçoit aucune justification chiffrée.
Objectifs
La myéline est une substance isolante qui entoure les prolongements des neurones du cerveau. Dans certaines maladies, la myéline peut être attaquée et détruite par les cellules du système immunitaire. A terme, les prolongements des neurones dénudés de myéline finissent par mourir. Cependant, bien que la capacité régénérative du cerveau soit limitée, une régénération de la myéline est possible dans certaines maladies comme la sclérose en plaques. Malheureusement, cette régénération est incomplète. Le but de ce projet est de déterminer comment l'activité neuronale et l’exercice physique favorisent la production de myéline quand celle-ci est diminuée dans le cerveau. Nous étudierons la capacité à produire de la myéline en réponse à une augmentation de l'activité neuronale et à un type d'entrainement physique qu'il soit simple (exercice volontaire) ou complexe (apprentissage moteur) sur des modèles présentant une baisse de myéline.
Bénéfices attendus
A terme, l’identification des mécanismes biologiques sous-tendant une meilleure production de la myéline peut être très important pour développer des thérapies non-invasives dans des maladies comma la sclérose en plaques.
Procédures
Tous les souriceaux sont soumis à une biopsie caudale afin d'effectuer un génotypage. Nous prévoyons sur un premier groupe d'animaux un traitement alimentaire spécifique, 6 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et deux chirurgies. Celles-ci durent entre 40 min et 1h30. Ces animaux seront imagés lors d'un exercice physique simple, un exercice impliquant un apprentissage moteur ou en contrôle. Leurs moustaches seront coupées pendant la période d'enregistrement. Un autre groupe de souris recevra le même traitement alimentaire et seront injectées 8 fois. Dans un troisième groupe d'animaux, nous prévoyons le même traitement alimentaire spécifique, 6 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et une chirurgie. Leur moustachese seront coupées pendant la période d'enregistrement lors d'un exercice physique simple, un exercice impliquant un apprentissage moteur ou en contrôle. Enfin, les animaux restants recevront 7 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et deux chirurgies.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales et sous-cutanées (nuisance légère), la coupe des vibrisses (nuisance légère), les anesthésies (nuisance légère) et les chirurgies intracrâniennes (nuissances modérées) vont induire un stress et une possible douleur. Les nouveaux-nés subiront un stress léger lié à la contention et une douleur légère liée à la biopsie de la queue.
Devenir
Certains animaux sont mise à mort car ils sont sans génotype d’intérêt pour le projet. Tous les autres animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de pouvoir collecter leur cerveau.
Remplacement
Notre compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies telles que la sclérose en plaques sera toujours insuffisante si ces mécanismes ne sont pas induits et analysés dans leur milieu naturel complexe. En étudiant les différentes composantes de façon isolée, de nombreux effets émergents de l'activité neuronale et des interactions cellulaires seront obligatoirement négligées. L’utilisation de l’animal est donc primordiale pour obtenir des résultats qui puissent avoir un véritable impact dans le développement de nouvelles thérapies chez l’homme. Les souris sont le seul modèle permettant d'étudier l'effet du comportement animal sur la myéline en temps réel.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux sera réalisée en limitant ce nombre au strict minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifiquement fiable. Les expériences seront arrêtées si des analyses intermédiaires permettent d’atteindre la significativité statistique. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés, pour comparaisons multiples ou données suivies selon les cas.
Raffinement
Lors des actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et reçoivent des analgésiques en pré- et post-opératoires par voie locale et sous-cutanée. Après l’opération, un apport de fluide est effectué pour réhydrater l’animal, puis celui-ci est placé dans une enceinte chauffée jusqu’à son réveil complet. De la nourriture est placée dans la cage d’hébergement afin de faciliter la récupération; la surveillance des animaux est renforcée afin d’éviter toute souffrance; les animaux sont observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites est utilisée. Tout signe de douleur est soulagé avec des analgésiques.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées chez des souris génétiquement modifiées. La souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler de types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Pour le génotypage et les biopsies, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours, âge a quel il est possible de tatouer les coussinets des phalanges. L'expérimentation est menée sur des animaux adultes entre 2 à 5 mois ce qui nous permet de faire nos protocoles et traitements.
Etude des mécanismes de sensibilisation nociceptive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
À cinq jours de vie, des souriceaux reçoivent dans le cerveau une substance qui détruit leurs neurones dopaminergiques. À vingt et un jours vient une chirurgie d'implantation de deux heures, à quarante-neuf jours une restriction alimentaire de cinq jours, à cinquante-trois jours un enregistrement électrophysiologique de la moelle épinière de trois à cinq heures. 6 050 souris vont être utilisées ainsi, dont 3 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour étudier comment l'anxiété et le trouble de l'attention amplifient la douleur, certaines recevant en plus une injection articulaire qui provoque une arthrite. Le porteur annonce une évaluation comportementale sans préciser quels tests seront conduits, affirme que ses travaux "permettront de développer des traitements efficaces", et toutes les souris sont tuées pour vérifier au microscope les coordonnées des injections.
Objectifs
Nous nous intéressons à la régulation de la nociception dans le cerveau et à ses effets sur l’intégration sensorielle dans la moelle épinière. La nociception est une douleur déclenchée par une agression de l'organisme elle est ensuite intégré par le système nerveux central et périphérique dont la moelle épinière. Nous étudions en particulier les dysfonctionnements cérébraux qui caractérisent certaines pathologies émotionnelles et psychiatriques et qui sont aussi responsables de douleurs. A ce titre, nous nous intéressons aux anomalies sensorielles fréquemment décrites en clinique dans des conditions d’anxiété pathologique, ou dans les troubles de l’attention et de l’hyperactivité, avec ou sans impulsivité (TDAH). Plus précisément, nous cherchons à comprendre le rôle de différents systèmes moléculaires dans l'activité de certaines régions corticales et dans le développement de la douleur et des symptômes du TDAH. Dans ce but, nous combinons des approches méthodologiques variées pour étudier les comportements et pour analyser l’activité des populations neuronales impliquées
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude concernent le traitement de la douleur, et en particulier des douleurs associées à des pathologies anxieuses ou au TDAH. Au-delà d'un inconfort temporaire. la sensibilisation chronique à la douleur provoque une dégradation générale de la qualité de vie et entraîne un coût économique très important (arrêt de travail, consultations médicales, prise en charge complexe des patients). Cette sensibilisation amplifie à son tour les symptômes du TDAH et de l'anxiété et contribue à la mise en place d'un cercle vicieux qui aggrave les conditions médicales des patients. Nos études permettront de développer des traitements efficaces car ils empêcheront les interactions entre ces pathologies et les douleurs, et bloqueront l'aggravation mutuelle des symptômes. L’innovation consiste à étudier des circuits, ou des systèmes moléculaires, qui interviennent à la fois dans ces pathologies neuropsychiatriques et dans la douleur. Ce sont les mécanismes moléculaires partiellement communs aux douleurs et aux troubles neuropsychiatriques associés qui seront la cible des traitements à développer.
Procédures
Chirurgie et implantation à l’âge adulte à 21 jours (2heures), injection cérébrale et injection de substance qui induit la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques chez les souriceaux à 5 jours (30minutes), restriction calorique à 49 jours (pendant 5 jours), imagerie et enregistrement électrophysiologique sur la moelle épinière à la fin de la procédure à 53 jours (3-5heures)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ Un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ Arthrite si injection dans l’articulation, dans le cas du projet ça provoque de l’inflammation locale. 3/ Un risque stress comportemental et stress alimentaire 4/Un risque de perte de poids et d'hypothermie à cause de l'injection de la 6-OHDA
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour collecter les tissus pour les analyses histologiques et la vérification des coorodonées des injections et l'histologie des tissus
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Pour vérifier et valider le concept du projet dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Le recours au modèle animal est indispensable car ce projet demande une évaluation comportementale et aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies étudiées
Réduction
Dans cette étude, la réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique (hétérogénéité inter-individuelle), le nombre de souris utilisées dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe. Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés
Raffinement
Tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse comme indiqué lors des procédures et un anti-douleur sera administré avant et après chirurgie pour éviter les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement et des traitements vétérinaires si besoin. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur bien-être sera contrôlé par la cellule de bien-être de l’animalerie. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Des points limites sont définis pour éviter la souffrance des animaux. Dans toutes les procédures où cela sera possible, un antalgique sera donné. Pour les autres procédures, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne renforcée, et les points limites définis permettront de maîtriser cette douleur.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de P0 semaines à 3 semaines. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Elevage de lignées murines transgéniques avec génotypage par méthodes invasives
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Nées de lignées transgéniques entretenues pour alimenter d'autres projets, 50 764 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées de souffrance légère. Entre le septième et le douzième jour de vie, chacune est tatouée aux phalanges ou aux coussinets et subit l'ablation de l'extrémité de la queue pour le génotypage, les deux gestes enchaînés sous contention et sans anesthésie. Le porteur présente le tatouage comme un moyen "de ne pas mutiler les animaux" et retient la biopsie caudale notamment parce qu'elle évite l'anesthésie. 40 000 de ces souris passeront dans d'autres autorisations de projet, les autres sont tuées selon leur génotype, dès le sevrage si aucune utilisation n'est possible, plus tard si elles servent à l'élevage et deviennent trop âgées ou "mauvais reproducteurs".
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Ces animaux sont identifiés par marquage et caractérisés à l’aide d'une biopsie (prélèvement de tissus). Cette demande d'autorisation de projet pour l'identification des animaux et le prélèvement de tissus se justifie par la nécessité de sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes de projet) ; sélectionner les animaux d'entretien des élevages ; sélectionner les animaux pour : • le maintien des compétences, • les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo.
Bénéfices attendus
La biopsie est une étape nécessaire pour déterminer quels sont les animaux dont le profil ADN est pertinent pour mener à bien les expérimentations, dans le but de trouver des thérapies innovantes qui puissent être transposées en recherche clinique. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux de cette DAP seront soumis à deux gestes techniques invasifs qui sont réalisés ensembles: 1/ l'identification par tatouage digital: 1 fois, durée de quelques secondes 2/ biopsie de queue: 1 fois, durée de quelques secondes
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress.
Devenir
A l'issue de cette unique procédure, le devenir des animaux est différent selon leur génotype: a/- ils sont prévus pour expérimentation, formation ou maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP): utilisation continue b/- ils sont sélectionnés pour entretien des colonies, puis mis à mort lorsque trop âgés ou mauvais reproducteurs c/- ils sont utilisés ex vivo, donc mis à mort avant utilisation d/- ils sont mis à mort dès sevrage si aucune utilisation possible au vu de leur génotype e/- ils sont mis à mort à tout moment si atteinte d'un point limite.
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’EU établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’EU. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté à jour de ses formations et qui ont un bon regard sur les points limites découlants de ces gestes. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté en respectant les conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Ces cages sont enrichies avec des palets de Woodwool qui permettent au souris de nidifier et de se cacher. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
Au sein de notre EU les équipes de recherche utilisent le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Les animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 de manière à cibler l'orientation des animaux avant sevrage.
Caractérisation des effets aigus de l’inhalation de protoxyde d’azote sur l’activation des voies monoaminergiques et l’équilibre glutamate/GABA chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux heures de chirurgie cérébrale par animal, pour implanter des fibres optiques après injection intracérébrale : 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique des douleurs, un inconfort, une perte de poids possible et une mobilité réduite les deux jours suivant l'opération. Elles inhalent ensuite du protoxyde d'azote ou un gaz témoin, dans une boîte en plexiglas qu'il qualifie lui-même d'anxiogène, pour observer en direct l'activité de leurs neurones et clarifier les mécanismes d'un gaz déjà employé en clinique psychiatrique. Le choix de la souris repose sur des homologies avec l'humain dans l'organisation des systèmes de neurotransmission, et sur le fait que la technologie d'imagerie n'est validée que dans cette espèce.
Objectifs
Outre la souffrance engendrée, l’impact socio-économique croissant des maladies psychiatriques liées au stress telles que la dépression et le trouble de stress post-traumatique est particulièrement important. La découverte de nouveaux traitements efficaces, sûrs et d’action rapide pour lutter contre ces troubles psychiatriques est donc toujours un enjeu majeur, en particulier devant l’efficacité toute relative des traitements actuels. Récemment, certaines études cliniques ont pu montrer que l’exposition au protoxyde d’azote (gaz hilarant) induisait une amélioration clinique des symptômes de la dépression dans les heures suivants l’exposition et maintenue au moins 2 semaines voire plusieurs mois pour certains patients. Si la littérature est moins abondante, certaines études suggèrent également un potentiel effet facilitateur de l’exposition au protoxyde d’azote sur la réduction des mémoires intrusives liées au trauma, conférant un intérêt certain pour le traitement du trouble de stress post-traumatique. Si cette efficacité doit continuer d’être documentée en clinique, il est egalement important de clarifier les mécanismes neurobiologiques susceptibles de participer aux effets thérapeutiques ou indesirables du traitement dans un cadre expérimental contrôlé. Malgré son utilisation en routine comme agent anesthesique et anxiolitique, les mécanismes d’action du protoxyde d'azote sont en effet assez méconnus. L’objectif de ce projet sera donc d’appliquer, pour la première fois, une technique d’imagerie cellulaire in vivo chez l’animal éveillé afin de caractériser comment l’exposition aigue à ce gaz modifie l’activité des neurones responsables de la libération des principaux neurotransmetteurs du cerveau. Cette étude pilote est importante car elle conditionnera la faisabilité d’études futures utilisant les mêmes outils dans un contexte pathologique.
Bénéfices attendus
Bien qu’utilisé en routine dans certaines applications médicales comme calmant et anesthésique, l’effet du protoxyde d’azote sur le système nerveux central reste très mal caracterisé. Cette étude sera la première a implémenter une technologie d’imagerie cellulaire in vivo pour apporter des réponses claires sur les effets aigus de cette molécule, en particulier sur les principaux neurotransmetteurs du cerveau. Par ailleurs, étant donné que le protoxyde d’azote commence à être utilisé dans des protocoles de recherche clinique afin d’étudier ses propriétés antidépressantes, il est fondamental de mieux connaitre ce fonctionnement. A la fois pour informer sur les mécanismes neurobiologiques susceptibles de participer à cette action therapeutique, mais également sur les dangers potentiels de cette utilisation, ce qui est difficile à anticiper sans une idee claire de son action centrale.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à des injections intracérébrales et à l’implantation de fibres optiques sous anesthésie générale, l’intervention durant environ 120 minutes.
Impact sur les animaux
- Injections intra-cérébrales et implantations de fibres optiques : la chirurgie est susceptible d’induire douleurs physiques et inconfort chez l’animal, avec perte potentielle de poids et mobilité réduite dans les 2 jours qui suivent la procédure (pour l’implantation de la fibre optique, l’injection seule étant bien tolérée). Les animaux récupèrent cependant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) sont faibles : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sans encombre sur l’animal mobile et éveillé sans gêne majeure.
Devenir
Les animaux expérimentaux seront euthanasiés à l’issue des enregistrements mesurant les effets de l'exposition au gaz témoin ou au protoxyde d'azote en vue du prélevement des cerveaux afin de réaliser des marquages cellulaires.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des systèmes de neurotransmission et les structures cérébrales visées dans le projet.
Réduction
Les effectifs (65 par groupe et par sexe, soient 260 au total) ont été calculés pour garantir la fiabilité statistique de nos conclusions . Ces effectifs prennent par ailleurs en compte qu’il faut mitiger les déviations potentielles des coordonnées ciblées lors des implantations et des injections cérébrales, correspondant à un taux de succès de 75%.
Raffinement
En plus des normes en vigueur, l'hébergement des souris sera enrichi avec des buchettes en bois et du matériel de nidification additionnel. En ce qui concerne les chirurgies stéreotaxiques, les soins pré- et post-opératoires sont bien établis afin de minimiser les risques de porter atteinte au bien-être de l’animal (antalgie, anesthésie locale, traitement anti-inflammatoire et antibiotique si nécessaire), et la formation rigoureuse de l’expérimentateur assure un respect de ces bonnes pratiques. Les points limites bien établis permettront de s'assurer de l'arrêt de l'expérimentation pour tout animal montrant des signes objectifs de souffrance. Une attention accrue sera portée aux animaux pour les soins post-opératoires. De la nourriture appétante et riche en énergie pour les souris (biscuits) sera deposée dans la cage d'hébergement des souris après opération en guise de récompense et pour stimuler leur rétablissement. Le même type de récompense sera sporadiquement administré aux souris pendant les phases d'habituation aux dispositifs expérimentaux afin de minimiser le caractère anxiogène de la boîte en plexiglas.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris font de cette espèce le modèle animal le plus pertinent pour ce projet, en particulier de part l’organisation cellulaire et la connectivité des systèmes de neurotransmission. Les outils permettant notamment l’application d’imagerie cellulaire in vivo de ces systèmes est par ailleurs validé dans cette espèce. Toutes les souris commenceront le projet à 10 semaines, c’est-à-dire l’âge adulte.