Système nerveux

Pour suivre le trajet d'une protéine, OTX2, depuis les plexus choroïdes jusqu'aux interneurones du cortex, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue et leur cerveau prélevé. Chacune subit une injection intracérébrale de trente minutes sous anesthésie, ou cinq injections intrapéritonéales quotidiennes, ou un prélèvement de liquide cérébrospinal de trente minutes, avec un risque de douleurs postopératoires et de fluctuations de poids. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids de départ, ou qui ne s'améliorent pas après deux jours de traitement, sont mises à mort.

Objectifs

Dans le cerveau des mammifères, la protéine OTX2 est transférée des plexus choroïdes (structure qui sécrète le liquide cérébrospinal dans lequel baignent le cerveau et la moelle spinale) aux interneurones du cortex via le liquide cérébrospinal. OTX2 régule les périodes critiques de plasticité cérébrale juvénile qui permettent aux circuits neuronaux de se restructurer en réponse à l'expérience et qui sont impliquées dans certaines maladies psychiatriques. Ce projet examinera l’activité sécrétoire du plexus choroïde en utilisant des approches in vivo pour suivre avec précision la sécrétion et le transfert de protéines, et évaluer les mécanismes de leur transport. En combinant plusieurs analyses, ce projet permettra d'étendre nos connaissances sur l'activité d'OTX2 et des plexus choroïdes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la sécrétion et distribution d’OTX2 dans le cerveau et son role dans la maturation des interneurones corticaux. Cette maturation régule les périodes critiques de plasticité cérébrale juvénile qui permettent aux circuits neuronaux de se restructurer en réponse à l'expérience et qui sont impliquées dans certaines maladies psychiatriques. A long terme, les résultats de ce projet impacteront notre compréhension des troubles du développement neurologique caractérisés par une maturation et un fonctionnement défectueux des interneurones corticaux.

Procédures

Une injection intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 30 minutes et sera effectuée une seule fois. Une injection intrapéritonéale sera réalisée sur certains animaux vigiles ; la procédure dure environ 1 minute en moyenne et sera effectuée une fois par jour pendant 5 jours. Un prélèvement de liquide cérébrospinal sera effectué sur certains animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 30 minutes et sera effectuée une seule fois.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que des douleurs post opératoires minorées par des antalgiques.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau sera collecté afin de permettre plusieurs analyses.

Remplacement

Nos recherches sur la distribution de protéine par le liquide cérébrospinal et les effets sur la plasticité du cerveau nécessitent des modèles de souris pour comprendre comment l'environnement juvénile affecte le comportement adulte. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent du développement du cerveau juvénile jusqu’à l'âge adulte.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses sur certaines souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine pour éviter le stress de l'isolement, puis observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours. Pour évaluer les points limites, les souris seront inspectées quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciales), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront un régime alimentaire enrichi. Les animaux seront euthanasiés si aucune amélioration n'est constatée après 2 jours de traitement ou si la perte de poids dépasse 20% du poids de départ.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la plasticité cérébrale et des effets du stress en début de vie. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet porte sur l'analyse du cerveau de la souris adulte mature. Des injections stéréotaxiques dans les ventricules cérébraux seront effectuées sur des souris agées d’un minimum de 60 jours, lorsque le cerveau est peu plastique. Les analyses histologiques et biochimiques seront effectuées chez l’adulte (agées de 70 à 120 jours) pour évaluer la cinétique de distribution de protéines dans le cerveau.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour produire la version humaine d'une molécule de l'inflammation, elles reçoivent une puce sous-cutanée, un prélèvement au bout de la queue, une injection déclenchant soit une inflammation cérébrale soit une inflammation systémique avec insuffisance cardiaque et lésions multi-organes, puis un cathéter et une séance d'imagerie. Le porteur indique qu'elles peuvent cesser de manger et de boire, maigrir et rester prostrées, et précise qu'elles ne seront pas gardées au-delà des 24 heures que durent les modèles. Sur le remplacement, il affirme qu'il faut mesurer l'affinité de l'agent de contraste à l'échelle d'un "organisme entier" et conclut au "caractère de stricte nécessité" des procédures.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de valider une nouvelle technique d'imagerie ciblée sur une souris génétiquement modifiée qui exprime la version "humaine" de la cible d'intérêt. En effet, au sein de notre équipe de recherche, nous développons un nouvel agent de contraste, une substance qui augmente artificiellement le contraste d'une imagerie médicale. Cet agent de contraste est conçu pour se fixer sur des molécules qui apparaissent spécialement pendant l'inflammation. Nous avons développé une version de cet agent de contraste qui pourrait potentiellement être utilisable chez l'Homme, notamment pour évaluer l'inflammation cérébrale (dans le cadre du diagnostic de l'AVC par exemple) ou encore dans le cadre de l'inflammation cardiaque (infarctus du myocarde ou atteinte cardiaque inflammatoire). Cet agent de contraste a la particularité d'être "ciblé" c'est-à-dire qu'il reconnaît une molécule exprimée lors de l'inflammation. Le but de ce projet est de tester si cet agent de contraste est efficace pour imager l'inflammation cardiaque ou cérébrale chez des souris modifiées génétiquement pour exprimer (c'est-à-dire "produire") la version humaine de cette molécule cible.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation cérébrale et cardiaque chez des souris non génétiquement modifiées et qui expriment donc la version murine de la molécule cible. Il est donc attendu que l'agent de contraste cible tout aussi bien la version humaine de la molécule exprimée par les souris modifiées génétiquement. Si les résultats de cette étude sont pertinents, cela permettrait d'ajouter des preuves solides au fait que l'agent de contraste développé ici pourrait être un jour utilisé en clinique chez l'Homme pour mieux diagnostiquer, évaluer et prendre en charge les pathologies inflammatoires cérébrales et cardiaques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o 1 prélèvement d'ADN pour confirmation du génotype (prélèvement d'un bout de queue) et insertion d'une puce en sous-cutanée (durée: 5min) o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 20min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o 1 pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o 1 imagerie avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).

Impact sur les animaux

L'étape de génotypage par puçage et prélèvement d'ADN peut induire un inconfort chez l'animal, tels que la douleur au niveau du site d'insertion de la puce sous-cutanée et des saignements, surtout au bout de la queue prélevée. Les deux modèles d'inflammation utilisées chez la souche de souris transgéniques peuvent produire des effets indésirables chez les animaux. Dans le premier modèle, une inflammation cérébrale créée pourra mener à des altérations de la signalisation neuronale et donc des problèmes cognitifs et comportementaux. Les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur de courte durée au niveau des points sutures et du site d’injection. Le deuxième modèle induit une inflammation systémique avec insuffisance cardiaque et des lésions multi-organes. Les animaux pourraient ressentir un inconfort physique et une souffrance de courte durée. Cette situation de mal-être et de stress pourra alors être repérée par une malnutrition liée à un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids, de la prostration et une inactivité dans la cage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (cerveau, coeur, foie, rate), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.

Remplacement

Des tests de ciblage in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant la molécule d'intérêt sur des cultures de cellules endothéliales humaines mises en conditions inflammatoires. Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour la molécule humaine exprimée à l'échelle d'un organisme entier sans pouvoir pour autant tester chez l'Homme de suite. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets ayant utilisé les mêmes modèles animaux et les mêmes types d'agents de contraste. Dans ces deux études précédentes, différents groupes de souris avec des doses variables du produit induisant l’inflammation avaient été mis en place et il semble nécessaire de reprendre ces mêmes groupes afin de comparer rigoureusement l'efficacité de ciblage des agents de contraste entre les molécules d'intérêt murine (résultats des études précédentes) et humaine (nouveaux résultats attendus). De plus, il est nécessaire qu'un groupe contrôle soit mis en place avec des souris recevant des agents de contraste dits « contrôle » (non ciblés) pour mettre en évidence la spécificité de détection chez les souris transgéniques. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a en plus été confirmé par un calcul de taille d'échantillons.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des souris est prévu. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Avant toute mise en place des modèles, un génotypage des animaux sera réalisé par puçage et prélèvement d'ADN. Cela se fera sous anesthésie générale à l'isoflurane et au protoxyde d'azote. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les injections du produit induisant l'inflammation, puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à la mise à mort des animaux. De plus, la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir les temps d'étude par une analgésie. Enfin, les animaux ne seront pas gardés pour des études sur le long terme pour ne pas les laisser en souffrance au-delà des 24 heures que durent les modèles.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies de type inflammatoire. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 8 semaines, en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études pilotes.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un tatouage des phalanges et le prélèvement d'un morceau d'oreille, cinq jours de gavage quotidien, une restriction alimentaire, puis un test comportemental de trente minutes par jour pendant onze semaines consécutives. L'enjeu déclaré est de savoir si des souris porteuses d'une mutation du gène FUS présentent des troubles de la motivation et de l'impulsivité, et si remettre la protéine dans le noyau des neurones les atténue. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à un modèle animal reproduisant la complexité comportementale et structurelle du système nerveux central humain.

Objectifs

La démence fronto-temporale (DFT) est une maladie maladie neurodégénérative incurable caractérisée par l’atteinte de deux structures majeures dans le cerveau. Les symptômes des patients atteints de DFT sont multiples et peuvent inclure des troubles liés au jeu d’argent, à l'hyperphagie et à la consommation de drogue. Tous ces comportements peuvent résulter d'une altération de la motivation et/ou de l'impulsivité. Ce type d’altérations est peu étudiée. Nous avons dans notre laboratoire un modèle de souris qui mime cette maladie en reproduisant la mutation d’une protéine mutée chez les patients. Ce projet a deux buts. Le premier est de regarder si ces souris présentent des problèmes de motivation et/d’impulsivité. Le second but est de voir si le fait de relocaliser cette protéine dans le noyau des neurones est suffisant pour atténuer ces problèmes comportementaux.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, les troubles des comportements compulsifs dans la DFT sont très peu étudiés alors qu’ils peuvent être à l’origine de souffrances physiques (alcoolisation, hyperphagie) et/ou mentale importantes. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre ces comportements. Par ailleurs, si le fait de remettre la protéine mutée à sa place s’avère efficace, cela pourrait orienter les prochaines recherches pharmacologiques ou pharmaceutiques vers une stratégie visant à relocaliser cette protéine à sa place normale chez les patients souffrant de maladie qui affectent le cerveau.

Procédures

Les animaux recevront un traitement (administration par gavage sur animal vigil afin de limiter les risques de fausse route) durant 5 jours, à raison de 1 fois par jour. La durée du gavage est d’environ 20 secondes. Nous réaliserons une tâche d’apprentissage qui nécessite que les souris soient motivées pour la réaliser. Pour atteindre ce niveau de motivation, la seule chose connue à ce jour est la mise en place d’une légère restriction alimentaire (qui vise à réduire le poids cible de l’animal est à 5%). Les souris passeront un test (non invasif) tous les jours pendant 11 semaines consécutive à raison de 30 minutes par jour.

Impact sur les animaux

6 types de nuisances sont attendues au cours de cette étude : 1- L’administration par gavage du traitement peut entrainer un stress lié à la contention transitoire et à l’administration du traitement ainsi que des fausses routes. 2- Le traitement en tant que tel pourrait avoir des effets secondaires mais de nombreuses études utilisent ce composé et aucune n’a fait remonter un effet secondaire notoire et délétère. 3- Le stress que pourrait causer la réalisation de la tache comportementale. 4- La restriction alimentaire nécessaire pour la réalisation de la tâche 5- Afin d’identifier les souris et de réaliser le génotypage, nous devons effectuer un tatouage (aux niveaux des doigts) et un prélèvement d’un morceau d’oreille (trou d’environ 1 mm de diamètre). Ceci entraine une douleur aiguë et transitoire.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des procédures car nous avons besoin de prélever les tissus pour vérifier que notre protéine d’intérêt (FUS) soit à nouveau à sa place (dans le noyau des neurones) mais aussi pour étudier les impacts au niveau microscopique (moléculaire, cellulaire et biologique) de notre intervention.

Remplacement

Ce projet a pour but d’étudier si la DFT est associée à des troubles motivationnels et compulsifs et si l’on peut modifier l’apparition de ces troubles en annulant une mutation. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale mais aussi celle structurelle du système nerveux central, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé une des procédures. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pilote qui sera un point de décision entre la suite de la réalisation, un non, du projet.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Les expérimentateurs en charge sont formés à chaque procédure et nous avons une très bonne connaissance du modèle utilisé. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal.

Choix des espèces

Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (âgées de 2/3 mois au début des procédures) car les patients souffrant de DFT liée à FUS sont toujours des patients adultes.

4 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées pour les prélèvements finaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est refroidie jusqu'à 32 °C par hypothermie provoquée, avec dix à quinze prises de température rectale espacées de quinze à trente minutes sur trois à cinq heures, une à trois administrations intraveineuses ou sous-cutanées et jusqu'à quatre prélèvements de sang, sans anesthésie ni analgésie. Cette hypothermie sert de signal pour mesurer si des molécules attelées à un médicament franchissent les barrières de l'organisme, sur une lignée dont le récepteur cible a été humanisé. Le porteur écrit travailler "faute d'alternatives de remplacement" et présente la souris comme "le seul système physiologique" intégrant les paramètres qu'il veut mesurer.

Objectifs

Les maladies neurologiques, musculaires et les maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. À l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, notre avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

Choix d’une lignée murine humanisée pour notre récepteur d'intérêt : La transposition de nos recherches sur un modèle de souris humanisées, permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. Enfin, le fait de pouvoir humaniser notre cible chez la souris constitue un excellent outil stratégique et scientifique, se traduisant par une réduction importante du nombre d’animaux au sein des études, par un gain de temps considérable (et de coût), tout en réduisant par la suite de potentiels essais sur modèles animaux plus gros. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention (avant toutes administrations (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 1 à maximum 3. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50µl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations (une ou trois maximum par individu), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7jours). Un stress thermique pouvant quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mise à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique, ou suffisamment informel. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Dans notre cas, le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit alors de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. L’utilisation de faibles cohortes d'animaux permettra d’aller en ce sens, tout en allant exploiter un maximum de résultats et par l’obtention de données statistiques significatives.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes mixtes 4 individus (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 8 groupes par étude et 15 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 960 animaux par an (4 *8*15*2), soit un total de 4800 souris sur 5 ans (960*5). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (50%mâles et 50% femelles (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la préparation en amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux (7 à 14 jours avant expérimentation). 48h à 72h avant les administrations, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce avec un cycle de lumière obscurité (12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Un maximum de 4 individus de même sexe par cage, maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain, la simplicité des administrations uniques ou répétées sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules, nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs issus de deux fournisseurs différents.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux, car il présente une cible humanisée (récepteurs) tout en gardant les avantages cités précédemment. Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, d'organes ou de liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées, des animaux dits « jeunes adultes », âgés en moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Injectées d'acroléine directement dans un ventricule du cerveau, gavées six jours sur sept pendant quatre semaines, puis soumises à des injections quotidiennes dans le nez ou l'abdomen pendant deux semaines, 484 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tests comportementaux sont annoncés à raison d'un par jour, sans que le RNT dise lesquels. L'objectif est de vérifier si une molécule dérivée d'un polyphénol protège du déclin cognitif un modèle de maladie d'Alzheimer construit par intoxication chimique. Toutes sont tuées à la fin pour analyser leur tissu cérébral.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de maladie neurodégénérative associée à une démence chez les sujets âgés. L'élaboration et la mise sur le marché de nouveaux traitements pour lutter contre ce fléau est un défi sanitaire et économique majeur. Le stress oxydant induit par de nombreux facteurs environnementaux (notamment l'exposition à des polluants chimiques) est un évènement extrêmement précoce et jouant un rôle majeur dans la maladie. En effet, l’oxydation des lipides et du glucose favorise l’accumulation d’espèces carbonylées réactives (ECR, stress carbonylé) dont la réaction avec les acides aminés entraîne des modifications et pertes de fonctions irréversibles des protéines cellulaires. Parmi les molécules capables de combattre ce phénomène, les polyphénols, métabolites secondaires du règne végétal, présents dans de nombreux fruits et légumes de notre alimentation, ont été largement étudiés. L'obstacle majeur à l'utilisation de ces composés en thérapeutique est leur très faible biodisponibilité. Pour contourner ce problème, une équipe de chimistes a synthétisé un composé capable de réduire à la fois le stress oxydant et le stress carbonylé. Un polyphénol naturel, le phloroglucinol (Phloro) a été modifié chimiquement afin de pouvoir piéger les espèces responsables du stress carbonylé. Afin d’augmenter sa biodisponibilité, le phloroglucinol modifié a ensuite été couplé à un acide gras à longue chaîne (DHA) pour donner le Phloro-OiP-DHA. Son activité a été validée in vitro et in vivo dans un modèle murin présentant une dégénérescence des photorécepteurs induite par la lumière. L'objectif de ce projet est de déterminer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle de stress carbonylé induit par une exposition chronique à une ECR (l'acroléine), mimant le développement de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : -de confirmer que l'exposition chronique à l'acroléine, conduisant à l'apparition d'un stress carbonylé, s'accompagne de troubles comportementaux et de neurodégénérescence. -de déterminer le potentiel thérapeutique du lipophénol Phloro-OiP-DHA dans ce modèle. Avec cette étude, nous posons donc l'hypothèse d'un mécanisme reliant le stress carbonylé aux processus neurodégénératifs asssociés à la maladie d'Alzheimer, et en particulier ceux associés à la formation des dépôts amyloïdes et l'hyperphosphorylation de la protéine tau. Ce projet nous permettra d'en appréhender les mécanismes biochimiques sur le long terme et de tester le potientiel thérapeutique d'une molécule ciblant le stress carbonylé, le Phloro-OiP-DHA.

Procédures

Les animaux, en fonction de leur groupe, pourront être soumis à : -un gavage quotidien pendant 4 semaines (6j/7) -une injection intracérébroventriculaire d'acroléine -des injections intrapéritonéales ou intranasales quotidiennes pendant 2 semaines - des tests comportementaux (un test par jour) - ils seront euthanasiés en fin de projet.

Impact sur les animaux

La dose d'acroléine utilisée est basée sur des travaux précédemment publiés . Les animaux seront observés quotidiennement afin d'évaluer les potentiels effets indésirables. L'inconfort lié au traitement peut provenir de la répétition quotidienne du gavage pendant 4 semaines et/ou des administrations intranasales pendant 2 semaines. Ces administrations seront toutefois effectuées par une personne qualifiée et après une période d'habituation à l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses biochimiques et immunohistologiques du tissu cérébral.

Remplacement

De manière générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveau sur des modèles simplifiés (in vitro ou in silico) et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs (in vitro ou in silico) validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans leur globalité. Il est primordial d’avoir des circuits neuronaux in vivo associés aux cellules gliales et vasculaires, pour caractériser les modifications moléculaires liées à la maladie d’Alzheimer d’un point de vue spatiotemporel. Les modèles utilisés sont acceptés, bien documentés, et très utilisés par la communauté des neurosciences.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour répondre aux objectifs du projet. Le nombre d'animaux dans chaque groupe, ainsi que le nombre de groupes est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe et a été déterminé par une analyse de puissance statistique basée sur nos études précédentes. Pour les analyses comportementales, histologiques et biochimiques, les tests seront de type non appariés, paramétriques sur les moyennes à variances égales ou différentes suivants les résultats des analyses précédentes. Ici, 10 animaux par groupe seront nécessaires pour observer d’éventuels changements. A ce nombre d’animaux une marge de 10% sera ajoutée afin de compenser les aléas expérimentaux.

Raffinement

Afin de minimiser les effets du stress qui pourraient fausser les résultats (en particulier sur les analyses comportementales), mais également de contrôler l’état général des animaux, les souris seront manipulées chaque jour par l’expérimentateur en charge de l’expérience, avant la procédure expérimentale. Tous les incidents et toutes observations anormales (comportement, poids, pelage, plaie,…) seront transmis à l’expérimentateur afin d’être traités dans les plus brefs délais et seront notés dans un tableau de suivi expérimental.

Choix des espèces

Il s'agit d'une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. La maladie d'Alzheimer étant une maladie se déclarant chez l'adulte voire la personne âgée, les animaux seront utilisés et sacrifiés à l'âge adulte (6 mois). De plus, la caractérisation du modèle de souris transgéniques a déjà été effectuée dans notre laboratoire et nous avons montré que : -les déficits comportementaux commencent à partir de 3 mois -les modifications biochimiques (augmentation de la charge amyloïde, de la phosphorylation de la protéine tau, principaux marqueurs de la maladie d’Alzheimer) et histologiques (formation des plaques amyloïdes) sont visibles à l’âge de 6 mois

58 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chez elles par traitement, avec inflammation de l'intestin et perte de poids possibles, et chacune subit cinq injections intrapéritonéales et six pesées. Le porteur indique que les données obtenues hors de l'animal ne suffisent pas, faute d'y retrouver le système immunitaire et les facteurs circulants. Le bénéfice annoncé se limite à identifier "potentiellement" des cibles thérapeutiques pour les troubles digestifs liés au stress.

Objectifs

Le système nerveux entérique (SNE) régule la motricité digestive et les fonctions de la barrière épithélio-intestinale. Il est admis que le stress altère l’axe cerveau-intestin et contribue à un large éventail de troubles gastro-intestinaux, incluant le syndrome de l’intestin irritable. La survenue d’évènements stressants ou traumatisants affecte les fonctions digestives, qui en pratique se manifestent par des flatulences, des douleurs abdominales, plus ou moins associées à une accélération ou à une diminution de la vidange gastrique. La réponse biologique au stress implique l’activation de l’axe hypothalamo-hypophysaire-surrénalien, initiant une sécrétion de glucocorticoïdes. Bien que la synthèse de glucocorticoïdes ait lieu principalement au niveau des glandes surrénales, il a été décrit de nombreux autres sites de production, associés à une action locale des glucocorticoïdes via le récepteur aux glucocorticoïdes. Dans l’intestin, le système nerveux exprime le récepteur des glucocorticoïdes ainsi que l’enzyme responsable de leurs synthèses. Une étude préliminaire in vitro de notre équipe de recherche a permis de mettre en évidence une synthèse de corticostérone par le système nerveux entérique et une augmentation de la synthèse de corticostérone en conditions inflammatoires. De plus, des modifications de l’expression de protéines impliquées dans l’activité neuronale ont également été mises en évidence en conditions inflammatoires et lorsqu’on bloque l’effet des glucocorticoïdes. L’objectif de ce projet est d’étudier comment l’inflammation module le système nerveux entérique in vivo, et si les conséquences fonctionnelles de l’inflammation passent par l’action des glucocorticoïdes.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les mécanismes de la synthèse locale des glucocorticoïdes au niveau de l’intestin afin de pouvoir potentiellement identifier des cibles thérapeutiques pour améliorer les troubles digestifs intestinaux liés au stress et à l’inflammation.

Procédures

Pesée quotidienne des animaux – 10 sec sur la balance – 6 au total Contention + injection intrapéritonéale – 30 sec – 5 au total

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent avoir une inflammation des intestins à l’issue du traitement et cela peut générer une perte de poids. Ils peuvent également avoir peur au moment des injections intrapéritonéales.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus d’intérêt (tube digestif) pour analyser les échantillons ex vivo.

Remplacement

Les données préliminaires obtenues dans un modèle ex vivo ne sont malheureusement pas suffisantes pour extrapoler les résultats obtenus à un individu entier. Plusieurs acteurs comme le système immunitaire et la présence de facteurs circulants sont absents de nos modèles ex vivo. C’est pourquoi il n’est pas possible de remplacer ce modèle d’induction de colite aigüe par un modèle ex vivo ou in vitro.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d’animaux minimum nous permettant d’obtenir des résultats statistiquement interprétables (n=9 pour une augmentation de 40 % de la production de corticostérone). Pour s’assurer de la réussite de ce projet, nous avons prévu un lot d’animaux « pilote » de 10 souris qui permettra de valider les expérimentations in vitro sur les échantillons issus de nos animaux. Comme une partie des animaux va recevoir une injection intrapéritonéale d’antagoniste et que ce type d’injection peut rater malgré un personnel compétent, nous avons prévu un lot supplémentaire (n=3 par groupe) qui sera réalisé seulement si certains animaux doivent être exclus. L’utilisation d’un tel nombre (58 au total) devrait nous éviter de devoir répéter l’expérience.

Raffinement

Les souris seront au maximum 5 par cages et de l’enrichissement (frisottis, tubes) sera placé dans les cages leur permettant de déchiqueter, de jouer et de se cacher. Elles seront également surveillées quotidiennement à l’animalerie avant et pendant la procédure expérimentale, y compris le week-end. Les souris seront habituées à la présence de l’utilisateur grâce à une manipulation régulière pour limiter le stress lors des expérimentations. Nous avons également défini des points limites à nos expérimentations pour évaluer le bien-être de nos animaux et prendre en charge la douleur si elle a lieu.

Choix des espèces

La colite expérimentale provoquée par le traitement chez les rongeurs est un modèle reconnu d’affections inflammatoires chroniques humaines. La souris représente un très bon modèle d’étude (plus petit) et est plus adapté à nos besoins qu’un modèle rat et nous permettra de faire un parallèle avec l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines) puisque ce projet s’intéresse à la régulation de la production de glucocorticoïdes à l’âge adulte.