Système nerveux

Toutes tuées pour extraire leur cerveau et vérifier que la lentille optique était au bon endroit, 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux opérations du crâne d'environ deux heures, reçoit un inhibiteur de la synthèse des protéines, et vit isolée en cage individuelle entre huit et seize semaines pendant les phases d'entraînement. Les séances consistent à explorer une enceinte à la recherche de récompenses alimentaires, vingt à quarante minutes par jour pendant environ huit semaines. Le porteur retient un effectif de 96 souris sur la base d'un taux de réussite d'implantation attendu de 50 %, et affirme que l'étude de ces circuits cérébraux exige un "organisme entier vivant".

Objectifs

L’objectif de cette saisine est de mettre en évidence le phénomène de marquage et capture synaptique (STC) chez l’animal vigile et de caractériser pour la première fois son implication fonctionnelle dans l’association temporelle de trace mnésique. Cet objectif sera réalisé à travers (1) l’étude du comportement lors de l’exposition à de nouveaux environnements couplée à (2) l’enregistrement simultané de l’activité calcique de neurones de l’hippocampe une région essentielle pour encoder la mémoire, (3) en présence ou en l’absence d’un inhibiteur de la synthèse protéique selon les environnements et les jours de tests, permettant ainsi d’utiliser chaque animal comme son propre contrôle (et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés) en comparant les résultats obtenus dans les environnements sans inhibition et avec inhibition. Pour cela, nous allons utiliser une technologie de pointe basée sur un système ultra miniaturisé et portatif permettant d’imager de manière longitudinale l’activité individuelle de multiples neurones en même temps chez l’animal libre de ses mouvements. La plupart des limitations habituelles éthiques et techniques liées à l’imagerie in vivo ont été gommées grâce à la conception de notre système d’imagerie : miniaturisation (moins de 2 cm et de 2 grammes) permettant de le placer directement sur la tête de l’animal de manière amovible comme un chapeau et sans entraver sans comportement normal. En outre, il permet de visualiser simultanément, à haute résolution et de manière répétée un nombre important de neurones par animal (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques implantables.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’apporter des éléments de connaissances des mécanismes sous-tendant l’association temporelle des traces mnésiques, un élément fondamental pour comprendre comment se forme la mémoire autobiographique, comment chaque individu peut voyager dans le temps de ses souvenirs et comment il peut s’adapter aux conditions présentes et futures en se basant sur ses expériences passées

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions chirurgicales (d’envrion 2h chacune) et une injection (subcutanée ou intrapéritonéale) entre les 2 séances d’exploration lors des entrainements et lors du test. Entrainements et tests comportementaux correspondant à une exploration libre de la souris d’une enceinte à la recherche de récompenses alimentaires (séance quotidienne de 20 à 40 minutes, ~8 semaines)

Impact sur les animaux

- Les chirurgies stéréotaxiques permettant l’injection du vecteur et l’implantation de la lentille optique avec son receptacle peuvent induire des douleurs post-opératoires légères à modérées avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal, les animaux étant traités avec un analgésique et récupérant rapidement de ce type de chirurgie. - Encombrement du système d’imagerie lors des tests, qui reste toutefois limité et léger (fibre optique et réceptacle seuls : < 0,2 g, miniscope < 2g), et n’entrave pas les mouvements et comportements normaaux de la souris après une première séance d’habituation. - Souris isolées lors des phases d’entrainements et tests après chirurgie (pour une durée comprise entre 8 et 16 semaines). - Douleur légère au niveau du site d’injection (ip, sc)

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau pour confirmer par histologie le bon positionnement de la lentille optique dans la zone cérébrale à imager puis doser l’expression de protéines cérébrales et comment celles-ci ont été influencées par l’apprentissage.

Remplacement

L’étude de circuits cérébraux et de leur implication dans lacmémoire et les réponses comportementales et physiologiques ne peut être réalisée qu’à partir de cerveau et d’organisme entier vivant.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques. En outre, le nombre d'animaux pourra être réduit en fonction des résultats et notamment de l’efficacité de l’implantation (maximum 96 souris avec un taux de succès attendu de 50% d’après la société du système d'imagerie et notre expérience ; minimum 48 souris avec un taux de succès de 100%).

Raffinement

Les méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont optimisés : Les injections/implantations intracérébrales se feront sous anesthésie générale par des chercheurs formés et expérimentés. Les animaux recevront un traitement analgésique avant l’intervention chirurgicale, un traitement anti-inflammatoire après l’intervention et 24 heures après. Pendant la chirurgie, chaque animal sera placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie et les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse (isoflurane) est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire (si reprise de poids déficiente ou température élevée, traitement antibiotique). En cas de plaie, les animaux recevront un traitement analgésique. La plaie est désinfectée par l’application de bétadine dermique. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être (hypothermie, prostration...) et intervenir si nécessaire (injection de saline pour l’hydratation, nourriture appétente...). Les injections sous-cutanées sont préférées aux intra-péritonéales pour leur plus grande sûreté et leur moindre invasivité. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites sont appliqués: les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. D’un point de vue scientifique, le système utilisé représente la méthode d’imagerie de résolution neuronale la plus moderne, performante et spécifique, permettant de visualiser simultanément à haute résolution un nombre important de neurones (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques d’imagerie.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des études des bases neurobiologique de la mémoire, de la formation des souvenir et de dysfonctions de la mémoire. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes normaux sous-tendant l’association temporelle de souvenirs et sa mise en mémoire dans des conditions normales. Il n’est pas nécessaire d’utliser des stades plus spécifiques du développement (précoce ou tardif).

Ouvertes sous anesthésie pour que leurs embryons reçoivent une injection intracrânienne suivie d'une impulsion électrique, les femelles gestantes de ce projet risquent l'avortement ou une mise bas prématurée. 2 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur note que les embryons peuvent ressentir une douleur de courte durée au moment de l'injection, leur crâne étant "encore totalement mou à ce stade", et que les cerveaux sont prélevés sur les souriceaux trois à cinq jours après la naissance pour cultiver des explants. Il affirme que ces cultures "permettent de réduire considérablement le nombre de souris utilisées puisqu'une seule souris permet de réaliser plusieurs essais", pour un effectif déclaré de 2 100 animaux.

Objectifs

Des altérations de la neurotransmission sont à la base de toutes les pathologies du cerveau. Le contrôle de la neurotransmission permet d’adapter les réponses des neurones et donc du cerveau aux modifications de l’environnement. Les microglies, qui sont les macrophages du cerveau, sont fortement impliquées dans le contrôle de la fonction synaptique. Un tel contrôle est important pour la physiologie du cerveau puisque les microglies représentent jusqu'à 20 pourcent des cellules du cerveau et qu'elles contactent en permanence 1 à 10 pourcent des synapses. En particuliers, les microglies sont nécessaires à la régulation des synapses inhibitrices : quand l’activité neuronale augmente, un rétro contrôle induit une augmentation du nombre de récepteurs au neuromédiateurs aux synapses inhibitrices ; ce rétro-contrôle ne peut pas se faire sans cytokines produites par les microglies. Le présent projet s’appuie sur ces observations et cherche à mieux comprendre les mécanismes de la régulation des synapses inhibitrices et à décrire les interactions morphologiques et fonctionnelles entre la microglie et les synapses.

Bénéfices attendus

Les microglies sont les macrophages du cerveau. Elles representent jusqu’à 20 pourcent des cellules selon les régions du cerveau. En permanence, elles envoient et retractent leurs prolongements qui contactent en permanence 1 à 10 pourcent des synapses. Pourtant, on ne sait pas encore à quoi servent ces interactions. Notre projet permettra de le comprendre. De plus, les microglies sont activées dans la quasi-totalité si ce n’est dans toutes les pathologies du cerveau, et elles ne sont donc plus dans un état physiologique. Il est donc probable qu’une perte des fonctions microgliales fasse partie de l’étiologie des pathologies du cerveau. Comprendre ces fonctions physiologiques a donc un intérêt majeur dans la compréhension des pathologies.

Procédures

Les femelles gestantes subiront une chirurgie unique sous anesthésie et analgésie d’une durée de 30 minutes. Les embryons subiront lors de cette chirurgie une injection intracrânienne suivie d’une impulsion électrique (électroporation in utéro). Les animaux seront ensuite euthanasiés par différentes méthodes réglementaires en fonction des analyses nécessaires

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes subiront une unique chirurgie pouvant entraîner un stress thermique et des risques liés à l’anesthésie (détresse respiratoire, mauvais endormissement, etc.). Les femelles pourront également ressentir de la douleur en post-opératoire avec également un risque infectieux ou de dessiccation. Au cours de cette chirurgie, les embryons seront manipulés afin de réaliser une électroporation in utero (injection d’une solution intracrânienne suivie d’une application d’un courant électrique sur la tête). Les embryons seront susceptibles de ressentir de la douleur de courte durée lors de l’injection. Il est à noter que le crâne est encore totalement mou à ce stade. Un risque d’avortement ou de mise bas prématuré existe également avec ce type de chirurgie.

Devenir

Nos études se fondent sur des cultures d'explants de cerveaux ou de cellules de cerveau dissociées. Il est donc indispensable d'euthanasier les animaux pour extraire leur cerveau.

Remplacement

Les études des interactions entre les microglies et les synapses doivent se faire dans un système qui récapitule les interactions spatiales et temporelles qui ont lieu dans le cerveau. A notre connaissance, ces interactions ne sont pas reproduites dans des systèmes en culture, mais sont acceptables dans des cultures organotypiques que nous utiliserons. De plus, nous souhaitons étudier l'importance cytokines et des mouvements des microglies et nous utiliserons des outils génétiques disponibles chez la souris qui permettent de les étudier.

Réduction

Nous utiliserons 2100 souris. Notre projet s'appuie sur des cultures d'explants qui permettent de réduire considérablement le nombre de souris utilisées puisqu'une seule souris permet de réaliser plusieurs essais. La taille des échantillons est calculée sur la base de nos études précédentes.

Raffinement

Les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de papier kraft ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons systématiquemnet de raffiner nos procédures pour optimiser le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études . Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la structure de bien être animale et ou la vétérinaire pourra être sollicitée. Les animaux sont hébergés dans des conditions standard : Hébergement en cages ventilées individuellement (moins de 6 souris/cages) - Salle d’hébergement en surpression - Cycle nycthémère de 12h (7h - 19h) - Hygrométrie de 55 plus ou moins 5 pourcent - Température 22 plus ou moins 2C - Change litière/abreuvement/nourriture 1 fois par semaine + vérification quotidienne - Enrichissement du milieu : papier kraft.

Choix des espèces

La souris est choisie pour plusieurs raisons dont les plus importantes sont la disponibilté des modèles transgéniques et de manipulations génétiques multiples, et l'existence de nombreuses études antérieures qui nous permettent d'étayer notre projet. Les électroporation in utéro se font entre 13,5 et 15, 5 jours après fécondation (début du 3eme tiers de la gestation) , au moment où les neurones qui nous interessent sont générés. Les cultures organotypiques de cerveaux se réalisent à partir de cerveaux de souris 3 à 5 jours après la naissance et on sait que dans ces conditions, les régulations microglies-synapses sont conservées .

Élevées sans aucune cachette sous une lumière colorée de 3 000 lux douze heures par jour, 240 jeunes seiches européennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique qu'il ne peut pas enrichir les bacs, un abri permettant aux animaux d'échapper à la lumière et ruinant du même coup l'expérience. Toutes sont tuées par refroidissement progressif, dix à quinze minutes entre l'anesthésie sous six degrés et la mort sous quatre, pour prélever et fixer leurs tissus. Parmi les bénéfices annoncés, le projet doit "optimiser les conditions d'élevage et d'hébergement" d'une espèce dont le porteur précise que les standards restent en cours d'élaboration.

Objectifs

Parmi les animaux aquatiques, les céphalopodes montrent des capacités de camouflage complexes et uniques. Le camouflage est permis par les motifs colorés qui sont dynamiques et changeants. Les couleurs sont dues aux pigments contenus dans les chromatophores, organes dont l’activité est contrôlée directement par le cerveau, permettant ainsi des modifications rapides des motifs. Notre espèce est la seiche européenne dont le développement et les premiers mois de vie se déroulent en milieu côtier. La pigmentation de la peau par les chromatophores a lieu dès la phase embryonnaire et les motifs se complexifient après éclosion, en lien avec les facteurs environnementaux directs, comme la lumière et le fond sur lequel elles vivent. Ce projet a pour objectif de tester différents facteurs comme l’effet d’un éclairement de “couleur” différente et la couleur du bac sur le niveau de pigmentation des animaux au cours de leur développement après éclosion. Par une expérimentation conduite sur des juvéniles de seiche, nous déterminerons si la “couleur” différente de la lumière d’éclairement et la couleur du bac modifient 1) les régulations moléculaires en lien avec la synthèse des pigments et 2) la couleur générale adaptée au fond et au type de lumière. Ce projet permettra une meilleure connaissance des adaptations et des effets des changements environnementaux sur le cycle de vie de ces animaux marins, il permettra d’élaborer des hypothèses évolutives et fonctionnelles sur l’influence du facteur couleur du bac et couleur de la lumière au cours du développement, chez l’embryon et chez le juvénile après éclosion. Ce projet permettra également d’optimiser les conditions d’élevage et de maintien des juvéniles Des caméras situées au-dessus des bacs permettent d’évaluer l’intensité de pigmentation des juvéniles en expérimentation par acquisitions d’images.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’identifier si la couleur de la lumière et la couleur du bac sont des facteurs importants dans le contrôle de la mise en place de la pigmentation. L’approche par l’expression des gènes permet de tester les régulations moléculaires mises en place par l’animal face à son environnement et de les corréler avec la pigmentation observée (plus ou moins foncée) et son comportement de camouflage. Il a été montré chez des poissons que la “couleur” d’éclairement et la couleur du bac entrainaient des différences de pigmentation. Nous avons observé une pigmentation plus importante des jeunes seiches élevées sur bac de couleur noire et nous souhaitons confirmer ou infirmer cette observation. Tester chez la seiche l’ effet éventuel de la “couleur” de lumière et de la couleur du fond permettrait d’apporter des éléments de réponse à la mise en place et la régulation des motifs colorés, qui conditionnent chez l’adulte la qualité du camouflage. En plus de mieux comprendre les facteurs conditionnant la mise en place des motifs colorés, ce projet permettra d’optimiser les conditions d’élevage et d’hébergement et le bien-être animal de cette espèce pour laquelle les standards d’élevage sont en cours d’élaboration.

Procédures

Les animaux sont soumis à des éclairages différents (photopériode de 12h de lumières et 12h de nuit). Les animaux ne subissent aucune intervention avant leur mise à mort. Lorsqu’ils sont retirés des bacs à l’épuisette, ils sont immédiatement transférés dans un récipient. La mise à mort dérogatoire par le froid amène progressivement les animaux vers une anesthésie (

Impact sur les animaux

Trois prélèvements manuels à l’épuisette d’une durée de 10 à 20 secondes sont prévus par aquarium sur toute la durée de l’expérimentation, ce qui peut occasionner un stress passager. En l’absence de cachettes, on ne peut exclure que l’éclairement appliqué avec une intensité peu élevée d’environ 3000 lux et le type de couleur d’éclairement puissent occasionner une nuisance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus. Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique la mise à mort des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréversibles (pas de survie après prélèvement des organes/tissus d’intérêt).

Remplacement

Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à comprendre la mise en place chez la seiche des motifs colorés qui constituent un élément fort du comportement de camouflage. Le développement requiert l’implication des organes du système nerveux (entre autres) qui contrôle ces éléments cutanés. Il s’agit donc d’un projet nécessitant un organisme entier intègre. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle

Réduction

La mise en place de collecteurs (support de ponte artificiel) relevés tous les jours dans le milieu naturel permet de récolter le nombre d’œufs nécessaires pour réaliser cette expérimentation en s’affranchissant de la conservation d’un stock de géniteurs en laboratoire. Il n’y a donc pas de maintenance de géniteurs sauvages. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Expérimentalement et statistiquement, le nombre de 10 animaux par groupe est un minimum afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique.

Raffinement

Les juvéniles éclosent dans leur aquarium d’origine (où ont été déposés les œufs); ils ne sont donc pas déplacés. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée (petites crevettes et mysis sp.) deux fois par jour (matin et après-midi). L’acquisition de données relatives à la pigmentation des animaux est réalisée sur photos prises par une caméra directement installée au-dessus du bac afin de limiter l’intervention humaine. Les rations sont réévaluées quotidiennement pour adapter la quantité d’aliment distribué à la biomasse de l’aquarium. Il n’est pas possible d’ajouter un enrichissement physique sous la forme de cachettes diverses (pièces en plastique) car cela contrecarrerait les objectifs du projet en permettant aux animaux de ne plus être sous l’influence de la lumière. L’éclairement est appliqué sur une période de 12h ; l’intensité de l’éclairement est d’environ 3000 lux grâce à la mise en place d’un variateur permettant la modulation de l’intensité. La mise en route ou l’arrêt de l’éclairement s’effectue sur une période de 30 min. Le bien être des animaux est évalué quotidiennement par une feuille de suivi permettant de quantifier l’expression de points limites en expérimentation.

Choix des espèces

Les céphalopodes sont les seuls mollusques possédant des capacités cognitives et des comportements élaborés. La seiche européenne pond des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, il n'y a pas de larves chez les seiches et les juvéniles se développent en 2 mois maximum ce qui permet de réaliser des observations. Les individus du projet sont des juvéniles après éclosion, pour évaluer la pigmentation et son contrôle nerveux, l’animal étant en lien direct avec les facteurs environnementaux.

Deux chirurgies du crâne de deux heures chacune, puis une injection sous-cutanée quotidienne pendant six à neuf semaines : 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une lentille optique implantée dans le cerveau et vivent seules en cage individuelle huit à seize semaines, avec une alimentation contrôlée pour rester motivées à chercher des récompenses dans une enceinte de test. Le porteur affirme que son dispositif miniature a "gommé" la plupart des limitations éthiques de l'imagerie in vivo et n'entrave pas les comportements normaux de la souris, quand l'isolement prolongé et la restriction alimentaire figurent au même protocole. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau et vérifier que la lentille était bien placée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer de quelle manière un traitement antidépresseur peut modifier le traitement de l’information et les codes neuronaux de la région cérébrale appelé hippocampe, une région essentielle pour la mémoire et l’adaptation aux conditions de stress. Cet objectif sera réalisé à travers (1) l’étude du comportement de souris traitées à un antidépresseur ou à un placebo lors de l’exposition à de nouveaux environnements couplée à (2) l’enregistrement simultané de neurones de la région d’intérêt. Pour cela, nous allons utiliser une technologie de pointe basée sur un système ultra miniaturisé et portatif permettant d’imager de manière longitudinale l’activité individuelle de multiples neurones en même temps chez l’animal libre de ses mouvements. La plupart des limitations habituelles éthiques et techniques liées à l’imagerie in vivo ont été gommées grâce à la conception de notre système d’imagerie : miniaturisation (moins de 2 cm et de 2 grammes) permettant de le placer directement sur la tête de l’animal de manière amovible comme un chapeau et sans entraver sans comportement normal. En outre, il permet de visualiser simultanément, à haute résolution et de manière répétée un nombre important de neurones par animal (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques implantables.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’apporter des éléments de connaissances des mécanismes et impacts des antidépresseurs à des niveaux cognitifs et neuronale permettant de comprendre comment les antidépresseurs peuvent induite leurs effets thérapeutiques et à l’avenir créer de nouvelles apporches favorisant ces effets

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions chirurgicales (d’envrion 2h chacune) et un traitement antidépresseur quotidien par voie subcutanée pendant 6 à 9 semaines. Entrainements et tests comportementaux correspondant à une exploration libre de la souris d’une enceinte à la recherche de récompenses alimentaires (séance quotidienne de 30 à 40 minutes, ~6 semaines)

Impact sur les animaux

- Les chirurgies stéréotaxiques permettant l’injection du vecteur et l’implantation de la lentille optique avec son receptacle peuvent induire des douleurs post-opératoires légères à modérées avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal, les animaux étant traités avec un analgésique et récupérant rapidement de ce type de chirurgie. - Encombrement du système d’imagerie lors des tests, qui reste toutefois limité et léger (fibre optique et réceptacle seuls : < 0,2 g, miniscope < 2g), et n’entrave pas les mouvements et comportements normaaux de la souris après une première séance d’habituation. - Souris isolées après l’implantation du réceptacle, lors des phases d’entrainements et lors des tests (souris hébergées en cage individuelle pour une durée totale comprise entre 8 et 16 semaines). - Douleur légère au niveau du site d’injection (ip, sc)

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau pour confirmer par histologie le bon positionnement de la lentille optique dans la zone cérébrale à imager puis doser l’expression de protéines cérébrales et comment celle-ci a été influencée par le traitement antidépresseur.

Remplacement

Ce modèle s'intéressant à l’activité du cerveau, aux effets cognitifs et comportementaux à la suite de traitement antidépresseur. Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques. En outre, le nombre d'animaux pourra être réduit en fonction des résultats et notamment de l’efficacité de l’implantation (maximum 104 souris avec un taux de succès attendu de 50% d’après la société du système et notre expérience ; minimum 52 souris avec un taux de succès de 100%).

Raffinement

Les méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont optimisés : Les injections/implantations intracérébrales se feront sous anesthésie générale par des chercheurs formés et expérimentés. Les animaux recevront un traitement analgésique avant l’intervention chirurgicale, un traitement anti-inflammatoire après l’intervention et 24 heures après. Pendant la chirurgie, chaque animal sera placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie et les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire (si reprise de poids déficiente ou température élevée, traitement antibiotique de penicilline). En cas de plaie, les animaux recevront un traitement analgésique. La plaie est désinfectée par l’application de bétadine dermique. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être (hypothermie, prostration...) et intervenir si nécessaire (injection de saline pour l’hydratation, nourriture appétente...). Les injections sous-cutanées sont préférées aux intra-péritonéales pour leur plus grande sûreté et leur moindre invasivité. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites sont appliqués: les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. D’un point de vue scientifique, le système utilisé représente la méthode d’imagerie de résolution neuronale la plus moderne, performante et spécifique, permettant de visualiser simultanément à haute résolution un nombre important de neurones (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques d’imagerie.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des pathologies psychiatriques. En outre, les traitements de référence ont démontré leur efficacité dans cette espèce. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes sous-tendant les effets cognitifs et thérapeutiques des antidépresseurs qui sont prescrits en premier lieu pour la dépression majeure de l’adulte chez l’homme.

Pour savoir si la présence d'un congénère modifie la consommation d'héroïne, 1 910 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit au moins une chirurgie sous anesthésie générale, injection intracérébrale d'une heure trente, implantation d'électrodes ou de fibres optiques de trois heures, pose de cathéter d'une heure, puis porte un capuchon de ciment dentaire sur le crâne. Une partie s'auto-administre l'héroïne, d'autres sont placés en position d'observateurs. Le porteur indique que la surconsommation peut conduire à une overdose et à la mort, que les rats sont isolés après l'opération et que leur alimentation reste contrôlée pour les garder motivés. Il justifie le recours au rat par le fait qu'il "s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'humain" et par l'interdiction, en France, de fournir des drogues d'abus dans une expérimentation humaine.

Objectifs

Le rôle du contexte social dans la consommation de drogue n’est pas bien déterminé. Chez le rat, la diffusion d’un enregistrement de vocalises ultrasoniques, que les rats émettent pour communiquer les uns avec les autres, diminue la consommation de cocaïne, de même que la présence physique d’un congénère avec lequel il peut interagir. Cette diminution est d’autant plus forte lorsque le congénère est inconnu plutôt que familier (c’est à dire le partenaire de cage). Ces effets peuvent varier en fonction du type de drogue ou de son mode d’administration. On observe ainsi à l’opposé une augmentation de la consommation d’alcool chez le rat mis en présence d’un congénère. Ce projet vise à évaluer l’impact de ces contextes sociaux sur la consommation d’un autre type de drogue, l’héroïne. Le noyau subthalamique (NST) est impliqué dans les comportements de recherche et consommation de drogue et son implication dans l’influence de la présence d’un congénère ou la diffusion d’un enregistrement de vocalises ultrasoniques a été mis en évidence. Ses connections avec d’autres structures cérébrales, pourraient, elles aussi, être impliquées dans ces processus. Le but de ce projet est donc de caractériser les réseaux cérébraux liés au NST responsables des modulations de la prise d’héroïne dans les contextes sociaux décrits précédemment. Nous utiliserons différentes techniques afin d’évaluer sélectivement le rôle de chaque connexion. Notre objectif est également de mettre en évidence d’éventuelles différences en fonction du sexe des individus, en étudiant à la fois des rats mâles et femelles. Dans son ensemble, ce travail conduira à une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques d’un effet du contexte social, déterminant pour la réduction des risques de consommation de drogues.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de découvrir quels sont les substrats cellulaires et moléculaires du NST et de son réseau pour mieux comprendre les processus émotionnels en lien ou non avec la prise de drogue, notamment l’effet du contexte social, qui peut être protecteur ou non en fonction de la drogue consommée. Pour cela, nous utiliserons la présence d’un observateur, qui permet une approche plus écologique et plus réaliste de la consommation de drogue chez l'humain. L’identité du congénère variera en fonction de sa familiarité, de son sexe et de son historique de consommation afin de déterminer l’impact de chaque paramètre social sur la consommation d’héroïne. En plus d’améliorer les modèles animaux d’addiction, ce projet générera des résultats à fort impact translationnel, apportant de nouvelles perspectives sur la physiopathologie de l’addiction, des potentiels effets réducteurs de risques des interactions sociales et confirmera le potentiel de la manipulation du NST pour le traitement de cette pathologie. Il permettra aussi de mieux comprendre les potentiels effets secondaires de la manipulation du NST. De plus, il permettra de mettre en évidence le rôle du NST dans la motivation et les comportements sociaux, et d’appréhender de nouvelles bases neurales de certains troubles liés, comme celui du spectre autistique.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet seront soumis au moins une fois à un acte chirurgical, réalisée sous anesthésie générale. Ces interventions peuvent être de différents types : injection intracérébrale (1h30), implantation d’électrodes ou de fibres optiques (3h), pose de cathéter (1h).

Impact sur les animaux

* Les nuisances attendues sont les conséquences « classiques » à court terme des interventions chirurgicales. Durant les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation de fibres optiques, de même que celle des électrodes, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période. * Un autre type de nuisance, pouvant engendrer du stress, est l’appariement fait entre les animaux de façon aléatoire à la réception des individus. Lorsque l’alimentation devient contrôlée (les animaux ne sont pas restreints, mais pas ad libitum), un sujet très dominant peut empêcher son partenaire de cage de s’alimenter correctement. * Les matériaux utilisés pour fabriquer et maintenir les cathéters ou fibres optiques ou électrodes, peuvent parfois engendrer des ‘bagarres’ entre partenaires de cage. En effet, les éléments en plastique, plus ou moins mous, les constituant, peuvent être ‘rongés’ par l’un des rats, provoquant ainsi une gêne et/ou un stress chez l’autre individu * La consommation d’héroïne n’induit pas d’augmentation générale de l’activité de l’animal, mais au contraire peut avoir un effet sédatif. Ces effets diminuent rapidement (environ 1h) après la dernière dose auto-administrée. * La surconsommation de drogue peut conduire à une overdose et la mort de l’animal. * Après une perte de contrôle de la consommation de drogue (protocole d’escalade de la consommation), l’animal n’ayant pas accès ad-libitum à la drogue, il peut présenter des symptômes de manque. * Les injections éventuelles d’analgésiant et d’anesthésique, de même que l’entretien du cathéter peuvent également engendrer du stress.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort après les études comportementales afin de vérifier que les injections des virus et implantations de fibres optiques et le cas échéant, d’électrodes d’enregistrement aient été correctement localisées. Cela est nécessaire afin de confirmer que les effets observés sur les comportements des rats soient liés aux structures cérébrales ciblées.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigile et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude. Le recours à des méthodes invasives exclut de fait les études chez le sujet humain, d’autant qu’il est interdit en France de fournir des drogues d’abus dans le cadre d’expérimentation humaine.

Réduction

L’expertise acquise dans l’équipe sur ce type d’expérience nous a permis de fixer a priori le nombre d’animaux nécessaires. Par expérience, 10 animaux sont nécessaires par condition testée pour permettre de mettre en évidence un effet comportemental dans les protocoles d'auto-administration de drogues ; ce nombre prenant en compte l’exclusion de certains individus suite à d’éventuels problèmes inhérents à ce type d’étude (infection, cathéter bouché etc…). Pour les études combinant auto-administration et optogénétique et electrophysiologiques, 15 animaux par condition testée sont nécessaires pour anticiper de possibles mauvais placements des fibres ou électrodes. Pour la photométrie, 5 animaux par groupes sont suffisants. Les rats observateurs naïfs à la drogue pourront venir d’autres protocoles de l’équipe après accord de la SBEA (Structures chargées du Bien Etre des Animaux) afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. Les rats observateurs non naïfs à la drogue seront les mêmes que les rats sujets qui s’auto-administreront la drogue.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation à l'animalerie ainsi qu'aux expérimentateurs avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress potentiel. La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques. Une grille de score sera utilisée systématiquement en période post-opératoire, ainsi que tout au long de l’expérimentation pour le suivi du bien-être des animaux, afin de surveiller au mieux les animaux et prendre les décisions les plus adaptées sans attendre. La souffrance des animaux sera limitée au maximum par une surveillance quotidienne. Les animaux seront hébergés si possible par 2 dans leur cage à l'animalerie, avec accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. En effet, les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l’humain. De plus le rat est un animal social dont le comportement se rapproche de l’humain, avec mise en place d’un système hiérarchique et organisé, un communication visuelle, olfactive, auditive et tactile. C’est un bon modèle d’étude du comportement social. Afin d'améliorer la précision de nos chirurgies, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez des rats adultes (>7-8 semaines), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

56 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un capteur cardiaque implanté sous anesthésie, puis subit échocardiographies, mesures de pression artérielle et prélèvements sanguins répétés, et vingt-quatre d'entre eux une ligature de l'artère coronaire gauche que le porteur reconnaît potentiellement létale. L'intoxication par la ciguatoxine peut provoquer diarrhées, troubles neurologiques et cardiovasculaires, les rats perdant plus de 15 % de leur poids étant alors mis à mort. Le porteur revendique de vouloir "exploiter au maximum chaque animal inclu dans le protocole" et prévoit le prélèvement des tissus cardiaques, neuronaux, adipeux et musculaires après la mise à mort.

Objectifs

La ciguatera (CG) est une maladie induite par les ciguatoxines (CTXs), naturellement prduites par certaines algues (microscopiques). Elles sont responsables d'intoxication alimenatire non bactérienne aux fruits de mer la plus courante dans le monde. L'explosion du trafic maritime, s'accompagnant de l'augmentation du volume des eaux de ballast transportées et mélangées, contribue considérablement à la propagation du plancton des zones tropicales contaminées, plus particulièrement d'Asie et d'Asie du Sud-Est, vers les côtes tempérées sujettes au réchauffement climatique. La CG, pourrait largement se propager, nottamment en méditérranée et prendre la forme d'une pandémie. L'absence de tests de détection rapide augmente l’exposition à la CG. De plus, aucun traitement ciblé n'est actuellement disponible en raison d'un manque d'identification précise des mécanismes moléculaires, physiologiques et pathologiques associés. La CG se manifeste par de multiples symptômes indéfinis (gastro-intestinaux, cardiaques, neuronaux, cutanés et inflammatoires), accentués en cas d'antécédents cliniques. Plusieurs cibles de canaux ioniques (canaux sodiques, potassiques et calciques), protéines essentielles au bon fonctionnement des cellules sont suspectées dans la CG. Les CTXs seraient capables de moduler l’activité de ces protéines canal pour modifier, notamment, les flux ioniques responsables du fonctionnement cardiaque et neuronal. Notre objectif est de caractériser le mode d’action et conséquences des CTXs sur la fonction cardiaque/vasculaire et le système nerveux in vivo. Nous souhaitons savoir si les effets liés à une intoxication aux CTXs et nottament à la Ciguatoxine 1B (CTX1B), peuvent être modulés par différents traitements préventifs et curatifs. Dans un second temps, ceci pourrait permettre de déterminer de nouveaux outils de diagnostic de la CG ainsi que de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser in vivo la nature des effets induits par une intoxication à la Ciguatoxine 1B (CTX1B). En particulier, nous determinerons la nature des altérations cardiaques (structurelle et/ou fonctionnelle) et vasculaires ainsi que le rôle des atteintes du système nerveux autonome dans ces conséquences délétères. A partir ders pélèvements sanguins, nous determinerons si certains marqueurs sanguins sont augmentés/diminués après une contamination à la CTX1B. De récentes études cliniques ont montrées une augmentation de lactate dans le sang évoquant une hypoxie tissulaire en rapport avec une insuffisance cardiovasculaire. Le suivi ECG nous permettra de voir si la CTX1B module le rythme cardiaque chez les sujets contaminés. Les prélèvements post-mortem permettrons de faire une exploration plus approfondie des tissus cardiaques et neuronaux, afin de voir les effets directs de la CTX1B, mais aussi sur les tissus adipeux et du muscle squeletiques pour détecter le site de stockage de la CTX1B dans l’organisme.

Procédures

La totalité des animaux (soit 56 animaux) seront tous soumis aux mêmes gestes techniques : échocardiographie (environ 15 min/ animal), électrocardiogramme (ECG, recueil des données pendant 24h/animal de façon non invasive) par télémétrie, prélèvement de sang (quelques secondes/animal), mesure non invasive de la pression artérielle (environ 15 minutes/animal). Ces gestes techniques seront chacun réalisés à 3 reprises sur la durée du protocole expérimental (19 jours pour 32 animaux et 24 jours pour 24 animaux). Vingt-quatre animaux seront soumis à ces gestes techniques à 4 reprises ainsi qu'à une chirurgie via la ligature de l'artère coronaire gauche. Il existe un risque que cette chirurgie nécessaire à l'induction d'une sensibilisation aux arythmies cardiaques soit léthale. Cette chirurgie, d'environ 1 heure/ animal, nécessitera une anesthésie générale des animaux. Des soins particuliers leur seront administrés en pré et post-opératoire. De plus, la totalité des animaux sera soumise à une chirurgie nécessitant une anesthésie générale pour l'implantation du capteur permettant le recueil des paramètres ECG d'une durée d'environ 25 min/ animal. Des soins particuliers leur seront administrés en pré et post-opératoire afin d'éviter toute douleur de l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront d'une part ressentir les symptômes classiques de la CG chez l’Homme, tels que : - Troubles gastro intestinaux (48-72h post infection) - Troubles neurologiques (48-72h post infection) - Troubles cardiovasculaires. (48-72h post infection). Ces troubles, notamment gastro intestinaux, peuvent induire des phénomènes de diarrhées pouvant mener à une perte de poids de l’animal. Si une perte de poids > 15% du poids initial est constatée, alors le point limite de l’expérimentation sera atteint et nécessitera la mise à mort de l’animal. Les groupes d'animaux sensibilisés pour les arythmies cardiaques via la ligature d'une artère coronaire ont un risque élevée de mortalité inhérent à la procédure. Le projet necessite l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Ces animaux implantés devront être isolés en cage unique uniquement pendant l'enregistrement de l'ECG (24h/ acquisition).

Devenir

A la fin des protocoles expérimentaux tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements post-mortem (tissus cardiaques, neuronaux, adipeux, musculaires).

Remplacement

La CG est une pathologie syndromique incluant de nombreux effets systémiques. Il n’existe pour l'heure pas de modèle in vitro sur lequel ont été relevés les effets cardiaques, effets vasculaires et effets sur le système nerveux autonome grâce à un modèle capable de mimer les conditions physiopathologiques induites par la Ciguatoxines 1B (CTX1B). .

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux via l'utilisation d'outils statistiques et en couplant plusieurs approches (echocardiographie, ECG par télémétrie, prélèvement de sang, mesure non invasive de pression arterielle), compatibles entre elles, et effectuables sur un même animal. Un suivi dans le temps sera également éffctué. L'ensemble des animaux sera prélevé post-mortem (tissus cardiaques, neuronaux, adipeux, musculaires) pour exploiter au maximum chaque animal inclu dans le protocole.

Raffinement

Notre objectif est de réduire au strict minimum la détresse imposée aux animaux. Les rats seront hébergés par groupes de 3 par cages dans un environnement calme, sous contrôle de luminosité, de l'hygrométrie et de la température, de manière appropriée avec un enrichissement du milieu (barre de bois, cabane, carré de ouate) permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Après chirurgie pour mise des télétransmetteurs, les animaux seront placés en couveuse thermorégulée et surveillés pendant un minimum de 3 heures. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les points limites établis dans ce projets seront appliqués. Nous allons fournir les soins per- et post-opératoires appropriés via l'administrations d'anesthésiques et d'analgésiques. Nous évaluerons entre autres les critères de souffrance animale communément utilisés (rythme cardio- respiratoire, reprise de mouvement, un état de prostration, l’hydratation). En cas de détresse anormale, les animaux seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, après analgésie.

Choix des espèces

Le modèle de rat Wistar est un modèle largement caractérisé sur le plan cardio-vasculaire, dont un nombre important de travaux est décrit dans la littérature (inculant ceux du laboratoire). La physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme (régulations et structure morpho-fonctionnelle, régulation par le système nerveux autonome). Le modèle rat a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo selon les mêmes techniques exploratoires employées chez l’homme. Les animaux entreront dans le protocole à un stade mature pour éviter tout problème lié au développement.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant deux chirurgies du crâne puis cinq à six semaines dans une cage divisée par une cloison de plexiglas, une souris par compartiment. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. La première chirurgie dure environ 45 minutes, la seconde de 90 à 120 minutes, et une sédation d'une heure sert à fixer une prothèse sur la tête, que l'animal apprend ensuite à porter au cours de séances de deux à six minutes avant une tâche comportementale que le porteur qualifie de légèrement désagréable. Le bénéfice annoncé, repérer un oubli anormal comme marqueur précoce de la maladie d'Alzheimer, reste une piste pour des travaux ultérieurs, quand la séparation des congénères et les deux ouvertures du crâne sont, elles, programmées.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est une affection progressive et mortelle, représentant la maladie neurodégénérative la plus répandue. Un diagnostic précoce s'avère crucial dans la recherche préclinique et clinique sur la MA, car il ouvre une fenêtre thérapeutique opportune pour initier des interventions avant l'installation d'un déclin cognitif sévère. L'accumulation de la protéine bêta-amyloïde dans la partie frontale du cerveau est associée à une perte de mémoire rapide, constituant un symptôme précoce de la MA détectable par des évaluations cognitives expérimentales et cliniques bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers signes signalés par les proches des patients. Fondée sur ces découvertes et sur des données préliminaires obtenues dans notre laboratoire, qui indiquent une activité neuronale anormale dans diverses conditions pathologiques, notre étude actuelle vise à explorer les changements des circuits cérébraux liés à l'intégration d'informations nécessaires à la consolidation de la mémoire et à l'oubli.

Bénéfices attendus

Ainsi, l'oubli précoce pourrait constituer une cible potentielle pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'émergence de formes plus graves de la maladie d'Alzheimer (MA). Nos recherches antérieures et actuelles sur le rôle des modifications de l'excitabilité neuronale dans le processus de formation de la mémoire nous conduisent à proposer une exploration des altérations des circuits du cortex préfrontal en tant que marqueur précoce d'un oubli anormal dans la MA. En se basant sur les données obtenues, nous pourrions identifier des cibles prometteuses pour de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie : la première intervention durera environ 45 minutes ; la deuxième intervention durera de 90 à 120 minutes. Ils subiront également une intervention sous sédation (sans acte invasif, d'une durée d'environ 60 minutes) pour la pose d’une prothèse sur la tête. Après la deuxième intervention chirurgicale et jusqu'à la réalisation des études d'imagerie calcique et de comportement, les animaux seront placés dans des cages collectives séparées en deux zones par une séparation en plexiglas transparent (deux souris par cage, une souris par zone) pendant une période de 5 à 6 semaines. Ils seront progressivement entraînés (lors de séances de durée croissante de 2 à 6 minutes) à accepter la pose d'un objet sur leur tête. Ils effectueront une tâche comportementale légèrement désagréable d’environ 6 minutes en présence de l’appareil d’imagerie (posé sur la tête). Ils seront ré-exposés au même dispositif de comportement le lendemain et 14 jours plus tard (pendant environ 6 minutes) afin d'évaluer leur mémoire.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent deux interventions chirurgicales : le risque d’inconfort, de douleur, d’infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. Ils seront endormis une fois de plus, ce qui pose un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront soumis à une tâche comportementale qui est légèrement désagréable et stressante pour l’animal. Celui-ci est entraîné à porter l'appareil d'imagerie sur sa tête, ce qui représente une contrainte pour sa posture. La pose de la prothèse implique également une contrainte pour l'animal et nous oblige à adapter les conditions d'hébergement.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la formation et le stockage de la mémoire dans le cerveau et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) qui se prête facilement à la modification de son ADN, iii) possédant un néocortex, la partie la plus récente et la plus évoluée du cortex cérébral chez les mammifères, iv) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. De plus, nous étudions le stade précoce de la maladie, lorsque les symptômes n'apparaissent pas nécessairement chez l'homme. Le tissu post-mortem humain n'est pas disponible et les biopsies ne sont pas pratiquées pour cette condition. Les modèles informatiques actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.

Réduction

Afin de n'utiliser qu'un nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison, nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. analyse effectuée en petits lots avec une expérience par jour). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire, selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant.

Raffinement

Les mesures de raffinement comprennent observation quotidienne des animaux et vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) en utilisant des critères généraux ainsi que des signes cliniques spécifiques à la manipulation. Les critères pour évaluer la souffrance incluent l'apparence et le comportement général de l'animal. Tout signe de souffrance, de douleur ou de détresse (comme un comportement inhabituel ou un pelage négligé) entraînera une réponse immédiate et adaptée. Cela peut inclure des mesures conservatoires comme isoler temporairement l'animal, administrer du glucose, le réchauffer dans une couveuse ou soigner les blessures en cas de bagarre avec d'autres animaux. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas après ces mesures, l'expérimentateur décidera de l'euthanasier si nécessaire, en consultation avec le vétérinaire et l'équipe des soigneurs. Les animaux sont manipulés quotidiennement avant les expériences pour réduire leur niveau de détresse. Les conditions d'hébergement sont adaptées en maintenant les animaux dans des cages collectives contenant des enrichissements tels que des tubes en carton et du matériel pour la nidification. Pour intégrer de nouvelles techniques de raffinement, les expérimentateurs reçoivent une formation régulière et consultent des sites éducatifs comme NC3R.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris car nous souhaitons exploiter un modèle impliquant la production d'amyloïde bêta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammifère pour laquelle il est possible, de manière routinière, de modifier l'ADN et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Les souris auront entre 8 et 10 semaines au début des procédures (c'est-à-dire la chirurgie) et entre 14 et 18 semaines au moment du test comportemental. Selon les données précédemment rapportées et nos données préliminaires sur le développement de la pathologie, il s'agit de l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave. Nous voulons étudier la phase précoce qui se situe vers 14-18 semaines d'âge. Les animaux seront utilisés pour un test de comportement qui nécessite l'utilisation d'animaux adultes. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les études publiées et les expériences antérieures dans notre équipe.