Système nerveux

281 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par obstruction d'une artère au moyen d'un filament inséré au cou, retiré une heure plus tard, suivi d'un traitement puis de tests comportementaux avant prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le modèle peut entraîner des pertes d'équilibre et une faiblesse musculaire, et héberge les rats isolément pour éviter l'arrachage des sutures. Il présente le rat comme un "modèle préférentiel" pour l'AVC et affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients est réalisée par l’injection de tPA. Toutefois, seule une faible proportion des patients peut être traitée du fait des effets secondaires de l’injection de tPA. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.

Bénéfices attendus

Cette étude pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre l’AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monofilament dans une artère pour l'obstruer et induire l'accident vascualire cérébral. Cet acte chirurgical durera 15 minutes. Une heure plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament et ainsi permettre à nouveau une circulation sanguine. Cet acte chirurgical durera 10 minutes. Le traitement sera administré 10 minutes après le rétablissement de la circulation sanguine. A J+1 un prélèvement sanguin sera réalisé. A J-1 et J+2, ces mêmes animaux suivront une série de test comportementaux. Un total de 20 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, le cerveau sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

L’utilisation d’une analgésie lors de la chirurgie va permettre de limiter au maximum la souffrance des animaux. L’hébergement en cage individuelle des animaux, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voire au moins un de ses congénères et également par l’utilisation d’enrichissements. Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire. Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après la chirurgie. Pour pallier à ces problèmes, les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Ce gel améliore la prise en charge des rats après la chrirugie, et demeure davantage accessible (placé sur le sol de la cage, contrairement aux granulés situés en hauteur). Une litière à forte granulométrie sera également utilisée pour éviter les risques d’étouffement après la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin du protocole expérimental.

Remplacement

L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire l’efficacité d’un traitement dans le cadre d’une intervention visant par exemple à limiter la taille des lésions cérébrales au cours d’un AVC chez l’Homme. Le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux au cours de l'AVC chez l’Homme ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos traitements. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 18 rats par groupe + 60% liée à la variabilité du modèle. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront 3 par cage avec plusieurs enrichissements, auront un accès non restreint à de la nourriture et à de l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie, anesthésie générale, maintient de la température corporelle, désinfection et anesthésie locale) ainsi qu’après. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, limitant le risque pour l’animal de rompre ses points. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle dans une pièce dédiée chauffée à 28°C jusqu’à leur réveil. Les animaux resteront en cage individuelle pendant le restant de la durée du projet. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les fonctions motrices peuvent être altérées durant les premières heures après la chirurgie. Pour pallier à ces problèmes, les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, nous constatons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. Enfin, une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivants l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Les mécanismes et les conséquences physiologiques de l'AVC sont similaires chez le Rat et chez l’Homme. Le Rat est donc une espèce pertinente pour modéliser les AVC chez l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par l'AVC. Les animaux utilisés seront âgés de 7-8 semaines soit un poids d’environ 250-300 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure puis des séances comportementales cinq jours par semaine pendant huit semaines, dont le RNT ne précise pas la nature, pour construire un modèle d'addiction reposant sur une stimulation lumineuse des neurones. Le porteur indique que les animaux peuvent présenter des symptômes d'addiction et de sevrage jugés modérément douloureux et sont ensuite tués pour prélever le cerveau. Sur le remplacement, il affirme que les effets des opiacés sur le cerveau ne peuvent être étudiés que sur des "organismes vivants et entiers".

Objectifs

Ce projet de recherche vise à identifier les circuits neuronaux participant à la dépendance aux substances d'abus et plus particulièrement aux opiacés. De plus, il permettra de créer un nouveau modèle d’addiction, ou les drogues d’abus seront remplacées par une stimulation lumineuse par optogénétique, technique qui consiste en le fait d’induire dans une cellule un gène codant pour une protéine photosensible, qui s’activera lorsque celle-ci sera éclairée par une lumière spécifique. Le système opioïde est un système neuromodulateur complexe composé de trois récepteurs (mu, delta et kappa), largement distribués dans le cerveau et peuvent moduler plusieurs fonctions dont la réponse à la douleur, au stress ou encore au contrôle des émotions. Ces derniers sont activés par des peptides opioïdes endogènes. Le système opioïde régule la douleur, les processus de récompense, la régulation des réponses émotionnelles et des réponses au stress. Les altérations de ce système sont centrales dans le développement de troubles addictifs. L’objectif de ce projet est de modéliser les dimensions comportementales de l’addiction communes à toutes les drogues d’abus (impulsivité, résistance à la punition, motivation, rechute), grâce à l’optogénétique et au comportement opérant.

Bénéfices attendus

Ce projet permettera d'améliorer nos connaissances sur mécanismes moléculaires impliqués dans l'addiction aux drogues d'abus, c’est-à-dire sur l’usage excessif de substances qui induisent des modifications des fonctions physiologiques, entraînant une dépendance du consommateur à celles-ci. De plus, il permettera d'établir un nouveau modèle d'addiction sans utilisation de drogues d'abus. ce modèle permettera l'étude de l'ensemble des dimensions comportementales de l’addiction communes à toutes les drogues d’abus (impulsivité, résistance à la punition, motivation, rechute), grâce à l’optogénétique, (technique qui consiste en le fait d’induire dans une cellule un gène codant pour une protéine photosensible, qui s’activera lorsque qu’elle sera éclairée par une lumière spécifique à celle-ci) et au comportement opérant, méthode d’apprentissage qui est basée sur l’associations de récompenses et de punitions à un comportement particulier.

Procédures

Procédure chirurgicale : 1 fois sous anesthésie générale pendant 1 heure Tests comportementaux : 5 sessions comportementales par semaine seront réalisées pendant 8 semaines (2 jours de repos par semaine), les sessions seront limitées à 60 minutes, sauf pour une session qui sera limité à 4 heures.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale peut induire des effets indésirables sur les animaux, tels que des ouvertures de la plaie et des infections. Un suivi rigoureux et quotidien sera mis en place pour chaque animal. Les animaux peuvent également présenter des états de stress en lien avec les expérimentations. Une habituation sera réalisée plusieurs jours avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress engendré. De plus, les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des cerveaux.

Remplacement

"Remplacer" : les effets moléculaires des opiacés, sur le cerveau et d’autres tissus de l’organisme, ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux complexes de structures interconnectées, ni les communications inter-tissulaires. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers.

Réduction

"Réduire" : les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 15 souris chacun (par sexe). En effet, chaque expérience sera menée en parallèle chez des souris mâles et femelles. Alors que l’addiction aux opiacés est plus fréquente chez l’homme que chez la femme, on sait très peu de choses sur les mécanismes neurobiologiques qui pourraient différer selon le sexe et contribuer à expliquer cette différence de vulnérabilité. Sur le plan éthique, il apparait essentiel d’aborder systématiquement cet aspect sur le plan de la recherche fondamentale, aussi bien pour maximiser la relevance des données obtenues pour la compréhension de l’addiction aux opiacés chez l’homme, que pour l’utilisation de tous les animaux obtenus lors de la reproduction de la lignée de souris que nous utiliserons.

Raffinement

"Raffiner" : nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront un traitement antidouleur (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien). De plus, des points limites seront déterminés avant et après les procédures chirurgicales afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs. Les souris seront également habituées aux expérimentations en étant enveloppées dans du papier afin d’être branchées à la fibre optique. Enfin, elles seront branchées à la fibre laser et seront libre d’explorer leur cage, afin d’être habituées à la sensation.

Choix des espèces

La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome (99 % identique à celui de l'humain). De plus, le modèle souris permet la création de lignées génétiquement modifiées (délétion/surexpression globale ou locale d’un gène ou d’un marqueur neuronal, manipulation de neurones ciblés). Pour notre étude, les souris MOR-Cre permetteront de cibler et manipuler spécifiquemenent les neurones aux opiacés. Nous utiliserons des souris agées de 8 semaines au début de l'expérience.

5 346 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent des injections quotidiennes entre le 7e et le 17e jour de gestation, des mesures répétées de tension pouvant irriter la queue jusqu'à des plaies, et se voient retirer leurs petits à trois jours, le suivi allant jusqu'à quinze mois après. Le porteur étudie la prééclampsie et ses conséquences cérébrales tardives, dont la valeur thérapeutique reste annoncée au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre placenta et système neurovasculaire dans la durée.

Objectifs

Ce projet porte sur la prééclampsie, la principale pathologie de la grossesse, et plus particulièrement sur l’implication d’une famille de facteurs dénommés les prokinéticines au cours de cette pathologie. Nous nous intéressons également aux conséquences à long terme de cette pathologie qui ont pu être observées en clinique chez les femmes ayant fait une prééclampsie. Au cours de la grossesse normale, les niveaux des prokinéticines circulants augmentent graduellement avec un pic au premier trimestre puis chutent significativement aux deuxième et troisième trimestres. En revanche, chez les patientes prééclamptiques, leurs taux circulants sont significativement plus élevés et le restent au deuxième et au troisième trimestres, associés à de l’hypertension. Ceci est dû à une anomalie au moment de la formation des vaisseaux sanguins du placenta, qui permettent les échanges entre la mère et le fœtus. De ce fait le placenta ne reçoit pas suffisamment de nutriments et d’oxygène et développe un retard de croissance. Chez la mère, le manque d’oxygénation du placenta a diverses conséquences : une hypertension artérielle gravidique, des lésions au niveau des vaisseaux des reins, du foie et du cerveau, ainsi que des troubles de la coagulation sanguine. Le placenta, qui est pour sa part en hypoxie, et va alors se mettre à sécréter et libérer de nombreux facteurs pro-inflammatoires, dont les prokinéticines, dans la circulation sanguine maternelle Il est connu que les femmes ayant fait une prééclampsie sont plus tard, davantage sujettes aux pathologies cardiovasculaires. Récemment, plusieurs études cliniques ont également reporté qu’elles sont aussi susceptibles de développer des troubles de l’attention et de la mémoire, associés à des modifications du tissu cérébral, observées par imagerie médicale, 10 à 20 ans plus tard. L’objectif du projet est donc d'investiguer les mécanismes impliquant les prokinéticines à long terme dans l’apparition des modifications anatomiques cérébrales qui provoqueraient des troubles cognitifs et d’éventuelles pathologies neurodégénératives. Actuellement, ces facteurs sont en cours de certification comme biomarqueurs de la pathologie de la prééclampsie. Donc le but ultime de notre projet est de déterminer s’ils pourraient constituer des cibles thérapeutiques pour traiter la pathologie et ses conséquences à long terme.

Bénéfices attendus

•Les analyses, réalisées précédemment sur des sérums de patientes prééclamptiques, ainsi qu’en provenance d’animaux modèle de la pathologie, suggèrent une implication de la famille des prokinéticines dans le développement de la pathologie grave de la grossesse, qu’est la prééclampsie. •Cette étude in vivo nous permettra de mieux comprendre le rôle des facteurs pro-inflammatoires, que sont les prokinéticines, dans la prééclampsie et sur leurs conséquences à long terme. Enfin ces études nous permettrons de démontrer la valeur thérapeutique des antagonistes des prokinéticines dans le cadre d’un traitement de la pathologie.

Procédures

•les souris gestantes seront traitées par injection (durée : 1 minute), une fois par jour et tous les jours, entre le 7ème et le 17ème jour de la gestation. •Mesure du poids (durée: 5 min) et de la tension artérielle (durée : 20 min) des souris gestantes, tous les 2 jours, pendant 17 jours. • L’IRM des cerveaux sera réalisée 1 fois après la gestation (durée : maximum 2h). •Au moment de l’euthanasie les souris seront analgésiées 30 minutes avant de procéder à l’anesthésie.

Impact sur les animaux

• L’étude implique des injections intrapéritonéales répétées ce qui risquent de provoquer un peu de stress, un léchage de la région d’injection et/ou l’adoption d’une position recourbée suite à l’injection et durant quelques minutes, comme toutes injections chez les souris. •Les souris donnant naissance et allaitant jusqu’au sevrage pourront avoir une perte de poids. •L’enlèvement des souriceaux à J+3 peut représenter un stress pour la mère. •Les mesures de la pression artérielle répétée peuvent provoquer une irritation de la queue avec parfois l’apparition de plaies. •Cette étude porte sur des temps longs (jusqu’à 15 mois après la prééclampsie), des troubles cognitifs, i.e. stéréotypie, pourraient apparaitre.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour effectuer soit des dosages sanguins et tissulaires, soit d’une recherche in situ de marqueurs de l’inflammation et du développement de démence cérébrovasculaire.

Remplacement

•Le projet porte sur l’étude des conséquences cérébrales au cours du vieillissement suite à une pathologie de la grossesse, il nous est donc impossible à ce jour de remplacer par un modèle cellulaire la complexité d’interaction entre organes et cellulaires sur la durée qui existe lors de ce processus in vivo. •Ces mécanismes résultent d’interaction entre le placenta et le système neurovasculaire. A ce jour, il n’existe pas de modèle qui puisse reproduire ce contexte in vitro, sur une seule population cellulaire ou des explants en culture. En effet, l’organisme entier offre la possibilité d’étudier les lésions et les réponses inflammatoires, par dosage des cytokines circulantes, et, in situ, au niveau du site inflammatoire, i.e. : le cerveau dans notre projet. •Ce projet nécessite donc l’approche sur des animaux modèles de la pathologie permettant l’étude des mécanismes physiologiques complexes mis en oeuvre.

Réduction

Cette étude se déroule sur une cinétique de 15 mois pour chacun des antagonistes testés, avec 6 points de cinétique. Pour obtenir des résultats statistiquement robustes, chaque groupe de souris comportera 10 souris femelles pour chaque étude. Afin de valoriser totalement les animaux engagés dans cette étude, une étude sera mise en place d’expérimentations in vitro, avec les souriceaux qui vont naitre au cours du projet.

Raffinement

Les animaux femelles sont hébergés en groupe et sans mâles dans un environnement enrichi : tube de cartons, petites maisons en plastique, matériel de nidification, ... L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) tout au long de l’expérience et quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. •Les modifications de comportement et le degré de mal être des animaux seront surveillés quotidiennement, les points limites seront estimés à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être animal spécifique au projet. Plus l’état de la souris se détériore, plus le score établi dans cette grille augmente. La grille attribue un score suivant l’aspect général, le comportement et la locomotion ainsi que la perte de poids. Des points limites spécifiques à ce projet seront également pris en compte Un arbre décisionnel est mis en place permettant d’intervenir en cas de douleur voir d’euthanasier l’animal, mettant un arrêt à son expérimentation. Dans ce cas les tissus seront prélevés pour être analysés. •Avant les procédures d’IRM et de collecte du sang, les animaux seront analgésiés et anesthésiés.

Choix des espèces

•L’objectif du projet est d’étudier les conséquences de la prééclampsie, c’est à dire de la réaction inflammatoire du placenta au moment de la grossesse, sur le vieillissement du cerveau des années plus tard. Donc le choix de travailler sur un modèle animal est nécessaire pour avoir cette interaction inter-organe et dans le temps. •L’usage de la souris pour ce projet est approprié car comme chez l’humain, la placentation chez la souris est hémochoriale (le sang maternel est au contact direct avec les cellules foetales placentaires). •Par ailleurs, plusieurs études ont montré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des gènes clés de la placentation chez les deux espèces et que plusieurs facteurs impliqués sont exprimés et régulés de la même façon. •Les travaux de l’équipe, depuis dix ans, ont montré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des prokinéticines, facteurs inflammatoires étudiés dans ce projet, chez les deux espèces également. •Le projet s’attache à étudier les troubles cognitifs des années après un épisode de prééclampsie, les souris femelles seront étudiées au moment de la prééclampsie (pendant et jusqu’à la fin de la gestation) puis au cours de leur vieillissement, jusqu’à 15 mois post-gestation, ce qui correspond à un âge d’environ 70 ans chez la femme.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure, onze injections sur animal éveillé et trois tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier les neurones impliqués dans le sevrage aux opiacés. Le porteur indique induire une aversion liée au sevrage tout en cherchant à la minimiser, et met les souris à mort pour prélever leur cerveau. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne reproduisent pas l'organisation cérébrale et que les souris génétiquement modifiées utilisées n'existent que chez cette espèce.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à identifier le rôle des circuits neuronaux participant au développement de troubles cérébraux, en mettant l'accent sur les troubles émotionnelles négatifs induit par la dépendance et le sevrage aux substances aux opiacés. Ce projet est centré sur les récepteurs aux opiacés. Le système opioïde est un système neuromodulateur complexe composé de trois récepteurs (mu, delta et kappa) activés par des peptides opioïdes endogènes. Le système opioïde régule la douleur, les processus de récompense, la régulation des réponses émotionnelles et des réponses au stress. Les altérations de ce système sont centrales dans le développement de troubles addictifs et de l'humeur. L’objectif de ce projet vise à déterminer le rôle des neurones exprimant les récepteurs aux opiacés dans différentes régions cérébrales dans le processus de sevrage aux opiacés.

Bénéfices attendus

Les implications sont à la fois fondamentales et cliniques, car elles nous permetteront une meilleur connaissance des mécanismes moléculaires responsables des états émotionelles négatifs suite au sevrage aux opiacés. Ce projet aura de nombreux bénéfices, en particulier d’identifier les neurones critiques dans le développement de l’état émotionnelle négatif pendant le sevrage aux opiacés. Ceci permettra de caractériser les mécanismes d’adaptation du cerveau à l’exposition répétée aux opiacés, afin d’identifier de nouvelles cibles neuronales pour des traitements pour la prévention et le traitement du sevrage aux opiacés et de faire face à la forte augmentation de la dépendance et de la consommation d’opiacés dans le monde.

Procédures

Procédure chirurgicale sous anesthésie générale 1 fois pendant 1 heure avec une injection d’anesthésiant local et une injection d’analgésique pendant la chirurgie. Injections multiples sur animal vigile pour administrer les traitements, qui fera un total de 11 injections sur animal vigile par souris. Chaque injection sur animal vigile dure 30 secondes. Nous allons effectuer 3 tests comportementaux par souris (chaque test dure entre 6 et 30 minutes).

Impact sur les animaux

Chirurgie stéréotaxique : Pendant la chirurgie, il y a un risque de surdose d’anesthésiant et d’hypothermie due à l’anesthésie. Il existe aussi un risque d’inflammation ou de réouverture du site d’incision,. Injections multiples : Les souris seront injectées il y a donc la possibilité d’irritation du site d’injection. Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal et il y aura un jour de repos entre chaque test. Les symptômes de sevrage seront minimisés en utilisant le plus faible pour induire une aversion. De plus, les tests ne durent pas plus de 30 minutes

Devenir

les animaux seront mis à mort pour prélèvement du cerveau

Remplacement

"Remplacement" : les effets comportementaux des opiacés ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de cibler les circuits neuronaux répondant aux opiacés, ces modèles n’existent que chez la souris.

Réduction

"Réduction" : les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. De plus ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (dépression et anxiété) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets effets aversifs des opiacés seront constitués de 12 souris chacun.

Raffinement

"Raffinement": nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les réponses comportementales au sevrage à la suite d’une administration d’opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger, une ‘’maison’’ en carton, et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur (traitement par un anti-inflammatoire). La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. Des points limites prédictifs seront établis permettant d’interrompre l’étude limitant ainsi la souffrance, la douleur et le stress pour l’animal.

Choix des espèces

La sourisest aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome (99 % identique à celui de l'homme). De plus, le modèle souris permet la création de lignées génétiquement modifiées (délétion/surexpression globale ou locale d’un gène ou d’un marqueur neuronal, manipulation de neurones ciblés). Pour notre étude, l’utilisation de la souris souris génétiquement modifiée est centrale, car elle nous permet d’étudier spécifiquement les neurones qui répondent aux opiacés, de manipuler leur activité et d’en voir les conséquences sur le comportement. Aucun autre organisme ne permet d’utiliser cette approche très puissante. Les modèles étudiés étant des modèles de pathologie neuropsychiatrique se manifestant principalement à l’âge adulte chez l’humain, les études se feront chez des animaux ayant atteint le stade mature de leur développement, c’est à dire au minimum 2 mois pour les modèles souris.

512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la patte des injections d'agents pro-inflammatoires comme l'adjuvant complet de Freund ou la formaline, puis leur douleur est mesurée par l'observation des léchages, morsures et secouements pendant quatre-vingt-dix minutes, et par le test des filaments de von Frey. Le porteur décrit ces modèles de douleur comme des standards de la littérature et indique vouloir confirmer in vivo le rôle d'un gène repéré sur des neurones en culture. Les retombées annoncées, des traitements contre les douleurs mécaniques de l'arthrose ou de la polyarthrite, restent une perspective.

Objectifs

Notre projet a pour but d’identifier des acteurs moléculaires impliqués dans la sensibilité mécanique douloureuse afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les désordres liés à la perception exagérée des douleurs d’origine mécanique. Nous avons identifié des gènes candidats impliqués dans la transduction mécanique, i.e. la conversion des stimulations mécaniques en signaux biologiques, dans les neurones sensoriels dont font partie les neurones nociceptifs impliqués dans la douleur. Nous avons ensuite testé ces candidats in vitro et identifié un gène dont l'inhibition diminue significativement les réponses des neurones nociceptifs aux stimulations mécaniques. Nous voulons confirmer ces résultats in vivo en testant l’impact de ce gène sur la perception de la douleur par la réalisation de tests comportementaux. Ces tests seront réalisés en conditions inflammatoires (induites par injection d’adjuvent complet de Freund (CFA) ou de Formaline), qui sont des modèles de douleur établis dans la littérature scientifique, sur des souris génétiquement modifiées.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait être à l’origine du développement de traitement ciblant des types de douleurs mécaniques qui interviennent dans de multiples maladies et syndromes chroniques ou inflammatoires, telles que la polyarthrite rhumatoïde ou l’arthrose qui touche 10 millions de français.

Procédures

Les animaux recevront des injections d'agents proinflamatoires dans la patte ou dans la zone tibio-tarsale. Les animaux ayant reçu une injection dans la patte seront ensuite placés en box d’observation afin de mesurer la durée de comportements douloureux spontanés (léchage, morsure, secouements de la patte) sur une durée maximum de 90 minutes. Les animaux ayant reçu une injection dans la zone tibio-tarsale seront testés avec des fialments de von Frey aux jours 7, 10 et 21 post-injection afin de determiner leur sensibilité mécanique. Le test dure environ 15 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les modèles inflammatoires utilisés dans ce projet constituent les standards de ce type d'étude et sont très bien établis dans la littérature. Ils produisent des phénotypes de douleur légère ou modérée chez l'animal, ce qui est l'objectif du projet de tester l'implication du gène cible dans la douleur. Les procédures de test comportemental (box d'observation ou test de sensibilité mécanique) peuvent induire un stress limité chez l'animal, qui sera minimisé par les temps d'acclimatation.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car ne pouvant plus servir dans de nouvelles procédures. Un certain nombre d'animaux seront utilisés pour le prélèvement des ganglions rachidiens (DRG) pour l'enregistrement électrophysiologique in vitro.

Remplacement

La sensibilité / douleur mécanique et thermique ne peuvent s'évaluer in fine que sur des animaux vivants. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit donc dans la continuité de nos expériences et des résultats que nous avons obtenus in vitro.

Réduction

Réduction du nombre d’animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude est paramétré afin de pouvoir effectuer des tests statistiques afin d’observer des différences significatives sur les paramètres étudiés. Lors de la réalisation des protocoles, le maximum d’informations sera récolté afin de restreindre le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : le nombre de souris par cage respectera les directives européennes du 1er février 2013, sachant que le projet utilise de jeunes adultes entre 20 et 25g, nécessitant 70 cm2 par individus dans les cages, soit 5 animaux par cage de 374 cm2. Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des animaux permettra d’éviter la souffrance des animaux. Ils permettront de définir la nécessité d’un traitement symptomatique (analgésique, modification du protocole expérimental). Les expériences de comportement ont été choisies afin de limiter au maximum la contention de l’animal (animal libre de ses mouvements), et l’environnement des animaux sera enrichi avec des dômes en cartonainsi que des nids de papier kraft (sizzle pad).

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris, du fait de l'existence de souris transgéniques dont le gène d'intérêt a été éteint (souris KO), et pour lequel les tests comportementaux évaluant la perception à la douleur d’origine mécanique et thermique sont établis et documentés dans la littérature scientifique. Nous pourrons ainsi déterminer l’effet spécifique de ces gènes dans la sensibilité mécanique et thermique dans des modèles de douleur. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 8 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ont ainsi fini leur croissance et présentent une sensibilité mécanique et thermique assez stable entre 6 et 8 semaines.