Système nerveux

648 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun hébergé seul en cage pendant 77 jours après la pose d'un cathéter intraveineux. Chaque rat enchaîne vingt-cinq séances quotidiennes d'auto-administration de nicotine de six heures, six semaines d'abstinence, une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter une enzyme qui dégrade le cholestérol, puis une séance de test de rechute. Chacun reçoit une trentaine d'injections intraveineuses en condition vigile. Les retombées annoncées, une meilleure prise en charge des personnes dépendantes et de futurs médicaments contre la rechute, sont formulées au conditionnel, quand l'isolement de 77 jours figure, lui, parmi les nuisances attendues.

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie comportementale et psychiatrique chronique avec une prévalence croissante, au coût élevé sur le plan médical, social et économique . Le tabagisme fait plus de 8 millions de morts chaque année dans le monde. Sur ces 8 millions, 7 millions sont dus à la consommation directe de tabac, et environ 1,3 million de ces morts subviennent chez des non-fumeurs, qui sont involontairement exposés à la fumée du tabac (selon l’OMS). L’une des caractéristiques de l’addiction est le risque durable de nouvelles consommations même après une abstinence prolongée. Ce risque serait lié à des adaptations durables laissées par les drogues dans le cerveau. La découverte de stratégies pour aider les personnes addicts dans leur désir d’abstinence est une réelle nécessité. Plusieurs évidences suggèrent que le cholestérol cérébral pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique pour traiter l’addiction. En effet, la littérature scientifique indique que le cholestérol pourrait participer aux modifications neuronales persistantes, qui sous-tendent les risques durables de rechute vers une addiction. Ce projet a pour premier but d'identifier chez le rat, une structure cérébrale dans laquelle la manipulation du cholesterol cérébral réduit la recherche de nicotine chez des rats addicts. Quand une structure sera identifiée, nous chercherons à identifier les mécanismes neurobiologiques associés à ces effets comportementaux.

Bénéfices attendus

Ce projet innovant permettra d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires expliquant la vulnérabilité à la rechute en particulier à l’addiction au tabac. Ces expériences pourraient conduire à une meilleure prise en charge des personnes addictes et au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire voire empêcher la rechute (nouvelle consommation) de nicotine.

Procédures

Tous les rats (648) suivront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (durée : 15minutes) afin d'implanter un cathéter intraveineux permettant les injections de nicotine pendant les sessions d’auto-administration. Après la chirurgie et jusqu’à la fin du projet, ces 648 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de nicotine concernera tous les rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 6 semaines pour tous les rats. Pour modifier la quantité de cholestérol cérébral, tous les rats suivront une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale gazeuse pour permettre l’injection d’une enzyme dégradant le cholestérol ou son contrôle dans une région cérébrale précise (environ 2 heures sous anesthésie générale). Après les 6 semaines d’abstinence, tous les rats sont replacés dans la cage d’auto-administration pour une session de test de rechute (1 session, 4 heures). Tous les rats auront 1 injection sous-cutanée avant et les 2 jours après les chirurgies (3 injections par rat) et une injection intraveineuse (par le cathéter), les 5 premiers jours après la chirurgie d’implantation de cathéter et tous les jours d’auto-administration (30 injections), en condition vigile.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil, douleur minimisée par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie -Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience -Période d’abstinence : peut causer un léger stress avec certaines drogues mais non observé avec la nicotine. -Isolement : stress modéré (pendant 77 jours)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement de rechute, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux au maximum et pouvoir faire des analyses statistiques de type ANOVA, le nombre d’animaux requis a été calculé par un test dit de puissance qui tient compte de la variabilité des mesures. Ainsi, nous avons trouvé que 18 animaux par lots seront nécessaires avec 36 lots au total soit 648 animaux maximum. Le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Le projet est conçue dans une démarche "pas à pas" où certaines expériences ne seront réalisées que si les résultats des expériences précédentes sont concluantes.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoce dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 2 fois par semaine. Lors des procédures de chirurgie un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec la souris, pour lesquelles la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, ce qui correspond au stade de développement utilisé dans l’ensemble de nos projets de recherche afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

Des ultrasons délivrés une minute par jour, jusqu'à cinq jours de suite, pour ouvrir la barrière qui protège le cerveau, après la pose d'un cathéter et l'injection de microbulles de gaz : 176 souris porteuses d'une modification génétique reproduisant la maladie d'Alzheimer subissent ce protocole, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi, à l'état vigile, une injection quotidienne pendant deux jours d'une protéine bactérienne qui déclenche fièvre, poil hérissé et prostration pendant trois à six heures, puis un inhibiteur censé bloquer l'inflammation cérébrale. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé pour analyse. Le porteur annonce des tests comportementaux étalés sur quatorze jours, dix minutes par test sur animal vigile, sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA), constituent un problème de santé et sociétal majeur dans le monde, les causes et les nombreux facteurs contribuant à la MA sont encore mal compris, et les essais cliniques n’ont jusqu'à présent pas réussi à stopper la progression de la MA. Une meilleure compréhension des mécanismes de la MA est nécessaire pour explorer de nouvelles approches thérapeutiques. La contribution de l'inflammation périphérique et cérébrale aussi appelée « neuroinflammation », à la pathologie de la MA est établie mais reste encore mal comprise. L’inflammation peut être ciblée via l’un de ses composants critiques : l’inflammasome, et plus particulièrement par une protéine impliquée dans cette neuroinflammation. Ce projet vise: - à déterminer la contribution de l'inflammation systémique, induit par des stimuli pro-inflammatoires, à la pathologie de la MA - à établir si la protéine peut être ciblée à la fois de manière périphérique et centrale - à utiliser une approche innovante pour améliorer la délivrance cérébrale d'un inhibiteur sélectif de cette protéine en utilisant les ultrasons (US) pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique(BHE).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont : • De valider une cible thérapeutique innovante associée à une technologie permettant d’améliorer l’efficacité potentielle de cette thérapie ; • D’apporter de nouvelles connaissances dans le domaine des neurosciences et plus particulièrement du rôle de l’inflammation et de la neuroinflammation dans la MA.

Procédures

Un groupe d'animaux recevra: une injection intra-péritonéale (IP) par jour d'une protéine bactérienne pendant 2 jours d'une durée de 20 secondes par injection. (Animal vigile) et recevra une autre injection intra-péritonéale (IP) d'une molécule inibitrice de la protéine concernée, 1 seule fois, d'une durée de 20 secondes par injection (Animal vigile). Les animaux ayant reçu les injections IP auront une séquence d'ultrasons d'une durée d'une minute: pose de cathéter en IV (1 min) puis injection de microbulles de gaz (1min) et séquence ultrasonore. (sous anesthésie gazeuse). Il auront 1 fois une injection en IP (vigile) pour une anesthésie chimique d'une durée de 20 secondes. Un autre groupe d'animaux recevra également une injection intra-péritonéale (IP) par jour d'une protéine bactérienne pendant 2 jours d'une durée de 20 secondes par injection. (Animal vigile) et recevra une autre injection intra-péritonéale (IP) d'une molécule inibitrice de la protéine concernée de J3 à J7 d'une durée de 20 secondes par injection (Animal vigile). Ces animaux recevront une fois par jour pendant 5 jours une séquence d'ultrasons d'une durée d'une minute: pose de cathéter en IV (1 min) puis injection de microbulles de gaz (1min) et séquence ultrasonore. (sous anesthésie gazeuse). Habituation de la pièce de comportement: 30 min avant les tests. Les souris auront différents tests comportementaux pendant 14 jours pour une durée de 10 min par test (animal vigile). Tous les animaux auront 1 fois une injection en IP (vigile) pour une anesthésie chimique d'une durée de 20 secondes.

Impact sur les animaux

Administration intrapéritonéale et intra veineuse: Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection et la manipulation/contention des souris peut engendrer un certain stress. La protéine bactérienne n’induit pas d’effets indésirables sévères chez les animaux, mais peut induire un état fiévreux : poil hérissé, prostration liée la fièvre (l’inflammation périphérique) induite par la protéine bactérienne pendant les 3-6h suivant l’administration. Ces symptômes disparaissent d’eux-mêmes dans les 6h suivant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du projet et leur cerveau sera prélevé pour des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire la complexité de l’ensemble des processus physiopathologiques dans leur intégralité. De plus, il est important de noter que la méthode d’imagerie TEP (tomographie émission de positions) utilisée est intégralement transférable à la clinique et que l’étude chez l’animal nous informera de l’amplitude des différences entre groupes qui lors d’études similaires précédentes se sont révélées similaires de celles observées chez l’homme.

Réduction

L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo permet de réduire le nombre d’animaux utilisé (-25%) par le biais du suivi longitudinal. Le nombre total d’animaux est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ces groupes seront composés de 50% de mâles et 50% de femelles. Bien que des différences mineures de pathologie de la MA aient été notées entre mâles et femelles dans le modèle transgénique, celles-ci ne devraient pas affecter significativement les paramètres mesurés dans cette étude. Nous prévoyons ainsi d’inclure un effectif de 10 animaux/groupe (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter, par exemple en cas d’échec de l’injection du traceur ou de mort au cours de l’imagerie), nombre qui a été suffisant lors d’études précédentes dans ce modèle. Par souci de réduction, nous n’inclurons qu’un seul groupe non transgénique comme contrôle absolu pour tous les autres groupes, puisque d’un point de vue scientifique et translationnel des animaux/patients sains ne recevraient pas de traitement. D’après notre expérience, ce groupe est néanmoins nécessaire car il y une légère augmentation de la neuroinflammation avec l’âge (notamment mesurée par un radiotraceur fluoré) chez ces souris. Dans ce projet, nous utiliserons des tests statistiques appropriées pour analyser les différents paramètres mesurés au cours de ce projet: en imagerie, le comportement, des études in-vitro.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une à deux fois par jour. Une récompense alimentaire sera donnée aux animaux après les injections pour diminuer leur stress. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Pendant le protocole, si nous constatons des conflits dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus. En cas de blessures, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à la cicatrisation complète. Pendant le projet, le point d’injection, les expressions faciales, la posture de l’animal, la réactivité de l’animal à des stimuli externes (bruit…) seront monitorés chaque jour. Une perte de poids de plus de 15%, une réactivité anormale à des stimuli externes (bruits), une posture et des expressions associées à une souffrance de l’animal impliqueront sa mise à mort. Le jour de l'imagerie l’induction et le maintien se fera sous anesthésie gazeuse. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la pathologie de la maladie d'Alzheimer (MA) est bien reproduite dans ce modèle d'animal transgénique et les processus inflammatoires lié à cette maladie dans ce modèle sont très similaire à ceux observé chez l'humain. La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra microTEP. Nous utiliserons des souris adultes car la MA ne concerne que les populations adultes/âgées.

Une heure trente de chirurgie intracérébrale pour injecter un virus qui fera exprimer une protéine toxique dans les cellules de soutien du cerveau, puis quatre à cinq prises de sang à la queue : 320 rats Sprague-Dawley subissent ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leur cerveau. L'induction de la maladie ralentit leur activité locomotrice et dégrade leur motricité fine. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de l'atrophie multisystématisée, maladie neurodégénérative sans traitement, et d'identifier des marqueurs sanguins qui seront ensuite vérifiés chez des patients. Le porteur annonce deux tests comportementaux répétés quatre à six fois sur des rats vigiles, l'un de trois minutes sur trois jours, l'autre d'une heure, sans indiquer à aucun moment lesquels.

Objectifs

L'atrophie multisystématisée est une maladie neurodégénérative fatale avec un handicap moteur sévère. Il n'existe actuellement aucun traitement disponible pour atténuer la gravité des symptômes ou la progression clinique de cette maladie orpheline. Elle se caractérise au niveau cellulaire par l'accumulation et l'agrégation d’une protéine dans les oligodendrocytes (cellule de soutien essentielle à la fonction et à la survie des cellules nerveuses) entrainant une neurodégénérescence. Dans ce projet, des rats recevront une injection de virus permettant l’expression de cette protéine spécifiquement dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires responsable du dysfonctionnement des oligodendrocytes et aboutissent à leur perte de fonction dans le cerveau en utilisant des approches comportementales (évaluation motrice), histologiques et cellulaires. De plus les prélèvements de sang réalisés chez les animaux à différentes étapes du développement de la maladie permettront d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour lesquelles des stratégies pourraient être développées afin de prévenir ou de corriger les altérations qui touchent les oligodendrocytes, dans le but de restaurer leur fonctionnement normal. Les marqueurs d'oligodendrocytes qui pourront être identifiés dans le modèles précliniques seront ensuite validés chez des patients atteint d’atrophie multisystématisée.

Bénéfices attendus

Le projet actuel propose d’identifier les mécanismes moléculaires responsables du dysfonctionnement des oligodendrocytes et la mise en évidence de biomarqueurs au niveau sanguin. Ces résultats de recherche amélioreraient considérablement la compréhension de la physiopathologie de l’atrophie multisystématisée d’une part et auraient des implications considérables pour les soins aux patients et le développement thérapeutique et de biomarqueur dans l’atrophie multisystématisée d’autre part.

Procédures

- Pour 320 animaux : test comportemental 1 d’une durée de 3 minutes sur 3 jours et test comportemental 2 d’une durée d’1h sur une journée. Ces tests comportementaux sont réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (4 à 6 fois maximum en fonction des lots de rats) sur animaux vigiles. - Pour 320 animaux : prélèvement sanguin au niveau de la queue sur animaux anesthésiés d’une durée de 3 minutes (4 à 5 fois maximum en fonction des lots de rats) - Pour 320 animaux : chirurgie intracérébrale réalisée sur animaux anesthésiés et sous couverture antalgique périphérique et locale, d'une durée d'1 heure 30. - Pour 160 animaux : perfusion intracardiaque réalisées sur animaux anesthésiés par une double dose d'un mélange d'anesthésique et antalgique permettant également une couverture antalgique périphérique.

Impact sur les animaux

- La chirurgie stéréotaxique peut induire une légère perte de poids et un stress notamment au réveil, la douleur occasionnée est soulagée par des antalgiques pendant et après la chirurgie. - L’induction de l’AMS va induire un ralentissement global de l’activité locomotrice et des difficultés de motricité fine. - Prélèvements de sang peuvent ponctuellement induire un hématome au niveau de la veine caudale. - Petit inconfort de la contention ou léger stress lors de la pesée hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récuperer les ceveaux et de réaliser des analyses histologiques, cytologique et transcriptionnel.

Remplacement

Malgré des recherches sur des modèles cellulaires dans l’atrophie multisystématisée, dans le cadre de ce projet basé sur la compréhension du développement de la maladie et de ces effets comportementaux ainsi que l’analyse de biomarqueurs sanguins le modèle animal entier ne peut pas être substitué car nécessite l’intégrité des réseaux neuronaux et ne peut donc pas être réalisée in vitro, ni in silico.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance. Ces critères impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 20 animaux par condition expérimentale par suivi longitudinal et par sexe soit 320 rats afin d'obtenir des résultats statistiques interprétables.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et les tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie voire 48h post- opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage autant que possible (isolement de maximum 7 jours après la chirurgie restant une démarche de soin exceptionnelle), avec eau et nourriture ad libitum. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement (bâtons à ronger et baguette de papier compressé) est disposé dans les cages d'hébergement. Un tunnel sera également rajouté si les animaux nécessitent un isolement. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour l’étude de l’atrophie multisystématisée. La lignée Sprague-Dawley a été choisie en raison des données déjà disponibles dans la modélisation de la maladie et de la similitude avec la pathologie humaine. Les animaux utilisés seront des animaux adultes (8 semaines au début des tests comportementaux réalisés avant la chirurgie) de façon à se rapprocher du stade de développement de l’atrophie multisystématisée.

Une semaine d'acclimatation, puis une injection dans le liquide céphalorachidien chaque semaine pendant huit semaines, sous anesthésie générale à chaque fois, et entre deux injections des tests de motricité et de force musculaire de dix minutes chacun. Un test de mémoire intervient au deuxième ou au troisième mois, des prélèvements de sang ont lieu en cours d'étude, et un mois après la dernière injection les 396 souris sont tuées pour prélever des structures de leur système nerveux central. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et le porteur écrit qu'il est probable que les souris injectées perdent peu à peu leur mobilité et leur masse musculaire, la mise à mort devant intervenir avant qu'elles ne puissent plus se déplacer, s'alimenter ni boire. Ce qui leur est inoculé provient du système nerveux central de patients atteints de sclérose latérale amyotrophique, dans l'espoir de reproduire chez elles une maladie dont le porteur dit qu'aucun modèle animal fiable n'existe.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (ou maladie de Charcot) est une maladie neurodégénérative qui touche les neurones du cerveau et de la moelle épinière, responsables du mouvement. La maladie débute en moyenne à l’âge de 60 ans et est responsable d’une paralysie progressive, de troubles de la parole et de la déglutition, et de difficultés respiratoires aboutissant au décès en 2 à 5 ans. Il n’existe, à ce jour, aucun traitement de la maladie, et la faible connaissance des mécanismes physiopathologiques impliqués associée à l’absence de modèles animaux fiables freinent la recherche sur la SLA. Deux formes de SLA existent, les formes héréditaires causées par des mutations génétiques (moins de 10% des patients), et les formes dites sporadiques qui représentent plus de 90% des patients et pour lesquelles l’origine de la maladie reste inconnue. Un acteur semble toutefois jouer un rôle central dans la maladie : la protéine TDP-43, qui s’accumule de manière anormale dans les neurones des patients atteints de SLA et semble jouer un rôle dans la propagation de la maladie au sein du système nerveux en se propageant de neurone en neurone. Des modèles animaux portant les mutations génétiques responsables de SLA familiales existent mais ne représentent que moins de 10% des patients. Il est donc indispensable de générer de nouveaux modèles représentatifs des 90% des patients atteints de la forme sporadique. Plusieurs équipes de recherche ont récemment tenté de reproduire la maladie en injectant la protéine TDP-43 issue de patients atteints de SLA dans le cerveau de souris. Ces études ont permis de reproduire des symptômes semblables à ceux présentés par les patients, et l’accumulation anormale de TDP-43 au sein des neurones des souris a été retrouvée comme celle observée chez les patients. Si ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes, les modalités d’induction de la maladie restent pour le moment très invasives pour les animaux (injections intracérébrales) et difficiles à réaliser. Afin de pallier ces contraintes, nous souhaitons mettre au point un protocole d’induction de la maladie plus facile et moins invasif pour les animaux. L’objectif du projet est de répondre à l’absence de modèles animaux fiables dans la recherche sur la SLA en générant un modèle animal de SLA sporadique (inexistant à ce jour limitant les progrès de la recherche) pour permettre la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués et appliquer des stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Si les souris développent une pathologie similaire à la SLA chez l’Homme, alors elle pourra être étudiée sur un modèle fiable de la maladie pour identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués afin de mieux comprendre la genèse et la propagation de la maladie, et enfin permettre d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. Les souris subiront une injection par semaine pendant 8 semaines sous anesthésie générale courte. L’anesthésie générale dure en moyenne 15 minutes. La procédure démarre par environ une semaine d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Une semaine après chaque injection, et avant l’injection suivante, les animaux subiront des tests comportementaux. Ces tests sont au nombre de 2 et visent respectivement à évaluer la motricité et la force musculaire . La durée de ces tests est d’environ 20 minutes par souris (2 tests différents de 10 min chacun avec des temps de récupération entre chaque). Un test de mémoire sera réalisé entre 2 et 3 mois après le début de l'expérience ( test d'environ 10 minutes par souris). Une fois le modèle mis en place, les animaux recevront une substance test de manière aigue ou de manière chronique au cours de l’expérience. Classiquement, les administrations durent quelques secondes pour chaque animal. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude (1 à 2 prélèvements avec au minimum une semaine d'intervalle, chaque prélèvement dure quelques secondes). Un mois après la dernière injection, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem et études biochimiques et d’imagerie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les administrations par voie intrathécale et la procédure terminale de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, du fait de l'anesthésie générale (total de 9 anesthésies sur 12 semaines). Les tests moteurs peuvent induire un léger stress chez l'animal. Si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive (entrainant une perte de poids). L'administration de nouveaux candidats médicaments par voie systémique ou orale peut également conduire à un léger stress chez l'animal vigile. Ces interventions peuvent générer un stress transitoire lié à la contention et une légère douleur comparable à l'introduction d'une l'aiguille selon l'art et la pratique vétérinaire. Il n'est pas attendue de douleur ou souffrance spécifique par les candidats médicaments eux-mêmes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des 2 procédures pour exploration de la propagation de la maladie par des études biochimiques et histologiques. Ces analyses impliquent le prélèvement de structures du SNC et ne permettent donc pas le maintien en vie des animaux.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de la protéine TDP-43 dans l’induction et la propagation de la Sclérose Latérale Amyotrophique. En effet la physiopathologie de la SLA met en jeu l’organisme entier et plus particulièrement le système nerveux central. Les modèles cellulaires ne permettent d’évaluer le mode d’action qu’au niveau moléculaire et sub-cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe ou à l’organisme entier. Aussi, il n’existe pas de modélisation mathématique ou d’alternatives non animales dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats exploitables au niveau statistique. Les tests statistiques ont été choisis de manière à répondre le plus précisément possible aux questions scientifiques

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (4 à 6 souris par cage car ce sont des animaux sociaux), et les animaux évolueront dans un environnement enrichi (coton, tunnel, etc…). Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et/ou les techniciens. La douleur susceptible d’être induite par les injections sera limitée car elles seront réalisées sous anesthésie par isofluorane. En revanche, si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive. Les animaux seront euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement et donc de s’alimenter et de boire correctement (point limite lié à ce protocole).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour l’étude des maladies humaines car l’organisation de son ADN et l’expression de ses gènes sont similaires à celles de l’Homme. La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle facile à entretenir, bien décrit et documenté. C’est un modèle utilisé dans le monde entier permettant ainsi de comparer les résultats entre les laboratoires de recherche. Les souris C57BL/6J seront âgées d’environ 4 mois, l’âge moyen pour avoir des animaux adultes et matures car la SLA est une maladie qui touche des adultes.

210 rats subissent chacun une chirurgie de deux heures sous anesthésie générale pour se faire implanter un dispositif d'enregistrement cérébral, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour analyser leur cerveau. Cent vingt d'entre eux reçoivent en plus un cathéter veineux, vivent seuls en cage jusqu'au terme du projet, puis s'administrent de la cocaïne au cours de 25 sessions de six heures, suivies de deux mois d'abstinence. Le porteur indique que la prise chronique de drogue peut provoquer un état émotionnel négatif, visible au poil hérissé et à l'irritabilité, et que l'isolement peut causer un stress modéré. Le projet ne teste aucun traitement, il sert d'abord à mettre au point la technique d'enregistrement par fibre optique.

Objectifs

Le projet présenté ici s’inscrit dans un projet plus large visant à évaluer si le métabolisme du cholestérol cérébral représente une cible thérapeutique potentielle pour prévenir les rechutes et traiter l’addiction. En effet, quelques études ont montré que l’expression de protéines impliquées dans ce métabolisme était modifiée aussi bien chez l’homme, que dans des modèles animaux d’addiction, en réponse à la cocaïne ou à l’alcool. Pour cela, nous avons besoin dans un premier temps de mettre au point une technique d'enregistrement par fibre optique afin de déterminer les conditions optimales d’enregistrement de l'activité des neurones puis de valider ces conditions expérimentales avec l'étude de cette activité chez des rats en situation de rechute après une période d’addiction volontaire à la cocaïne puis une phase d'abstinence.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise au point d’une technique innovante pour mesurer l’activité neuronale chez l’animal vigile. Cette technique, réalisée sur animal vigile, couplée à des mesures comportementales, nous permettra de mieux comprendre les processus neuronaux sous-tendant les phénomènes de rechute afin de mieux les combattre et promouvoir l’abstinence.

Procédures

Tous les rats (210) suivront une chirurgie sous anesthésie générale (durée : 2h00) afin d'implanter un dispositif pour mesurer l'activité neuronale. 120 rats seront soumis à une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée 15 min) pour implanter un cathéter veineux. Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 120 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de drogue se fera avec ces 120 rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 2 mois. Pour mesurer l'activité neuronale, tous les rats vigiles (210) seront placés pendant 1 heure dans une cage spéciale ; dans cette cage les rats sont libres de leur mouvement. 90 rats auront 3 sessions de mesure de l'activité neuronale (repartis sur 40 jours), 120 rats auront 1 seule session de mesure de l'activité neuronale. Tous les rats (210) seront pesés (2 fois par semaine, 15 semaines maximum, 10 secondes par pesée).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques et inconfort transitoire au réveil. - Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Auto-administration : La prise de drogue chronique peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur mais pas envers ses congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques jours. - Période d’abstinence : peut causer un léger stress. - Isolement : peut causer un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, vise à mettre au point une technique d’enregistrement de l’activité des neurones in vivo chez l’animal vigile au cours de tests comportementaux, ce qui implique d’utiliser des animaux vivants. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Dans la première phase du projet, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous progresserons pas à pas avec des groupes de 3 animaux. Nous testerons une condition à la fois, jusqu’à l’obtention de résultats satisfaisants. Nous avons fixé une limite maximale de 30 animaux par lot pour trouver les conditions optimales pour la mise au point de la technique d’enregistrement des neurones, soit 10 conditions expérimentales maximum. Dans la seconde phase de mesure de l'activité cérébrale chez les rats addicts, nous estimons à 20 rats par lot le nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir faire les analyses statistiques de nos résultats.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ces points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoces sont définis dans une grille de suivi. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, avec un recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température par un tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec une autre espèce, pour laquelle la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur confondant de déclin cognitif lié au vieillissement.

Sur les 207 souris utilisées, 192 seront tuées pour prélever leur intestin et leur cerveau, les 15 souris dites naïves employées dans les tests d'interaction sociale étant mises à disposition d'autres utilisateurs. Ces souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une hypothyroïdie provoquée chez les mères par un antithyroïdien dans l'eau de boisson, puis chez la descendance un gavage trois fois par semaine pendant deux semaines, des prélèvements de sang à la queue et une bille introduite par voie anale pour mesurer le transit colique. Les tests comportementaux sont détaillés, exploration, interaction sociale de 35 minutes, mesure des stéréotypies et test d'anxiété de 15 minutes chacun. Le porteur affirme qu'évaluer un traitement des symptômes digestifs et comportementaux de l'autisme ne peut, à ce jour, être réalisé que sur des animaux non-humains.

Objectifs

6. Les troubles du spectre de l’autisme sont caractérisés par des déficits dans les interactions sociales, des stéréotypies et des centres d’intérêts restreints. En plus des symptômes comportementaux, une grande majorité de personnes avec TSA souffrent de symptômes gastro-intestinaux. Aucun médicament spécifique des troubles du spectre de l’autisme n’existe à ce jour. Il s’avère que le microbiote intestinal présente une composition altérée chez les patients avec autismes par rapport à des sujets témoins. Appuyant le microbiote intestinal comme possible cible thérapeutique dans l’autisme, des études cliniques pilotes de thérapie par transfert de microbiote fécal ou de probiotiques (micro-organismes vivants tels que bactéries, levures exerçant un effet bénéfique sur l'organisme) chez des enfants avec autisme ont permis d’améliorer certains symptômes comportementaux et digestifs, suggérant que des éléments produits par le microbiote intestinal possèdent un potentiel thérapeutique. Nous proposons de tester l’un de ces éléments : les vésicules extracellulaires produites par le microbiote intestinal qui sont présentes dans les selles. Parmi les facteurs de risques de l’autisme, la santé de la mère pendant la grossesse semble jouer un rôle crucial. En particulier, l'hypothyroxinémie maternelle est associée à un risque quatre fois plus élevé de développer des troubles du spectre de l’autisme chez la descendance. L’hypothyroxinémie est une forme d’hypothyroïdie dans laquelle la concentration sanguine de T3 (l’hormone thyroïdienne active) est normale alors que celle de T4 (précurseur de T3) est diminuée. Un modèle animal chez la souris permettant de modéliser l’hypothyroxinémie maternelle montre en effet l’apparition de troubles comportementaux et digestifs pertinents des TSA chez la descendance. L’objectif de ce projet est d’étudier une nouvelle approche thérapeutique dans un modèle animal d’hypothyroxinémie maternelle. Cette approche est basée sur l’utilisation vésicules extracellulaires fécales (contenant les vésicules extracellulaires du microbiote intestinal) ou des vésicules extracellulaires issues de probiotiques (micro-organismes vivants tels que bactéries, levures). L’objectif est d’étudier si un traitement d’un modèle animal avec des vésicules extracellulaires provenant d'un microbiote fécal sain ou de probiotiques réduira les symptômes comportementaux et gastro-intestinaux de type autistique chez la descendance de mères avec hypothyroxinémie.

Bénéfices attendus

Les troubles du spectre de l’autisme touchent environ 1% de la population mondiale et restent en constante augmentation sans médication proposée à ce jour. Plusieurs études indiquent que des éléments produits par le microbiote intestinal ou par des probiotiques (micro-organismes vivants tels que bactéries, levures) possèdent un potentiel thérapeutique pour les troubles du spectre de l’autisme. En ciblant les vésicules extracellulaires, notre projet pourrait apporter un nouvel outil thérapeutique dans l’autisme. Dans des modèles animaux de colites, l’emploi des vésicules extracellulaires fécale ou dérivées de probiotiques, a montré leur efficacité dans la diminution des symptômes gastro-intestinaux. Ce projet pourrait donc apporter de nouvelles perspectives pour un traitement thérapeutique de l’autisme basé sur l’utilisation de vésicules extracellulaires comme postbiotiques (composés produits par les probiotiques).

Procédures

Pour la procédure n°1 visant à induire une hypothyroxinémie chez les souris gestantes, nous réaliserons un seul prélèvement d’un échantillon de sang à la base de la queue (environ 200μl) de 5min. Pour la procédure n°2 visant à étudier le comportement et les fonctions digestives, nous réaliserons : - un gavage 3 fois par semaine (un jour sur deux) durant 2 semaines à l’aide d’une canule de gavage pour rongeurs avec 100 µl d’une solution de VE (2min). - des tests comportementaux sur 3 jours seront effectués sur les souris : 1) test d’exploration, 2) test d’interaction sociale de 35min 3) mesure des stéréotypies de 15min et 4) test d’anxiété de 15min. - un seul prélèvement d’un échantillon de sang à la base de la queue (environ 30μl) de 5min. - un prélèvement de selles tous les ¼ d’heure sur 2 heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendues sur les souris sont faibles. Cependant, du stress et de la douleur peuvent être générés par les différentes procédures expérimentales (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l’étude.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux, à l’exception des souris naïves dites inconnues utilisées pour les tests comportementaux d’interaction sociale, seront mis à mort. Les souris naïves seront mises à disposition pour d’autres utilisateurs. L’intestin et le cerveau seront prélevés et des mesures ex vivo de motricité colique et de perméabilité colique seront effectuées ainsi que des analyses supplémentaires d’expression de protéines clés des fonctions digestives et cérébrales.

Remplacement

Une étude visant à évaluer le bénéfice thérapeutique d’un traitement sur les symptômes digestifs et comportement dans le cadre des troubles du spectre de l’autisme ne peut, à ce jour, être réalisée que sur des animaux.

Réduction

Des études antérieures publiées sur des modèles in vivo de colites et des approches in vitro conduites dans notre laboratoire sur des modèles de cultures de neurones entériques ont montré la bioactivité des VE fécales ou dérivées de probiotiques à induire des modifications fonctionnelles des neurones entériques et ainsi à déterminer la dose efficace de VE à administrer chez l’animal. Ces données et expériences préliminaires in vitro ont permis de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour révéler ces effets in vivo. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.

Raffinement

Le bien-être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Nous recevrons les souris gestantes au stade gestationnel embryonnaire de 6 jours, soit 5 jours avant le début du traitement avec le 2-mercapto-1-methylimidazole dans l’eau de boisson pour induire une hypothyroxinémie gestationnelle. Les souris gestantes seront hébergées collectivement dans un environnement enrichi avec frisottis et tunnels, puis seront transférées 3 jours avant la mise-bas dans des cages individuelles enrichies avec igloo pour leur permettent de construire leur nid. Pour la descendance, les souris seront hébergées collectivement dans des cages enrichies avec frosottis et tunnel. Concernant les tests comportementaux, une habituation d’1h est réalisée dans la pièce dédiée au comportement avant le début des tests. Pour le test du temps de transit colique distal par l’introduction d’une bille par voie anale dans le rectum, de la vaseline sera utilisée pour l’introduction de la bille. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel qualifié. L’évaluation des animaux sera effectuée selon des critères définis de poids, d’apparence physique (pelage, posture), d’activité, de comportement et de fréquence respiratoire. Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés régulièrement pour les femelles gestantes et au stade P10, P30 et P55 pour la descendance. Pour l’ensemble des procédures, des points limites sont mis en place. Si l’animal présente 2 ou 3 signes cliniques notables ou 1 signe clinique sévère, il sera retiré de l’étude et sacrifié. En cas de doute, nous ferons appel aux responsables de la SBEA de l’établissement. Si un seul signe clinique est notable, il sera alors demandé une consultation par le vétérinaire référent ou un responsable SBEA. Si un protocole d’analgésie s’avère nécessaire, les souris ayant eu une analgésie seront retirées de l’étude en raison du biais expérimental apporté par l’analgésie.

Choix des espèces

Des études antérieures conduites par nos collaborateurs ont montré la pertinence chez la souris du modèle d’hypothyroxinémie maternelle comme modèle d’autisme intégrant un facteur de risque maternel. De plus, nos études conduites dans le laboratoire montrant l’impact du microbiote fécal dans les troubles gastro-intestinaux et comportementaux ont été réalisées chez la souris. Les souris gestantes au stade gestationnel E4 seront réceptionnées à l’animalerie. Pour induire l’hypothyroxinémie, les souris au stade gestationnel E10 recevront 0,02% de 2-mercapto-1-methylimidazole (MMI) dissout dans l’eau de boisson jusqu’au stade E14 selon le protocole bien établi. Sur la descendance, les souris recevront le traitement avec les VE au stade 40 jours après la naissance, correspondant à un stade adolescent, encore en phase développementale de maturation cérébrale et intestinale. A cet âge, les symptômes gastro-intestinaux et comportementaux sont apparents. De plus cet âge est pertinent avec l’autisme, s’inscrivant dans une trajectoire développementale. Après 2 semaines de traitement, les souris seront étudiées au stade 54 jours après la naissance jusqu’à 58 jours.

Des souris femelles gestantes respirent un insecticide pyréthrinoïde huit heures par jour, du douzième jour de gestation jusqu'à la naissance de leur portée, et jusqu'à sept jours au-delà. 258 souris, mères et petits, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leur cerveau. Le porteur attend chez les mères des troubles digestifs, une hyperventilation, des déficits moteurs et des symptômes de type parkinsonien ou épileptique, et chez la descendance une mortalité accrue à la naissance ou un syndrome de type autistique, qui constitue précisément l'hypothèse testée. Les petits passent ensuite l'open field, la croix surélevée et le test d'interaction sociale à trois chambres, et le porteur affirme que reproduire une exposition par inhalation impose l'"organisme entier".

Objectifs

La prévalence de l'autisme ne cesse d'augmenter à l'échelle mondiale, devenant un problème de santé publique non négligeable. Les composantes environnementales ont un plus fort impact que les facteurs génétiques dans l'apparition de troubles du spectre autistique (TSA). Parmi elles, on retrouve les pesticides, néfastes pour les nuisibles mais également pour l'Homme dans le stades précoces du développement. En effet, diverses études épidémiologiques (Etats-Unis, France, Royaume-Uni...)) montrent une utilisation durant la dernière décennie de pesticides mais plus précisément d'insecticides à usage domestique dans 70 à 95% des cas. Ces produits sont retrouvés majoritairement sous forme de pulvérisateurs avec pour la plupart, comme substance active : les Pyréthrinoïdes (insecticides). Ainsi, une exposition aux pyréthrinoïdes pendant la période périnatale augmente le risque d'apparition de TSA, au travers d'un contact entre le pesticide et le foetus par l'intermédiaire de la mère qui l'inhale. Les agences environnementales alertent également sur leur utilisation intensive en air intérieur, notamment par les femmes enceintes car dans la société actuelle, la majorité de la population passe plus de 80% de son temps dans un environnement clos, taux augmentant à 95% pour les femmes enceintes. Nous avons précédemment montré que les concentrations de pyréthrinoïdes domestiques dans l'atmosphère intérieure sont 1000 fois plus élevées qu'à l'extérieur et que l'application aiguë de pyréthrinoïdes modifie l'activité électrophysiologique (activité électrique) des neurones des mammifères. Nous supposons qu’une exposition prénatale aux pyréthrinoïdes perturbe la séquence de développement des réseaux neuronaux et la synaptogenèse (connexions nerveuses), entraînant une altération durable des comportements sociaux et cognitifs. Nous sommes un consortium de neurobiologistes et de chimistes de l'atmosphère qui modéliseront l'exposition environnementale aux pyréthroïdes humains chez la souris. Nous focaliserons notre étude sur la deltaméthrine, un pyréthrinoïde de type II car il est le plus fortement détecté dans l'air ambiant ; l'Agence Française ANSES le classe parmi les 32 substances prioritaires ; enfin, il cible les récepteurs GABA et l'altération de la neurotransmission GABAergique est un mécanisme physiopathologique des TSA.

Bénéfices attendus

Face à l'orientation pandémique actuelle des TSA, la recherche doit aller au-delà des facteurs génétiques, sachant que les produits chimiques industriels largement disséminés dans l'environnement sont des contributeurs importants à cette pandémie. La nature innovante du projet est de démontrer le lien neurobiologique avec les preuves émergentes d'une association entre l'exposition prénatale à la pollution par les pyréthrinoïdes et l'apparition des TSA. Dans ce contexte, l'utilisation croissante d'insecticides ménagers commerciaux dans les atmosphères intérieures soulève des questions en raison des propriétés potentiellement dangereuses des substances actives pour la progéniture, étant donné que le niveau et la durée d'exposition à ces produits chimiques sont susceptibles d'être significatifs. La modélisation de cette exposition subaigue sur un modèle animal apportera donc des avancées importantes quant à la neurotoxicité des pyréthrinoïdes sur le cerveau en développement.

Procédures

Aucune intervention invasive ou chirugicale ne sera conduite sur les animaux. Les femelles gestantes seront exposées 8h/ jour à minima 7 jours (du stade embryonnaire jour 12 (E12) de gestation à la naissance de la portée) et jusqu'à 14 jours (du stade E12 de gestation à la naissance de la portée + 7 jours de vie). Cette procédure sera conduite à deux doses; l'une représente une dose mesurée en air intérieur (1µg/m^3) et l'autre une dose mesurée en air extérieure (10 ng/m^3). Des tests comportementaux seront effectués, à savoir : Les milestones entre les âge 3 et 15 jours afin de percevoir la présence de déficits sensori-moteurs caractéristiques des troubles autistiques pour une durée de 30 minutes par jour et par portée. Les enregistrements de vocalisations seront réalisées pendant 5 minutes sur des animaux âgés de 8-10 jours. Les tests comportementaux suivants seront réalisés sur des animaux âgés de 21 à 48 jours : le test de l'Open Field (10 minutes); la croix surélevée (5 minutes) et enfin le test d'interaction sociale à trois chambres (40 minutes).

Impact sur les animaux

Des effets indésirables sur les mères gestantes pourront être observés suite à l'inhalation de pyréthrinoides de type 2 : troubles digestif, hyperventilation, déficits cognitifs et moteurs avec symptomes de type parkinson ou de C-S syndrome (épilepsies). Les effets indésirables liés à l'exposition subaigue de l'insecticide sur la descendance sont une augmentation de la mortalité à la naissance ou un syndrome de type autistique ce qui est l'hypothèse de notre étude. Les tests comportementaux seront une source de stress engendrée par la séparation maternelle et les manipulations que nous prendrons en compte.

Devenir

L'ensemble des animaux seront sacrifiés dans la dernière étape de la procédure pour récuperer leur cerveau et permettre les analyses electrophysiologiques ou biochimiques.

Remplacement

L'objectif du projet étant de mimer l'exposition humaine par inhalation des insecticides sur un modèle animal afin de mesurer la neurotoxicité sur le comportement ainsi que sur l'activité nerveuse, ce projet ne peut pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, ces connaissances de l'impact de l'environnement sur le développement cérébral ne peuvant pas être transposées sur des modèles ex-vivo ou organoïdes, le remplacement n’est donc pas possible.

Réduction

Un plan d’expérience sera systématiquement rédigé avant les expérimentations dans un souci permanent d’optimisation du nombre d’animaux. Aucune étude antérieure n’a été menée sur ce projet auparavant. Nous envisageons l'utilisation de tests statistiques non paramétriques (Wilcoxon-Mann-Whitney, ANOVA 1 facteur - Kruskal Wallis, ANOVA 2 facteurs ) afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Les expériences seront conduites sur un seul modèle animal et une seule souche : souris de type sauvage. Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture exposée à l'insecticide, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Les mères et leur nouveau-nés seront hébergés sous environnement contrôlé, dans une cage d'exposition aux insecticides avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids, et avec la possibilité de boire et manger ad libitum. Afin de réduire la souffrance des expositions, celles-ci seront appliquées par inhalation et à des doses contrôlées par des mesures permanentes du taux d'insecticide (1µg/m^3 et 10ng/m^3). Les expériences de comportement sur la progéniture seront conduites uniquement en situations aigües et non chroniques. Afin de limiter leur stress, la salle de comportement est équipée d'un tapis chauffant, d'une lumière tamisée, d'un contrôle de la température. La pièce est silencieuse et ventilée. Le manipulateur frottera ses gants dans la sciure pour ne pas perturber les animaux par ses odeurs. Nous mettrons en place les points limites suivants: pour les femelles gestantes nous observerons la détérioration de l'apparence de l'animal, des difficultés respiratoires sévères et prolongées, la léthargie de l'animal (immobile, ne répondant pas aux stimuli), la perte de poids excessive (supérieure à 20% de son poids initial), diarrhée et température (suivi par caméra thermique). En fonction du score de l'animal (Annexe 3), les interventions seront : à surveiller (score de 3 à 5), demander un second avis et considérer l'euthanasie (score de 5 à 7) et souffrance sévère, prévoir l'euthanasie (score de 7 à 9). En ce qui concerne les descendants, les points limites seront l'apparition de troubles respiratoires (la cyanose), l'hypotonie néonatale, la perte de poids, et la prise de lait (visualisée au niveau de l'estomac).

Choix des espèces

Nous avons sélectionné la Souris pour plusieurs raisons: - L'objectif étant de reproduire l'exposition perinatale et par inhalation des femmes à un insecticide répandu, nous devons rester sur un modèle mammifère - Afin de pouvoir contrôler au mieux les concentrations d'expositions tout en considérant le bien être animal nous avons réalisé une chambre d'exposition dont le volume (30l) est approprié pour les rongeurs. - L'équipement que nous possédons sur notre plateforme comportementale afin de rechercher un phénotype autistique est adapté à la souris jeune et adulte et pas complètement au rat. - La période d'exposition (stade embryonnaire 12 à 7 jours post-natal) a été choisie car c'est une période critique pour le développement du système nerveux. Les expériences d'électrophysiologie sont réalisées au 7ème et 20ème jour post-natal afin d'observer la séquence développementale de l'activité excitatrice versus inhibitrice du GABA.

Pour tester si une molécule empêche la douleur du visage déclenchée par une inflammation, 130 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués ensuite pour le prélèvement de tissus nerveux. Chacun reçoit une injection intrapéritonéale par jour pendant cinq à huit jours sous anesthésie gazeuse, plus une injection sous-cutanée, puis passe chaque jour un test d'allodynie où un filament est appliqué sur sa face. Le porteur qualifie ces mesures de peu douloureuses au motif que l'animal peut se soustraire au filament, et attend de l'expérience qu'elle produise l'hypersensibilité douloureuse recherchée. Les rats qui perdent plus de 15 % de leur poids sont mis à mort.

Objectifs

Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse, qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la génèse de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau de la face sont peu connus.Nos résultats obtenus jusqu’à présent ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution d'un type de canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal astrocytaire, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Le projet étudiera s’il est possible de prévenir les inflammations sur les canaux astrocytaires et par conséquent la douleur, à l’aide d'une molécule capable de moduler l’expression du gène correspondant à la protéine du canal astrocytaire. Il combinera des approches moléculaires et comportementales, et sera réalisé sur des rats adultes mâles, âgés entre 4 et 8 semaines.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 2 : • Injections intra-péritonéales (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Afin de diminuer le stress lié aux tests de comportement et aux injections, les animaux ont une prériode d’adaptation suite à la livraision suivie d'une période d’habituation.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse protéique.

Remplacement

L’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tout ces éléments. C’est pourquoi il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc par il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections systémiques,comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à parti de 7 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 5 à 8 semaines (125 à 250 g), pour comparer avec les données du laboratoire.