Système nerveux

1 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, une chirurgie stéréotaxique intracérébrale de quarante minutes, une légère décharge électrique et une série de tests comportementaux (activité motrice, exploration, anxiété, attention, mémoire associative), avant d'être tuées pour prélever le cerveau. Le porteur décrit des atteintes limitées, un stress lié à l'anesthésie et aux tests, mais ne précise pas les effets de la décharge électrique. Il affirme que ces explorations sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro et espère identifier des cibles thérapeutiques contre les troubles neuropsychiatriques.

Objectifs

Percevoir avec précision la réalité extérieure est essentiel à notre survie. En particulier, les modifications de la perception sont une des caractéristiques majeures de la plupart des troubles neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux, eux-mêmes source de souffrance et d ́exclusion sociale. Bien qu'elles soient fondamentales, les bases biologiques d'une perception précise ou altérée sont très peu comprises. Dans cette étude, nous allons étudier d'une part chez des souris comment les neurones des régions cérébrales clés de la perception échangent des informations. D'autre part, nous allons nous demander quel est le rôle de ces régions spécifiques dans la cognition sensorielle. Dans les deux cas, nous évaluerons les mécanismes qui conduisent au fonctionnement et au dysfonctionnement, grâce à l'utilisation d'un modèle de souris à haut risque de troubles neuropsychiatriques. Nous espérons que cette recherche fera progresser nos connaissances limitées sur la façon dont les troubles neurodéveloppementaux modifient les circuits neuronaux sensoriels et affectent ainsi la perception. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de disséquer de manière fonctionnelle l’implication du système thalamo-corticale dans la mémoire sensorielle chez la souris, modèle bien adapté pour mimer la physiologie et certains aspects de la pathologie humaine. L’utilisation de modèles murins transgéniques appropriés apportera des données au niveau cellulaire, anatomique et fonctionnel en identifiant les structures cérébrales fonctionnellement mises en jeu. Mieux comprendre le système thalamo-corticale sensorielle permettra d’appréhender les processus d'apprentissage, de mémorisation et de perception, mais aussi une meilleure compréhension des maladies psychiatriques dans lesquelles elle est altérée. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.

Procédures

Biopsie de queue: 1 fois de moins d'une seconde. Injection sous-cutanée : 3 fois pour la chirurgie stéréotaxique, durée 5 secondes. Chirurgie pour injection stéréotaxique intracérébrale, 1 fois de 40 minutes. Légère décharge électrique, 1 fois de 1 seconde. Injection intra-péritonéale: 1 injection, durée 5 secondes. Etudes du comportement, 1 fois chacun: moteur (5 minutes), d’exploration (10 minutes), d’anxiété (10 minutes), d’attention (15 minutes) et de mémoire associatif (15 minutes/jour, 3 jours), répartis sur 4 à 7 jours.

Impact sur les animaux

L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. Une douleur peut également être associée à la biopsie de queue et aux injections d’analgésique et à l’acte chirurgical. Le test de memoire peut entraîner de l'inconfort et du stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort: 1) pour prélever le cerveau en vue d'études physio-histologiques sur les souris expérimentales; 2) à la fin de la période de reproduction chez les souris utilisées pour les croisements.

Remplacement

Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Des analyses a priori de puissance statistique permettent de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. D'autres tests statistiques a posteriori choisis en fonction des distributions des populations nous permettre de comparer les moyennes et identifier des différences deux à deux entre groupes expérimentaux et génotypes. Les tests statistiques permettent également de trouver des corrélations entre les variables étudiées.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes sociaux de plusieurs animaux afin d'éviter tout stress produit par un isolement social, dans un environnement avec matériel pour faire un nid. L’état de sante des animaux et leur accès à l’eau et nourriture sont surveillés quotidiennement. La chirurgie et le post-opératoire se déroule dans des conditions qui protègent la santé de l'animal, en lui protégeant de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant et de la déshydratation avec une solution de serum physiologique. Des analgésiques sont utilisés avant et après la chirurgie, et sur les jours suivants. A la fin de la chirurgie, après le réveil complet, l'animal est replacé dans sa cage collective avec de la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont habitués aux mains de l'expérimentateur afin de réduire leur stress par leur manipulation.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour l'exploration du comportement car les régulations cellulaires mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies cellulaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Pour les experiences, nous utiliserons des souris adolescentes et adultes entre 5 semaines et 6 mois car c'est au cours du jeune âge adulte que la plupart des altérations de la perception sensorielle apparaissent dans les troubles neurodéveloppementaux.

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies du crâne pour injection de virus et implantation d'électrodes, jusqu'à quatre heures, puis des enregistrements et tests comportementaux sur l'animal vigile, avec une restriction alimentaire maintenant la faim pendant dix à vingt jours et une perte de poids jusqu'à 15 %, pour étudier le rôle du cervelet dans l'autisme. Le porteur reconnaît que les chirurgies provoquent une douleur de 24 à 48 heures et que l'isolement postopératoire génère un stress, jugés "indispensables" pour cibler des sous-régions cérébrales. Il affirme que les études in vitro et sur invertébrés ne permettent pas d'étudier ces comportements complexes.

Objectifs

Le syndrome de Phelan McDermid (PMS), qui est dû à une mutation génétique du gène Shank3, provoque des déficits moteurs, des troubles du spectre autistiques (TSA) et des déficiences intellectuelles. Ce gène est fortement exprimé dans plusieurs régions du cerveau et chaque région touchée pourrait donc contribuer à un sous-ensemble des déficits exprimés par les patients. Notre projet a pour objectif de caractériser en détail la contribution spécifique du cervelet à ce trouble neuro-developpemental.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre l'implication du cervelet dans l'expression de certains troubles comportementaux associés au syndrome de Phelan Mc Dermid. Il contribuera ainsi non seulement à mieux cibler les causes des troubles neurodeveloppementaux associés à une dysfonction du cervelet mais apportera plus largement des pistes sur de nouveaux mécanismes physiopathologiques sous-jacents aux troubles du spectre autistique.

Procédures

Un groupe de 6 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h) - chirurgie sans réveil sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 20 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h), euthanasie par mode réglementaire. Un groupe de 288 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h) - Chirurgie stéréotaxique implantation d'electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) - Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 20 j max) - chirurgie sans réveil sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 96 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique implantation d'electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) - Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 20 j max) - chirurgie sans réveil sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 24 animaux suivra l'étape suivante : test comportemental.

Impact sur les animaux

Les procédures de chirurgie (injection de virus et implantation d'éléctrodes) peuvent être à l'origine d’une perte de poids transitoire (inférieur à 20 pour cent de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seule une chirurgie stéréotaxique permet de cibler spécifiquement des sous régions cérébrales (placement d’électrodes et injection locale de virus). L'isolement post-chrirugie (après la pose d'implant) ainsi que certaines tâches comportementales mesurant l'anxiété pourront entraîner une sensation de stress pour l'animal. Enfin certaines tâches comportementales reposent sur la motivation de l'animal à chercher des récompenses alimentaires et nécéssitent donc que les animaux ressentent de la faim. Une restriction aimentaire est donc maintenue pendant 10 à 20 jours maximum et la perte de poids est limitée à 15 pour cent du poids initial.

Devenir

Le prélèvement et l’analyse des cerveaux post-mortem sont indispensables à la validation des procédures d'injection virale et d'implantation d'électrodes. Cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux par différentes méthodes réglementaires en fonction des analyses nécessaires.

Remplacement

La modélisation permet d’apporter des informations sur le fonctionnement et les opérations faites par le cerveau mais nécessite les données cellulaires et comportementales. La modélisation ne nous permet pas d’étudier le rôle précis de notre gène d'intérêt dans les différentes sous régions du cervelet impliquées dans la cognition et les troubles du spectre autisitque. Les etudes in vitro et les animaux invertebres ne permettent pas l'etude des comportements complexes ; la souris est donc l'espece la plus appropriee pour ce type d'etudes.

Réduction

En se basant sur plusieurs articles utilisant des tests comportementaux et des analyses statistiques similaires, nous estimons le nombre de souris par groupe à 12 souris pour les études comportementales et 5 souris pour les analyses moléculaires. La taille des effectifs nécessaires par groupe a également été confirmé par un calcul de puissance et des tests stattistiques seront réalisés afin d'avoir une interprétation stable des résultats. Au total, nous estimons donc que pour réaliser l’ensemble du projet, 434 souris seront nécessaires.

Raffinement

Les souris provenant d'un fournisseur extérieur ont un temps d'adaptation à la pièce d'hébergement de 5-7 jours. Afin de réduire au maximum le stress, les animaux sont habitués à être manipulés 5min par jour par l’expérimentateur avant le début du protocole expérimental. Les animaux sont placés dans des cages en communauté de 2 à 5. Lorsque la procédure nécessite l’isolement des animaux, du nid végétal et un jouet d'exploration (cube, tunnel ou abri) est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux plus d’enrichissement. De plus, les cages utilisées sont transparentes, placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. . Des points limites sont mis en place afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux. Ils seront suivis quotidiennement par les mêmes manipulateurs et les procédures nécessaires seront mises en place pour garantir leur bien-être. Pendant les chirurgies, les animaux seront anesthésiés et recevront des analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle murin est idéal pour répondre à notre question scientifique. En effet, il existe un grand nombre de lignées de souris transgéniques que nous pourrions utiliser dans le cadre de notre projet d’étude du rôle du cervelet dans les troubles du spectre autistique. L’utilisation de modèles murins transgénique permettra de déléter spécifiquement un gène d'intérét dans les cellules granulaire de tout le cervelet ou dans les cellules granulaires de lobules spécifiques du cervelet. De plus, la souris est un animal explorateur pour lequel de très nombreux tests de comportement ont été développés. le projet utilisera des souris adultes âgées de 2 à 6 mois nous permettant d’étudier le comportement et la physiologique sur un cerveau stable d'un point de vue développemental (2 mois). Nous arrêterons les tests avant l'effet du vieillissement cérébral (6 mois).

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une irradiation cérébrale à forte dose sous anesthésie sur trois jours, puis cinq mois de tapis de course, des prélèvements sanguins en contention et des séances d'IRM sous anesthésie, pour tester si l'activité physique et de faibles doses de rayonnements limitent les lésions dues à la radiothérapie. Le porteur décrit une batterie de tests comportementaux répétée quatre fois (fatigue, locomotion, anxiété, mémoire, apprentissage spatial) et indique que l'irradiation provoque fatigue, perte de poids et érythèmes cutanés, présentés comme transitoires. Les retombées pour les patients sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal pour une analyse intégrée.

Objectifs

La radiothérapie (RT) est un traitement de référence pour traiter les tumeurs cérébrales, mais celle-ci peut induire des déficits cognitifs et une fatigue altérant la qualité de vie des patients. Les travaux de recherche actuels soutiennent l'implication concomitante de plusieurs processus interconnectés (dommages vasculaires, modifications de la matrice extracellulaire, neuroinflammation, neurodégénerescence, démyélinisation) contribuant au développement du déclin cognitif. Proposer une stratégie thérapeutique pour remédier aux déficits cognitifs observés après RT est essentiel pour améliorer la prise en charge des patients et représente un enjeu sociétal majeur face à l’augmentation du nombre de patients survivants après un cancer. Bien que les irradiations ionisantes appliquées à fortes doses utilisées pour la RT soient délétères pour les cellules, une exposition à de faibles doses de rayonnements ionisants (FDRI) pourrait promouvoir la protection et la réparation tissulaire, par leurs effets antioxydants, anti-inflammatoires et anti-apoptotiques. Récemment, il a été proposé l'existence d'un effet hormétique des FDRI sur le cerveau, suggérant que les FDRI pourraient être une thérapie prometteuse dans le cadre de diverses pathologies cérébrales. Parmi les traitements proposés pour la prise en charge de la radiotoxicité cérébrale, l’activité physique adaptée (AP), outil de réadaptation non invasif et non médicamenteux, semble pertinente. Plusieurs études cliniques menées sur différents types de cancer ont montré un bénéfice de l’AP sur le pronostic et la qualité de vie des patients. Des études épidémiologiques et interventionnelles suggèrent que l’AP améliore des processus cognitifs liés aux processus mnésiques et aux fonctions exécutives. De plus, la pratique d’une AP permettrait de réduire le déclin cognitif associé au vieillissement à la fois normal et pathologique, notamment dans des conditions neurodégénératives. Dans ce contexte, le projet proposé vise à étudier l’intérêt d’une exposition aux FDRI et de l’AP, seules ou combinées, pour réduire les lésions cérébrales et les déficits cognitifs consécutifs à la RT cérébrale.

Bénéfices attendus

Cette étude préclinique doit permettre de 1/ d’apporter des preuves expérimentales robustes pour évaluer l'intérêt thérapeutique des FDRI et de l’AP sur les effets délétères induits par une irradiation cérébrale à fortes doses de rayonnements ionisants et 2/ de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux bienfaits des FDRI et de l’AP dans un contexte de radiotoxicité cérébrale. A la fin du projet, les résultats seront accessibles sous la forme d’articles scientifiques. De plus, des biobanques de tissus cérébraux et de sang seront établies lors de ce projet et seront mises à disposition de la communauté scientifique. A long terme, une transposition à la clinique pourrait être envisagée pour atténuer le déclin cognitif des patients traités par RT et améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes procédures : - irradiation cérébrale à fortes doses de rayonnements ionisants qui sera délivrée sur 3 jours consécutifs et qui durera 10 minutes pour chaque fraction d’irradiation, réalisée sous anesthésie générale des animaux. - exposition cérébrale aux faibles doses de rayonnements ionisants (traitement FDRI) qui sera délivrée sur 3 jours consécutifs et qui durera 10 minutes pour chaque fraction d’irradiation, réalisée sous anesthésie générale des animaux. - pratique régulière de l’activité physique via l’utilsiation d’un tapis de course (traitement AP). Chaque session d'activité physique durera 30 minutes et sera réalisée 3 fois par semaine pendant 5 mois. - tests comportementaux : fatigue, activité locomotrice et comportement de type anxieux, mémoire à court-terme, mémoire à long-terme et apprentissage spatial et mémoire de référence. Chaque animal réalisera 4 fois cette batterie de tests comportementaux (3 semaines, 5 semaines, 2 mois et 6 mois post-irradiation). L’ensemble des tests comportementaux seront échelonnés sur 2 semaines avec 1 seul test par jour. La durée de chaque test sera comprise entre 10 et 20 minutes. - prélèvements sanguins : ils seront réalisés sur animaux vigiles, en utilisant une boîte de contention, à 5 semaines et 2 mois post-irradiation cérébrale. La durée totale de la procédure (temps maximal pour réaliser le prélèvement) ne dépassera pas 5min. - examens en IRM cérébral qui seront réalisé à 2 mois et 6 mois post-irradiation. Ces examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale des animaux et l’examen durera 60 minutes pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Suite à l'irradiation cérébrale, les animaux seront fatigués, présenteront une perte de poids et pourront présenter des signes de dégradation de leur état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, érythèmes cutanés sur la tête) accompagnés d'une diminution de la prise alimentaire et hydrique. Cependant, ces effets indésirables sont transitoires et réversibles(de 5 jours à 14 jours après irradiation), comme cela est décrit chez les chez les patients traités par radiothérapie.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés seront mis à mort à la fin de l’étude afin de mener des études post mortem sur le sang et le tissu cérébral.

Remplacement

Les effets délétères de l’irradiation cérébrale sur l’organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau ne sont pas seulement dus à des effets directs sur le cerveau, mais aussi à des phénomènes humoraux (stress oxydatif, inflammation, exosomes, hormones) et nerveux (dommages des voies nerveuses périphériques) qui ampflient les dommages cérébraux, les déficits cognitifs et la fatigue induits après l’irradiation cérébrale. Ainsi, il est indispensable d’avoir recours à l’expérimentation sur des animaux pour permettre une analyse intégrée des phénomènes complexes induits par l’irradiation cérébrale, d’évaluer l’intérêt des FDRI et de l’AP, et d’avoir des preuves expérimentales suffisamment robustes pour, à terme, tester ces traitements chez l’Homme.

Réduction

Grâce à l'utilisation au préalable de tests statistiques appropriés et à l'utilisation de techniques d'investigation non invasives (imagerie IRM et tests comportementaux), le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une puissance des résultats sera réduit au minimum. Chaque animal subira ces examens non invasifs de façon séquentielle (suivi longitudinal pendant 6 mois post-irradiation), ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés. A partir de données du laboratoire obtenues sur ce modèle animal de radiotoxicité cérébrale, nous estimons que le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est N=20 rats/groupe pour les 4 groupes expérimentaux. Au total, 80 rats seront nécessaires pour réaliser l’ensemble du projet. Par ailleurs, l’ensemble de ce projet sera réalisé sur plusieurs cohortes d’animaux successives avec des effectifs par groupe plus réduit afin de réaliser une analyse statistique séquentielle des données obtenues en IRM et comportement, ce qui permettra si des différences significatives sont observées de ne pas atteindre le nombre maximal d’animaux par groupe fixé. Cette méthode d’analyse statistique séquentielle permettra éventuellement de réduire le nombre d’animaux initialement prévu dans ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en animalerie conventionnelle aux normes requises. Le personnel participant au projet est formé aux procédures en expérimentation animale. Des inspections du bien-être des animaux sont réalisées quotidiennement. De plus, toutes les mesures visant à réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux seront entreprises, notamment en appliquant une anesthésie et une analgésie appropriées. Concernant les effets indésirables liés à l’irradiation cérébrale qui peuvent affecter de façon transitoire l’état général des animaux, des mesures sont déjà mises en place dans le laboratoire et connues par les personnes impliquées dans ce projet. Pour limiter ces effets indésirables survenant uniquement pendant les 2 premières semaines après irradiation, le poids des animaux est relevé quotidiennement, une alimentation particulière est donnée aux animaux : croquettes mouillées dans une coupelle déposée directement dans la cage ainsi que de la gelée hyperprotéinée. Des injections intrapéritonéales de sérum physiologique sont réalisées 2 fois par semaine, pour éviter une éventuelle déshydratation. Concernant les érythèmes cutanés sur le haut de la tête, celles-ci sont bien connues et prises en charge selon les recommandations du vétérinaire de l’animalerie. Dès que la peau est bien sèche, une crème hydratante et cicatrisante est appliquée tous les 2 jours jusqu’à la cicatrisation cutanée. De plus, une échelle d’évaluation de l’état général des animaux (score défini par plusieurs items visuels) a été mise en place par le laboratoire sur ce modèle animal pour surveiller finement l’état général des animaux. Enfin, des points limites spécifiques et de critères d'arrêt de souffrance seront utilisés afin de réduire toute souffrance ou douleur chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat possède un cerveau dont la taille est supérieure à la souris et qui est compatible avec les appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée ainsi qu’une imagerie de haute résolution. D’autre part, plusieurs tests comportementaux visant à évaluer les déficits moteurs et cognitifs sont bien décrits chez le rat. Enfin, nous avons développé au sein du laboratoire un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat, pour lequel nous avons déjà très bien caractérisé les dommages cérébraux ainsi que les modifications comportementales (fatigue, locomotion, mémoire, comportements de type anxiété et de type dépression) jusqu’à 6 mois après irradiation encéphalique. Ainsi, nous maitrisons très bien ce modèle animal que ce soit dans le décours temporel de sa physiopathologie mais aussi en termes de prise en charge du bien-être animal. Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 5 mois (correspondant à un poids d’environ 350 g) lors de leur arrivée à l’animalerie. Lors du 1er mois, les rats seront acclimatés dans leur nouvel environnement, habituer aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux (tests comportementaux et tapis de course pour l’AP). L’irradiation cérébrale sera réalisée sur des animaux âgés de 6 mois. . L’âge de 6 mois a été retenu puisqu’il correspond à l’âge adulte mature chez le rat et est équivalent à l’âge de 18 ans chez l’Homme. A ce stade de développement chez le rat, la substance blanche est complètement mature, ce qui représente un critère très important pour modéliser les atteintes cérébrales observées chez le patient adulte traité par radiothérapie.

3 228 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections répétées, une infection chronique par le parasite Toxoplasma pouvant provoquer "un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à sept jours" et une perte de poids, des chirurgies stéréotaxiques et des tests cognitifs, pour étudier la neuro-inflammation dans la maladie d'Alzheimer. Les organes, dont le cerveau, sont prélevés après mise à mort. Le porteur affirme que les études in vitro "ne permettent pas" d'étudier le comportement et la cognition.

Objectifs

Une inflammation à bas bruit tout au long de la vie contribuerait aux mécanismes du vieillissement et même pourrait fortement peser dans la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer et des démences associées. Au niveau du cerveau, des médiateurs de l’inflammation, les cytokines, qui circulent en grande quantité dans le cerveau au cours des infections ou lors des maladies neurodégénératives pourraient perturber les mécanismes de réponses physiologiques du neurone. Il est donc important de mieux comprendre comment les processus de neuro-inflammation affectent le comportement et la cognition. Ici, il est proposé d'utiliser des modèles de souris dans lesquels il est possible d’induire la suppression de l’expression d’un récepteur à une cytokine à la fois, et cela seulement dans les neurones. Cela permettra d’étudier l’importance de cette cytokine dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, ainsi que dans des processus pathologiques. Ces derniers sont la neuroinflammation chronique ou des infections du système nerveux central. L'étude utilisera un modèle transgénique entrainant les symptômes de la maladie d'Alzheimer, ou une infection par Toxoplasma ou l'expression isolée de médiateurs de l'inflammation. Le recours à un modèle animal est donc irremplaçable pour cette étude, puisqu'elle vise à déterminer les effets de la suppression de la signalisation de cytokines sur la physiologie de neurones, le comportement et la cognition.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle des signaux pro-inflammatoires reçus par les neurones au cours des infections du système nerveux central et la réponse neuro-inflammatoire et la neurodégénérescence, permettra, sur le plan fondamental d'élucider les mécanismes clés mis en jeux dans les neurones et leur importance pour la fonction cognitive. Sur le plan médical, ces recherches pourraient déboucher sur l'identification de nouvelles cibles, pour des stratégies thérapeutiques contre des maladies neurodégénératives dont la maladie d'Alzheimer, pour laquelle aucun remède n'est connu.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections intrapéritonéales répétées journalièrement pendant 5 jours, sur animaux vigiles (2904 souris, 5 jours, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection intrapéritonéale d'un parasite, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (2796 souris, une injection de quelques secondes); iii) deux types de chirurgies sous anesthésie générale: une de moins de 15 minutes (chirurgie cutanée, 432 animaux), ou/et une de moins de 40 minutes par animal (injection intracrânienne bilaterale, 960 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), la force (une session de 5 minutes au total par animal, à raison deux 3 essais de 5 secondes chacun et 30 secondes au minimum entre chaque groupe de 3 essais) et les processus cognitifs ( toutes les souris (3228), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal), labyrinthe de Barnes ( chaque souris testée une fois pendant 7 jours consécutifs, à raison de 3 essais d'exploration libre sur la table de 3 minutes maximum (selon la performance de l'animal) chacun par jour)), la perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde terminale (sans réveil, 3228 animaux, moins de 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées ne présentent aucun symptômes apparents de maladie et n'ont donc pas de phénotype dommageable, ce que nous avons confirmé lors de leur utilisation dans le cadre du premier protocole APAFIS autorisé pour ces lignées. Dans le cas d'infection par Toxoplasma ou l'infusion chronique de cytokines pro-inflammatoires par implantation de pompes sous cutanées, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies stéréotaxiques peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Du fait que les animaux sont acclimatés à l'environnement des tests comportementaux et sont habitués aux expérimentateurs par manipulations régulières des animaux dans les semaines précédant les tests, aucune nuisance n'est constatée durant les tests comportementaux. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes; où les souris doivent être hébergées individuellement, l'hébergement pourrait devenir anxiogène mais des mesures d'enrichissement du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

Les 3228 animaux seront en fin de procédure euthanasiés. L'euthanasie est nécessaire afin de prélever les organes en post-mortem (dont le cerveau) des animaux pour comprendre ensuite au niveau cellulaire et moléculaire, les causes et mécanismes des changements observés au niveau comportemental, et limiter le double-emploi au maximum. Ces prélèvements post-mortem sont aussi nécessaires afin de confirmer l'efficacité de la procédure.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant la neurodégénérescence. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires (12 pour les groupes contrôles témoins). En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 3 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 4 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont: perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, absence de toilettage. L'utilisation d'implants sous-cutanés permettront de délivrer des molécules de manière chronique ce qui évitera de devoir recourir à des injections journalières répétées. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). La maitrise des interventions qui pourraient s'avérer douloureuses sera effectuée par l'utilisation d'analgésiques en péri-opératoire. Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux .

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel du parasite Toxoplasma gondii, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques la signalisation de médiateurs de l'inflammation dans les neurones dans le cadre d’une infection naturelle. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés (modèles invalidés pour un gène contribuant à la maladie ou exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux déficients pour la protéine étudiée n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieur à 6 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulations sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.

800 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent de multiples injections, jusqu'à douze prélèvements de sang à la queue et une perfusion intracardiaque décrite comme une "douleur modérée", certaines étant rendues diabétiques, pour étudier la communication entre cellules immunitaires et réseau nerveux des îlots pancréatiques. Les organes sont prélevés après mise à mort. Le porteur indique que ce dialogue "n'a jamais été étudié" et affirme que les modèles animaux sont nécessaires pour analyser plusieurs organes à la fois.

Objectifs

Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation du glucose dans le sang. Ces micro-organes produisent les hormones permettant de réguler le taux de glucose. Des cellules immunitaires sont présentes dans les ilots et jouent une rôle important dans leur fonction. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, la communication entre les cellules immunitaires et le réseau nerveux n’a jamais été étudié et son rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes de communication entre les cellules immunitaires et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces moyens de communications dans la fonction des ilots en condition normal et diabètique, une maladie caractérisée par une dérégulation du glucose dans le sang.

Bénéfices attendus

Il est aujourd'hui admis que les cellules immunitaires jouent un rôle primordial dans la régulation du taux de glucose sanguin par le gras et le foie. Les cellules immunitaires présentes dans les ilots pancréatiques n'ont elles été décrites que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'elles restent encore très peu connues. La communication entre les cellules immunitaires et le système nerveux a été montrée comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant, de part la difficulté d'étudier les cellules immunitaires des ilots pancréatiques, ces moyens de communications n'ont pas encore été décrits dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les moyens de communication entre cellules immunitaires et réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans la régulation du taux de glucose sanguin.

Procédures

9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésie gazeuse (10min), 1 perfusion intra-cardiaque.

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier la communication entre les cellules immunitaires et le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de dérégulation du taux de glucose sanguin, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’anti-douleur et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement. Les souris diabétiques urinant plus souvent, pour permettre une bonne hygiène des souris les cages seront changées deux fois par semaines.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.

400 têtards de xénope vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie une transplantation de cellules de drosophile dans le chiasma optique, puis est disséqué pour observer l'enroulement de ces cellules autour des neurones. Le porteur indique qu'une transplantation peut traverser une veine et provoquer une hémorragie, l'animal étant alors tué dans les cinq minutes, et que l'exposition au métronidazole tue environ 10 % des têtards. Il revendique le remplacement de vertébrés comme la lamproie par un invertébré, la drosophile, et justifie le xénope par sa transparence et sa position sur l'arbre évolutif.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie du système nerveux central qui dans sa forme la plus fréquente évolue par poussées et régressions des symptômes. La régression des symptômes, plus ou moins complète en début de la maladie, devient de moins en moins complète au cours de la progression de la maladie. La SEP associe une atteinte inflammatoire et de dégénérescence des neurones. Depuis les 30 dernières années des progrès considérables ont été réalisés dans la prise en charge du volet inflammatoire de la maladie. En nous attaquant à la compréhension du processus de mise en place des couches (myéline) qui entourent les neurones, pour les protéger et permettre une conduction nerveuse rapide, nous espérons pouvoir identifier des cibles thérapeutiques pour lutter contre la dégénérescence des neurones dans la SEP.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps le bénéfice de notre projet est fondamental, conduisant à comprendre les signaux minimums qui permettent la mise en place de la couche de protection autour des neurones (myéline). A plus long terme notre ambition est d’ouvrir des voies thérapeutiques dans les maladies dégénératives dont la plus fréquente est la sclérose en plaques.

Procédures

Dans notre protocole expérimental, les têtards seront soumis à une étape de transplantation des cellules dans le chiasma optique sous anesthésie générale. Du début à la fin de l’anesthésie nous estimons que la durée ne dépassera pas 10min. Le chiasma optique est la structure anatomique dans laquelle les deux nerfs optique (un pour chaque œil) se croise. Réaliser la transplantation dans le chiasma optique, nous permet d’envisager que les cellules transplantées migreront dans les nerfs optiques et seront facilement identifiables et analysables. Cette procédure de transplantation n’a lieu qu’une seule fois par animal, sous anesthésie générale, avec un taux de survie dépassant les 90 pour cent pour les concentrations de cellules injectées. L’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) entraine une perte d’environ 10 pour cent de têtards. La même technique d’anesthésie est utilisée pour une observation du nerf optique au macroscope, mais le têtard est cette fois ci placé sur une petite boite dans une goutte d’anesthésiant, l’observation ne dépasse pas 5 min, ce qui fait que le têtard est anesthésié au maximum pendant 10 min. Ces observations auront lieu 5 fois pendant toute la durée du protocole. Pour le comportement, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac, et prélevés délicatement avec une épuisette pour les placer dans une large boite avec leur milieu de nage. Leur nouvel environnement ne semble pas induire de stress car aucun comportement de fuite n’est observé. Cette expérience n’est réalisée que 2 fois et dure moins de 5 minutes par têtard. A la fin de la procédure les têtards seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L’anesthésie est maintenue durant toute la durée de la procédure pour ne pas engendrer de stress chez le têtard mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires, les battements du cœur sont donc fréquemment contrôlés durant l’anesthésie (facilement visible chez les têtards). La capture avec une épuisette peut générer un stress, ainsi que le changement d’environnement lors du test comportemental. L’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) entraine une perte d’environ 10 pour cent de têtards. Lors de la transplantation, il est possible de traverser une veine, ce qui provoque une hémorragie, dans ce cas-là, à la reprise de la nage à la suite de l’anesthésie, le têtard peut soit nager de travers, soit avoir une poche de sang visible. Le têtard est donc directement euthanasié dans les 5 minutes après la transplantation.

Devenir

Suite aux transplantations, les têtards sont euthanasiés pour observer les cellules gliales de Drosophile qui ont été injectées dans le chiasma optique. Cette euthanasie est nécessaire pour observer l’enroulement possible des cellules gliales de Drosophile autour des neurones de Xénope, et cette observation n’est possible qu’après dissection des têtards.

Remplacement

L’enroulement autour des axones par des cellules gliales (myélinisation), comme la remyélinisation (suite à une ablation de ces cellules gliales, évènement de démyélinisation), ne peut que difficilement s’étudier sur un autre modèle que chez les vertébrés. Une autre possibilité eut été d’utiliser deux espèces de vertébrés : Tous les vertébrés sont myélinisés sauf les plus anciens, dépourvus d’une mâchoire à savoir la lamproie et la mixine. Nous aurions pu ainsi transplanter des cellules gliales de lamproie dans le système nerveux de Xénope. Afin d’éviter l’utilisation de ces vertébrés nous avons préféré les remplacer par la Drosophile, qui est un invertébré, dont les cellules gliales ne s’enroulent par autour des axones (au plus 1 à 2 tours) mais forment des empilements protégeant les axones.

Réduction

La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences et ainsi d’éviter des suivis histologiques nécessitant l’euthanasie des têtards expérimentaux à différents points critiques du protocole. Le chiffre de 400 têtards utilisés pour ce projet a été déterminé de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en s’assurant de résultats statistiquement robustes. Il est à noter que dans un souci de respecter au plus près la règle des 3R ces expérimentations in vivo ne seront que l’aboutissement d’études préalables, n’entrant pas dans le champ d’une demande Apafis, réalisées sur des co-cultures de cellules de Drosophile et de Xénope.

Raffinement

Les têtards sont placés dans un bain à une température de 23 degrés celsius avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau (moitié osmosée moitié dure) est renouvelée régulièrement pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets urémiques. L’eau est oxygénée de manière plus importante après anesthésie pour permettre une meilleure récupération du têtard. Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les surplus de nourriture sont aussi retirés de l’eau quotidiennement. De plus, des branches de plantes artificielles sont placées dans les bacs des têtards, qui leurs permettent de se cacher dessous. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pour les manipulations, les têtards sont attrapés par une épuisette, ce qui n’entraine normalement pas de blessures ou de comportements anormaux suite à la capture. Pour le comportement, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac, et attrapés par une épuisette pour les placer dans une large boite de Pétri (145 x 20mm) avec leur milieu de nage. Leur nouvel environnement ne semble pas induire de stress car aucun comportement de fuite n’est observé. Les têtards sont isolés seulement 5 minutes avant d’être replacés dans leur bac d’origine avec leurs congénères, ce qui n’entraine pas de troubles de comportement visible. Durant l’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle), les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour/nuit n’impacte pas les têtards car nous n’avons pas observé de stress ou d’augmentation de la mortalité durant les 10 jours d’exposition. De plus, les têtards aiment les zones qui sont peu lumineuses, ils se cachent naturellement dans les plantes et dans les tuyaux. Le passage à l’obscurité n’est donc pas une perturbation pour eux.

Choix des espèces

Le choix du Xénope se justifie pour 3 raisons : 1) le Xénope vit à la même température que les Drosophiles, critère indispensable pour créer les transplantations 2) les têtards de Xénope sont transparents, ce qui facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction) ; 3) contrairement aux poissons (osteichtyens(danio) ou chondrichtyen) les amphibiens (Xénope) sont les premiers vertébrés sur l’arbre évolutif à utiliser un profil protéique myélinique différent dans le système nerveux central et périphérique. Les transplantations seront réalisées à différents stades de développement : au début de la myélinisation (stade 48) et des têtards déjà bien myélinisés juste avant la métamorphose (stade 55-60). Ceci afin de déterminer le stade auxquels les axones sont le plus "aptes" à être myélinisés.

1962 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil et, pour 606 d'entre elles, quatre lésions au laser de la rétine sur un œil, avant récupération des yeux après mise à mort. Le porteur classe l'injection intravitréenne en gravité modérée par précaution et affirme que les lésions laser sont indolores et compensées par le cerveau en moins d'une semaine. Il conclut qu'aucune alternative in silico ou in vitro ne donne accès aux "grandes fonctions physiologiques des mammifères", et prévoit d'arrêter si un vecteur atteint 80 % de neutralisation du VEGF.

Objectifs

Les maladies de la rétine sont des troubles neurologiques majeurs pour lesquels aucun traitement efficace n’existe, et ce malgré les découvertes mettant à jour certains mécanismes liés à leur progression. Pour la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age (DMLA) seuls existent des traitements palliatifs visant à réduire la prolifération de nouveaux vaisseaux immatures dans la rétine avec des anticorps administrés en Injection Intravitréenne (IVT) et qui sont dirigés contre un facteur de croissance des vaisseaux sangins : le VEGF. Ces nouveaux vaisseaux immatures ne sont pas étanches et laissent passer un liquide qui crée un œdème rétinien responsable de la perte de la vision. Ces traitements ne sont que palliatifs et ne ciblent en aucun cas les mécanismes à l’origine du développement de la pathologie. L’approche visant à bloquer en amont la fabrication du VEGF (avant sa synthèse) via des petits bouts d’ARN interférents (siARN) prend donc tout son sens. En effet dans la cellule, des petits bouts d’ARN quittent le noyau (ARN messagers) pour initier la fabrication du VEGF. Les siARN dirigés contre le VEGF entrent dans les cellules et viennent neutraliser les ARN messagers bloquant ainsi la fabrication du VEGF. Depuis plusieurs années notre société et ses partenaires ont mis en place un consortium permettant le développement de vecteurs (V) améliorant la délivrance de siARN dans le Système Nerveux Central (SNC) dont la rétine. Ces vecteurs se présentent sous la forme d’anticorps modifiés et ciblent les récepteurs impliqués dans le transport au travers des barrières biologiques, par exemple pour passer du sang vers le cerveau ou la rétine, ou pour rentrer directement dans les cellules. A ces vecteurs nous venons y accrocher des molécules thérapeutiques comme des siARN dirigés contre le VEGF. Issus du savoir-faire de notre société, nos candidats médicaments sont couplés à nos vecteurs (V-siARN) et transformés dans le but d’améliorer le transport vers la rétine pour augmenter le pouvoir d’action du traitement.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de ce projet est donc de combattre plus efficacement les rétinopathies à prolifération vasculaire (la DMLA mais aussi la rétinopathie diabétique) au moyen de vecteurs combinées à des brins d’ARN interférents pour bloquer les messagers cellulaires responsable de la synthèse du VEGF et donc lutter contre la pousse de nouveaux vaisseaux dans la rétine. La valeur ajoutée consiste à tester de nombreux de siARN dirigés contre le VEGF et à améliorer leur délivrance grâce à notre technologie (nos Vecteurs). Cette première phase expérimentale nous permettra de sélectionner les meilleurs couples siARN-Vecteurs pour passer, dans une deuxième étape, aux tests d'efficacité sur des modèles animaux pathologiques. Les bénéfices attendus pour de futures applications chez l'homme sont multiples par rapport à l'utilisation d'anticorps actuellement administrés en IVT. En effet notre technologie autorise nos vecteurs à se lier qu’à un seul type de récepteur sur les membranes des cellules de la rétine, ce qui nous permet de cibler précisément les cellules à l'origine de la surproduction pathologique de VEGF. D'autre part, il est connu que l'utilisation de siARN permet de rallonger significativement l'efficacité d'un traitement dans le temps par rapport aux simple anticorps classiques dirigés contre le VEGF, ce qui en théorie permettrai aux patients d'espacer la fréquence (mensuelle) des injections qu'ils reçoivent ; administration IVT qui reste un geste chirurgical particulièrement anxiogène et porteur de potentielles complications.

Procédures

Les animaux anesthésiés seront soumis à des administrations dans l’œil (IVT) (1440 animaux, durée de l’acte : 5 min par œil) et à 4 lésions laser de la rétine sur un seul œil (606 animaux, durée 30 min environ). Ils seront ensuite hébergés de 4 jours jusqu'à 3 mois maximum (4, 7, 14 jours, 1 et 3 mois pour un petit sous-groupe seulement) avant leur mise à mort pour récupération des yeux. Dans la partie concernant la mise en place du modèle pathologique de pousse de nouveaux vaisseaux immatures induit par lésion laser un groupe restreint d'animaux (30) subira 4 contrôles en imagerie rétinienne des lésions (le jour de la lésion, puis à, 4, 7 et 14 jours, durée 30 min) sous anesthésie générale. Lors de ces contrôles les animaux recevront à chaque fois une injection d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min) pour la visualisation des vaisseaux rétiniens. En point final tous les animaux seront mis à mort dans nos expériences.

Impact sur les animaux

La procédure d'administration IVT est considérée comme légère chez l'homme mais pour plus de sureté nous la classons en modérée. Seule une désinfection du pourtour de l’œil est requise avant de commencer. Pour éviter de stresser les animaux, cette procédure sera effectuée sous anesthésie générale avec des antidouleurs. Avec une très faible fréquence, les nuisances pouvant être rencontrées dans ce type d’administration seront surveillées attentivement tous les jours (infections notamment). Pour éviter ce type de complication une pommade antibiotique sera systématiquement déposée sur la cornée. Concernant nos composés, nos données issues de projets précédents avec les mêmes molécules ne montrent pas de réaction du système immunitaire, ni de toxicité apparente. L'autre aspect susceptible d'affecter les animaux concerne les lésions rétiniennes par laser. Ces dernières, indolores, aboutissent à des déficits visuels qui correspondent à des tâches noires dans le champs visuel (< 15° d'angle visuel, ce qui correspond à peu près à des cercles de 10 cm de diamètre à un mètre de distance de l’œil). Au nombre de 4 par animal (en haut, en bas, à gauche et à droite), ces lésions couvrent au total moins de 10% du champ visuel des animaux et ceci sur un seul œil. De plus il est connu que des mécanismes corticaux au niveau des aires visuelles du cerveau compensent une partie de cette perte en moins d'une semaine (la lésion dans la rétine est toujours présente mais l’animal ne voit plus ces tâches sombres : mécanisme de remplissage perceptif). De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux mais nous nous contenterons d'effectuer ces lésions sur un seul œil pour plus de sureté.

Devenir

Dans la procédure 1, un groupe de 720 animaux est inclus pour étudier le potentiel de nos vecteurs couplés au siARN. Si les analyses montrent qu'un couple de nos Vecteur/si ARN atteint plus de 80% de neutralisation des ARN messagers du VEGF-A alors le reste des animaux ne sera pas utilisé. Sinon le reste des animaux inclus sera mis à mort car il est nécessaire pour les analyses de les perfuser pour enlever le sang et nous récupérons les deux yeux pour analyse. Etant donné que nous commandons les animaux pour chaque expérience individuellement, les animaux inclus dans le projet et non utilisés ne seront pas à replacer. Dans la procédure 2 tous les animaux seront mis à mort car ils doivent être perfusés avant récupération des yeux pour analyse.

Remplacement

Toutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifToutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.ères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux nous avons opté pour des injections IVT bilatérales chez l’animal sain pour la sélection des différents siARN couplés à nos vecteurs car le geste, bien que classifié ici comme modéré, est à considérer comme une procédure légère sans composante douloureuse, ni impact au niveau de la vision. Le fait d'injecter les deux yeux dans cette phase de sélection nous permet donc de réduire le nombre d’animaux de moitié. Le nombre total d'animaux dans cette procédure fait l'hypothèse de l’échec des précédents V-siRNA testés. Si un des composés atteint plus de 80% de neutralisation du VEGF (observation systématiquement quantifiée dans chaque expérience) alors notre objectif sera atteint et le reste des animaux inclus dans le projet ne sera pas utilisé.

Raffinement

Les animaux seront soumis à un protocole anesthésique et analgésique rigoureux. Dans ce projet nous avons remplacé notre précèdent anesthésique par un de nouvelle génération car il permet un réveil plus rapide des animaux et n'entraine pas d'augmentation de la pression intra-oculaire (problématique pour l'IVT). Une couverture analgésique générale et locale permet d'éviter toute souffrance pendant l'expérimentation. Etant donné le court laps de temps d’exposition de nos V-siRNA dans l’œil (en moyenne 14 j et jusqu'à 3 mois pour un petit sous-groupe), ce type d’action n’est pas à même d’entrainer l’apparition de problèmes dommageables chez les animaux (observation effectuée dans nos précédentes études). Pour des questions de raffinement et de bien-être animal les groupes de lésions rétiniennes au laser passeront de 4 à 8 individus : en effet un seul œil sera lésé pour affecter le moins possible leur vision. De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux. Enfin Le fait de choisir une administration IVT pour combattre les pathologies rétiniennes permet d’utiliser des doses largement revues à la baisse par rapport à une injection intra-veineuse avec une diminution des risques toxiques et immunitaires associés ainsi qu'une distribution dans tout le corps qui n’est pas voulue. Pour éviter toute souffrance animale, nous avons mis en place une grille d'évaluation de la condition des animaux avec toute une série de points limites et les actions y étant associées. Enfin les souris seront hébergées par 4 sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C (portoirs ventilés) et dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglas et dômes en papier, accompagné de nids en coton, de la frisure de papier craft et nous mettrons également à l’intérieur des cages quelques croquettes).

Choix des espèces

Dans ce projet nous avons choisi des souris saines adultes et pigmentées pour 3 raisons : En ophtalmologie il est indispensable d’utiliser des espèces pigmentées (non albinos) car elles ne sont pas dépourvues d’un type de photorécepteur dans la rétine. De plus leur utilisation est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler la version « souris » du récepteur auquel ils se lient. Certains de nos Vecteurs ciblent également la version humaine de ce même récepteur d'où le choix d'une deuxième espèce, des souris adultes, pigmentées et humanisées pour le récepteur ciblé par nos vecteurs et ceci pour évaluer le potentiel de transfert de nos avancées chez l'homme. Enfin nous utiliserons ici uniquement des souris mâles et adultes car il a été prouvé que le modèle de lésion de la rétine que nous allons utiliser est beaucoup plus variable chez les jeunes individus et chez les femelles.