Système nerveux

3 332 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vecteurs viraux par chirurgie intracérébrale sous anesthésie, puis passent une série de tests, exposition à des goûts et à des sons, exploration d'un labyrinthe et test de mémoire contextuelle conditionnée, avant euthanasie pour des analyses d'électrophysiologie et d'imagerie. Le porteur présente l'objectif comme fondamental, mieux comprendre le rôle de la plasticité présynaptique dans la formation des souvenirs, sans application annoncée à court terme. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico n'étudie la neurotransmission de synapses matures et que les souris transgéniques sont "nécessaires".

Objectifs

La capacité de garder en mémoire une expérience est essentielle pour la survie des organismes supérieurs. Cette capacité est assurée en partie par 2 structures cérébrales appelées néocortex et hippocampe. Ces structures sont composées de cellules appelées "neurones". Ces derniers sont connectés entre eux par des synapses, et sont capables de modifier leurs connexions en fonction des informations qu’ils reçoivent, autrement dit, ils sont capables de « plasticité synaptique ». L'objectif général du projet est de mieux comprendre le rôle de la plasticité présynaptique dans la formation et le stockage des informations des souvenirs dans ces 2 structures du cerveau. La formation de la mémoire et la mémorisation de nouvelles informations dans les circuits neuronaux du cortex dépend de la capacité des neurones et des synapses à modifier leurs propriétés. Nous allons utiliser comme modèle soit des souris contrôle, soit des souris génétiquement modifiées (souis n'exprimant pas des protéines présynaptiques). Nous utilisons des injections localisées de vecteurs viraux (outils permettant de délivrer un gène d'intérêt) pour visualiser les cellules impliquées dans la formation de la mémoire, ou pour réaliser des modifications génétiques, en supprimant par exemple les protéines impliquées dans la plasticité présynaptique. Nous effectuerons ensuite des expériences d'électrophysiologie (enregistrement de l'activité électrique des neurones) et d'imagerie cellulaire sur tranches de cerveau, combinées à des taches comportementales.

Bénéfices attendus

Nous espérons mieux comprendre comment les neurones du cerveau, en particulier dans nos 2 structures cérébrales d'intérêt, traite la formation et le stockage d'informations des souvenirs.

Procédures

Une injection de virus par chirurgie intra cérébrale: entre 30 et 60 min pour tous les animaux du projet. Tests sensoriels: - gustatifs: exposition à différents gouts pendant 2 Heures une fois par animal. - Exposition à des sons: 5 minutes une fois par animal Tests contextuels: - Exploration dans un labyrinthe: 1H une fois par animal. Tests comportementaux de mémoire contextuelle : une fois par animal pendant 5 minutes. Injcetion intrapéritonéale durant quelques secondes d'une molécule une fois par animal.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie stéréotaxique (stess de l'anesthésie, perte de poids légère). Les tests comportementaux ne durent que quelques minutes et n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Le test de mémoire contextuelle conditionnée peut induire un léger stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en vue d'études électrophysiologiques ou d'imagerie.

Remplacement

La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à mieux comprendre en quoi la plasticité présynaptique au niveau des synapses contribue à l'encodage et la mémorisation d'informations sensorielles et contextuelles. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici. En effet, les modèles alternatifs ne permettent pas d’étudier la neurotransmission au niveau de synapses matures complètement développées. De plus, l’étude du rôle des différe,tes protéines nécessite d'utiliser des souris transgéniques.

Réduction

Le même animal sera utilisé pour différents protocoles d’électrophysiologie ou d’imagerie afin de récolter un maximum de données scientifiques pour chaque souris. Si cela est possible, le nombre d’animaux sera revu à la baisse en cours d’expérimentation. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement (tunnel et matériel de nidification) et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex et de l'hippocampe de la souris présentent de nombreuses similitudes avec ceux d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les protocoles utilisés seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. L'introduction des différents gènes d'intérêt doit se faire à l'âge jeune (3 semaines) et le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge jeune adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage.

5 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène et de médicaments psychiatriques, puis passent jusqu'à trois tests comportementaux dont des mesures d'impulsivité et de locomotion, pour étudier l'action de deux composés sur les réseaux neuronaux de la dopamine. Le porteur classe la procédure en modérée en raison des injections et des tests et prévoit une grille de score, tous les animaux étant tués pour prélèvement de tissus. Il affirme que la souris est le "seul organisme modèle" permettant ce type d'étude grâce aux lignées transgéniques.

Objectifs

Les neurones du cerveau communiquent entre eux à l’aide de substances appelées neurotransmetteurs, dont la dopamine. De nombreuses maladies psychiatriques telles que la schizophrénie, les troubles attentionnels et la dépression sont associées à un déséquilibre important des quantités de dopamine libérées dans le cerveau. Les neurones se retrouvent alors suractivés et le comportement est modifié de façon pathologique. Des composés utilisés en clinique, tels que le pramipexole et l'aripiprazole, vont réguler la suractivation des neurones et ainsi neutraliser certains des symptômes. Cependant leur utilisation s’accompagne, à plus ou moins long terme, de complications dont des troubles de l’impulsivité motrice et cognitive qui se manifestent sous forme d'agressivité, impatience, recherche de sensations fortes. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes d'action de ces deux médicaments sur les différents types de neurones du cerveau. Ceci constitue un aspect important pour développer des approches thérapeutiques efficaces pour traiter les troubles de l’impulsivités induites par ces deux médicaments. La réalisation de ce projet nécessite l'utilisation de souris non génétiquement modifiées ainsi que de différentes lignées de souris transgéniques permettant 1) l'identification cellulaire et moléculaire des populations neuronales activées dans le cerveau en réponse à la dopamine et de 2) déterminer le rôle fonctionnel de ces réseaux dans le contrôle des fonctions motrices, cognitives et des émotions.

Bénéfices attendus

Cette étude s'inscrit dans le cadre d'une meilleure compréhension de l'action dans le cerveau du pramipexole et de l'aripiprazole, deux composés prescrits dans de nombreuses maladies psychiatriques. Les résultats obtenus lors de la réalisation de ce projet permettront également de préciser certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l'apparition d'effets secondaires indésirables tels que des troubles anxieux ou de l'impulsivité associés à ces traitements, et à terme de proposer des approches thérapeutiques innovantes.

Procédures

Les animaux recevront différents types d'injections par voie intra péritonéale : de tamoxifène, de composé pharmacologique (pramipexole ou aripiprazole) ou de solution saline (Nacl 0.9%). La durée de ces injections ne dépassant pas 1 minute par animal. Des tests comportementaux sont prévus dans la procédure. Les animaux ne seront jamais soumis à plus de 3 tests (2 tests uniques toujours suivi d’un nécessitant un conditionnement). Ces tests ont une durée comprise entre 10 et 30 min dans la majorité des cas, 45 min à 1h pour certains (impulsivité, locomotion). Chaque test sera répété qu'une fois, à l'exception du protocole d'impulsivité qui, incluant des phases d'habituation et d'apprentissage, prévoit des séances étalées sur plusieurs jours (maximum 3 semaines). Le cumul de ces tests ne dépassera pas les 4 semaines.

Impact sur les animaux

La procédure prévoit des injections intrapéritonéales ainsi que des tests comportementaux. Ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, dégradation de l'apparence physique). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de ces signes cliniques (voir annexe). D'autre part, selon notre expérience le protocole prévu est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

La réalisation de notre projet repose sur l'utilisation de nombreuses lignées transgéniques nous permettant de travailler sur différentes populations de neurones. La souris est le seul organisme modèle permettant ce genre d'étude. L'utilisation d'animaux demeure donc la seule option à ce jour pour évaluer avec précision et pertinence certains des mécanismes neuronaux et moléculaires sous-tendant l'apparition d'effets secondaires indésirables tels que des troubles anxieux ou de l'impulsivité associés à la prise de pramipexole et d’aripiprazole.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à l'utilisation d'un logiciel statistique sur la base de publications précédentes et de l’expérience acquise au laboratoire depuis plus d’une vingtaine d’année, de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences. Dans le but d'une exploitation maximale des données obtenues, plusieurs régions cérébrales seront systématiquement analysées sur le même animal.

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages: sciure, pellets de coton. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.

Choix des espèces

Les souris fournissent des excellents modèles pour l'étude des réseaux neuronaux, au cœur de notre projet. En effet, nous disposons aujourd'hui de nombreux modèles murins transgéniques qui nous permettront d'atteindre les objectifs de notre étude, à savoir l’étude détaillée des réseaux neuronaux. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue médical. Les animaux seront utilisés entre 3 et 8 mois ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines.

930 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une ou deux neurochirurgies pour induire un modèle de maladie de Parkinson, des prélèvements sanguins sous anesthésie et une batterie de tests comportementaux moteurs, cognitifs et sensoriels dont le RNT ne précise pas le détail, pour évaluer un implant censé protéger les neurones. Le porteur indique que le modèle induit des symptômes moteurs qui restent légers et que les rats sont mis à mort pour analyse du cerveau. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthodes alternatives" et renvoie les bénéfices pour les patients au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier les effets d’un dispositif ayant des propriétés protectrices contre la mort des neurones impliqués dans la maladie de parkinson sur un modèle de rat parkinsonien. Ce projet a pour but d'évaluer l'effet bénéfique de ce dispositif sur la perte de ces neurones ainsi que les performances des rats dans des tâches comportementales motrices, sensorielle, psychiatrique et d'apprentissage caractéristiques de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet aura pour bénéfice d’apporter les dernières preuves d’efficacité du dispositif sur les mécanismes connus pour déclencher la maladie de Parkinson. Ces résultats permettront de faciliter le passage aux essais cliniques directement chez le patient. La maladie de Parkinson, ainsi que de nombreuses maladies neurodégénératives, n’a à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique autre que le soulagement des symptômes. La finalité de ce projet est que ce dispositif apportera une possibilité de ralentir la progression de la maladie et ainsi, l’évolution des patients vers des stades de plus en plus handicapant pouvant aller jusqu’à la perte d’autonomie, la démence et une forte réduction de la qualité de vie des patients.

Procédures

Les rats subissent des neurochirurgies pour une durée de 30 minutes, anesthésie incluse. Les rats peuvent avoir une ou deux neurochirurgies. Les rats auront 4 prélévements sanguins sous anesthésie générale pour une durée de 10 minutes maximum. Les rats participeront également à des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités motrice, psychiatrique, d'apprentissage et sensorielle impactées par le modèle de la maladie de Parkinson. La durée de ces tests est de 1 à 30 minutes et se feront durant deux semaine, avec un test par jour maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux seront : 1) la neurochirurgie pour induire le modèle de rats parkinsoniens qui implique une anesthésie générale, 2) Le modèle utilisé induit l’apparition progressive des symptômes moteurs et non-moteurs qui restent cependant légers sur la plus grande partie de ce projet 3) Nous effectuerons 4 prélèvements sanguins dans la veine de la queue du rat qui peut induire du stress dû à l'anesthésie et une légère hémorragie. 4) Nous effectuerons un large panel de tests comportementaux afin d’évaluer l’effet de notre modèle de rats parkinsoniens et l’effet bénéfique de notre implant qui peuvent induire un stress dû au déplacement dans la salle d'expérimentation et le passage dans un nouvel environnement.

Devenir

Les rats seront mis à mort pour effectuer des analyses des tissus cérébraux.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent d'évaluer l'impact du modèle de rats parkinsoniens et du dispositif sur les différents marqueurs cellulaires et moléculaires caractéristiques de la maladie de Parkinson et du modèle de rats parkinsoniens et sur le comportement des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique. Les animaux seront testés en deux sessions successives incluant la moitié des rats de chaque groupe. Si les résultats sont suffisant pour mettre en évidence des différences satistiquement significative sur les paramètres décrits précedemment, il ne sera pas nécessaire de faire la deuxième session.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur ayant pour avantage que les déficits moteurs bilatéraux restent modérés tout au long du protocole. Afin de prévenir toute douleur post-opératoire supplémentaire pouvant affecter la récupération de l’animal, une injection d'un analgésique avant la procédure chirurgicale puis toutes les 24 heures après la chirurgie si nécessaire sera effectuée. Ces chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale en maintenant une température constante, les yeux sont protégés du déssechement et un anesthésique local est injecté sur le crâne de l’animal avant incision. Suite à la chirurgie, les rats sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Afin de réduire le plus possible toute douleur ou détresse que les animaux pourraient ressentir, ils seront observés au moins une fois par jour par le personnel compétent impliqué dans la réalisation des expériences et/ou dans le soin des animaux. Une échelle de cotation de douleur sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal. Les animaux seront également hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'Annexe II du premier février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément.

Choix des espèces

Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau d'un réseau de neurones important pour notre étude car il est connu pour dysfonctionner dans la maladie de Parkinson, ce qui peut être reproduit chez le rat. Les modèles de rats Parkinsoniens seront réalisés sur des rats jeunes adultes (à partir de 10 semaines, environ 300g en début d’expérience) afin de travailler sur des systèmes cérébraux matures et stables qui resteront stables tout au long du projet.

646 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une molécule par voie intraveineuse sous anesthésie ou par voie orale, certaines subissant cinq anesthésies en vingt-quatre heures pour de l'imagerie, l'étude portant aussi sur des femelles gestantes ou allaitantes, leurs embryons et leurs souriceaux. Le porteur décrit une molécule "très peu toxique" utilisée comme complément alimentaire et vise à préciser ses doses avant une éventuelle application à l'homme. Il affirme que l'analyse de la distribution d'une molécule doit "nécessairement" être réalisée in vivo, et les tue pour la doser dans leurs organes.

Objectifs

Chaque jour, le cerveau humain utilise 20% de l’énergie apportée par l'alimentation. Ce besoin énergétique est encore plus important chez l’enfant, ce qui rend le cerveau particulièrement sensible aux perturbations énergétiques survenant pendant le développement embryonnaire et l’enfance, et qui peuvent causer des pathologies du neurodéveloppement telles qu’épilepsie ou retard mental, dont la prévalence est estimée à une naissance sur 100 dans les pays industrialisés. L’objectif de ce projet est d’étudier une molécule d'intérêt thérapeutique qui promeut la production d’énergie cérébrale. C’est une molécule très peu toxique, utilisée comme complément alimentaire, et qui a montré son intérêt chez la souris dans des modèles de troubles neuropsychiatriques (dépression). Nous avons observé son efficacité dans des modèles de pathologie du développement neuronal, quand elle est donnée à des femelles gestantes ou allaitantes. Cependant, nous ne savons pas encore si la molécule agit directement sur l'embryon/le souriceau, ou a un effet bénéfique chez la mère qui bénéficie indirectement à l'embryon. D’autre part, nous ne savons pas quand la molécule doit être administrée pour agir au mieux. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire de conduire une étude dite de pharmacocinétique qui permettra de connaitre la vitesse d’absorption, de transformation et d’élimination de cette molécule, ainsi que sa distribution dans les différents tissus et notamment le passage chez l’embryon ou dans le lait. A notre connaissance ces données ne figurent pas dans la littérature

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de la molécule d'intérêt et d’affiner ses conditions d’utilisation dans des études de neurodéveloppement. Cela permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique potentiel de cette molécule pour des maladies du neurodéveloppement, ainsi que de déterminer avec plus de précision les doses et voies d’administration. Ces données renseigneront les futures études sur cette molécule avant une éventuelle proposition d’application à l’homme.

Procédures

Administration de la molécule d'intérêt, sous anesthésie par voie intraveineuse (1 seule fois), ou sur animaux vigiles (sans anesthésie) par voie orale (1 seule fois). Une partie des animaux subira des anesthésies répétées (5 anesthésies sur 24 heures) pour de l’imagerie. Les animaux seront placés en hébergement individuel après administration de la molécule d’intérêt, pour un maximum de 24 heures. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure, selon une cinétique après l'administration de la molécule d'intérêt et au plus tard 24 heures après le début de la procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux ne suburont pas d'effet secondaire lié à l'injection de la molécule. Un risque de réaction allergique ou de fausse route est en théorie possible suite à l'injection bien que jamais constaté en pratique. L'anesthésie répétée chez certains animaux peut engendrer un stress lié aux manipulations répétées et un changement du comportement (prostration, perte d'appétit). L'isolement de moins de 24 heures, nécessaire chez certains animaux, peut entraîner un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'organe permettant le dosage de la molécule d'intérêt

Remplacement

La preuve de l’efficacité de la molécule d'intérêt a été obtenue dans un premier temps in vitro. L’analyse de la distribution d’une molécule implique tout l’organisme (absorption intestinale, distribution sanguine, captage par les différents organes) et doit nécessairement être réalisée in vivo. Dans la mesure du possible les paramètres de l'expérience sont basés sur l’analyse de la littérature et notamment de la cinétique d’élimination de molécules similaires.

Réduction

L’étude sera conduite sur des groupes d’animaux réduits au minimum de façon à obtenir une information biologique pertinente. Des mesures de la répartition de la molécule dans les différents organes seront réalisées sur des lots de trois animaux, qui est le minimum permettant de faire une analyse statistique. En parallèle, un suivi longitudinal qui n’entraînera pas d’analyse statistique, sera réalisé sur deux animaux par condition pour confirmer que les résultats sont reproductibles.

Raffinement

Les animaux auront un temps d’acclimatation de 7 jours avant l’étude pour limiter le stress lié au nouvel environnement. Pour chaque groupe d'animaux, deux semaines sépareront les groupes expérimentaux, permettant d’analyser rapidement les résultats et d’adapter les paramètres de l’expérience d'un groupe à l'autre. Des points limite, adaptés et prédictifs, ont été définis pour limiter les souffrances que pourraient subir les animaux.

Choix des espèces

Notre étude précédente démontrant l’efficacité de la molécule d'intérêt sur des modèles de troubles autistiques a été réalisée chez la souris. Conduire l’étude de la biodistribution de la molécule d'intérêt chez la souris permettra d’éclairer les mécanismes qui ont abouti à ce résultat positif lors de la première étude, et de guider des études ultérieures en raffinant les doses employées ou le moment auquel le traitement doit être administré. Procédure 1 : animaux adultes. Dans cette procédure l’objectif est d’obtenir des paramètres de base avant d'étudier l'effet de la molécule d'intérêt chez des femelles reproductrices (procédure 2). Procédure 2 : animaux adultes (femelles gestantes et allaitantes) et embryons de 15j (E15)/souriceaux de 5 jours (P5). Ces stades correspondent à des étapes clés du développement cortical.