Système nerveux

10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des séances d'imagerie sous anesthésie, l'injection de traceurs dans le cerveau ou la pose d'une chambre d'enregistrement par trois à quatre chirurgies de six à sept heures, puis des enregistrements cérébraux pendant plusieurs mois sur animal vigile entraîné à des tâches, sous contrôle de la boisson. Le porteur justifie ce contrôle hydrique par la coopération de l'animal et euthanasie les dix individus pour analyser leur cerveau. Les retombées annoncées pour les troubles humains de la conscience et l'épilepsie sont renvoyées au moyen et long terme.

Objectifs

La connectivité étendue du claustrum avec le cortex suggère son implication dans les fonctions cognitives supérieures, y compris la conscience. Des résultats récents chez la souris remettent en question la globalité des interactions entre le cortex et le claustrum et donc leur implication dans les fonctions cognitives supérieures telles que la conscience. L’objectif du projet est donc de clarifier le role du claustrum dans les fonctions corticales chez le primate non-humain en réalisant des investigations anatomiques et physiologiques. Nos travaux préliminaires suggèrent que le macaque présente des caractéristiques inattendues propres aux primates concernant l'intégration du claustrum dans le réseau cortical global, il occupe une position centrale et est fortement connecté avec l’ensemble du cortex. L'achèvement de ces travaux dans le cadre du présent projet nous permettra de construire une matrice détaillée des connections entre le claustrum et le cortex afin de déterminer la centralité du claustrum dans le réseau cortical interaréal. En fonction du contexte, l’activité cérébrale transite rapidement entre deux états cérébraux fondamentaux en fonction du contexte : un état au repos et un état actif. Les transitions rapides entre différents états et leurs distributions spatiales en fonction des exigences comportementales sont une caractéristique majeure et encore mal comprise du cerveau. Notre hypothèse de travail est que la position centrale du claustrum dans le réseau cérébral lui confère un rôle privilégié en facilitant l'orchestration des changements rapides d'états du cerveau. Nous aborderons cette question en utilisant des enregistrements multisites de plusieurs aires corticales et du claustrum lors de différents états comportementaux chez le PNH. Nous mettrons en relation les modèles de connectivité fonctionnelle et anatomique à grande échelle. Ces résultats pourraient permettre des progrès sans précédent dans la compréhension des fonctions cognitives supérieures chez les primates.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Le choix des animaux est significatif : Le macaque est un modèle de choix pour les neuroscientifiques du monde entier, il possède de nombreuses aires corticales similaires à celles de l’homme, avec des propriétés fonctionnelles et cognitives comparables. Seul le singe présente une hiérarchie des aires corticales qui ressemble étroitement à celle de l'homme. De plus, nos résultats préliminaires suggèrent que le claustrum des primates présente des différences significatives par rapport au claustrum des rongeurs, ce qui pourrait être directement pertinent pour les processus cognitifs, y compris les transitions entre différents états du cerveau, que nous abordons ici. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez le singe sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux à grande échelle qui sont probablement impliqués dans les fonctions cognitives les plus élevées, y compris les différents états de conscience, mais aussi dans l'épilepsie. Le lien avec l'épilepsie est plausible car une des hypothèses sur le rôle du claustrum est qu’il prévient la propagation incontrôlée de vagues d’activité excitatrice en stabilisant le réseau cortical par rétroaction inhibitrice. Ainsi les bénéfices à moyen et/ou long terme seraient l’utilisation de nos résultats à des buts thérapeutiques en médecine appliquée dans le traitement des troubles de la conscience et des épilepsies e.g. par stimulation du claustrum, après validation sur des modèles précliniques.

Procédures

Pour l’étude des connections anatomiques, les animaux seront soumis sous anesthésie générale à des examens d’imagerie (1 scanner de 10min et 2 sessions d’IRM de 3-5 heures chacune) puis à l’injection de traceur dans le cerveau (1 chirurgie de 6-7 heures) avant d’être euthanasiés pour analyser le marquage neuronal. Pour l’étude des connections fonctionnelles, les animaux seront soumis sous anesthésie générale à des examens d’imagerie (1 scanner de 10min et 2 sessions d’IRM de 3-5 heures chacune) puis à la fixation d’une chambre d’enregistrement (3 chirurgies de 6-7 heures à plusieurs semaines d’intervalle). Les animaux sont entraînés à effectuer des tâches comportementales cognitives et l’activité cérébrale est enregistrée pendant plusieurs mois sur animale vigile. Les animaux sont ensuite euthanasiés pour vérifier avec précision les sites d’enregistrements.

Impact sur les animaux

Le bien-être de l’animal suivant les procédures chirurgicales fait l’objet d’un suivi régulier afin d’adapter le niveau d’antalgiques au besoin . En dehors de la période post-opératoire, les effets indésirables potentiels sont principalement liés à l’hygiène de l’implant : en cas d’infection ou d’inflammation constatée autour de l'implant, lors des soins réguliers de l'animal par les expérimentateurs, une intervention rapide est prévue en consultation avec le vétérinaire (e.g. antibiogramme et traitement antibiotique). Il existe un risque rare que l’implant devienne non fonctionnel (casse, réaction de rejet tissulaire, infection non contrôlée par voie systémique), dans ce cas l’implant est retiré lors d'une procédure chirurgicale, la plaie nettoyée parfaitement et refermée, et l'animal traité par antibiotiques. Dans chacun de ces cas le protocole est interrompu et l’animal placé sous surveillance accrue. Toutes les expériences sur les animaux sont réalisées dans le souci du bien-être des animaux. La condition de base de toutes les expériences avec des singes éveillés et entraînés au comportement est la coopération de l'animal afin qu'il puisse accomplir les tâches comportementales de manière concentrée, persévérante et précise. Or, il n'est capable de le faire que s'il n'est ni malade, ni apeuré, ni distrait. D'autre part, l'ensemble de la situation d'élevage des singes joue un rôle décisif. En effet, seul un animal vivant dans un environnement intact et stimulant est motivé et curieux, et peut donc être entraîné. Il est réalisé un suivi régulier du poids et du niveau d’hydratation de l’animal (pendant la période de contrôle hydrique), de l‘hygiène de l’implant et du niveau de douleur suite aux actes chirurgicaux. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 10 animaux est nécessaire à la validation scientifique projet (quantification des connexions du claustrum et validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Nous avons démontré par ailleurs que la mise en évidence des voies neuronales par IRM de diffusion (tractographie) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Notre approche pour la réduction du nombre d’animaux se base sur une amélioration des techniques utilisées, une approche statistique prospective et le partage des données acquises dans ce projet. Le nombre de traceurs pouvant être utilisé simultanément a été augmenté de 3 à 4, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Notre expérience montre que le risque d’une mauvaise position du site d’injection (contamination de l’aire adjacente ou de la matière blanche sousjacente), liés aux limites de résolutions de l’IRM et de la caméra du système de navigation cérébrale (1mm), représente environ 25% des cas. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous ne prévoyons pas d’utiliser plus d’animaux que nécessaire une fois que 8 régions différentes du claustrum auront été correctement ciblées (e.g. si toutes les injections de traceurs étaient correctement placées dans deux animaux, nous ne prévoyons pas d’utiliser plus d’animaux pour cette procédure). Le nombre d'animaux utilisés est déjà réduit au niveau indispensable (1 animal par site d’injection permet d’obtenir la connectivité empirique pour ce site pour des connexions impliquant plus de 8 neurones par région). Nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage de voie et la tractographie (IRMd) et les données de ce projet y seront intégrées afin d’augmenter la puissance statistique. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l'IRMd, absolument non invasive. La modélisation (modèles linéaires généralisés) des comptes issus du traçage de voie et de la tractographie, permettrons de caractériser la variabilité intra- et interindividuelle pour ces deux types de mesures de la connectivité. Pour l’étude de la connectivité fonctionnelle, deux animaux constituent le minimum internationalement reconnu pour la publication des résultats. D'autres animaux sont prévus uniquement si cela s'avérait absolument nécessaire, par exemple si l'un des animaux tombait malade et serait retiré de l'expérience. Toutes les données issues de ce projet seront partagées dans un premier temps avec les différents collaborateurs directement impliqués dans l’analyse des données et la modélisation et, dans un deuxième temps, via des sites de partage pour l’utilisation de ces données par la communauté scientifique (e.g. Zenodo).

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie. Une grille de score post-opératoire nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Ces critères prennent en compte l'apparence de l'animal, les signes cliniques (température et les fréquences cardiaque et respiratoire), son comportement, la prise de nourriture et de boisson et l'aspect de la zone opérée. Le suivi de la douleur est évalué par 2 ou 3 personnes indépendantes (expérimentateurs et zootechniciens). Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, en supprimant la procédure chirurgicale d’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce au nouveau système de navigation cérébrale qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par des caméras infrarouge pour la navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous pouvons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre l’homme et le carnivore est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications démontrent une forte homologie entre le connectome cortical de l’homme et du PNH mais également de nombreuses différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.

48 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une inoculation d'alpha-synucléine agrégée dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie, pour accélérer une pathologie proche de la maladie de Parkinson et chercher des marqueurs de la maladie dans leur sang. Le porteur indique que les souris développent une démarche saccadée et des troubles de l'équilibre, signes à l'apparition desquels elles sont tuées avant que ne survienne une paralysie du train postérieur. Sur le remplacement, il affirme que le projet ne peut être réalisé qu'in vivo et qu'il n'existe "pas de méthode alternative" à l'expérimentation animale.

Objectifs

Le projet vise à identifier des marqueurs moléculaires de la maladie dans le sang de souris modifiées génétiquement pour développer une maladie associée à l’agrégation de l’alpha-synucléine, une protéine qui est le constituant principal des lésions cérébrales dans la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rechercher si de nouveaux marqueurs moléculaires de la maladie peuvent être identifiés dans ce modèle expérimental à partir d’un prélèvement de sang. Réalisable du vivant de l’animal et au cours de l’incubation de la maladie, cette identification ouvrirait la voie à des recherches de marqueurs précoces de la maladie.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 48 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation d’alpha-synucléine agrégée est réalisée afin d’accélérer l’apparition des signes cliniques moteurs, qui se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet développent des signes cliniques lors de leur vieillissement qui conduiraient irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie. Leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à rechercher des biomarqueurs dans le sang. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Dans le cadre de cette étude pilote, les nombres de 12 animaux par lot sont déterminés afin de permettre la collecte d’une quantité de sang suffisante chez au moins 8 souris, pour isoler une quantité suffisante de vésicules extracellulaires d’origine neuronale. Concernant la détection d‘alpha-synucléine pathologique dans les vésicules extracellulaires neuronales, le test t de Student bilatéral non apparié et l'ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Sidak seront appliqués. Concernant les analyses des microARN, les tests P-value, test exact de Fisher et FDR (False Discovery Rate) seront utilisés.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée chez un animal soumis à une anesthésie générale, permettant de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé et maintenus dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Ces enrichissements, comme les cachettes et les éléments de nidification, sont doublés en cas de dépilations qui peuvent être observées chez quelques souris femelles au delà de l’âge de 7 mois. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort, afin d’éviter des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris, espèce qui peut être modifiée génétiquement pour produire une forme de la protéine alpha-synucléine humaine entraînant le développement d’une pathologie de cette protéine accompagnée d’une symptomatologie motrice. L’expresssion de cette protéine dans cette espèce permet l’accélération de la maladie après inoculation d‘alpha-synucléine agrégée. Les souris sont adultes lors de l’inoculation, âgées de 6 à 8 semaines, permettant l’inoculation des extraits cérébraux dans une région précise du cerveau, et sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie avant son délai d’apparition normale lors du vieillissement spontané de cette lignée, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie par perfusion intra-cardiaque sans réveil afin de pouvoir réaliser des prélèvements de sang.

10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent plusieurs chirurgies de six à sept heures, une injection de traceur dans le cerveau ou la pose d'une chambre d'enregistrement, puis sont entraînés à des tâches cognitives sous contrôle hydrique pendant des mois avant d'être tués pour analyse du cerveau. Le porteur revendique le primate non-humain comme "modèle de choix" pour comprendre le cerveau humain et présente ces recherches sur la conscience comme fondamentales. Il évoque des bénéfices thérapeutiques renvoyés au moyen et long terme, dans l'épilepsie ou les troubles de la conscience.

Objectifs

La connectivité étendue du claustrum avec le cortex suggère son implication dans les fonctions cognitives supérieures, y compris la conscience. Des résultats récents chez la souris remettent en question la globalité des interactions entre le cortex et le claustrum et donc leur implication dans les fonctions cognitives supérieures telles que la conscience. L’objectif du projet est donc de clarifier le role du claustrum dans les fonctions corticales chez le primate non-humain en réalisant des investigations anatomiques et physiologiques. Nos travaux préliminaires suggèrent que le macaque présente des caractéristiques inattendues propres aux primates concernant l'intégration du claustrum dans le réseau cortical global, il occupe une position centrale et est fortement connecté avec l’ensemble du cortex. L'achèvement de ces travaux dans le cadre du présent projet nous permettra de construire une matrice détaillée des connections entre le claustrum et le cortex afin de déterminer la centralité du claustrum dans le réseau cortical interaréal. En fonction du contexte, l’activité cérébrale transite rapidement entre deux états cérébraux fondamentaux en fonction du contexte : un état au repos et un état actif. Les transitions rapides entre différents états et leurs distributions spatiales en fonction des exigences comportementales sont une caractéristique majeure et encore mal comprise du cerveau. Notre hypothèse de travail est que la position centrale du claustrum dans le réseau cérébral lui confère un rôle privilégié en facilitant l'orchestration des changements rapides d'états du cerveau. Nous aborderons cette question en utilisant des enregistrements multisites de plusieurs aires corticales et du claustrum lors de différents états comportementaux chez le PNH. Nous mettrons en relation les modèles de connectivité fonctionnelle et anatomique à grande échelle. Ces résultats pourraient permettre des progrès sans précédent dans la compréhension des fonctions cognitives supérieures chez les primates.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Le choix des animaux est significatif : Le macaque est un modèle de choix pour les neuroscientifiques du monde entier, il possède de nombreuses aires corticales similaires à celles de l’homme, avec des propriétés fonctionnelles et cognitives comparables. Seul le singe présente une hiérarchie des aires corticales qui ressemble étroitement à celle de l'homme. De plus, nos résultats préliminaires suggèrent que le claustrum des primates présente des différences significatives par rapport au claustrum des rongeurs, ce qui pourrait être directement pertinent pour les processus cognitifs, y compris les transitions entre différents états du cerveau, que nous abordons ici. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez le singe sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux à grande échelle qui sont probablement impliqués dans les fonctions cognitives les plus élevées, y compris les différents états de conscience, mais aussi dans l'épilepsie. Le lien avec l'épilepsie est plausible car une des hypothèses sur le rôle du claustrum est qu’il prévient la propagation incontrôlée de vagues d’activité excitatrice en stabilisant le réseau cortical par rétroaction inhibitrice. Ainsi les bénéfices à moyen et/ou long terme seraient l’utilisation de nos résultats à des buts thérapeutiques en médecine appliquée dans le traitement des troubles de la conscience et des épilepsies e.g. par stimulation du claustrum, après validation sur des modèles précliniques.

Procédures

Pour l’étude des connections anatomiques, les animaux seront soumis sous anesthésie générale à des examens d’imagerie (1 scanner de 10min et 2 sessions d’IRM de 3-5 heures chacune) puis à l’injection de traceur dans le cerveau (1 chirurgie de 6-7 heures) avant d’être euthanasiés pour analyser le marquage neuronal. Pour l’étude des connections fonctionnelles, les animaux seront soumis sous anesthésie générale à des examens d’imagerie (1 scanner de 10min et 2 sessions d’IRM de 3-5 heures chacune) puis à la fixation d’une chambre d’enregistrement (3 chirurgies de 6-7 heures à plusieurs semaines d’intervalle). Les animaux sont entraînés à effectuer des tâches comportementales cognitives et l’activité cérébrale est enregistrée pendant plusieurs mois sur animale vigile. Les animaux sont ensuite euthanasiés pour vérifier avec précision les sites d’enregistrements.

Impact sur les animaux

Le bien-être de l’animal suivant les procédures chirurgicales fait l’objet d’un suivi régulier afin d’adapter le niveau d’antalgiques au besoin . En dehors de la période post-opératoire, les effets indésirables potentiels sont principalement liés à l’hygiène de l’implant : en cas d’infection ou d’inflammation constatée autour de l'implant, lors des soins réguliers de l'animal par les expérimentateurs, une intervention rapide est prévue en consultation avec le vétérinaire (e.g. antibiogramme et traitement antibiotique). Il existe un risque rare que l’implant devienne non fonctionnel (casse, réaction de rejet tissulaire, infection non contrôlée par voie systémique), dans ce cas l’implant est retiré lors d'une procédure chirurgicale, la plaie nettoyée parfaitement et refermée, et l'animal traité par antibiotiques. Dans chacun de ces cas le protocole est interrompu et l’animal placé sous surveillance accrue. Toutes les expériences sur les animaux sont réalisées dans le souci du bien-être des animaux. La condition de base de toutes les expériences avec des singes éveillés et entraînés au comportement est la coopération de l'animal afin qu'il puisse accomplir les tâches comportementales de manière concentrée, persévérante et précise. Or, il n'est capable de le faire que s'il n'est ni malade, ni apeuré, ni distrait. D'autre part, l'ensemble de la situation d'élevage des singes joue un rôle décisif. En effet, seul un animal vivant dans un environnement intact et stimulant est motivé et curieux, et peut donc être entraîné. Il est réalisé un suivi régulier du poids et du niveau d’hydratation de l’animal (pendant la période de contrôle hydrique), de l‘hygiène de l’implant et du niveau de douleur suite aux actes chirurgicaux. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 10 animaux est nécessaire à la validation scientifique projet (quantification des connexions du claustrum et validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Nous avons démontré par ailleurs que la mise en évidence des voies neuronales par IRM de diffusion (tractographie) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Notre approche pour la réduction du nombre d’animaux se base sur une amélioration des techniques utilisées, une approche statistique prospective et le partage des données acquises dans ce projet. Le nombre de traceurs pouvant être utilisé simultanément a été augmenté de 3 à 4, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Notre expérience montre que le risque d’une mauvaise position du site d’injection (contamination de l’aire adjacente ou de la matière blanche sousjacente), liés aux limites de résolutions de l’IRM et de la caméra du système de navigation cérébrale (1mm), représente environ 25% des cas. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous ne prévoyons pas d’utiliser plus d’animaux que nécessaire une fois que 8 régions différentes du claustrum auront été correctement ciblées (e.g. si toutes les injections de traceurs étaient correctement placées dans deux animaux, nous ne prévoyons pas d’utiliser plus d’animaux pour cette procédure). Le nombre d'animaux utilisés est déjà réduit au niveau indispensable (1 animal par site d’injection permet d’obtenir la connectivité empirique pour ce site pour des connexions impliquant plus de 8 neurones par région). Nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage de voie et la tractographie (IRMd) et les données de ce projet y seront intégrées afin d’augmenter la puissance statistique. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l'IRMd, absolument non invasive. La modélisation (modèles linéaires généralisés) des comptes issus du traçage de voie et de la tractographie, permettrons de caractériser la variabilité intra- et interindividuelle pour ces deux types de mesures de la connectivité. Pour l’étude de la connectivité fonctionnelle, deux animaux constituent le minimum internationalement reconnu pour la publication des résultats. D'autres animaux sont prévus uniquement si cela s'avérait absolument nécessaire, par exemple si l'un des animaux tombait malade et serait retiré de l'expérience. Toutes les données issues de ce projet seront partagées dans un premier temps avec les différents collaborateurs directement impliqués dans l’analyse des données et la modélisation et, dans un deuxième temps, via des sites de partage pour l’utilisation de ces données par la communauté scientifique (e.g. Zenodo).

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie. Une grille de score post-opératoire nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Ces critères prennent en compte l'apparence de l'animal, les signes cliniques (température et les fréquences cardiaque et respiratoire), son comportement, la prise de nourriture et de boisson et l'aspect de la zone opérée. Le suivi de la douleur est évalué par 2 ou 3 personnes indépendantes (expérimentateurs et zootechniciens). Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, en supprimant la procédure chirurgicale d’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce au nouveau système de navigation cérébrale qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par des caméras infrarouge pour la navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous pouvons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre l’homme et le carnivore est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications démontrent une forte homologie entre le connectome cortical de l’homme et du PNH mais également de nombreuses différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.

76 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux chirurgies, un amincissement du crâne et une injection d'un vasoconstricteur dans le cerveau pour provoquer un accident vasculaire, puis quatre à cinq anesthésies consécutives pour des séances d'imagerie. Le porteur reconnaît un risque de dépression respiratoire lié à cette succession d'anesthésies et d'hémorragie lors de l'amincissement du crâne. Les rats sont gardés vivants trois à quatre jours puis tués pour prélever le cerveau.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Disposer de modèles animaux bien caractérisés est nécessaire à l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection. De plus, leur utilité en recherche translationelle est renforcée lorsque l’effet thérapeutique peut être mesuré par la même méthode d’imagerie chez l’animal et le patient. L’objectif global du projet est de caractériser par imagerie in vivo le modèle d’AVCi expérimental consistant en une injection intra-cérébrale d'un vasoconstricteur (endothelin-1) chez le rongeur. Plus précisement, il s’agit d’étudier la dynamique de la formation de la lésion ischémique lors de l’injection intra-cérébrale du vasoconstricteur ainsi que la réaction neuroinflammatoire qui s’ensuit. Pour cela seront mises en œuvre différentes méthodes d’imagerie, i) récemment développées, ii) en voie de transfert clinique, et iii) susceptibles d’apporter un nouvel éclairage sur la physiopathologie de ce modèle animal : ultrasons fonctionnels (fUS), permettant de visualiser l’activité cérébrale grâce aux variations de volume sanguin cérébral, et IRM moléculaire ou cellulaire, utilisant un agent de contraste à base de particules d’oxyde de fer, respectivement spécifique d’un récepteur sur-exprimé en condition inflammatoire (sur la paroi des vaisseaux) ou d’un type cellulaire (macrophages/microglies). Ces deux méthodes sont donc particulièrement adaptées à ce modèle où l’infarct ischémique dérive d’une réaction vasculaire (vasoconstriction) induite localement par l’endothelin-1. En résumé, ce projet consiste en une caractérisation renouvelée d’un modèle d’AVCi chez le rat grâce à de nouvelles méthodes d’imagerie. Il comprend 3 procédures de sévérité modérée, et a une durée de 4 ans.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral est une maladie invalidante chez l’adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre la dynamique de formation de l’infarct, et la réaction inflammatoire associée, dans un modèle animal plus simple à mettre en œuvre et à standardiser que le modèle classique d’occlusion artérielle mécanique avec un filament. Ces aspects inexplorés du modèle animal permettront ensuite de définir des biomarqueurs d’imagerie utiles pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. Ces biomarqueurs seront à terme utilisables chez l’homme puisque le transfert en clinique des techniques d’imagerie utilisées dans ce projet est à l’étude.

Procédures

Deux chirurgies : amincissement du crâne (30 min) et injection stéréotaxique (45 min), sous anesthésie générale. Deux à trois sessions d'imagerie (ultrasons et IRM), de durée moyenne

Impact sur les animaux

Les animaux subissent deux chirurgies (amincissement du crâne et injection stéréotaxique intracérébrale), ainsi que des sessions d’imagerie (ultrasons et IRM). Cette succession d’anesthésies générales sur 4 à 5 jours consécutifs comporte des risques de dépression respiratoire et peut affecter leur état général. L’emploi systématique d’un anesthésique gazeux (isoflurane) et une surveillance étroite au réveil permet de contrôler ces effets. Suite à la chirurgie permettant de réaliser le modèle d’ischémie cérébrale, une perte de poids minime (

Devenir

Euthanasie pour prélèvement post-mortem du cerveau et analyses complémentaires.

Remplacement

Ce projet consiste en une étude à l’échelle du cerveau entier, dont les mécanismes physiopathologiques (ischémie et inflammation associée) et les méthodes d’imagerie sélectionnées (US & IRM) ne peuvent être actuellement adaptés et étudiés sur un système in vitro. Ce projet vient compléter notre connaissance d’un modèle animal utilisé depuis les années 90. L’utilisation du modèle animal adéquat conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des mammifères de plus grande taille (cochon, primate) grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie dédiés aux petits animaux.

Réduction

Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude bibliographie de la variabilité du modèle. Des groupes expérimentaux de 10 animaux (5 mâles et 5 femelles) seront typiquement utilisés, avec une analyse intermédiaire à 6 animaux. Si la variabilité est faible, notamment dans les groupes contrôles (injection sans endothelin-1), alors l’inclusion sera stoppée. Il n’y a pas de mortalité directement liée à l'infarct ischémique, qui est de taille limitée en comparaison du modèle d‘AVC le plus utilisé (occlusion artérielle mécanique). L’imagerie longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion au cours du suivi à la taille de l’atteinte initiale chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Plus spécifiquement dans ce projet, des méthodes d’imagerie innovantes vont permettre de mieux décrire la cascade physiopathologique dans ce modèle d’AVC. Si la variabilité du modèle s’avère plus importante que décrite dans la littérature, celle-ci pourra être mieux contrôlée car à l’imagerie réalisée très précocement (pendant ou juste après l’occlusion). Les chirurgies sont réalisées sous traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), avec thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. Une grille de score dédiée permet de juger objectivement les déficits sensori-moteurs, et le codage des expressions faciales permet de quantifier la souffrance post-opératoire. La salle d’évaluation neurofonctionnelle a été installée dans un endroit dédié et calme avec une lumière rouge afin de ne pas agresser les yeux des animaux albinos. En soins post-opératoires, nourriture et boisson sous forme gélifiée sont mises à disposition de l'animal en plus de la nourriture et boisson habituelles, et les groupes sociaux sont conservés (isolement limité au réveil complet de l’animal, sauf en cas d’aggressivité constatée).

Choix des espèces

L’utilisation du rat est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau du rat est proche de celle de l’homme. Ce modèle est aussi pertinent car la taille du cerveau est suffisante pour la mise en place de l’imagerie ultrasonore et IRM de manière efficace et le modèle ET-1 est très bien défini chez le rat. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : maturité cérébrale atteinte.

86 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des chirurgies vasculaire et intracérébrale, l'injection d'un ARN interférent dans le cerveau et l'auto-administration intraveineuse d'héroïne pendant vingt jours. Les animaux sont tués pour prélever leurs cerveaux. Le porteur présente comme bénéfice attendu la possibilité de répondre aux relecteurs d'un manuscrit déjà soumis, ce qui situe l'enjeu au niveau d'une publication.

Objectifs

Notre objectif est mettre en évidence un rôle fonctionnel de Sez6 dans la mise en place d’un comportement compulsif de prise d’héroïne chez le rat, en diminuant son expression et en étudiant le comportement des rats vis-à-vis de la prise de drogue.

Bénéfices attendus

Notre objectif est mettre en évidence un rôle fonctionnel de Sez6 dans la mise en place d’un comportement compulsif de prise d’héroïne chez le rat. Ce résultat nous permettra de répondre aux experts qui ont évalué le manuscrit que nous avons soumis.

Procédures

Les chirurgies vasculaires (qui durent 30 min) et les chirurgies intracérébrales (qui durent 15 min) seront réalisées sous anesthésie générale. Les injections des ARN interférents se feront par voie intracérébrale, et la mise en place du comportement d’auto-administration par voie intraveineuse d'héroïne. Le comportement des animaux sera enregistré pendant 20 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont essentiellement liées à la procédure chirurgicale. L’administration d’antalgiques est prévue en pré et post opératoire.

Devenir

A l'issue des 2 procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement des cerveaux.

Remplacement

Ce projet ayant pour but d’étudier le rôle fonctionnelle d’une protéine sur le comportement d’auto-administration de drogue, aucune méthode alternative n’existe. Il s'agit en effet d'étudier le comportement spontané et volontaire des animaux après apprentissage, ce qui ne peut être réalisé sur des modèles alternatifs (approches in silico, in vitro ou ex vivo).

Réduction

Pour réduire au miminum le nombre de rats utilisés, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données obtenues lors de projets précédents. Pour les études d’éfficacité de l’ARN interférent à diminuer la quantité de notre protéine d’intérêt nous aurons 5 rats par condition. Pour les études comportementales, chaque groupe sera constitué de 14 animaux pour révéler des différences inter-individuelles comportementales.

Raffinement

L’hébergement s’effectuera dans un environnement enrichi (présence de nids végétaux et de tunnels opaques). Les rats seront également logés à deux par cage d’habitation permettant un enrichissement social tout en assurant un espace d’hébergement suffisant. L’angoisse des animaux sera réduite par une manipulation quotidienne par l'expérimentateur. Les chirurgies sous analgésie et anesthésie générale seront réalisées par une personne compétente ayant suivie la formation réglementaire de chirurgie. De plus les animaux seront observés quotidiennement, et pesés tous les 2 jours. Ces observations permettent de graduer les points limites pour l'apparence et la perte de poids. En fonction du degré de gravité, les animaux seront isolés et mis sous antibiotiques (perte de poids 15%; apparence avec dos rond, agitation ou immobilité importante).

Choix des espèces

L’investigation d’une pathologie telle que l’addiction nécessite d’étudier une espèce animale phylogénétiquement voisine de l’homme pour pouvoir reproduire la maladie. Le rat est un modèle de référence dans le domaine des addictions. Il possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. De plus, il est idéal pour les études comportementales. Le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés. Les animaux testés seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 7 semaines environ et ne sont pas testés avant leur 8ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte pour pouvoir éviter le facteur confondant de l’âge sur les facteurs comportementaux mesurés. En effet, l’âge peut influencer de manière significative l’état émotionnel et le comportement de l’animal.

380 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau ou le cœur, un inhibiteur administré par la bouche, une irradiation cérébrale et la pose répétée de cathéters, le porteur anticipant perte de poids, de motricité et de sensibilité liées aux métastases cérébrales. Les animaux sont tués à un stade défini ou après une étude de survie. Le porteur évalue un traitement des métastases cérébrales pour une application clinique lointaine, et affirme que le microenvironnement tumoral rend le remplacement in vitro impossible.

Objectifs

Au vu des échecs des thérapies standard existantes en ce qui concerne les MC, ce projet vise à évaluer l’intérêt de nouveaux traitements pour ces MC en ciblant spécifiquement leur microenvironnement tumoral hypoxique. En effet, l’hypoxie est connue pour être un facteur de mauvais pronostic dans de nombreuses tumeurs. Elle est à l’origine de l’expression des facteurs de transcriptions Hypoxia Inducible Factors (HIFs), principaux facteurs de résistance à la radio- et chimiothérapie. Ce projet visera donc à évaluer l’intérêt d’un inhibiteur de HIF-2 dans les MC, qui s’avère déjà être prometteur dans le traitement des carcinomes rénaux. Ce projet permettra également de mieux caractériser le microenvironnement tumoral des MC dans différents modèles chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de connaître l'efficacité d'un inhibiteur de HIF-2 en combinaison ou non à la radiothérapie externe pour le traitement des métastases cérébrales, ce qui pourrait être appliqué à long terme par la suite en clinique. Il apportera également des connaissances complémentaires sur le microenvironnement tumoral de ces tumeurs et permettra de trouver des cibles thérapeutiques supplémentaires potentielles contre ces métastases cérébrales.

Procédures

Implantation, réalisée sous anesthésie générale (isoflurane) : - Implantation intracérébrale : une seule fois par animal, durée de l’acte = 30 minutes maximum, 240 animaux (rats nudes) - Implantation intracardiaque : une seule fois par animal, durée de l’acte = 20 minutes maximum, 140 animaux (souris nudes) Administration per os d’une solution contrôle ou de l’inhibiteur : durée du geste = 1 minute maximum, 2 fois par jour par cycle de 21 jour ON/7jours OFF, 320 animaux (180 rats nudes et 140 souris nudes) Irradiation : Elles auront lieux sous anesthésie générale à l’isoflurane comme décrit précédemment. L’irradiation sera réalisée à une dose de 4 Gy pendant 3 jours. Le protocole complet d’irradiation dure 30 minutes par animal sur 120 rats nudes. La pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale comme décrit précédemment et anesthésie locale au niveau de l’incision. La pose de cathéter dure maximum 10 minutes et sera réalisée 4 fois maximum sur chaque animal, 300 animaux sont concernés par cet acte.

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de métastases cérébrales au bout d’une vingtaine de jours. Nous nous attendons également à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale dans la première semaine suivant la fin de l’irradiation. Nous avons adapté en conséquence le suivi des animaux, le raffinement des conditions expérimentales et le scoring afin d’anticiper et d’éviter l’exclusion des animaux par atteinte du point limite.

Devenir

Les animaux seront soit mis à mort à un temps défini ou à un volume tumorale défini, en fonction des résultats obtenus en procédure 1, 3 et 5, afin de réaliser des analyses post-mortem, soit ils seront gardés en vie pour une étude de survie jusqu’au point limite puis mis à morts.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, à savoir qu'en plus de la simple cellule cancéreuse, les tumeurs sont composées d’un microenvironnement tumoral. Celui-ci comprend une composante hypoxique, inflammatoire et vasculaire, toutes connues pour avoir un effet majeur sur la réponse aux traitements tels que la radiothérapie et la chimiothérapie. Ici, l'utilisation de modèles in vivo, permet de travailler sur des modèles de métastases cérébrales entièrement intégré à l'organisme. Ces modèles, à la différence des modèles in vitro, permettent l'intégration de ces différentes composantes, qui sont indispensables pour la compréhension des mécanismes de développement tumorale et de réponses aux différents traitements. Par conséquent, ce projet ne peut pas s’effectuer sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L'utilisation de méthodes d’imagerie non invasive telle que l’imagerie IRM permet de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur sans nécessité de mettre à mort plusieurs animaux à chacun de ces temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle dans chaque point de l’étude et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Des simulations statistiques en ligne ont été réalisées à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe. . Concernant les modèles d’injection intracérébrale et intracardiaque, ces simulations ont mis en évidence un nombre minimum de 4 animaux par sous-groupe. Connaissant la littérature et l’expérience du laboratoire pour ces modèles, le nombre d’animaux doit être augmenté à 10 animaux maximum par sous-groupes. Le nombre maximum d’animaux sera de 10 mais il pourra cependant être revu à la baisse. Dans la mesure où ce nombre de 10 animaux par groupe n’est pas réalisable en même temps pour toutes les procédures, 2 cohortes de 5 animaux seront réalisées. Les résultats de la première cohorte nous permettront de réaliser des statistiques séquentielles et ainsi de décider du nombre d’animaux à inclure dans la deuxième cohorte pour obtenir des résultats significatifs et ainsi de réduire le nombre d’animaux au total.

Raffinement

La présence quotidienne de personnels formés et expérimentés permettra le suivi du bien-être des animaux et la mise en place des différentes procédures du projet. L’apparence physique, mais aussi le poids des animaux sera suivi, par ce même personnel 3 fois par semaine et permettra d’évaluer l’inconfort des animaux. Les animaux seront scorés 3 fois par semaine via différents item, lorsque l’un des items atteindra un score de 1, l’animal sera scoré quotidiennement et différentes mesures seront mises en place en fonction de l’item pour éviter à l’animal d’atteindre un score de 2. Le score établi en amont comme point d’arrêt des expériences sera lorsqu’un des items possède un score de 2, ou que l’ensemble des items donnera un score un score supérieur à la moyenne. Si malgré les mesures en place, le score limite est dépassé pendant plus de 48h, l’animal sera mis à mort. En raison de l'utilisation de modèles animaux immunodéprimés, les animaux seront hébergés en zone EOPS, ils seront placés dans des cages individuelles, ventilées et mis sur des portoirs ventilés. L’entrée dans l’animalerie se fait via un sas et un protocole de désinfection est mis en place. Le port d’une combinaison intégrale, avec masque chirurgical, charlotte et sur-chaussures est nécessaire pour accéder à l’animalerie. Ils seront hébergés en groupes sociaux permettant une stimulation sociale (2 animaux par cage pour les rats et 5 animaux par cage pour les souris). Ils bénéficieront également d’enrichissement dans la cage : roue d’activité, stimulation sensorielle par différents objets. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriées et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Pour les deux espèces utilisées, l'utilisation de souches nude est nécessaire en tant qu’hôte pour des modèles de développement de tumeurs humaines afin d’éviter leur rejet. Le modèle de développement des MC par voie intracérébrale chez le rat est pertinent car il possède un cerveau dont la taille est supérieure à celui de la souris. Cela nous permet d’utiliser des appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée, une imagerie de haute résolution mais aussi l’utilisation de la TEP, qui, à cause de sa résolution spatiale, nous contraint à imager des cerveaux plus volumineux comme celui du rat. Le modèle de développement de MC chez la souris, injectées par voie intracardiaque est le modèle se rapprochant le plus pour inclure les phases précoces d’apparition et développement des MC chez l'Homme. Ce modèle est bien décrit et validé dans la littérature ainsi que dans notre laboratoire. Les animaux seront âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. A ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l'évolution des animaux sur des temps longs. De plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux, ce projet scientifique est une poursuite de travaux antérieurs réalisés dans l'équipe et cela nécessite que nous puissions compléter les expériences avec des animaux du même âge. En effet, toute modification de l'âge nécessiterait de nouvelles mises au point.

300 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie du crâne pour injecter un virus dans l'hippocampe, des contentions prolongées avec incisions de la queue et prélèvements sanguins répétés pour mesurer le stress, et un test de mémoire en labyrinthe aquatique où l'animal nage pour retrouver une plateforme immergée. Les cerveaux sont prélevés après mise à mort. Le porteur étudie le rôle des nouveaux neurones dans les troubles de mémoire liés à l'âge, et affirme qu'une approche in vitro ou in silico ne pourrait convenir.

Objectifs

Il est maintenant bien établi qu’il existe une formation de nouveaux neurones tout au long de la vie dans l’hippocampe des mammifères (y compris l’Homme), et que ce phénomène joue un rôle dans la mémoire. L’hippocampe est une structure clé impliquée dans les processus de mémoire. Les nouveaux neurones nés à l’âge adulte s’intègrent aux réseaux des neurones formés au cours du développement. Ces nouveaux neurones, appelés néo-neurones, sont cruciaux pour l’apprentissage et la mémoire. Au cours du vieillissement, certains individus présentent un déficit de mémoire beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables alors que d’autres individus sont dits résilients car ils conservent une bonne mémoire au cours du vieillissement. La compréhension de ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles de mémoire liés à l'âge. L’une des explications pourrait être la capacité des nouveaux neurones créés à l’âge adulte à s’intégrer totalement (individus résilients) ou partiellement (individus vulnérables) dans le réseau de neurones au cours des processus de mémoire. L’objectif de ce projet est de regarder si l’intégration totale ou partielle de ces nouveaux neurones est à l’origine de déficits mnésiques.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'Union européènne. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémoire, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences interindividuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle des nouveaux neurones dans la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

7 gestes techniques seront réalisés : *Composition corporelle : Après une acclimatation de 30 minutes dans la zone d’analyse, les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention en plastique durant le temps de l’examen qui dure 3 min (180 rats). *Réactivité au stress : les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention pendant 30 min pour induire un stress. Immédiatement après, le bout de la queue (~0.3cm) est incisé à l’aide d’une lame de scalpel, la queue est massée et un volume de sang d’~200μl est prélevé. L’opération est renouvelée 30, 60 et 120 minutes plus tard. Les animaux sont remis dans leur cage après le second prélèvement (à 30 min) et sont replacés dans les tubes (2x2min) pour les deux derniers prélèvements afin d'éviter qu’ils ne se retournent. 180 rats sont concernés à 3, 8, 12 et 18 mois. *Injections intra-hippocampiques : Geste réalisé sous anesthésie gazeuse durant toute la chirurgie (~40 min), consistant en une incision du scalp, une craniotomie pour l’injection de virus et la suture de la peau. La totalité des animaux est concernée. *Injections sous-cutanées : Elles sont réalisées sur animal vigile. Les animaux reçoivent au total 4 injections (contention + injection : 4x2min=8 min) sur 4 jours consécutifs (4x8min=32min) (180 rats). *Labyrinthe aquatique : les rats nagent dans une piscine et apprennent à localiser une plateforme immergée en s’aidant des indices disposés dans la pièce. Lors de l’habituation, ils passent 2x60s dans la piscine sans la plateforme. Lors de l’apprentissage, ils font chaque jour 4 essais consécutifs, pendant 6 jours. Pour chaque essai, les animaux passent 90s maximum dans l’eau (temps maximum passé dans l’eau au cours d’une session = 4 x 90s = 360s). Au fil des jours, les animaux apprennent et le temps passé dans l’eau diminue. Les groupes Apprentissage et Plateforme visible sont concernés (207 rats). *Injection d’anesthésie : Dans la partie I, les animaux sous anesthésie gazeuse sont euthanasiés (induction 5min + maintien 3-4min jusqu’à confirmation euthanasie) par injection intrapéritonéale d’une dose létale d’Exagon. (180 rats). Dans la partie II, les animaux vigiles reçoivent une injection intrapéritonéale d’un mélange d’analgésique/anesthésique (2min) (120 rats)*Perfusion intracardiaque : Après obtention d’une anesthésie profonde, une perfusion intracardiaque d’une solution enrichie en sucrose est réalisée (3min). Tous les animaux de la partie II sont concernés (120 rats).

Impact sur les animaux

Comme tout projet incluant des contentions, des injections et des gestes chirurgicaux (stéréotaxie, incision de la queue), Il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adaptées. Tout d’abord concernant la contention dans l’appareil à Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN), celle-ci sera la plus légère possible et de durée relativement courte (3min) de manière à induire le moins de stress possible. S’agissant de la contention afin d’étudier la réactivité de l’axe corticotrope en réponse à un stress, nous savons que cela sera forcément générateur de stress puisqu’il est nécessaire à l’étude. Ensuite, même si cela est relativement rare, il est possible que les sites d’injection (intra-péritonéale, sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales (stéréotaxie, incision de la queue) s’infectent ou deviennent douloureux. De même dans les 2 jours suivants la chirurgie stéréotaxique, il est possible que les animaux perdent du poids (~10/20g pour un rat de 400g au moment de la chirurgie) ou présentent des signes de douleur. Enfin, au sujet de l’isolement certes les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant 14 jours mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.

Devenir

A l’issue de ces expériences, les animaux seront mis à mort et les cerveaux récupérés en vue de leur analyse.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact du vieillissement sur l’intégration des nouveaux neurones dans le cerveau, et ce en fonction du vieillissement des capacités de mémoire. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problèmes au cours de la chirurgie, variations anatomiques inter-individuelles, des expériences d’électrophysiologie), ainsi que des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus). Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux générés en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les objectifs sont atteints plus précocement que prévu.

Raffinement

Hébergement : Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés par 2 en cages collectives (grande taille) enrichies (sizzle pad : lanières de papier kraft vierge) afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect général et aspect du pelage) et manipulés hebdomadairement jusqu’à leur sacrifice. Ils seront stabulés dans une animalerie avec une température maintenue constante, une hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera illimité et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Gestion de la douleur : La chirurgie se fait sous anesthésie et analgésie. Après chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement et quotidiennement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire (comportement, plaie, pesée). Si un animal présente des signes de douleur, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. En cas de signes d’infection de la plaie chirurgicale (rougeur, oedème, écoulement, saignement), nous la désinfecterons et administrerons un analgésique. Nous utilisons des grilles d’évaluation de la douleur permettant de scorer de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies par l’expérimentateur jusqu’au sacrifice des animaux. Plus le score est élevé plus le bien-être de l’animal est menacé et des points limite ont été définis. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera euthanasié par inhalation de gaz carbonique.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la néo-neurogenèse hippocampique est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’Homme. Enfin, cette étude vient compléter nos investigations menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante (continuité et contrôle des résultats). Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des chirurgies stéréotaxiques. Ensuite, comme indiqué dans le paragraphe 3.3.2, les différentes études seront réalisées 5 à 15 mois après les injections intra-cérébrales. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : 8 mois :1) adulte : 8 mois ; 2) milieu de vie : 12 mois ; 3) fin de vie : 18 mois. Ces âges ont été choisis car ils permettent une étude longitudinale du rôle des néo-neurones nés à l’âge adulte dans l’apparition de déficits mnésiques.