Système nerveux

390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections stéréotaxiques dans le cerveau, la pose de pompes osmotiques et l'injection d'une toxine destinée à détruire certains neurones, pour étudier la propagation d'agrégats de protéines liés à des maladies neurodégénératives. Le porteur affirme que les produits injectés ont un impact "très limité" sur le comportement et une symptomatologie "très réduite", les effets attendus étant surtout moléculaires. Les retombées annoncées, mieux connaître ces maladies, restent générales et renvoyées au long terme, l'objectif immédiat étant de tester si la mort provoquée de neurones libère les agrégats.

Objectifs

Certaines pathologies neurodégénératives sont caractérisées par l'apparition d'agrégats intracellualires de synucléine au sein de certaines cellules nerveuses, comme par exemple les neurones, et par l'augmentation progressive "en tache d'huile" des régions cérébrales atteintes. Cette évolution "en tache d'huile" correspondrait à une transmission de ces agrégats entre les neurones. Nous souhaitons à travers cette étude nous intéresser aux mécanismes cellulaires de dispersion et de transmission de ces agrégats dans des zones cérébrales de plus en plus éloignées et de plus en plus étendues, 1/ en utilisant un modèle de maladie neurodégénérative induite chez la souris, modèle maîtrisé par notre institut, 2/ en provoquant la libération massive des agrégats contenus dans les neurones atteints, grâce à l’utilisation d’une toxine (l’acide 3 nitripropionique) largement utilisée pour détruire certains neurones dans les régions cérébrales d’intérêt (substances noire, striatum). En pratiquant de telles injections au niveau de la substance noire et de l’aire tegmentale ventrale, nous avons observé une apparition progressive d'agrégats intraneuronaux localement au site d'injection, mais aussi plus tardivement à distance et latéralement opposé au site d’injection. Cependant, au bout de 4 mois ces agrégats contenus dans un type neuronal particulier du striatum (MSNs pour medium spiny neurones) apparaissent stationnaires et ne se propagent absolument pas aux neurones corticaux, qui pourtant ont des connexions avec le striatum. Il semblerait donc que la propagation interneuronale du processus d'agrégation par transfert de fragments amyloïdes d'un neurone à l'autre n'ait pas lieu. La propagation longue distance observée entre le site d'injection, la substance noire, et le striatum, quant à elle, pourrait simplement s'expliquer par la progression intracellulaire du processus d'agrégation de la terminaison vers le corps cellulaire. En revanche, l'absence de transmission secondaire aux étages corticaux laisse penser que la libération de fragments amyloïdes par les MSNs n'a pas lieu. Nous souhaitons donc savoir si la mort provoquée des MSNs porteurs d'agrégats pourrait provoquer la libération extracelllulaire complète de ces agrégats et ainsi de provoquer une transmission secondaire au niveau du cortex dans le même hémisphère cérébral mais aussi dans l’hémisphère opposé.

Bénéfices attendus

A court terme : Ce projet permettra peut-être d’améliorer la voie d’administration d’une toxine pour l’utilisation d’un modèle animal de destruction de neurones. A plus long terme : Ce projet permettra de mieux connaître les mécanismes de transmission des agrégats entre les neurones distants et parfois même dans l’hémisphère cérébral opposé. Ainsi, ce projet s’inscrit dans la thématique de notre institut et contribuera à améliorer les connaissances sur la mise en place moléculaire des pathologies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux sont soumis à des procédures chirurgicales : 1/ injection stéréotaxique de composé (durée 30 min maximum par animal) pour une partie des groupes 2/ pose de pompe osmotique pour une partie des groupes 3/ Les deux types de chirurgie, mais à 1 mois d'intervale, pour une partie des groupes Il seront aussi soumis à des injections intrapéritonéales (répétées pendant 7 jours à raison de deux fois par jour espacées de 12heures)

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables sont ceux liés aux chirurgies réalisées sur les animaux ainsi qu'a la fréquence d'injection intrapéritonéale. A contrario, que ce soit les produits injectés dans le cerveau ou en intrapéritonéal, ceux-ci ont un impact très limité sur le comportement (moteur par exemple) et ont une symptomatologie très réduite, car les effets attendus sont moléculaires, concernent peu de neurones et sont liés à la méchanistique de la pathologie.

Devenir

Le sacrifice des animaux permet de récupérer le cerveau pour réaliser une étude histologique des zones cérébrales impliquées dans la pathologie.

Remplacement

Nous souhaitons étudier et caractériser des modèles mimant la pathologie chez l’humain nécessitant ainsi l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Modèle : la souris C57BL6/JR a été choisie car nos études antérieures ont montré une bonne stabilité et reproductivité, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux pour réaliser ces études. De plus, le statut sanitaire des animaux étant maîtrisé, la stabilité du modèle est éprouvée. Enfin, nous testerons l’utilisation de pompe Alzet, pour essayer de s’affranchir d’une administration répétée par ip.

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés soit par la peau du dos soit dans des tubes, afin de ne pas les manipuler par la queue. Chirurgie : une attention particulière est apportée pour un maintien de l'aseptie pendant la période opératoire. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.

Choix des espèces

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Ces travaux d'étude des maladies neurodégénératives en utilisant la souris comme modèle sont largement decrits dans la littérature ce qui nous donne une base solide pour valider nos résultats. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte qui est compris entre 8 et 12 semaines.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un gène de l'autophagie est invalidé, puis les animaux passent des tests d'interaction sociale et d'ultrasons avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie ou une dislocation cervicale. Le porteur indique que les nuisances tiennent à une période d'isolement, au stress des tests et aux contentions. Il affirme que l'étude d'un défaut d'autophagie sur le comportement "ne peut se faire autrement" qu'in vivo, la retombée contre les troubles du neurodéveloppement restant renvoyée au long terme.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autre les capacités d’interaction sociale et d’ultravocalisations, à différents âges, chez des souris pour lesquelles un gène de l’autophagie a été invalidé. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs. Ils sont ensuite soumis à un protocole de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).

Impact sur les animaux

A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans la procédure du présent projet, les animaux subissent des tests non invasifs de comportement, jusqu’à la perfusion intracardiaque (n = 120), pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place ou jusqu’à l’euthanasie par dislocation cervicale (n = 120). Des nuisances et effets indésirables classés comme modérés sont attendus, en lien avec notamment la mise en place d’une période d’isolement pour les animaux, le stress induit par les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques.

Devenir

La procédure décrite dans ce projet sera réalisée sur des souris. C’est une procédure modérée qui concerne les 120 animaux issus de la lignée (animaux résidents) et les 120 animaux naïfs (visiteurs WT). L’ensemble des animaux sera euthanasié en fin de procédure.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 240 souris. Le nombre d’animaux est réduit en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. D'une manière générale, conçu les lots sont conçus pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans la procédure expérimentale (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 240 souris.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie).

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux modèles pathologiques sont induits, puis les animaux subissent des mesures de sensibilité avant une mise à mort par surdose d'isoflurane et dislocation cervicale pour prélèvement de tissus. Le résumé annonce l'étude de la rosacée oculaire, mais ses justifications glissent vers le syndrome de l'intestin irritable et une infection à C. rodentium, sans que le protocole soit détaillé. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de travailler sur des animaux" et qu'il n'existe "pas d'autre alternative".

Objectifs

La rosacée est une maladie commune de la peau, inflammatoire et chronique, avec une variété de manifestations cliniques telles que l’érythème centro-facial, les papules et les pustules, ainsi qu’une atteinte oculaire. Il s’agit d’une pathologie fluctuante, avec une alternance de poussées et de rémissions. Plusieurs facteurs exacerbant la pathologie ont été décrits, comme l’alcool, l’exposition au soleil, le sport, la nourriture épicée, le stress, les émotions et les changements de température.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs et d'inflammation associées à la rosacée occulaire afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec des services de gastroentérologie. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.

Procédures

Suite à l'induction des 2 modèles (procédures 1 et 2), l'ensemble des animaux subiront les procédures 3 et 4 une seule fois et une semaine après l'induction du modèle.

Impact sur les animaux

Les animaux seront mis à mort par une overdose d’isoflurane puis dislocation cervicale. Ceci concernera les animaux en fin d'expérimentation mais aussi si un animal présente au moins 1 des points limites décrits par la suite.

Devenir

Pour l'ensemble des procédures, les animaux seront maintenus en vie. A l’issue de la procédure 4 (mesure de la sensibilité mécanique), les animaux seront mis à mort pour effectuer différents prélèvements de tissus.

Remplacement

Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.

Réduction

Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.

Raffinement

Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.

204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection de vecteurs viraux et implantation de fibres optiques ou de lentilles, un test d'évitement de lieu associé à des chocs électriques, puis une perfusion intracardiaque létale pour fixer le cerveau. Le porteur relie ce travail à l'évitement observé dans le stress post-traumatique et espère y trouver des cibles thérapeutiques. Il affirme qu'un "organisme vivant intègre" est nécessaire, aucun modèle in vitro ou informatique ne pouvant selon lui le remplacer.

Objectifs

Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans la persistance de l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les circuits liant l’hippocampe au noyau accumbens via le septum latéral. L’hippocampe a déjà été impliqué dans la persistance d’évitement de place et le noyau accumbens joue un rôle clef dans la génération du comportement d évitement. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’hippocampe contrôle la persistance de l’évitement de place chez la souris. Pour atteindre l’objectif général, nous réaliserons une caractérisation neuroanatomique et optogénétique des circuits neuronaux activés pendant l’encodage et le reversal de l’évitement de place. Un point clé de cette étude est l’aspect longitudinal indispensable à la caractérisation de ces circuits neuronaux. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ces différents circuits.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.

Procédures

Ce projet implique 4 procédures expérimentales décrites en item 4. Chaque procédure (classe modérée) comprend la chirurgie stéréotaxique pour des injections de vecteurs viraux (30-45 min), le comportement d’évitement de place (10-30 min par jour pendant 3-4 jours) et la perfusion intracardiaque (10 min). La procédure 3 comprend également une chirurgie stéréotaxique pour l’implantation de lentilles à gradient d’indice (30-45 min) et la pose d’une baseplate qui n’implique pas de chirurgie stéréotaxique (30-45 min) pour les études d’imagerie calcique. La procédure 4 comprend également une chirurgie stéréotaxique pour l’implantation de fibres optiques (30-45 min) pour les études d’optogénétique.

Impact sur les animaux

Le comportement d’évitement de place et la perfusion intracardiaque n’engendrent ni douleur ni stress. L'intensité du choc électrique choisie (maximum de 0.2 mA) est largement inferieure aux intensités de chocs classiquement utilisées dans la littérature (0,7 mA). Par ailleurs, ce protocole a été démontré comme n’étant pas plus stressant que l’exploration délibérée d’un environnement familier. Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures douloureuses, l’usage d’anesthésiques et analgésiques est prévu, avant, pendant et après la chirurgie (jusqu’à 8 jours).

Devenir

Notre étude nécessite d’une part de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose létale d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.

Remplacement

L’utilisation d'animaux vivants se justifie par la nécessité d’identifier des phénomènes physiologiques complexes au sein des circuits neuronaux impliqués dans le comportement d’évitement chez la souris, ainsi que leur interaction fonctionnelle. De nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent entre elles. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé à ce jour par des techniques in vitro. De plus, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques contrôlant la persistance de l’évitement actif restent inconnus.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 204 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. De plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de 1) déterminer les conditions optimales lors des tâches comportementales de conditionnement et 2) mettre en place de nouvelles techniques, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.

Raffinement

Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont rapprochées les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri-opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés (la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement) et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Toutes les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines. Les souris transgéniques seront élevées dans notre animalerie. Les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au delà de 10 mois.

2 264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sept jours de privation de sommeil paradoxal pour reproduire une fatigue chronique, passent un test moteur et exploratoire, puis sont tués par prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie ou par décapitation à la guillotine pour prélever le cerveau. Le porteur cherche à modéliser le syndrome de fatigue chronique et à y tester des molécules candidates. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer la fatigue chronique, rendant selon lui le recours à l'animal "nécessaire".

Objectifs

La fatigue chronique est l’un des principaux facteurs qui dégradent la santé humaine ; aussi appelée syndrome de fatigue chronique (SFC), il se définit comme un ensemble de symptômes d’épuisement intense et quasi permanent qui apparaissent sans raison apparente ou pathologie sous-jacente. Afin d'étudier la physiopathologie de la fatigue chronique, ce projet consiste : 1) Dans un premier temps, à mettre en place un modèle animal de fatigue chronique chez le rat. Les animaux seront exposés à une privation continue de sommeil à mouvements oculaires rapides (REM) pendant 7 jours. L’impact de cette privation de sommeil sera étudié dans un test de comportement moteur/exploratoire. A la fin de l’étude, différents prélèvements (sang et cerveau) seront réalisés pour des mesures de paramètres biochimiques; 2) Puis, dans un deuxième temps, l’objectif sera de tester, dans ce modèle, des médicaments candidats pouvant réduire la fatigue généralisée.

Bénéfices attendus

Les origines du syndrome de fatigue chronique (SFC) restent méconnues et à ce jour il n’existe pas de traitement spécifique au SFC dont l’efficacité ait été démontrée. Les traitements proposés visent à soulager les symptômes qui lorsqu’ils se manifestent de façon intense deviennent particulièrement invalidants pour le malade. Ce modèle est utile pour : 1) identifier les voies neurobiologiques impliquées dans ce syndrome; et 2) tester de nouvelles molécules candidats, pour améliorer sa prise en charge.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes régulières dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre les prélèvements de sang sont réalisés : 1) soit en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris entre 1 ml à 4 ml maximum ; 2) soit par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d’une nécessité de prélèvement sanguin important (supérieur à 4 ml). A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.

Impact sur les animaux

Durant la période d'induction de la fatigue , les animaux sont pesés et leur état général est évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans un tableau définissant les points limites expérimentaux, et aussitôt analysées. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Par ailleurs, certains effets indésirables des produits tels que des crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après administration.

Devenir

L’impact de la privation de sommeil sera étudié dans un test de comportement moteur/exploratoire. A la fin de l'étude, pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à : 1) à un prélèvement de sang en intracardiaque sous isoflurane ou par décapitation (sous anesthésie générale) avec une guillotine dans le cas d'une nécessité de prélèvement sanguin important et 2) à un prélèvement de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour évaluer la fatigue chronique, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier la physiopathologie de la fatigue et évaluer l’efficacité de nouvelles molécules qui pourrait la réduire.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Ils seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. Cette grille permet d’évaluer le niveau de souffrance des animaux selon des critères cliniques spécifiques, par un personnel dûment formé. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans un tableau définissant les points limites expérimentaux, et aussitôt analysées. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rats correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Espèce/lignée utilisée : rat mâles Sprague-Dawley Ce modèle est reconnu et sa validité a été démontrée chez le rat. Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.