Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude des mécanismes des récepteurs du glutamate sur la régulation de l’activité des neurones : EU 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'implantation d'électrodes dans le cerveau et des injections de virus, suivies d'enregistrements pendant l'éveil et le sommeil, avec douleur post-chirurgicale, risques anesthésiques et hébergement isolé. Le porteur mène une recherche fondamentale sur les récepteurs du glutamate et renvoie au long terme d'éventuelles stratégies contre les troubles anxieux. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que la modélisation informatique de ces réseaux reste hors de portée.
Objectifs
Le projet a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux, à la fois dans un cadre physiologique et pathologique. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à l’activation et au dialogue de différentes structures du cerveau durant la veille et le sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l’activités des neurones chez des souris libres de leurs mouvements et endormies.
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones ; 2) injection de virus ; 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui permet les prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes est réalisés sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : Chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement (stress modéré).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem).
Remplacement
Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1360 animaux.
Raffinement
Après leur réception, les animaux sont habitués à l’animalerie de l’Institut pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés seront maintenus en isolation: la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Afin de garantir la taille minimale réglementaire au sein d'un compartiment une fois la cloison installée, les cages utilisées sont des cages prévues pour des rats. Pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes et facilitera l’accès à la nourriture. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une construction de lego sera mise en-dessous du biberon d’eau pour réduire la hauteur et faciliter l’accès à l’eau. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur (utilisation de l’échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.
Choix des espèces
Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Circuits neuronaux des comportements addictifs alimentaires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique du cerveau, des injections répétées et un régime alimentaire, parfois une restriction alimentaire qui les stresse, pour modéliser la boulimie et la frénésie alimentaire humaines et en disséquer les circuits neuronaux. Le porteur reconnaît des risques d'infection et de douleur post-opératoires, ainsi qu'un stress lié à l'isolement. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne permet d'étudier de tels comportements et que les lignées transgéniques requises n'existent que chez la souris.
Objectifs
L'obésité augmente considérablement dans le monde. Malgré des recherches approfondies et des développements dans le domaine, le problème ne cesse de s'aggraver. Les comportements de dépendance alimentaire tels que la boulimie et la frénésie alimentaire sont considérés comme des traits caractéristiques des personnes obèses. Ces comportements pathologiques sont mal connus. Ce projet dissèque les circuits neuronaux des comportements de dépendance alimentaire en modélisant la boulimie et la frénésie alimentaire chez la souris. Dans ce projet, nous concevons un paradigme pour imiter les caractéristiques comportementales de boulimie et de frénésie alimentaire chez la souris. Les objectifs de ce projet consistent à identifier les circuits hypothalamiques sous-jacents au comportement alimentaire compulsif, puis à moduler ces circuits pour arrêter le comportement. L'activité des circuits cérébraux sera imagée lorsque les souris sont impliquées dans des comportements alimentaires compulsifs. Sur la base des résultats d'imagerie, nous ciblerons des populations neuronales spécifiques dans l'hypothalamus. Les objectifs de ce projet consisteront à étudier des circuits neuronaux hypothalamiques spécifiques et à tester si leur ciblage a un potentiel thérapeutique pour développer des stratégies de ciblage de médicaments.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet seront de déterminer des nouvelles cibles thérapeutique pour les troubles alimentaires.
Procédures
Procédure 1 : Dans chaque groupe, les souris seront soumises à un régime alimentaire pendant 16 séances. Les souris recevront 2 injections intrapéritonéales sur animal vigile au cours de cette procédure (30 sec par injections). Procédure 2 : Dans chaque groupe, les souris seront soumises à 1 chirurgie stéréotaxique intracérébrale, 2 injections sous-cutanées et 1 injection intrapéritonéale sur animal vigile. Procédure 3 : Dans chaque groupe, les souris seront soumises à 1 chirurgie stéréotaxique intracérébrale, 2 sous-cutanées, 1 régime alimentaire et 5 injections intrapéritonéales sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Chirurgie stéréotaxique : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire. Prise alimentaire : la restriction alimentaire pourra entrainer un stress de l’animal. Cette restriction ne sera utilisée uniquement si nécessaire, lorsque les animaux n’apprendront pas à manger dans les chambres opérantes. En temps normal les souris auront libre accès à leur alimentation normale pendant toute la procédure d'expérimentation. De plus, l'isolement et la présence d'un régime riche en graisses et en sucre peuvent entraîner une augmentation du poids corporel (qui sera enregistrée lors des paradigmes comportementaux et de la procédure). Ces expériences choisies ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les tests de prises alimentaire sont potentiellement stressant pour l’animal car les souris seront soumises à un isolement. Les souris seront injectées en intrapéritonéale ,il y a donc la possibilité d’irritation du site d’injection.
Devenir
mise à mort pour prélèvement
Remplacement
Remplacement : Les conduites addictives alimentaires ne peuvent pas être récapitulées dans d'autres modèles cellulaires. Il est impossible d'étudier la complexité de tels comportements dans des modèles non animaux. Afin d'étudier les circuits impliqués dans le cerveau, l'utilisation d'animaux vivants est nécessaire car il n'existe actuellement aucun autre modèle où une telle expérimentation peut être effectuée. Plus précisément, dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour imager ou cibler un circuit spécifique dans le cerveau de souris comportementales. À l'heure actuelle, nous n'avons pas de stratégies ou de modèles alternatifs pour étudier le cerveau et le comportement sans utiliser d'organismes vivants.
Réduction
Réduction : Afin de réduire le nombre d'animaux dans l'étude, des souris seront consanguines et plusieurs paramètres seront testés de manière longitudinale. Nous optimiserons les conceptions comportementales et les chirurgies pour obtenir une conclusion statistiquement pertinente avec un nombre minimum de souris. Les nombres seront optimisés selon les données de la littérature, compte tenu de la variabilité interindividuelle, des groupes expérimentaux requis et des complexités procédurales.
Raffinement
Raffinement : Les souris seront maintenues dans des conditions d'hébergement optimisées dans des cages ventilées individuellement (IVC) où les souris seront logées en groupe. Chaque cage a un environnement contrôlé, enrichi d'une barre à ronger, de serviettes en papier et d'un nid. Pour réduire la douleur et l'inconfort de toutes les souris d'expérience non invasives, elles seront habituées pendant quelques jours à l'environnement et à l'expérimentateur. Pour effectuer des procédures invasives, les souris seront sous anesthésie et recevront des analgésiques. Pendant toutes les procédures invasives, la température corporelle à l'aide de tapis thermostatiques jusqu'à ce que les souris soient complètement éveillées. Les souris seront étroitement surveillées après les procédures pour la douleur et l'inconfort. Nous évaluerons le corps et le poids, la consommation de nourriture et d'eau des souris pendant les 3 à 4 prochains jours afin de déterminer si les souris se sont bien rétablies ou non de la procédure invasive. Nous utiliserons une grille d'évaluation pour déterminer la santé des souris et dans des circonstances où la santé se détériore, les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
Le projet étudie les circuits neuronaux sous-jacents au comportement alimentaire compulsif in vivo, et aucune alternative in vitro n'est disponible pour les expériences que nous réalisons. Les lignées transgéniques nécessaires à ce projet ne sont disponibles que chez les souris, ainsi des souris adultes sont choisies car ces comportements addictifs ont été observés chez chez l'homme adulte selon la littérature.Les caractéristiques uniques de l'approche adoptée dans mon laboratoire incluent la combinaison d'études comportementales avec des études anatomiques et biochimiques sur les mêmes animaux. Les phénomènes que nous souhaitons étudier ne se produisent pas en culture cellulaire.
Choix d’un modèle murin d’accident vasculaire cérébral ischémique adapté pour l’étude des conséquences des comorbidités liées au vieillissement
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vieillies puis soumises trois mois à un régime gras déséquilibré, elles subissent un test de tolérance au glucose puis une chirurgie d'accident vasculaire cérébral de dix à quarante minutes, qui provoque une douleur peropératoire, des pertes sensorimotrices et une perte de poids. Le porteur indique qu'une première étape sert surtout à choisir le meilleur modèle et à faire acquérir le geste chirurgical par deux personnes du laboratoire. Il écarte le remplacement en affirmant que l'étude ne peut s'envisager que dans un "organisme entier", et justifie la mise à mort par le prélèvement des tissus.
Objectifs
Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est dans un premier temps de déterminer le meilleur modèle d’étude de la maladie chez le sujet âgé. Dans un premier temps nous comparerons deux modèles classiquement utilisés et qui sont les plus proches de l’accident vasculaire cérébral chez l’homme. Dans un second temps, le modèle choisi fera l’objet d’une acquisition du geste chirurgical par deux personnes pour permettre la continuité de la compétence acquise au sein du laboratoire. Enfin, le modèle sélectionné et acquis par le personnel compétent sera appliqué dans le cadre d’une première étude dont le but est de prendre en compte le rôle de l’âge et des comorbidités associées dans l’accident vasculaire cérébral. En effet, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude permettra de choisir un modèle d'étude fiable et reproductible pour mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en place un modèle adapté et robuste pour comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).
Procédures
Tout d’abord, nous testerons 2 différents modèles d’accident vasculaire cérébral ischémique chez des animaux de plus de 9+/- 2 mois. La chirurgie est de 40min pour le modèle semi permanent (procédure 1) et de 10 min pour le modèle permanent (procédure 2). Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral ischémique en utilisant un modèle in vivo, préalablement retenu, d'ischémie cérébrale (chirurgie de 10 ou 40 min). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés à 72h après la mise en place du modèle d’accident vasculaire cérébral à l’aide de tests de comportement et de l’imagerie post mortem.
Impact sur les animaux
L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). Le test d'intolérance au glucose pourra induire une légère douleur de courte durée (1 injection intrapéritonéale de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie). Le modèle d’accident vasculaire cérébral induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire de l’imagerie
Remplacement
Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale dans un contexte de vieillissement vasculaire et comorbidités liées à l’âge, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’accident vasculaire cérébral. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.
Mesures par électromyographie de l’activité neuro-musculaire chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent des électromyographies sous anesthésie tous les trois mois pendant vingt et un mois, sous régime obésogène pour une partie, avant le prélèvement de leurs muscles, pour valider un protocole de mesure de l'onde H et prendre en main un nouvel appareil. Le porteur présente ces mesures comme non invasives et vise à en faire une "prestation" ouverte à la communauté scientifique. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet ces mesures et qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal.
Objectifs
Examen de référence en neurologie, l’électromyographie (EMG) permet d’analyser l’activité électrique des nerfs et des muscles chez l'Homme. En complément de l’examen clinique, il aide au diagnostic de différentes pathologies nerveuses et musculaires. L'EMG est utilisée chez la souris pour étudier les maladies neuromusculaires. Après stimulation électrique du nerf sciatique, la réponse électrique au niveau du muscle plantaire est enregistrée. Deux ondes sont présentes dans cette réponse : une onde motrice (onde M), correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres motrices du nerf sciatique, et une onde réflexe (onde H) correspondant à la réponse du muscle à la stimulation des fibres sensorielles du nerf sciatique. La latence et l'amplitude de ces ondes permettent de détecter une atteinte neuromusculaire. L'onde H est difficile à détecter et à mesurer car son amplitude est faible (inférieure à 1 mV) et l'onde peut être difficile à distinguer du bruit de fond. Nous avons fait l'acquisition d'un système EMG qui permet d'éliminer le bruit de fond et de visualiser l'onde H. Une équipe partenaire a mis au point et validé un protocole permettant d'observer correctement l'onde H. Nous souhaitons d'une part prendre en main ce nouvel appareil et valider notre capacité à observer une onde H en utilisant quelques animaux envoyés par cette équipe, d'autre part valider ce protocole de mesure de l'onde H dans notre laboratoire avec les souris C57Bl6J adultes jeunes et âgées afin de déterminer si l'évolution de l'amplitude de l'onde H chez ces souris est une variable d'intérêt pour les études sur le vieillissement, et enfin, tester si un régime obésogène, entraine une diminution plus rapide de l'amplitude de l'onde H chez les souris, signant un développement précoce d'atteintes neuromusculaires liées à l'âge. Ces mesures non invasives, si nous validons nos protocoles lors de ce projet, seront proposées à la prestation dans notre plateforme d'exploration fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Validation du protocole de mesure de l'onde H dans notre laboratoire, plateforme d'exploration fonctionnelle ouverte à la communauté scientifique - Ouverture d'une nouvelle prestation répondant à des besoins exprimés par la communauté scientifique locale - Utilisation d'une variable obtenue de manière non invasive dans les études du vieillissement.
Procédures
Mesures de l'electromyogramme (EMG) sous anesthésie générale chaque 3 mois durant 21 mois maximum. Mise en régime obésognène durant 21 mois. Pour l'enregistrement de l'EMG, les souris sont anesthésiées par voie intra-péritonéale (durée de l'injection
Impact sur les animaux
La mesure de l'EMG ne présente pas de nuisance pour l'animal qui est anesthésié. Si un animal commence à se réveiller au cours du test, l'expérience sera immédiatement stoppée. Les souris FXN-Pvalb ont une délétion homozygote du gène codant pour la frataxine. Ces animaux présentent une mortalité liée à l'apparition de crises épileptiques à partir de l'âge de 20 semaines, âge qui ne sera pas atteint au cours de notre protocole, les animaux étant euthanasiés à l'âge de 15 semaines. Par ailleurs, des déficits de coordination motrice apparaissent dès l'âge de 5 semaines. Ces déficits augmentent au cours du temps et à l'âge de 15 semaines, ces animaux présentent des troubles de la démarche marqués mais non délétères.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort afin de permettre le prélèvement de différents organes d'intérêt, notamment des muscles afin de comparer les mesures EMG et des observations histologiques.
Remplacement
Les modèles murins de neuropathies présentent des troubles moteurs. Pour étudier l'efficacité thérapeutique d'une molécule d'intérêt, ces troubles moteurs sont évalués au cours du temps et les mesures électromyographiques viennent compléter les phénotypes observés. Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique ou du vieillissement sur la coordination motrice. Il est donc indispensable de pouvoir réaliser des mesures électromyographiques sur l'animal.
Réduction
Les effectifs utilisés dans ce protocole ont été établis par étude de puissance sur les mesures électromyographiques. Ainsi, pour une puissance d'analyse de 80% avec un risque de 5%, nous avons défini des tailles de groupes de n=12 pour pouvoir conclure sur les paramètres mesurés. Nous avons constaté que cette taille d'effectif convenait dans les études électromyographiques antérieures réalisées chez nos partenaires d'autres plateformes nationales. Dans le protocole de challenge nutritionnel qui s'étale sur 21 mois, la cohorte de départ est doublée pour garantir un nombre correct d'animaux exploitables jusqu'au dernier point de mesure. La latence et l'amplitude de l'onde H seront les paramètres analysés. En fonction de la normalité des données, la comparaison des résultats entre deux groupes sera réalisée à l'aide d'un test paramétrique ou non paramétrique. Nous utiliserons 168 souris au total pour cette étude.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un travail de raffinement qui devrait nous permettre de préserver au maximum le bien-être des animaux tout au long des procédures. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage, ils sont hébergées par cage de 4. De l'enrichissement sera ajouté pour pour amoindrir le stress et permettre aux animaux de faire un nid, des igloos seront placés dans les cages. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours par les personnels de la zootechnie et 2 fois par semaine par une personne impliquée sur le projet, ceci permettant de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements.
Choix des espèces
Notre plateforme propose des expérimentations sur les souris de laboratoire, c'est également l'espère hébergée dans la zootechnie dans laquelle sera installé le matériel. C'est par conséquent l'espèce sur laquelle nous souhaitons travailler et nous entrainer afin de répondre aux besoin de nos utilisateurs. Les souris FXN-Pvalb sont utilisées pour modéliser l'ataxie de Friedreich et montrent une diminution progressive de l'amplitude de l'onde H à partir de l'âge de 7 semaines. Un premier EMG sera réalisé à l'âge de 5 semaines, avant que l'amplitude de l'onde H ne commence à diminuer chez ces souris, puis un deuxième EMG sera réalisé à l'âge de 15 semaines, lorsque l'amplitude de l'onde H est fortement diminuée chez les souris FXN-Pvalb. Ces animaux seront donc utilisés au stade jeune et adulte. Les souris C57Bl6J seront utilisées du stade jeune adulte (3 mois) jusqu'au stade âgé (24 mois) pour répondre à la question de l'évolution de l'onde H au cours du vieillissement sous challenge nutritionnel ou non.
Mise en évidence des effets du LSD sur l’activité comportementale et cérébrale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
1 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Issues d'un modèle de trouble obsessionnel-compulsif au toilettage poussé jusqu'à la lésion cutanée, elles sont isolées dans des cages automatisées pour apprendre des tâches jusqu'à quatre mois, reçoivent une injection de LSD et subissent pour certaines une chirurgie de deux à trois heures, pour cartographier les régions cérébrales activées par la molécule. Le porteur indique que le LSD provoque des mouvements rapides de la tête et que de rares souris peuvent montrer une souffrance prolongée. Sur le remplacement, il affirme que la neuromodulation "ne peut être remplacée" par une approche ex vivo.
Objectifs
Ce projet, qui vise à enrichir les connaissances sur les mécanismes d'action de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) grâce à un ensemble d'expériences chez la souris, comporte trois axes: 1) Caractériser l'ensemble des régions cérébrales mis en jeu lors de l'administration de l'acide lysergique diéthylamide (LSD), grâce à des approches immunohistochimiques et de clarification du cerveau. 2) Étudier l'effet de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) sur le comportement des animaux. 3) Étudier plus en détail et à long-terme les modifications d'activités au niveau du cortex orbitofrontal, en lien avec la tâche d'apprentissage et l'administration de l'acide lysergique diéthylamide (LSD).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à enrichir les connaissances sur les mécanismes généraux d'action de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) grâce à un ensemble d'expériences chez la souris. Notre objectif est de cartographier les modifications d'activités cérébrales induites par l'acide lysergique diéthylamide (LSD) et pouvant sous-tendre ses effets thérapeutiques en psychiatrie.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, nous prévoyons d'étudier un modèle murin de trouble obsessionnel-compulsif (TOC) qui ont la particularité d’engager des actions de toilettage de manière compulsive. Ce phénotype peut conduire à des lésions cutanées au niveau de la face et du corps, qui est observable à partir de l’âge de 3 mois, seulement chez certains individus. Les souris seront isolées et placer dans des cages opérantes automatisées dans laquelle elles apprendront des tâches comportementales. Ces systèmes de cages fournissent un environnement enrichi pour les animaux où ils peuvent entreprendre des tâches comportementales à leur propre rythme. Les souris resteront dans ces boîtes en fonction du temps nécessaire à l'animal pour obtenir de bonnes performances dans la tâche, pour une période pouvant aller jusqu'à 4 mois. De plus, tout animal présentant des symptômes de stress élevé ou un manque de motivation lors de la tâche comportementale sera exclu du protocole et laissé en stabulation sous observation. Dans le cadre du projet proposé, les animaux vigiles recevront une dose faible ou élevée de l'acide lysergique diéthylamide (LSD). Nous retiendrons et manipulerons les animaux de manière douce et appropriée pour une injection rapide et réussie. Nous vérifierons également la zone injectée avant de remettre l'animal dans sa cage. L'ensemble de la procédure ne dure que quelques secondes. Nous prévoyons de ne faire qu'une seule injection par animal. Cependant, en raison de son métabolisme rapide, il pourrait être nécessaire d'administrer des doses répétées pour obtenir les mêmes effets que ceux observés chez l'homme. Les animaux qui atteindront un bon niveau de performance dans la tâche envisagée auront une seule intervention chirurgicale. L'opération dure généralement 2-3 heures pendant lesquelles les animaux sont anesthésiés et sous analgésie appropriée. Comme des prélèvements et des analyses post-mortem sont nécessaires, nous devons euthanasier tous les animaux impliqués dans notre projet.
Impact sur les animaux
Étant donné que l'objectif principal de ce projet est d'étudier les effets de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) sur le comportement et l'activité cérébrale de souris, nous utilisons le modèle murin de trouble obsessionnel-compulsif (TOC) qui ont la particularité d’engager des actions de toilettage de manière compulsive. Ce phénotype peut conduire à des lésions cutanées au niveau de la face et du corps, qui est observable à partir de l’âge de 3 mois, seulement chez certains individus. Les souris seront isolées pour être entraînées à des tâches comportementales. Cependant, elles seront logées dans des boîtes opérantes homecage automatisées, qui constituent un environnement enrichi. Dans le cadre du projet proposé, les animaux recevront une dose faible ou élevée de l'acide lysergique diéthylamide (LSD), qui induit transitoirement (quelques minutes) chez les souris des mouvements rapides de la tête d'un côté à l'autre. Rarement, les animaux peuvent montrer des signes de souffrance prolongée malgré les injections d'analgésiques. Tout animal présentant de tels symptômes sera exclu du protocole et euthanasié.
Devenir
Comme des prélèvements et des analyses post-mortem sont nécessaires, nous devons euthanasier tous les animaux impliqués dans notre projet.
Remplacement
Les méthodes utilisées nécessitent l’utilisation de modèle murin, notamment pour la neuromodulation qui ne peut être remplacé par une autre approche ex vivo pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
En réalisant des tâches comportementales ciblées utilisant des boites opérantes automatisées, nous pouvons récolter des milliers d’essais par animaux en une période courte, sans intervention de l’expérimentateur. Cette méthodologie permet de diminuer la variance comportementale par animal, obtenir des résultats très constants entre animaux et ainsi de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Les tests statistiques que nous utiliserons nous permettront d'obtenir des résultats fiables avec un nombre réduit d'animaux. Sur la base des calculs de puissance et de notre expertise, pour obtenir des résultats fiables dans le cadre de ce projet de 5 ans, nous devrons élever 1700 animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet proposé, pour chaque mesure expérimentale, des points limites sont établis pour éviter la souffrance et garantir le bien-être de l’animal. En plus, si les animaux, n’atteignent pas de point limites définis, ils seront tous conservés jusqu’à 240 jours au maximum. Les animaux soumis aux procédures comportementales vivront dans des boîtes automatisées qui nous permettent de mieux répondre aux critères des 3R en minimisant l'inconfort des animaux et en réduisant le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérience puisque nous pouvons obtenir des résultats plus fiables par animal. Ces systèmes de cages fournissent un environnement enrichi pour les animaux où ils peuvent entreprendre des tâches comportementales à leur propre rythme. Les souris resteront dans ces boîtes en fonction du temps nécessaire à l'animal pour obtenir de bonnes performances dans la tâche, pour une période pouvant aller jusqu'à 4 mois. De plus, tout animal présentant des symptômes de stress élevé ou un manque de motivation lors de la tâche comportementale sera exclu du protocole et laissé en stabulation sous observation. En plus de cela, anesthésie et analgésie seront administrées à tous les animaux soumis à des procédures chirurgicales afin de minimiser leur douleur. Nous retiendrons et manipulerons les animaux de manière douce et appropriée pour injections rapides et réussies. Nous vérifierons également la zone injectée avant de remettre l'animal dans sa cage. L'ensemble de la procédure ne dure que quelques secondes.
Choix des espèces
Nous disposons de souris qui présentent des comportements compulsifs. En effet, les comportements répétitifs sont la marque de certains troubles neuropsychiatriques apparentés, ce qui offre une occasion unique d'explorer le mécanisme neurobiologique qui sous-tend leur régulation. Dans ces pathologies, l'incapacité de réguler l'expression des comportements appris a souvent des conséquences comportementales délétères. Nous proposons d'utiliser ces conditions pathologiques chez ce modèle rongeur pour mieux comprendre la neurophysiologie des comportements répétitifs et leur rôle dans l’adaptation comportementale. Pour notre étude nous utilisons un modèle murin de troubles obsessionnels compulsifs qui a nécessité des techniques de génie génétique. La pertinence de ce modèle n’a pas d’équivalent dans d’autres espèces. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes entre 12 et 36 semaines (3 à 6 mois). L’utilisation d’animaux relativement jeunes est justifiée puisque ce modèle murin présente des lésions cutanées (perte de poils, croûte, plaies) suite au toilettage compulsif, plus fréquemment après 6 mois. Cependant, indépendamment de l'âge, tout animal présentant des lésions cutanées sera exclu du protocole et traité.
Effet de la température sur le développement et la croissance de la seiche commune
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
486 seiches communes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées à trois températures pendant huit semaines, elles sont capturées à l'épuisette puis anesthésiées par le froid avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau, des lobes optiques et des yeux, pour étudier l'effet de la température sur le développement de leur système nerveux et leur camouflage. Le porteur souligne que la seiche possède un système nerveux et des comportements élaborés, analogues à ceux des vertébrés. Il indique qu'aucune partie ne peut être prélevée sans dommage irréversible, ce qui "implique" la mise à mort.
Objectifs
Les facteurs externes comme la température ont des effets sur le développement du système nerveux chez certains organismes animaux. Ce projet a pour objectif de tester l’effet de la température sur le développement d’un Céphalopode, mollusque au système nerveux et comportements élaborés. Notre espèce est la seiche commune européenne. Il s’agit plus précisément de déterminer si la température modifie 1) les régulations « génétiques » en lien avec le développement du système nerveux et des yeux 2) les comportements, en particulier de camouflage. Le camouflage est en effet directement contrôlé par le système nerveux et il a été montré que le camouflage peut être modifié par la température. Dans un contexte de réchauffement climatique, y compris sur les zones côtières, ce projet permettra de mieux comprendre comment le développement du système nerveux central (cerveau et lobes optiques de la seiche) et les comportements associés peuvent être modifiés par la température afin d’inférer des hypothèses évolutives et fonctionnelles sur l’influence du facteur température au cours du développement, chez l’embryon et chez le juvénile après éclosion.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’identifier si la température est un facteur important voire essentiel au développement et à la croissance du système neuro/photosensoriel permettant la mise en place des capacités cognitives chez la seiche dont le système nerveux est analogue à celui des vertébrés. L’approche par l’expression des gènes et l’étude comportementale parallèle permet de tester les régulations moléculaires mises en place en lien avec les réactions observables de l’organisme. Les résultats attendus sont de déterminer quel est l’effet de la température sur cet organisme et si son comportement et son cycle biologique pourraient être affectés. Il a été montré récemment que la température pouvait modifier le comportement de camouflage à l’éclosion, mais pas celui d’exploration du milieu. Nous cherchons à évaluer en première approche si ces modifications de camouflage perdurent jusqu’à 4 semaines ou si elles se lissent et si ces modifications dependent du “substrat”. La mise en place des deux conditions (HV et HNV) permettra d’évaluer si la visibilité des activités environnantes modifie le comportement, la neurogenèse et donc l’expression des gènes (stimulation, habituation). Par ailleurs, les résultats permettront d’optimiser les conditions d’élevage de cette espèce pour laquelle les standards de culture sont inexistants.
Procédures
Les animaux sont exposés à trois conditions de températures sur une durée de 8 semaines : sur la période ceux dans des aquariums avec fonds artificiels différents sont soumis à 1 pêche à l’épuisette , ceux destines aux études moléculaires sont soumis à 3 pêches à l’épuisette (à une semaine d'intervalle) d'une durée de 10 à 20 secondes. Ils sont immédiatement transférés dans un récipient, anesthésiés, puis mis à mort.
Impact sur les animaux
Un à trois (en fonction des aquariums) prélèvements manuels à l’épuisette d’une durée de 10 à 20 secondes sont prévus par aquarium sur toute la durée de l’expérimentation, ce qui peut occasionner du stress. Un siphonnage quotidien des aquariums peut également occasionner du stress sur une durée de 2 à 3 min. La température haute (24°C) en exposition prolongée (moins de 2 mois) peut occasionner un inconfort. Cette nuisance est supposée légère.
Devenir
Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique la mise à mort des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréversibles (pas de survie après prélèvement des yeux, du cerveau entre autres).
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à déterminer, par une approche physiologique globale, l’effet de la température sur le développement et la croissance des organes du système nerveux (cerveau, lobe optique, yeux) d’un organisme entier, en lien avec le comportement. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle
Réduction
La mise en place de collecteurs (support de ponte artificiel) relevés tous les jours dans le milieu naturel permet de récolter le nombre d’œufs nécessaire pour réaliser cette expérimentation en s’affranchissant de la conservation d’un stock de géniteurs en laboratoire. Il n’y a donc pas de maintenance de géniteurs sauvages. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Le nombre de 5 échantillons est le minimum adéquat pour garantir une puissance statistique suffisante pour examiner les variations d’expression. Nos expériences précédentes ont montré que les qualités d’ARN extrait étaient inégales. Le nombre d’animaux prend donc en compte la quantité d’ARN parfois insuffisante pour tester l’ensemble des gènes cibles, et les variabilités intra expérimentales (correspondant à la variabilité biologique) afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique, soit 10 animaux. Pour les estimations par approche génique de la neurogenèse, la variabilité interindividuelle peut être importante, 5 animaux sont également nécessaires. Chaque étape de prélèvement nécessite donc au total 15 individus. N’attendant pas de différence dans le nombre de neurones du cerveau, les animaux pour la phase d’études comportementales seront fixés uniquement pour les études d’expression de gènes réduisant ainsi le nombre d’animaux de 15 à 10. Cependant, afin de pallier d’éventuelles anomalies individuelles, les études de comportement intégreront 12 animaux par traitement.
Raffinement
Les juvéniles éclosent dans leur aquarium d’origine (où ont été déposés les œufs aux températures cibles) ; ils ne sont donc pas déplacés. A l’éclosion, ils auront un enrichissement environnemental varié à disposition dans les aquariums sous la forme de cachettes diverses (pièces de PVC (coude/té) de différents diamètres (16 à 25mm)) leur permettant de se cacher comme en milieu naturel. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée (petites crevettes et mysis sp.) deux fois par jour (matin et après-midi). Les rations sont réévaluées quotidiennement pour adapter la quantité d’aliment distribué à la biomasse de l’aquarium et au métabolisme des animaux (température). La température haute maximale appliquée reste inférieure à la température maximale observée en plein soleil dans les « mares » à marée basse. Les constantes physico-chimiques (température, salinité, pH, oxygène) sont contrôlées quotidiennement sur toute la durée du développement. La concentration en déchets azotés (nitrate, nitrite, ammonium/ammoniac) est mesurée chaque semaine afin de suivre la qualité d’eau d’élevage. Afin de limiter le stress et la souffrance supposée des juvéniles, ils sont transférés délicatement et rapidement dans un récipient contenant de l’eau de mer du système d’élevage jusqu’à une salle adjacente où la mise à mort sera réalisée. Le récipient est mis sur glace ce qui permet un refroidissement progressif, et une anesthésie des animaux par le froid. Ils sont observés jusqu’à constatation d’une léthargie (relâchement pupillaire, le relâchement des bras et du manteau) puis une fois la mort confirmée (arrêt respiratoire); les juvéniles sont alors placés dans le fixateur
Choix des espèces
Les céphalopodes sont les seuls mollusques possédant des capacités cognitives et des comportements élaborés. La seiche européenne pond des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, son développement est court (
Etude des conséquences à long terme de l’isolement social dès la période adolescente chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
554 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère, 494 tuées à l'issue et 60 gardées pour réutilisation. Isolées en cage individuelle du sevrage à l'âge adulte, elles subissent une batterie de tests comportementaux, un test de nage, des chocs électriques de faible intensité et un stress de contention, pour étudier les conséquences de l'isolement social sur l'anxiété et la mémoire. Le porteur indique que les souris isolées devraient développer les troubles comportementaux qui font l'objet de l'étude et renonce à tout enrichissement pour ne pas biaiser les résultats. Sur le remplacement, il affirme que ces comportements ne peuvent s'étudier que chez l'animal vivant.
Objectifs
Il est aujourd'hui largement documenté que l'isolement social durant la période adolescente constitue un facteur de risque au développement de troubles anxieux et mnésiques, et de déficit des interactions sociales à l'âge adulte. Ainsi, des études portant sur des enfants élevés dans des institutions où de la négligence et une absence d'interactions et de stimulations sociales ont été rapportées ont montré que la privation est corrélée à des altérations du fonctionnement neuronal et à d'importants troubles comportementaux. Néanmoins la compréhension des mécanismes impliqués reste très parcellaire en raison de la nature observatoire et corrélationelle des études épidémiologiques disponibles à ce jour. Sur la base de ces observations, notre projet a pour objectif de mettre en place un modèle murin d'isolement social durant l'adolescence, d'en analyser les conséquences comportementales à long terme, et de relier les potentiels dysfonctionnements comportementaux à une altération du développement de l'hippocampe, une structure clé pour la gestion des états émotionnels, des capacités cognitives et pour la mise en place des interactions sociales. Deux groupes expérimentaux seront crées: un groupe "Social" dans lequel les souris seront élevées en groupe social stable; un groupe "Isolement" dans lequel les souris seront hebergées individuellement à partir du sevrage (P21) et ce jusqu'à la fin de l'expérience à l'âge adulte. Les animaux seront soumis à l'âge adulte à une batterie de tests visant à caractériser leur niveau d'anxiété générale ainsi que leur capacité d'interaction avec leurs congénères et leur capacités mnésiques. L'impact des différents traitement sur le développement de l'hipppocampe sera également analysé.
Bénéfices attendus
Ces expériences fourniront des informations uniques sur les facteurs à l'origine de l'émergence des troubles anxieux et sociaux ainsi que sur les processus neuronaux impliqués. Elles permettront à moyen terme d'identifier des marqueurs biologiques précoces prédictifs d'une vulnérabilité comportementale ultérieure. La transposition à l'humain, à plus long terme, permettra la prise en charge des individus à risque.
Procédures
Procédure 1: hébergement en cage individuelle durant la gestation . Procédure 2: hébergement en cage individuelle du sevrage à la mise à mort à l'âge adulte; tests comportementaux (4 tests de 30 min max par jour). Procédure 3: hébergement en cage individuelle du sevrage à la mise à mort à l'âge adulte; tests comportementaux de 30 min max par jour. Procédure 4: hébergement en cage individuelle du sevrage à la mise à mort à l'âge adulte; tests comportementaux de 10 min max par jour. Procédure 5: hébergement en cage individuelle du sevrage à la mise à mort à l'âge adulte; test comportemental de 30 min; stress de contention de 30 min; prélèvements de sang (3 prélèvement à 30 min et 90 min d'intervalles pour un volume de 50µl par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes seront isolées afin de dater précisément la mise bas. Les animaux des groupes "isolé" seront hébergés en cages individuelles avec peu de contacts sensoriels avec leurs congénères. Nous nous attendons à ce qu'ils développent des troubles comportementaux qui font l'objet même de l'étude. Toutes les souris (hormis les mères) recevront 3 injections intrapéritonéales à 24h d'intervalle. Ces injections et le composé injecté sont sans effets nuisibles pour l'animal. Un groupe de souris sera soumis a des tests comportementaux basés sur leur propension naturelle à explorer de nouveaux environnements / congénères. Ces tests sont non invasifs et sans nuisances pour l'animal. Un second groupe sera soumis à deux tests légèrement aversifs. Dans le premier, les souris doivent nager pour trouver un refuge. Les sessions durent moins d'1 minute et sont sans impact sur le metabolisme ou le comportement ultérieur des animaux. Dans le second, les animaux recoivent des chocs électriques de faible intensité et durée (1seconde) qui engendrent une légère douleur et un inconfort immédiat mais est sans impact sur leur comportement ultérieur. Enfin, un dernier groupe de souris sera soumis à un stress aigü de 30 min (stress de contention) . Nous nous attendons à une activation de l'axe hormonal du stress qui fait l'objet de l'étude.
Devenir
Les femelles utilisées pour la reproduction (procedure 1) et les 60 souris démonstratrices utilisées en procédure 2 et 3 seront gardées en vue d'une réutilisation dans le même établissement utilisateur. Toutes les autres souris seront mises à mort pour collecte des cerveaux en vue des analyses ultérieures.
Remplacement
L’objectif du projet est de caractériser et de valider un protocole de stress précoce dans un modèle murin et d’étudier les conséquences de ce stress sur le développement de troubles anxieux, mnésiques, et d'interaction sociale à l’âge adulte. Par essence, l'expression de tels comportements ne peut s'envisager que chez l'animal in vivo et il n'est pas possible a l'heure actuelle d'envisager le remplacement de ce modèle par des approches in vitro ou in silico.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, un effectif de 12 animaux par groupe est nécessaire. Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, et les tests comportementaux envisagés étant non invasifs, nous effectuerons tous les tests sur les mêmes animaux. Pour le test de paradigme social à trois chambres, nous utiliserons comme souris étrangères les animaux reproducteurs ayant Cre-. Ces animaux Cre- sont issus des mêmes accouplements que ceux mis en place pour générer les animaux Cre+. Enfin mâles et femelles seront utilisés.
Raffinement
Afin de ne pas interférer avec les conséquences de l'isolement social, aucune mesure de surenrichissement ne sera mise en place par ce qu'elle pourrait biasier les résultats. Néanmoins, des points limites stricts et spécifiques seront mis en place et un soin particulier sera accordé à l'observation des animaux au travers de la surveillance quotidienne effectuée par le personnel zootechnique mais aussi par l'évaluation de critères de bien être: pesée des souris a chaque changement de cage (une fois tous les 15 jours), observation de l'état du poil,
Choix des espèces
La neurogenèse dans le GD de l'hippocampe, qui est notre candidat mécanistique pour expliquer les effets de l'isolement social, a été étudiée principalement chez le rongeur. De plus, le modèle utilisé dans ce projet est la souris car 1) ce projet fait suite à des premières études réalisées chez la souris; 2) il s'insère dans un projet plus général faisant appel à des lignées transgéniques développées chez la souris (lignées GR-flox, Ascl1-flox...). Enfin le modèle d’étude employé doit permettre de reproduire un système biologique fonctionnel et complexe, dont les mécanismes ontogénétiques sont comparables à ceux qui régissent le développement des mêmes fonctions chez l’humain. Dans ce cadre, le modèle rongeur constitue un outil incontournable. Nous avons opté pour l'utilisation de souris dans un souci d'homogénéité de l'ensemble de nos expériences, ce qui permet une réduction du nombre d'animaux utilisés. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage (21 jours de vie) et jusqu'à l'âge adulte puisque notre modèle a pour objectif d'étudier l'impact à long terme de l'isolement social durant les périodes juvéniles et adolescentes.
Analyse des dysfonctionnements périnataux des réseaux moteurs chez la souris SOD1-KCC2-T906A/T1007A, un modèle de la maladie SLA exprimant une activité KCC2 génétiquement augmentée
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
4 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues du croisement de deux lignées génétiquement modifiées, elles sont pesées puis soumises à des tests d'agrippement et de rotarod, le porteur prévoyant de les laisser atteindre les points limites pour évaluer un éventuel gain de survie dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique. Il indique que l'atteinte de ces points limites peut occasionner des effets indésirables et une difficulté à se nourrir en fin de vie. Sur le remplacement, il décrit des modèles in vitro qu'il juge seulement "complémentaires" de l'approche in vivo.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie caractérisée par une dégénérescence des neurones commandant les muscles. La SLA survient pendant la vie adulte et conduit à une paralysie fatale. Aucun traitement n'est disponible pour cette maladie. La plupart des études se sont focalisées sur les périodes symptomatiques ou pré-symptomatiques et non sur les mécanismes initiaux conduisant fort probablement à la survenue de la SLA. La présente DAP est basée sur nos récents travaux montrant que la transmission synaptique inhibitrice est réduite aux stades périnataux au niveau des neurones moteur de la moelle épinière de souris modèle de la maladie SLA. Notre projet est donc basé sur l’hypothèse que les premières dérégulations liées à la SLA débutent dès le développement du système nerveux central et sont accompagnées de mécanismes de compensation. L'effondrement tardif de ces mécanismes de compensation conduirait à l'apparition des symptômes de la SLA. Nos travaux montrent un déficit dans la transmission synaptique inhibitrice à des stades précoces de développement. Nous proposons donc d’augmenter la transmission synaptique inhibitrice chez la souris en utilisant une approche génétique et nous émettons l’hypothèse que cette augmentation aura des répercussions positives sur le développement de la maladie chez la souris adulte.
Bénéfices attendus
Le présent projet a pour but de mettre en évidence un défaut d'inhibition chez une souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA). Cette démonstration pourra être bénéfique aux patients SLA qui pourraient être traités par des molécules agissant sur l'inhibition synaptique.
Procédures
Aucune procédure chirurgicale n'est prévue dans le présent projet. Les souris seront pesées de manière hebdomadaire, soumises au test d'agrippement (grip-test) et au test du rotarod (locomotion sur un cylindre mobile). La survie des souris sera également évaluée. Enfin, certaines souris seront euthanasiées afin de collecter les tissus nerveux (moelle épinière).
Impact sur les animaux
Notre projet prévoit de laisser les souris atteindre les points limites afin d'évaluer l'éventuelle amélioration de leur durée de vie après croisement avec des souris ayant un niveau d'inhibition accru. L'atteinte des points limites, bien que ces derniers soient controlés, peut occasionner des effets indésirables sur les animaux. Certaines souris seront enthanasiées en vue de prélever des tissus nerveux pour étude immunohistochimique à posteriori. Là encore, bien que réduits au maximum par des injections de produits anesthésiants, des effets indésirables sur les animaux sont à considérer.
Devenir
Les souris modèle de sclérose latérale amyotrophique ayant atteint les points limites et les animaux contrôles du même âge seront euthanasiés afin de prélever des tissus nerveux et réaliser à postériori des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les souris utilisées dans notre projet sont des souris transgéniques modèles murins de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) et des souris génétiquement modifiées afin d'augmenter le niveau d'inhibition au sein du système nerveux. Les deux souris seront croisées pour obtenir des animaux doublement génétiquement modifiés. Des animaux contrôles de la même lignée (et même portée) seront utilisés. Les modèles murins de la maladie SLA sont les animaux les plus utilisés pour tenter de comprendre les mécanismes de développement de cette maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs. Des modèles in vitro ont été développés pour l'étude du dysfonctionnement des motoneurones issus de patients SLA mais ces modèles restent complémentaires aux approches in vivo. Il est donc logique que le modèle murin de la SLA soit utilisé dans le cadre de la présente DAP.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre projet basé sur des méthodes variées permet d'utiliser au maximum tous les embryons et animaux néonataux disponibles issus d'une portée. Concernant les expériences réalisées chez l'adulte, un nombre minimum d'animaux est programmé en accord avec les tests statistiques qui seront réalisés à posteriori.
Raffinement
Les souris sont élevées avec un enrichissement. Des points limites sont établis afin de réduire au maximum la souffrance des animaux liée à leur difficulté à se nourrir en fin de vie.
Choix des espèces
La souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) que nous utilisons reproduit les symptômes de la maladie de manière fiable et reproductive. L'autre souris présente un taux d’inhibition accru. Ces deux souris seront croisées afin d'obtenir des souris SLA ayant un niveau plus élevé d'inhibition (souris présentant une double modification génétique). Ces souris et leur contrôles non génétiquement modifiés seront testées chez des mâles puis femelles, au niveau comportemental à l'âge de 8 semaines jusqu'à l'âge de 20 semaines environ (= âge moyen de fin de vie de nos souris modèles de SLA).
Impact de la neuroinflammation et des encéphalites virales sur le développement précoce du système nerveux
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
10 345 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie gardée vivante comme géniteurs et les autres tués à l'issue. Aux stades larvaires surtout, ils sont infectés par des virus neuroinvasifs ou reçoivent des injections de cytokines et une activation optogénétique, pour étudier l'impact d'une inflammation précoce sur le système nerveux. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte d'équilibre, hémorragies, arythmies et nécrose cérébrale, les larves atteignant un point limite étant alors anesthésiées. Il affirme que ces interactions complexes ne peuvent être "totalement remplacées" in vitro, tout en signalant un modèle mathématique réduisant le nombre d'animaux.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels une neuroinflammation précoce peut conduire à des déficits neurologiques ou des maladies psychiatriques, en utilisant le poisson-zèbre comme modèle animal. D’une part, nous étudierons les conséquences de cette inflammation dans le contexte d’une infection virale neuroinvasive, comme modèle d’encéphalite virale du nouveau-né. Nous utiliserons pour cela le modèle d’infection par le virus de Sindbis (SINV), bien établi, et nous développerons un autre modèle par le virus de herpès simplex (HSV-1). Nous chercherons à distinguer les impacts du virus lui-même sur ceux de l’inflammation dans les déficits neurologiques observés. D’autre part, nous analyserons les impacts d’une inflammation stérile sur le système nerveux en cours de développement ou de réparation. L’inflammation peut se manifester de diverses façons avec l’induction du plusieurs cytokines (molécules permettant la communication entre cellules) aux effets parfois antagonistes. Pour clarifier notre analyse, nous aurons essentiellement recours à l’injection de cytokines recombinantes. Nous développerons par ailleurs des systèmes optogénétiques pour induire l’expression de cytokine in vivo sans avoir recours à une injection. Afin de disséquer les mécanismes impliqués, nous aurons recours à différents mutants dans les voies de signalisation des cytokines ou dépourvus de certains types cellulaires importants. Nous vérifierons d’éventuelles modifications neurologiques chez ces mutants adultes. Nous étudierons le comportement de nos animaux ainsi que la morphologie et la composition cellulaire du système nerveux, avec un intérêt plus particulier pour le système dopaminergique (système particulier de transmission nerveuse) impliqué dans plusieurs maladies psychiatriques qui ont été liées à des infections précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux appréhender le rôle de la neuroinflammation dans les déficits neurologiques constatés après une encéphalite d’origine infectieuse ou stérile. Ceci devrait aider à décider du bien-fondé des traitements anti-inflammatoires dans ces situations. L’identification de gènes protecteurs contre l’infection sans effet indésirables lors d’une surexpression par des neurones ouvrira de nouvelles pistes vers le traitement ou la prévention des encéphalites virales par thérapie génique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigile. Pour du génotypage de routine, des prélèvements d'un fragement de nageoire seront réalisés sous anesthésie. Microscopie intravitale effectuée sous anesthésie (durée maximale une heure, avec des sessions quotidennes pendant 10 jours au plus). Tests de comportement: enregistrement de la locomotion spontanée ou après stimuli lumieux ou sonore (durée maximale 1 heure, avec deux sessions par semaine au plus). Suivi d'une infection virale établie par microinjection sous anesthésie (pendant 7 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par microinjection de protéines sous anesthésie (pendant 14 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par activation optogétique (pendant 3 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par transgénèse (pendant 7 jours au plus). Suivi de le régénération du cerveau après arrêt d'une infection virale (pendant 17 jours au plus).
Impact sur les animaux
Les infections virales des larves sont susceptibles d’entraîner les effets suivants : perte d’équilibre, hyperactivité, apathie, hémorragies localisées, arythmies cardiaques, oedèmes, et ceci tant que l’infection persiste. Dans les cas d’infection létale (attendue chez certains mutants notamment) un assombrissement du cerveau sera préalablement observé, traduisant un début de nécrose, qui entraînera une anesthésie profonde évitant tout décès non traité. Les injections de cytokines inflammatoires (ou leur équivalent optogénétique) devraient causer hyperactivité ou apathie, comportements anxieux, arythmies cardiaques. Ces effets devraient être transitoires (moins de 24 heures) pour la plupart. Lors des tests de surexpression des ISGs (gènes induits par les interférons, qui sont des cytokines antivirales) par des neurones, ces effets sont attendus pour les ISGs qui seraient neurotoxiques. Dans les cas les plus extrême une nécrose localisée pourrait être observée, entraînant là aussi une anesthésie définitive. Dans les expériences de régénération du cerveau chez les juvéniles, une perte d’appétit et une apathie globale est attendue. Chez les adultes mutants pour les gènes immunitaires d’intérêt, une susceptibilité aux infections opportunistes peut se traduire par l’apparition plus précoce de signes classiques tels que cachexie, lordose, pétéchies, ou nage anormale.
Devenir
Les animaux utilisés à des fins d'élevage et entrant dans les procédures de génération de lignées transgéniques, de génotypage de routine, ou de caractérisation de lignées potentiellement délétères, seront conservées pour servir de géniteurs. Tous les autres animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Nous travaillons sur des interactions complexes entre les nombreux types cellulaires du système nerveux, du système immuntiaire, et un pathogène, qui ne peuvent être totalement remplacées par des modèles in vitro ou in silico. Nous avons toutefois développé un modèle mathématique de la progression virale et de la réponse interféron de type I dans le système nerveux et la périphérie, à partir de nos données d'imagerie et de mesure d'expression des gènes par biologie moléculaire. Ce modèle permet de déduire certains paramètres expérimentaux, comme l'évolution du titre viral, réduisant le nombre d'animaux nécessaires à certaines de nos expériences.
Réduction
Les nombres d'animaux employés dans les expériences sont basés sur notre expérience passée pour des tests comparables, nous permettant de prédire la variance attendue et donc de réaliser des tests de puissance statistique. Lorsqu'il n'y a pas d'nterférence attendue entre deux tests, les animaux sont réutilisés pour plusieurs mesures.
Raffinement
Grâce à la transparence de la larve de poisson-zèbre, il nous est possible de mesurer la localisation de l'infection et la charge virale par des approches d'imagerie intravitale non-invasives. Pour limiter la douleur liée à l'infection de la larve sans interférer avec le déroulement de l'expérience, nous suivons les larves infectées en mesurant un score clinique quotidien; si l'infection est avancée avec atteinte de point limite, les larves sont anesthésiées pour éviter toute souffrance, tout en nous permettant de continuer à suivre l'évolution de l'infection.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle animal bien établi. En tant que vertébré, les principes de fonctionnement de ses systèmes nerveux et immunitaire sont semblables aux nôtres. Sa manipulation génétique est aisée et la petite taille, la transparence, et l’anesthésie facile de ses larves en fait un excellent système pour la microscopie intravitale. De nombreuses lignées transgéniques fluorescentes permettent d’observer la localisation et/ou l’activité de diverse populations neurales ou immunes. Combinées avec des pathogènes eux-mêmes porteurs de gènes fluorescents, on peut suivre en temps réel la propagation d’une infection et la réponse immune et neurale. La très grande majorité de nos expériences seront réalisées au stade larvaire, qui se prête le mieux à la microscopie et requiert le moins d’espace. Toutes les infections, notamment, seront réalisées à ce stade, avec des animaux maintenus en plaques multi-puits en incubateur dans un laboratoire de sécurité de niveau 2, facilitant le confinement des pathogènes. L’élevage de poissons adultes aura pour finalité principale la production des larves destinées à nos expériences. Si le(s) transgène(s) et/ou la mutation portés par ces adultes sont potentiellement dommageables, nous mesurerons cela aux stades juvénile et adulte. Les conséquences à long terme de certaines manipulations au cours du stade embryonnaires seront évaluées chez des poissons juvéniles.
Etudes histologiques de maladies du système nerveux central
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
864 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie profonde et tuées avant tout réveil. Chaque animal subit une thoracotomie, ouverture de la cage thoracique que le porteur qualifie lui-même d'acte douloureux, suivie d'une perfusion intracardiaque de fixateur, pour préparer le cerveau à des analyses histologiques. Ces souris sont génétiquement modifiées pour reproduire des maladies neurodéveloppementales avec déficience intellectuelle ou autisme et des maladies neurodégénératives, et sont uniquement dédiées à des études post-mortem. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro, y compris les organoïdes cérébraux, ne remplace l'étude d'un cerveau entier.
Objectifs
Le but de la fixation est de préserver des tissus biologiques rapidement et de façon uniforme afin de réaliser des examens histologiques de qualité. Placer directement un tissu ou un organe dans une solution de fixation est efficace pour de petits volumes. Pour un organisme entier, il est nécessaire de passer par l'étape de perfusion afin que le fixateur pénètre dans tous les organes et à des concentrations similaires. C'est pourquoi la perfusion par voie intracardiaque est utilisée, ainsi la la solution de fixation circule dans l'organisme par les vaisseaux sanguins pour une fixation optimale. Ce projet nous permet de regrouper les perfusions faites sur différentes lignées génétiquement modifiées afin d'étudier le système nerveux central des animaux lors d'analyses histologiques de qualité. Le projet concerne des modèles de maladies neurodéveloppementales avec retard mental et/ou autisme ainsi que des maladies neurodégénératives. Les animaux concernés sont des souris génétiquement modifiées pour modéliser des des mutations et des anomalies chromosomiques (duplications ou pertes de fragments de chromosomes) observées dans les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives étudiées. Les animaux de ces études sont uniquement dédiés à des études post-mortem après la perfusion. C'est donc la seule PE de ce projet.
Bénéfices attendus
Cette procédure permet d’avoir des prélèvements de qualité pour réaliser des études histologiques et mieux comprendre certaines maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives.
Procédures
Les souris subissent une chirurgie sans réveil pour pouvoir fixer le cerveau de manière optimale. Pour cela, une anesthésie profonde est couplée à un anti-douleur.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale consiste en un acte chirurgical avec une thoracotomie (ouverture de la cage thoracique), qui est un acte douloureux.
Devenir
Cette procédure implique la mort des animaux. Les cerveau ainsi qu'éventuellement d'autres organes seront utilisés pour des analyses histologiques
Remplacement
Pour les études concernant le cerveau, il n'existe à l'heure actuelle pas d'alternative à l'utilisation des animaux. Les organoïdes cérébraux, censés mimer la structure et les fonctions principales du cerveau, n’ont pas la capacité de répliquer toutes les structures et réseaux neuronaux d’un cerveau adulte. Il n'existe donc pas encore de modèle de cerveau in vitro ou autre permettant de réaliser les analyses qui sont faites dans ce projet.
Réduction
Au cours de ce projet 12 lignées de souris mutantes seront utilisées. Ces lignées pourront pour certaines aussi contenir un marqueur fluorescent pour l’analyse de lignées neuronales spécifiques. Pour chaque lignée, les effectifs ont été calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de réduction du nombre d’animaux utilisés (n=6 individus par sexe et génotype et par âge (non-sevré (P8-P12), juvénile (3-6 semaines), jeune adulte (2-4 mois), vieux (6-18 mois)) soit 6 individus x 2 sexes x 2 génotypes (mutant/contrôle) x 3 âges (non sevré, juvénile et jeune adulte pour les maladies neurodéveloppementales ou jeune adulte et 2 stades de vieillissement pour les maladies neurodégénératives) = 72) ) tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique. L’effectif total de souris utilisées sera donc de 12 x 72 = 864.
Raffinement
La procédure expérimentale consiste en un acte chirurgical avec une thoracotomie (ouverture de la cage thoracique), qui est un acte douloureux. Afin que l’animal ne ressente aucune douleur, les animaux reçoivent préalablement une injection d’un mélange d’anesthésiques. Ces anesthésiques sont administrés afin de plonger l’animal dans une anesthésie profonde mais non létale et d’éviter tout réveil. Comme la souris peut conserver un certain degré de réaction douloureuse lors de l’anesthésie, un analgésique est ajouté au mélange d’anesthésiques. L’absence de douleur est vérifiée par la perte des réflexes de retrait de la patte et des réflexes palpébraux. L’anesthésie peut entrainer un stress léger chez l’animal. L'analgésique qui est administré ayant aussi un effet sédatif, permet aussi de calmer l’animal et de réduire l’anxiété. La procédure étant sans réveil, il n'y a pas besoin de suivi post-chirurgical.
Choix des espèces
La compréhension des mécanismes associés à des déficits neurologiques, requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. Les animaux sont utilisés à différents stades post-natals : avant sevrage (8-12 jours) juvénile (3-6 semaines), jeune adulte (2-4 mois) et vieux (6-18 mois)). Pour les syndromes neurodéveloppementaux, les études nécessitent de comprendre le développement dès le stade embryonnaire et jusqu’à l’établissement des pathologies à l’âge adulte. Cependant, pour des raisons techniques, la procédure expérimentale utilisée ne concerne que les individus à partir de 8 jours post-natal, celle-ci ne pouvant être réalisées sur des individus plus jeunes. Pour les syndromes neurodégénératifs, la progression de la maladie doit être suivie à partir du stade jeune adulte et sur au moins un stade intermédiaire (stade prodromique) avant la déclaration complète des symptômes.
Identification et manipulation des réseaux neuronaux contrôlant les comportements dirigés vers un objectif et habituels chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 824 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale puis un enregistrement de l'activité neuronale, de l'imagerie calcique et de l'optogénétique pendant une tâche comportementale opposant actions dirigées et habituelles, avant prélèvement du cerveau. Le porteur cite la chirurgie, l'euthanasie et l'isolement en cage individuelle comme sources de souffrance, sans détailler le contenu des tests comportementaux. La rubrique réduction avance 912 souris et 16 par groupe, chiffre inférieur au total de 1 824 déclaré, et présente ces travaux comme une étape "indispensable" contre la toxicomanie et les troubles compulsifs.
Objectifs
L’objectif principal du projet est double. Premièrement, développer et valider une tache comportementale pendant laquelle des souris libres de leurs mouvements performent des actions dirigées et habituelles. Deuxièmement, identifier et manipuler les réseaux neuronaux contrôlants les deux types d’actions. Ces objectifs seront atteints en combinant des approches comportementales, électrophysiologiques, d’imagerie calcique et d’optogénétiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont doubles. Premièrement, la compréhension des mécanismes neuronaux contrôlants les actions dirigées et habituelles, et leur interaction chez le même sujet est une étape indispensable pour dans le développent de nouvelles stratégies thérapeutiques des troubles psychiatriques comme la toxicomanie et les comportements obsessionnels compulsifs. Deuxièmement, nous pensons que notre approche nous permettra d’améliorer le phénotypage des actions dirigées et habituelles chez la souris. Les procédures de psychologie expérimentale actuellement utilisées allongent le temps d’expérience et le stress des animaux.
Procédures
Opérations chirurgicales : les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale d'une durée maximale de 1h15.
Impact sur les animaux
Les sources éventuelles de douleurs ou souffrance dans notre procédure : la chirurgie, l’euthanasie ainsi que l'isolement des animaux en cage individuelle.
Devenir
Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.
Remplacement
Le rat reste encore le modèle animal de prédilection pour étudier les fondements comportementaux et neuronaux du comportement instrumental. Cependant, les souris peuvent remplacer les rats. Les souris peuvent apprendre un comportement instrumental et faire une distinction claire entre les actions dirigées et habituelles. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris pendant qu’elles exécutent une tâche comportementale. Pour comprendre les mécanismes des circuits neuronaux contrôlant les actions instrumentales, nous devons utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones spécifiques avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant. Il est impossible d’étudier des réseaux neuronaux avec des méthodes in vitro ou in silico. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
En calculant l’estimation de la variance observée avec ce type de données pour atteindre une signification statistique, nous avons besoin de 16 souris par groupes expérimentaux. La mise en œuvre de cette tache comportementale nous permettra l’étude de ces deux types d’action chez le même sujet, ce qui n’est pas le cas des taches comportementales classiques dans lesquelles actions dirigées et habituelles sont étudiées séparément avec des groupes expérimentaux distincts. Pour la réalisation de toutes les expériences de ce protocole nous utiliserons 912 souris.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans les comportements instrumentaux. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Étude de l’activité des neurones répondant aux opiacés
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure, des injections de morphine puis de naloxone provoquant un sevrage, et jusqu'à sept tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour mesurer l'activité de neurones par fibre optique. Le porteur indique mettre les souris à mort pour vérifier l'implantation de la fibre. Sur le remplacement, il affirme que ces effets ne s'étudient que sur des "organismes vivants et entiers" et que les souris génétiquement modifiées utilisées n'existent que chez cette espèce.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mesurer l’activité des neurones répondant aux opiacés lors de comportements liées aux réponses émotionnelles chez des animaux naïfs et dépendants aux opiacés ( comme la morphine ou l’héroïne). Le rôle des circuits neuronaux qui répondent aux opiacés dans les réponses émotionnelles positives (activité sociale ou consommation de boisson sucrée) et négatives comme le stress est encore peu étudié. L’objectif de ce projet sera de mesurer l’activité des neurones répondants aux opiacés en utilisant une technique d’imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier des nouveaux circuits neuronaux lors de réponses émotionnelles positives et négatives. Ce projet aura de nombreux bénéfices, en particulier d’identifier l’implication des neurones critiques dans le développement de l’état émotionnel négatif à l’état pendant le sevrage aux opiacés. Les états négatifs (anxiété et depression) pendant le sevrage aux opiacés sont important car il contribue en grande partie au risque de rechute et donc la fin de l’abstinence. Ceci permettra de caractériser un circuit important dans le développement des troubles affectifs tels que l’anxiété et la dépression, ainsi que les mécanismes d’adaptation du cerveau à l’exposition répétée aux opiacés. Ceci aidera aussi d’identifier de nouvelles cibles neuronales pour des traitements des troubles affectifs et du sevrage aux opiacés, permettant de faire face à la forte augmentation des troubles émotionnelles et de la dépendance et de la consommation d’opiacés. Les implications sont à la fois fondamentales et cliniques.
Procédures
Procédure chirurgicale sous anesthésie générale 1 fois pendant 1 heure avec une injection d’anesthésiant local et une injection d’analgésique pendant la chirurgie pour chaque souris. i) Groupe 1 : Nous allons effectuer 7 tests comportementaux par souris de maximum 45 minutes séparées par 7 jours. ii) Groupes 2 et 3 : Les souris recevront 9 injections sur animal vigile par souris d’une durée de 30 secondes iii) Groupes 4 et 5 : Nous allons effectuer un test comportemental sur 5 jours (15-30 minutes). Les souris recevront 8 injections sur animal vigile par souris d’une durée de 30 secondes
Impact sur les animaux
Chirurgie stéréotaxique : Après la chirurgie, Il existe aussi un risque d’inflammation de la plaie, d’infection et de douleur post-opératoire. Injections multiples : Les souris seront injectées par la morphine ou saline (6 fois) en intrapéritonéale et avec la naloxone et saline en sous-cutanée (2 injections), donc il y a la possibilité d’irritation du site d’injection. Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal. Les tests de comportementaux sont potentiellement stressant pour l’animal, donc il y aura 7 jours de repos entre chaque test. Sevrage précipité : les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée. Le sevrage précipité avec la naloxone peut induire des symptômes somatiques de sevrage, tels que les tremblements de corps ou de pattes, la piloérection, le ptosis, et des sauts.
Devenir
Mise à mort afin de vérifier l'implantation de la fibre optique permettant la mesure d'activité.
Remplacement
"Remplacement" : les effets comportementaux des opiacés ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de cibler les circuits neuronaux répondant aux opiacés, ces modèles n’existent que chez la souris.
Réduction
"Réduction" : les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. De plus ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester l’activité des neurones pendant plusieurs comportements (dépression et anxiété) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux i) troubles affectifs et ii) effets aversifs des opiacés seront constitués de 12 souris chacun.
Raffinement
"Raffinement": nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les réponses comportementales au sevrage à la suite d’une administration d’opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger, une ‘’maison’’ en carton, et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur (traitement par un anti-inflammatoire). La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. Des points limites prédictifs seront établis permettant d’interrompre l’étude limitant ainsi la souffrance, la douleur et le stress pour l’animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle de prédilection pour la recherche biomédicale et sont aujourd'hui utilisés comme modèles standards pour l’étude de la plupart des pathologies, grâce aux connaissances de plus en plus précises de leurs génomes permettant la création de modèles transgéniques de ces maladies. Des souris adultes seront utilisées (agées de 8 semaines au début des expériences).