Système nerveux

Le poids des souris est maintenu à 85 % de leur poids de départ par le contrôle de la nourriture, un point limite étant fixé à 20 % de perte, seuil auquel la ration est augmentée. 240 souris, adultes de trois à six mois ou âgées de dix-sept à vingt mois, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant cinq à six semaines, chacune est pesée deux fois par jour et cherche des récompenses alimentaires dans des labyrinthes, une à quatre fois par jour, avant d'être tuée sous anesthésie pour prélever son cerveau. Le porteur affirme que le modèle murin offre des avantages "uniques et irremplaçables" pour ces évaluations comportementales, qui exigent selon lui les interactions d'un "organisme entier".

Objectifs

La mémoire de travail est un système cognitif essentiel au comportement dirigé vers un but : elle permet le maintien temporaire et la manipulation d'informations pertinentes en vue de la réalisation d'actions motivées . Dans ce cadre, elle joue un double rôle — planification et exécution — en assurant la coordination optimale des actions nécessaires à l'atteinte d'un objectif. Bien qu'il soit largement admis que le vieillissement physiologique altère la mémoire de travail chez l'humain comme chez le rongeur, il demeure incertain que ses différents sous-processus — maintien, mise à jour et manipulation de l'information — soient également vulnérables au vieillissement normal, en particulier dans le modèle murin. L’objectif de ce projet est de déterminer l’effet du vieillissement sain sur ces différents sous-processus de la mémoire de travail dans le modèle murin de vieillissement, en testant des souris dans différents dispositifs expérimentaux ciblant spécifiquement chacun de ces sous-processus, suivi par des études. Cette recherche pourrait contribuer à mieux comprendre les mécanismes du déclin cognitif, identifier des cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques et améliorer la qualité de vie des personnes âgées.

Bénéfices attendus

Au cours des deux dernières décennies, l’espérance de vie a augmenté de plus de six ans, principalement en raison d’une diminution des taux de mortalité plutôt que d’une augmentation des années vécues sans incapacité. Par conséquent, l’amélioration de la qualité de vie des personnes âgées est devenue un enjeu majeur de santé publique, nécessitant une compréhension approfondie de la biologie du vieillissement. Par ailleurs, la trajectoire du vieillissement cognitif en bonne santé varie considérablement d’un individu à l’autre, soulevant la question suivante : pourquoi certaines personnes présentent-elles des signes de déclin cognitif plus précocement que d’autres ? Cette variabilité constitue un axe central des recherches actuelles et forme le fondement du présent projet. Ce projet vise à caractériser les différentes composantes de la mémoire de travail. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra d’expliquer pourquoi certains individus conservent une flexibilité cognitive préservée, tandis que d’autres connaissent un déclin plus marqué.

Procédures

Le contrôle de la prise alimentaire vise à encourager les souris à apprendre et à réaliser les exercices de mémoire, leur consommation de nourriture étant régulée afin de maintenir un état de faim modérée tout en assurant leur bonne santé grâce à un suivi quotidien. Cette phase dure environ 5 à 6 semaines. Pendant cette période, les souris participent quotidiennement à des exercices dans des labyrinthes, au cours desquels elles doivent retrouver des récompenses alimentaires en mobilisant leur mémoire. Ces sessions durent quelques minutes et sont réalisées une à quatre fois par jour sur une durée totale de cinq à six semaines. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire réalisée sous anesthésie et analgésie afin de permettre la réalisation des prélèvements nécessaires à l’analyse des cellules cérébrales au microscope. Cette chirurgie terminale sous anesthésie profonde durera environ 20 à 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus au cours de cette procédure sont d’impact léger à modéré et suivent le parcours chronologique de l'animal. En amont des tests, la mise en place du contrôle alimentaire peut générer une sensation de faim légère, susceptible d'induire un stress ou une agitation transitoire. Lors des sessions épreuves, la confrontation à la nouveauté de la tâche comportementale et le processus d'apprentissage peuvent également devenir sources de fatigue, de frustration (notamment lors des erreurs) ou de stress, se manifestant par une possible agitation. À cela s'ajoute un stress léger lié aux manipulations régulières et aux déplacements des animaux vers les dispositifs expérimentaux. Enfin, lors de l’euthanasie des animaux effectuée sous anesthésie générale et analgésie, il existe un risque lié à l’utilisation des anesthésiques (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire, etc.).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérience car les tissus cérébraux doivent être préservés pour une analyse histologique ultérieure.

Remplacement

Le modèle murin est essentiel pour notre projet en raison de ses avantages uniques et irremplaçables. Les évaluations comportementales nécessitent des interactions complexes de l'organisme entier qui ne peuvent être reproduites par des méthodes in vitro ou ex vivo. Ainsi, l’utilisation du modèle murin est cruciale pour étudier de manière exhaustive les processus neurologiques et comportementaux.

Réduction

Nous avons déjà réalisé une étude comportementale pilote préalable au cours de laquelle nous avons vérifié que les dispositifs fonctionnent et que les souris sont capables d'apprendre. De plus, des tests statistiques rigoureux sont employés afin de garantir la fiabilité et la validité des données, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en maintenant la rigueur scientifique. Ces analyses permettent d’obtenir des résultats fiables avec un effectif réduit. En tenant compte de l’expérience antérieure du laboratoire et des paramètres de puissance statistique, le nombre total d’animaux requis est estimé à 240. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet.

Raffinement

À l’animalerie, les souris sont hébergées en groupe et ont accès à la nourriture et à l’eau ad libitum pendant 5 jours. Après, il y a une phase d’habituation à l’expérimentateur. Le début de l’expérience correspond à la mise en place du contrôle alimentaire ; à partir de ce moment, les animaux restent hébergés en groupe de 2-3 souris par cage, où leur consommation alimentaire est surveillée au niveau de la cage, tandis que leur poids est suivi individuellement. On prendra soin de distribuer la nourriture à chaque animal dans la cage pour éviter que les animaux ne se disputent la nourriture. Un suivi rigoureux est mis en place pour détecter d'éventuels symptômes de dominance ou d'anhédonie ; en cas de comportement dominant avéré, l'animal concerné sera isolé, et si des signes d'anhédonie apparaissent, la souris sera isolée et bénéficiera d'un retour à une alimentation normale. Tout au long de ce processus, la Structures chargées du Bien-être Animal (SBEA) sera systématiquement sollicitée et assurera un suivi quotidien des animaux pour valider le maintien de leur bien-être. Chaque animal sera pesé 2 fois par jour. Le poids cible pour les procédures expérimentales est fixe à 85 pour cent par rapport au poids de référence initial. Le point limite est fixé à une perte de poids de 20 pour cent par rapport au poids de référence. Si le poids d’un animal descend en dessous de ce seuil, sa ration alimentaire sera immédiatement augmentée afin de stabiliser son poids autour de la valeur cible de 85 pour cent du poids initial. En complément du suivi pondéral, l’état de santé général sera évalué quotidiennement au moyen d’une fiche de suivi comprenant : 1) General: observation de la posture, de l’état du pelage, des yeux 2) Le comportement : détection de signes de fatigue importante, d’apathie ou d’agitation excessive 3) L’échelle de grimace : utilisation de cet outil pour détecter d’éventuels signes de douleur ou d’inconfort significatif. En cas de fatigue marquée ou de score de détresse modéré, l'animal sera retiré de la session de test, placé sous surveillance rapprochée et bénéficera d'un retour à une alimentation ad libitum si son état ne s'améliore pas dans les 24 heures. En cas de dépassement des points limites éthiques sans possibilité de récuperation, l'euthanasie sera pratiquée. L'abre décisionnel avec les point limites en en annexe.

Choix des espèces

La souris est un modèle robuste et bien validé pour l'étude de l’effet de l’âge sur des comportements cognitifs, notamment la mémoire spatiale et les apprentissages dépendants de la motivation et de la récompense. Les circuits cérébraux responsables de ces processus sont hautement conservés entre la souris et l'homme, ce qui confère à ce modèle une forte pertinence translationnelle pour répondre à notre question scientifique. Comme nous cherchons à comparer les performances des souris adultes et âgées des deux sexes dans une tâche de flexibilité cognitive, les animaux sélectionnés pour cette étude représenteront deux stades de développement distincts : 1) des souris adultes (3 à 6 mois) et 2) des souris âgées (17 à 20 mois).

Toutes les souris de ce projet subissent une chirurgie du crâne de vingt à trente-cinq minutes sous anesthésie générale, avec injection dans la zone de l'horloge interne. 600 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour vérifier après coup où l'injection a atteint le cerveau. Selon les lots, elles vivent trois semaines seules en cage avec une roue d'activité, passent 48 heures isolées en imagerie cérébrale, ou enchaînent quatre tests comportementaux en quatre jours. Le porteur indique que les procédures reproduisent une perturbation du cycle repos-activité pouvant conduire à un état assimilé à l'anxiété, sans nommer aucun des quatre tests.

Objectifs

L'hypothyroïdie concerne près de 10% de la population. Cette maladie induit notamment des troubles de l'humeur tels qu'irritabilité, anxiété ou dépression, qui restent mal compris. Ces troubles pourraient être liés à la perturbation de notre horloge interne qui régule le cycle veille-sommeil. Nos résultats obtenus chez des souris hypothyroïdiennes soutiennent cette hypothèse. Notre objectif est maintenant de comprendre plus précisément comment les hormones thyroïdiennes, dont le taux sanguin est diminué pendant la maladie, interfèrent avec le fonctionnement de l'horloge, située dans une zone précise du cerveau. Pour répondre à cette question, nous utiliserons 2 lignées de souris génétiquement modifiées permettant de modifier l'action de ces hormones spécifiquement au site de l'horloge. Des tests comportementaux et une imagerie cérébrale permettront d'évaluer l'état d'anxiété et la physiologie de l'horloge interne de ces souris.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la régulation de l'horloge circadienne par les hormones thyroïdiennes. Cette compréhension pourrait ouvrir sur de nouvelles approches des troubles psychiques associés à l'hypothyroïdie, en tenant compte des rythmes circadiens des patients. Plus généralement, les mécanismes identifiés constitueront de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des maladies mentales liées aux troubles circadiens dans une société moderne active 24 heures sur 24.

Procédures

Toutes les souris subiront une chirurgie crâniale sous anesthésie générale de 20 à 35 minutes. Un lot sera hébergé en cages individuelles enrichies d'une roue d'activité pendant 3 semaines, un autre lot subira une série de 4 tests comportementaux sur 4 jours consécutifs, et un autre lot suivra une session d'imagerie cérébrale en cage individuelle pendant 48h.

Impact sur les animaux

Les procédures devraient reproduire certains effets de l'hypothyroïdie liés à l'horloge circadienne, notamment une perturbation du cycle repos-activité, ce qui peut conduire à un état assimilé à l'anxiété. Dans de rares cas, l'approche chirurgicale du cerveau pourrait induire inflammation, infection ou inconfort. Les périodes en hébergement individuel sont source de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour vérification des sites d'injection dans le cerveau

Remplacement

La réponse comportementale à une perturbation cérébrale telle que réalisée ici ne peut pas être étudiée par des méthodes alternatives. Toutefois, ce projet s'inscrit dans un cadre plus large visant à établir sur le long terme un modèle théorique du fonctionnement de l'horloge circadienne. Nous espérons aboutir à un modèle suffisamment riche et prédictif pour anticiper par le calcul sur ordinateur les réponses de l'horloge dans différentes situations physiopathologiques en complément/remplacement des modèles animaux.

Réduction

Sur la base de notre connaissance des tests comportementaux envisagés, nous avons utilisé un programme de calcul de puissance statistique. L'imagerie cérébrale permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires car chaque animal est son propre contrôle au cours du temps, et plusieurs cellules sont enregistrées dans un même champ.

Raffinement

Pour toutes les souris subissant une intervention chirurgicale, la douleur sera prise en charge avant, pendant et après la chirurgie. Les points limites définis permettent une prise en charge suffisamment précoce des animaux pour limiter les nuisances subies à un niveau modéré. Toutes les souris seront habituées progressivement à l'environnement expérimental et aux personnels en charge de l'application des procédures.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix dont l'horloge interne et la physiologie thyroïdienne reposent sur les mêmes principes que l'espèce humaine. Cette espèce donne un accès unique à un large éventail d'outils génétiques, notamment les 2 lignées uniques utilisées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à un stade de jeunes adultes, à partir de 6 semaines, lorsque la croissance du crâne est terminée.

Jusqu'à trente gavages et cinq privations d'eau de quinze heures trente en cinq jours : 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une prise de sang et jusqu'à trois injections sur animal vigile, un isolement quotidien d'environ une heure pour mesurer la prise de boisson, et deux passages en pot de plastique jusqu'à ce que l'animal défèque. Le projet cherche à savoir si les souris qui absorbent mal le fructose en boivent moins par aversion, et si leur microbiote en est la cause. Toutes seront tuées pour prélever le cæcum et son contenu.

Objectifs

Le fructose est un sucre très présent dans notre alimentation et mal absorbé lorsqu’il est consommé en excès, on parle de malabsorption du fructose. Cette malabsorption, très fréquente chez les enfants et les jeunes adultes, cause des symptômes gastrointestinaux (production excessive de gaz, diarrhées, douleurs abdominales) et peut induire une sensation de satiété. Nous étudions ce phénomène à l’aide de modèles de souris qui présentent les mêmes difficultés d’absorption du fructose que les humains. Nous avons constaté que le fructose, consommé lors d’un repas ou sur le long terme : augmente une hormone digestive pouvant jouer un rôle dans les douleurs intestinales et la prise alimentaire, modifie la composition du microbiote intestinal, et change le comportement alimentaire des animaux : ils mangent moins pendant les deux premiers jours d’exposition au fructose, puis reviennent à la normale à partir du sixième jour. Nous voulons comprendre si dans ce contexte de mauvaise absorption du fructose, ces changements de comportement alimentaire traduisent un phénomène d’aversion (réaction négative ou ressentiment fort qui pousse à éviter ou à rejeter quelque chose) puis d’habituation suite à la consommation ponctuelle ou répétée à ce sucre et identifier les médiateurs biologiques impliqués. Nous souhaitons savoir si ces modifications de la prise alimentaire sont liés aux changements du microbiote et si ce dernier en est la cause directe. Pour cela, nous comparerons des souris normales à des souris qui absorbent mal le fructose, traitées ou non par des antibiotiques déplétant le microbiote. Elles recevront un régime sans fructose, puis seront soumises à un test visant à évaluer leur préférence ou leur refus de la solution de fructose par rapport à une solution neutre telle que l’eau, un test d’aversion lors d’une exposition ponctuelle, dite « aigüe » (5 min) ou répétée, dite « chronique » (10 jours) à ce sucre. Ce test a pour but de comparer le volume de fructose ingéré sous forme liquide dans la boisson à celui de l’eau afin d’évaluer la préférence de boisson des animaux et ainsi leur potentiel refus (aversion), vis-à-vis de ce sucre. Nous analyserons aussi le microbiote et marqueurs biologiques potentiellement liés à ces modifications du comportement alimentaire. L’objectif est de mieux caractériser la malabsorption du fructose et les mécanismes associés en clarifiant le lien entre le fructose, le microbiote, la douleur viscérale et la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier les mécanismes impliqués dans les changements de comportement alimentaire observés chez les souris qui n’absorbent pas bien le fructose, suite à une exposition répétée ou ponctuelle à ce sucre. En effet, cela permettra de mieux comprendre la mise en place de ce phénomène et de déterminer s’il existe un lien entre ces changements de comportements alimentaires, la douleur intestinale, et les changements du microbiote. En effet, l’identification des médiateurs biologiques impliqués dans l’établissement de ces symptômes de malabsorption du fructose, pourraient permettre de développer à terme, de meilleures stratégies alimentaires ou thérapeutiques et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes atteintes. De plus, on retrouve des symptômes similaires dans le syndrome de l’intestin irritable (SII), qui est le désordre intestinal le plus fréquent, avec 14,4 à 22 % des patients atteints qui n’absorbent pas bien le fructose. Ainsi, compte tenu de la forte prévalence du SII dans le monde, et d’un pourcentage non négligeable de malabsorption du fructose parmi les patients atteints de SII, il semble crucial d’en décrypter les mécanismes sous-jacents.

Procédures

Les animaux seront soumis à un et/ou deux tests comportementaux ayant pour objectif d’évaluer leur réaction (refus ou préférence) vis-à-vis du fructose via la mesure de sa consommation dans la boisson. Au cours de ce protocole qui durera au total 5 jours, les souris seront soumises à 5 périodes de restriction d’eau de 15h30, à un hébergement individuel (de courte durée (1h05/jour) nécessaire pour mesurer la prise hydrique, à un prélèvement sanguin (moins de 20 secondes) à l’état vigile, à maximum 3 injections (moins de 20 secondes/ injection) à l’état vigile, à maximum 30 gavages (moins de 20 secondes / gavage) à l’état vigile ainsi qu’à de la contention (quelques secondes) à l’état vigile. Les animaux seront soumis à deux prélèvements de fèces au total, au cours desquels les animaux seront placés dans un pot transparent, le temps (maximum 10 minutes) qu’ils évacuent deux fèces.

Impact sur les animaux

Les animaux seront susceptibles d’être seront susceptibles d’être soumis : A un stress et une potentielle déshydratation, lors des périodes de test de préférences et de mesure de la prise hydrique, nécessitant une période de restriction d’accès à l’eau. • A un stress lors de l’hébergement individuel de courte durée, nécessaire pour mesurer la prise hydrique au cours des tests d’aversion, lors de la récolte de fèces impliquant le placement de la souris dans un pot en plastique afin qu’elle émette des selles et lors du prélèvement de sang, nécessitant une contention de moins de 20 secondes. Au cours de ce prélèvement et des injections prévues, les animaux ressentiront une légère douleur due à la piqûre, de l’ordre de quelques secondes.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus (caecum et contenu de caecum).

Remplacement

À ce jour, aucun modèle ou technique in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire les interactions complexes entre le fructose, le microbiote et l’axe intestin-cerveau. Le recours à des animaux est donc indispensable pour intégrer et analyser de manière globale les données génétiques, physiologiques, du microbiote et de l’alimentation ainsi que les informations biologiques obtenues à partir des dosages hormonaux dans le sang et des analyses des tissus intestinaux et cérébraux.

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental et par génotype afin d’obtenir des résultats fiables et significatifs. Ce nombre a été déterminé en prenant en compte la variabilité des mesures de prise hydrique et des dosages ainsi que la variabilité connue des réponses du microbiote et de son adaptation au fructose. Pour analyser les résultats, nous utiliserons des méthodes statistiques adaptées, en fonction du type de données recueillies, pour garantir des conclusions solides et précises. Dans cette perspective de réduction, nous prévoyons de n’inclure qu’un seul groupe contrôle, valable pour l’ensemble des groupes tests.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place : • Un enrichissement du milieu de vie : Les souris disposeront de papier sopalin pour construire leur nid, d’un bâton à ronger, d’un abri en propylène rouge, ainsi que de deux hamacs pour réduire les risques de bagarres. • Les animaux seront en groupe ; • Une habituation à la contention : Les animaux seront habitués à la contention et à l’expérimentateur afin de minimiser leur stress pendant les manipulations expérimentales ; • Cages des souris placées côtes à côtes sur le même portoir dans des cages transparentes lors de l’hébergement individuel nécessaire au test de préférence et de mesure de la prise hydrique d’aversion ; • Une surveillance et une pesée seront réalisées quotidiennement pendant la période du test d’aversion, pour contrôler l’état des animaux et s’assurer de leur bien-être tout au long du test et pouvoir intervenir ; • Des points limites seront définis et appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé dans les recherches sur les maladies gastro-intestinales, en raison de sa pertinence scientifique. Nous disposons de données préliminaires sur ces modèles génétiques originaux, qui sont disponibles uniquement chez la souris et indispensables pour notre étude. De plus, la souris possède les mêmes transporteurs et enzymes impliqués dans le métabolisme du fructose que l’humain ce qui renforce sa pertinence pour cette étude. Enfin, la malabsorption du fructose observée chez l’homme l’est également chez la souris et fait intervenir chez l’un comme chez l’autre, une altération dans la voie du métabolisme du fructose. Les groupes de souris seront testées pour l’aversion au fructose à 7 semaines d’âge, ce qui correspond chez l’humain à environ la tranche d’âge « 18-25 ans », groupe démographique étant le plus grand consommateur de fructose dans la population humaine.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe six semaines seule en cage, subit une chirurgie crânienne d'au plus 80 minutes, puis dix jours de restriction alimentaire avant d'apprendre à appuyer sur un levier pour obtenir jusqu'à 60 récompenses par jour, l'activité de son cerveau étant enregistrée pendant environ trois heures de sommeil. Le porteur justifie l'isolement par la protection des implants et l'homogénéité de la restriction alimentaire, et reconnaît qu'il provoque du stress. Les retombées annoncées pour la santé humaine sont renvoyées à cinq ou dix ans, quand l'objectif immédiat reste de décrire des mécanismes de neuro-modulation chez la souris.

Objectifs

Les neuro-modulateurs sont importants pour les processus d'apprentissage et la consolidation de la mémoire. De plus, ils sont aussi des cibles pharmaceutiques de prédilection dans le cadre des traitements de certaines maladies psychiatriques (depression, anxiété, Parkinson). Malheureusement, les mécanismes de neuro-modulation impliqués dans l’apprentissage et la consolidation de la mémoire sont peu connus. Dans ce contexte, l’objectif principal du présent protocole est de découvrir les mécanismes de neuro-modulation impliqués dans l’apprentissage et la consolidation de la mémoire chez la souris.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra : à court terme (au terme du projet), d’identifier les mécanismes de neuro-modulation de l’apprentissage et la consolidation de la mémoire chez la souris. À moyen terme (5–10 ans), les données générées pourront servir de base de travail pour le développement de stratégies thérapeutiques ciblant les différents neuro-modulateurs pour la santé humaine.

Procédures

Opérations chirurgicales : tous les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale qui dure maximum 80min. Tests comportementaux: tous les animaux sont soumis à une procédure comportermentale pendant laquelle elles apprennent à appuyer sur un levier pour obtenir une récompense. Pendant 5 jours, une fois par jour, les souris disposent au maximum de 60 min pour obtenir 60 récompenses. Des enregistremetns seront rélasés pendant la période de sommeil qui suit le premier jour d’apprentissage (environ 3 heures).

Impact sur les animaux

Les sources éventuelles de nuissances ou effets indésirables dans notre procédure : la chirurgie, l’hébergement individuel la restriction alimentaire et les test comportementaux. La chirurgie est susceptible d’occasionner un stress, une douleur et une perte de poids de manière aigüe (3 jours). L’hébergement individuel est necessaire pour garantir l’intégrité des implants et assurer une restriction alimentaire homogène. En effet, les restrictions alimentaires en cage collective exacerbent les hiérarchies et biaisent l'accés à la nouriture de certains individus. L'hébergement individuel commence avant la chirurgie jusqu'à la fin de la procédure, soit 6 semaines. Il occasionne un stress notamment au début. La restriction alimentaire, dure 10 jours et provoque une légère perte de poid. Lors des tests comportementaux les souris sont engagées dans une tâche de recherche de récompenses alimentaires; pour enregistrer l'activté cérébrale, elles sont connectées ce qui peut constituer une contrainte physique. Cependant au vue de nos données, le déplacement d'une souris connectée et non connectée est similaire.

Devenir

Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.

Remplacement

Chez l’homme, les neuro-modulateurs sont des cibles pharmaceutiques de prédilection dans le cadre des traitements de certaines maladies psychiatriques (depression, anxiété, Parkinson). De plus, chez l’homme, aucune méthode ne permet de comprendre les mécanismes cellulaires de la mémoire. Nous devons donc utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones ou de neuro-modulateurs avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux transgéniques et non-transgéniques (N) utilisé sera réduit à son minimum, en calculant l’estimation de la variance observée avec ce type de données pour atteindre une signification statistique. Nous avons besoin de 480 souris non-transgéniques l’étude des dynamiques des différents neuro-modulateurs et de 320 transgéniques souris pour la manipulation de la libération des neuro-modulateurs. Pour la réalisation de toutes les expériences de ce protocole nous utiliserons 800 souris.

Raffinement

Tous les soins seront pris afin de limiter la douleur et le stress des souris au minimum. Une période de 2 semaines d'acclimatation à l'animalerie (en cage collective) sera respectée à l'arrivée des souris. Après cette période, une habituation à la manipulation sera effectuée pendant une semaine. Les souris subiront des actes chirurgicaux. Afin de réduire au minimum leur souffrance, nous appliquerons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Après la chirurgie, l’évaluation de l’état général de l’animal et de son poids est effectuée de façon journalière à partir du moment de la chirurgie. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris. A la suite de la chirurgie, les souris seront isolées. Le temps de maintien des souris en habitat isolé sera réduit à son minimum, et les souris auront néanmoins accès à des stimuli olfactifs, visuels et auditifs provenant d’autres cages (ventilation collective et cages transparentes)

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliquées dans les comportements. Nos objectifs scientifiques nécessitent l’enregistrement et/ou la manipulation des différents neuro-modulateurs. L’existence de différentes lignées de souris rend cette espèce la plus indiquée pour réaliser notre étude. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal, soit un âge adulte, l’âge auquel les souris montrent de bonne performance d’apprentissage et de mémoire.

Opérées du cerveau sous anesthésie générale pour implanter une canule ou une fibre optique dans l'hippocampe, 210 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau et leur tissu adipeux. L'intervention dure environ une heure, et le porteur signale des crises d'épilepsie rares ainsi que la possibilité que l'animal décolle son implant en se frottant. Chaque souris subit ensuite deux stress de cinq minutes et un test de mémoire, après un régime riche en gras et en sucre administré dès l'adolescence, avec ou sans restriction horaire. Au titre de la réduction, le porteur indique récupérer pour ses mises au point des souris "produites mais non utilisées", issues de croisements transgéniques n'ayant pas donné le génotype voulu.

Objectifs

La consommation de régime alimentaire obésogène (riche en gras et en sucre) pendant la période d’adolescence est associée à des troubles de mémoire. Ceux-ci peuvent être prévenus si l’alimentation obésogène est restreinte dans le temps (chrononutrition). Nos travaux précédents montrent que le régime obésogène entraine une modification de la régulation des hormones glucocorticoïdes (corticostérone chez la souris) qui est restaurée par la chrononutrition. Or ces hormones sont connues pour être fortement impliquées dans les processus de mémoire. Leur altération pourrait expliquer les troubles de mémoire associés à la consommation d’alimentation obésogène. L’objectif principal de ce projet est de mesurer le rôle des hormones glucocorticoïdes in vivo, en temps réel et au cours du temps dans différents contextes d’alimentation (obésogène vs contrôle, avec ou sans chrononutrition) en une utilisant une approche nouvelle basée sur la fibre optique. Nous pensons qu’avec cette technologie nous pourrons plus finement comprendre le rôle de ces hormones dans les troubles de mémoire et leur prévention par la chrononutrition.

Bénéfices attendus

L’achèvement des expériences proposées devrait fournir des preuves de concept pour de nouvelles approches thérapeutiques potentielles utilisant l’alimentation limitée dans le temps(chrononutrition) pour traiter les troubles de la mémoire (et éventuellement des troubles émotionnels) induits par l’obésité. Le projet fournira également de nouvelles connaissances sur les actions des hormones glucocorticoïdes sur le cerveau, ce qui pourrait aider à traiter les pathologies associées à un excès de ces hormones.

Procédures

Chaque animal (210 au total) subit une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. La chirurgie dure environ 1h et la récupération post-opératoire est d’environ 2 heures. Ensuite, chaque animal subit deux stress modérés de 5 min chacun. Tous les animaux subissent un test de mémoire de 2 fois 10 min. Six animaux recevont deux injections de drogue et 6 animaux recevront une injection de drogue. Les injections durent 3 min chacune.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie du cerveau bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (nuisance modérée). L'implantation de canule ou de fibre optique dans la région du cerveau appelée hippocampe (siège de la mémoire), peut entrainer parfois des crises d'épilepsie (rare et de courte durée). La souris opérée peut parfois décoller la canule implantée ou la fibre optique en la frottant. Cela peut générer un inconfort qui reste modéré car il n’y a pas de plaie ouverte. Certains tests de comportement sont stressants mais ne durent que 5 min. Le régime obésogène utilisé n'entraine pas de diabète pour le temps d'exposition maximale utilisé (12 semaines).

Devenir

les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes (cerveau, tissu adipeux) en vue d’analyses post mortem

Remplacement

L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques de régime obésogène sur la mémoire et les émotions et les effets de la chrononutrition. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la mémoire et des émotions reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la deuxième. Pour les mises au point nous utilisons des animaux produits mais non utilisés (par exemple souris récupérées de croisements de souris transgéniques n'ayant pas le génotype désiré) afin de réduire les pertes pour la réalisation des expérimentations. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié

Raffinement

A leur arrivée, les animaux ne subissent pas d’expérimentation pendant 2 semaines afin de favoriser leur acclimatation à notre animalerie. Nous les manipulons régulièrement pour qu’ils s’habituent à l’expérimentateur. Lors des chirurgies nous pratiquons une anesthésie générale et une antalgie médicamenteuse. La chirurgie est réalisée dans des conditions d’asepsie et nous pratiquons des soins pré et post-opératoires adaptés. Nous avons mis en place un arbre décisionnel de points d’arrêt précoces où nous intervenons pour réduire le stress et la douleur des animaux si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utilisons uniquement des souris car les expériences de comportement sont validées dans cette espèce et les appareillages sont disponibles. Les traitements nutritionnels sont faciles à conduire et divers aliments/régimes alimentaires sont disponibles commercialement. La plupart des expérimentations en neurosciences sont conduites sur des rongeurs (rat ou souris), nos expériences enrichissent le corpus de données en permetttant des compariasons directes avec ce qui es déjà publié. Nous étudions les souris entre 3 et 15 semaines d'âge. Ces âges couvrent la période d'adolescence (3 à 7 semaines) jusqu'à l'état jeune adulte, stades de développement que nous voulons étudier dans notre projet.