Système nerveux

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie de Huntington, elles subissent des injections intracérébrales sous anesthésie, des gavages répétés sur quatre mois, de l'imagerie cérébrale et une batterie de tests comportementaux évaluant motricité, sociabilité, vocalisation, anxiété et anhédonie, avant la mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur n'attend que peu d'effets indésirables hormis la douleur des chirurgies et le stress de la contention. Il affirme que les interactions entre neurones et astrocytes ne sont pas reproduites in vitro ou in silico et qu'un modèle murin est nécessaire pour tester cette thérapie génique.

Objectifs

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative d’origine génétique sans traitement curatif. Elle se caractérise par la mort de neurones du système nerveux central, ce qui provoque d’importants troubles moteurs, cognitifs et comportementaux chez les patients. Un défi majeur est de retarder l’âge d'apparition des symptômes et de ralentir la progression de la maladie de Huntington. La production et l’élimination du cholestérol, qui est essentiel pour le cerveau, est altéré dans la maladie de Huntington. Le métabolisme du cholestérol implique un dialogue finement régulé encore mal compris entre les neurones mais aussi leurs partenaires, les astrocytes. Les études pilotes montrent que la thérapie génique avec CYP46A1, qui vise à rétablir le métabolisme du cholestérol, impacte aussi les astrocytes et les rend réactifs. Nous faisons l’hypothèse que les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets bénéfiques de cette stratégie thérapeutique. L’objectif de ce projet est de mieux définir le potentiel thérapeutique de CYP46A1 dans un modèle murin pertinent de la maladie de Huntington et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. D’une part, il s’agit d’établir si les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets thérapeutiques de la CYP46A1 : une approche préclinique complète évaluera les effets thérapeutiques au niveau moléculaire, histologique, biochimique, métabolique, comportemental et de la connectivité cérébrale. Il s’agit également de comprendre quels sont les effets de CYP46A1 sur la morphologie des astrocytes du striatum et leur transcriptome (ensemble des gènes exprimés par une cellule). Pour cela, les souris anesthésiées recevront des injections intracérébrales de vecteurs viraux dans le striatum ou un traitement pharmacologique oral qui mime les effets d’une surexpression de CYP46A1. Ces souris seront analysées par un panel d’approches précliniques (analyse des performances motrices et des altérations comportementales par des tests du comportement, de l’imagerie cérébrale non invasive sur souris anesthésiée, par résonance magnétique nucléaire pour identifier des altérations morphologiques et du métabolisme cérébral et enfin par des techniques d’analyses post-mortem variées).

Bénéfices attendus

Cette analyse préclinique va permettre de confirmer les effets bénéfiques d’une thérapie génique et pharmacologique sur les altérations comportementales typiques de la maladie de Huntington mais rarement étudiées dans les protocoles précliniques. De plus, l’analyse par une méthode non-invasive par imagerie cérébrale va permettre d’évaluer l’effet de ces approches thérapeutiques sur un ensemble de paramètres fonctionnels pertinents pour une future étude clinique. Enfin une meilleure compréhension du rôle des astrocytes, des partenaires essentiels aux neurones, permettra de mieux comprendre les effets intracérébraux de ces thérapies et d’affiner leur utilisation clinique.

Procédures

Certaines souris seront soumises à une injection unique intracérébrales sous anesthésie et analgésie pendant environ 30 min, puis à des tests comportementaux étalés sur plusieurs jours avec au moins 2 jours de repos entre chaque tests, qui visent à évaluer les capacités motrices, la sociabilité, la vocalisation, l’anxiété et l’anhédonie des souris. Chacun de ces tests durent moins de 30 min par souris, sauf la cage d’activité qui permet de suivre le comportement spontané de la souris dans une cage dédiée pendant 24h. Certaines souris auront aussi deux sessions d’imagerie cérébrale sous anesthésie (moins de 2h30/souris). Certaines souris recevront à des injections intracérébrales sous anesthésie et analgésie de 30 min, puis une injection retro-orbitaire 6 mois plus tard, sous anesthésie gazeuse, pendant 5 min. D’autres souris recevront des gavages en contention pendant 1 min, 3 fois par semaine pendant 4 mois. souris seront habituées à l’expérimentateur et à la contention avant de démarrer les gavages.

Impact sur les animaux

Très peu d’effets indésirables sont attendus sur les animaux utilisés dans ce protocole à part la douleur lors des chirurgies intracérébrales, le stress lié à la contention lors du gavage et à la manipulation lors des tests comportementaux.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Ce projet est basé sur des résultats obtenus in vitro qui ont mis en évidence les effets bénéfiques de la modulation du métabolisme du cholestérol dans le contexte de la maladie de Huntington. Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules, dont les astrocytes. Ces interactions qui sont très probablement à la base des effets thérapeutiques ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. En particulier, il existe des souris transgéniques modèles de la maladie de Huntington qui ont la mutation génétique responsable de cette maladie et permettent d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement cérébral. Ces souris modèles ont également l’avantage de permettre d’évaluer des symptômes cliniques très importants de la maladie de Huntington : les altérations comportementales (ex. atteintes motrices, anxiété), les déficits métaboliques et les altérations des connections cérébrales, ainsi que leur potentielle restauration par nos stratégies thérapeutiques.

Réduction

Le projet prévoit au maximum 370 souris. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux sera réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par exemple, les mêmes souris auront une évaluation extensive de leur comportement ainsi qu’une analyse de plusieurs paramètres par imagerie et pour finir une analyse histologique complète du cerveau avec quantification d’une dizaine de paramètres/souris. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liée aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à l’expérimentateur avant les sessions de tests comportementaux et l’habituation à la contention permet de réduire le stress des souris. Un soutien thermique sera mis en place lors des chirurgies et sessions d’imagerie.

Choix des espèces

Les souris modèles de la maladie de Huntington permettent d’étudier les cellules cérébrales (neurones, astrocytes…) in situ, dans un contexte génétique permettant le développement de la maladie de Huntington. Ces souris présentent des altérations moléculaires, cellulaires et comportementales caractéristiques de la maladie de Huntington. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés. La MH est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés.

320 souris et 802 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont entraînés à consommer de l'alcool pendant plusieurs semaines, reçoivent des injections répétées d'alcool, de lithium ou de psilocybine, une partie subissant une chirurgie cérébrale pour implanter des cannules ou injecter un vecteur viral, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-chirurgicales et un isolement sans enrichissement pour certains animaux. Il affirme que l'addiction est un mécanisme trop complexe pour être remplacé par des méthodes in vitro ou in silico.

Objectifs

L'objectif principal de cette étude est d'étudier le rôle de la mémoire associée au contexte de la consommation d'alcool sur l'efficacité de la psilocybine à réduire la consommation d'alcool. Les objectifs secondaires seront d'étudier l'implication des récepteurs à la sérotonine et à la dopamine dans la réponse à la psilocybine en fonction des différents contextes de consommation d'alcool.

Bénéfices attendus

L'utilisation des psychédéliques dans le traitement de maladies psychiatriques est en plein renouveau depuis une petite dizaine d'années. Notre projet se place dans ce contexte et vise à mieux identifier les cibles moléculaires et les mécanismes cellulaires responsables de l'effet bénéfique de la psilocybine, un psychédélique issue de champignons, sur la réduction de la consommation d'alcool et sur la rechute après une période d'abstinence.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections répétées (x 3) d'alcool ou de chlorure de lithium et une injection supplémentaire de psilocybine. Les rats recevront des injections de psilocybine et certains rats seront soumis à une chirurgie (30 minutes environ) visant soit à injecter un vecteur viral directement dans les structures cérébrales ciblées, soit à implanter des cannules d'enregistrement de l'activité dopaminergique. Les animaux seront également entrainés à consommer de l'alcool volontairement sur une période de 8 semaines à 4 mois.

Impact sur les animaux

Au cours des différentes expériences, les animaux ne subiront que des nuisances légères (injections uniques) ou modérées de courte durée (injections répétées - douleurs post-chirurgicales de palier 1-2). Les animaux consommeront volontairement de l'alcool pendant plusieurs semaines, certains animaux seront intégrés dans un protocole chirurgical visant à injecter un vecteur viral dans différentes structures du cerveau (durée de la nuisance: 3-4 jours). Les rats recevront 4 injections (3 de solution saline et une de psilocybine) au total. Les souris recevront entre 7 et 12 injections au cours des expériences de conditionnement de place. Dans certaines procédures, les animaux seront isolés et stabulés sans enrichissement du milieu. Ce manque d'enrichissement du milieu sera contrebalancé par des manipulations régulières voire quotidienne pour la majorité des animaux et par l'exposition à des contextes environnementaux différents aux cours des procédures fournissant ainsi un enricissement cognitif et psychomoteur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience. En effet, nous aurons besoin de récupérer les cerveaux pour effectuer des vérifications histologiques des sites d'injections et d'implantation, ou nous effectuerons des études de biochimie et de biologie moléculaire sur les tissus collectés.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à une analyse statistique correcte pour chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant les mêmes modèles de consommation d'alcool. Nous avons également pris en compte la variabilité inter-individuelle observée dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Nous utiliserons une échelle de suivi du bien-être animl par espèce. Ces 2 échelles sont mondialement reconnues pour être suffisament prédictive de tout mal-être/douleur ou souffrance perçue par l'animal. En fonction des scores obtenus à ces échelles nous apporterons une réponse antalgique adaptée (dose croissante d'antalgique en fonction du score observé) et dose modérée immédiate pour les périodes post-opératoires chez le rat. Les animaux seront stabulés à plusieurs (sauf période transitoire de mesure de la consommation d'alcool individuelle pour certains rats), ils seront manipulés quotidiennement (enrichissement inter-espèces) et différents contextes environnementaux (texture du sol, décoration des murs, appuis sur des leviers conduisant à l'apparition de stimuli visuels et sonores) leur seront présentés (enrichissement environnemental).

Choix des espèces

Le rat est actuellement le modèle animal le plus couramment utilisé dans les études utilisant le paradigme de l'auto-administration opérante. Néanmoins, pour les études de préférence de place conditionné, le rat n'est pas le modèle idéal. En effet le rat ne développe pas de préférence de place conditionnée pour l'alcool. Donc pour les quelques expériences utilisant ce paradigme spécifique nous utiliserons la souris et plus précisemment la souche DBA /2J qui est connue pour présenter un comportement de préférence de place pour l'alcool supérieur à celui d'autres souches commes les C57Bl/6J ou encore les Swiss. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour nous permettre de mimer les troubles de la consommation d'alcool observés chez l'être humain adulte.

3 900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent jusqu'à deux chirurgies cérébrales, l'une pouvant durer quatre heures, puis des manipulations optogénétiques, des enregistrements électrophysiologiques et des injections intracérébrales, sous restriction d'eau et récompensés au sucrose pour apprendre à appuyer sur un levier à un signal sonore. Une partie subit une induction de la maladie de Parkinson, avec réduction de l'activité motrice et comportement de rotation. Le porteur revendique le rat comme "espèce de choix" et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire la complexité des ganglions de la base.

Objectifs

La mise en œuvre de ces protocoles expérimentaux vise la compréhension et l’identification des activités neuronales impliquées au cours de l’exécution d’un mouvement volontaire chez des rats en situations physiologique ou lors de maladies motrices graves comme la maladie de Parkinson et une des complications motrices associées telle que les dyskinésies levodopa induite. Pour ce projet, nous utiliserons soit des rats de souche sauvage (Long Evans, ou GAERS) ou modifiés génétiquement (11 lignées différentes de rats transgéniques). Les objectifs principaux de ces protocoles sont l'identification et la manipulation de large ensembles et circuits neuronaux permettant l'expression et/ou l'inhibition de comportements moteurs. Pour réaliser ces objectifs, nous utilisons des approches technologiques de pointes chez l'animal combinant manipulations optogénétiques, enregistrements électrophysiologiques, et manipulations pharmacologiques (par injection intracérébrale). La tâche comportementale que nous avons mis au point consiste à entrainés des rats à effectuer un mouvement d’appuie sur un levier avec leur patte avant en réponse à un stimulus sonore ‘Go !’. L’accès à l’eau sera rationalisé pour ces animaux (restriction hydrique) et pour chaque essai réussi, ils recevront une dose de 40μL de solution de sucrose à 5%. Les expériences optogénétiques, d’enregistrement électrophysiologiques, et de manipulations pharmacologiques commenceront après apprentissage de la tâche chez des animaux normaux ou après induction de la maladie de Parkinson. Les effets de nos manipulations optogénétiques/pharmacologiques seront évalués sur les niveaux de performance moteurs liés à notre tâche et sur l’activité électrophysiologique enregistré en parallèle.

Bénéfices attendus

Ce projet original permettra d’amener des connaissances nouvelles et fondamentales sur le mode de fonctionnement normal et pathologique des ganglions de la base. Il permettra de définir les circuits neuronaux permettant l'expression et/ou l'inhibition de comportements moteurs et ainsi de mieux comprendre le mode d’action de stratégies thérapeutiques utilisées quotidiennement en clinique.

Procédures

Nos procédures expérimentales comportent aux maximum deux chirurgies, la première aura une durée maximale de 4 heures, la deuxième sera inférieure à 1 heure. Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux enregistrements électrophysiologiques. 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. 4/ des effets indésirables moteurs unilatéraux inhérents à l'induction de la maladie de Parkinson (réduction de l'activité locomotrice et comportement rotatoire).

Devenir

Toutes les procédures sont terminales car les cerveaux des animaux seront prélevés pour analyse immunohistochimique.

Remplacement

Le but de se projet est de comprendre la physiologie et physiopathologie du réseau des ganglions de la base dans le contrôle de la motrivité volontaire. La seule manière d'atteindre nos objectifs est d'utiliser des approches in vivo mises en place chez l'animal se comportant ce qui nécessite donc le recours à l'utilisation d'animaux. A l'heure actuel, aucun modèle "in vitro" ou "in silico" ne peuvent reproduire la complexité et le mode de fonctionnement des ganglions de la base.

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’anesthésiques et d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux et ont à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. Lors de la partie comportementale, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur pour diminuer leur niveau de stress lors des tests. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après chirurgie, et accrue dès qu’un signe d’appel est constaté. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances prolongées aux animaux avec des mesures de soulagement mis en place (réhydratation, réchauffement, et traitements vétérinaires si nécessaire).

Choix des espèces

Le rat est une espèces de choix car l’organisation des ganglions de base est inchangée au cours de l'évolution ce qui nous permet d'extrapoler les résultats que nous observerons à l'espèce humaine et donc de mieux comprendre le rôle de ces circuits dans certains troubles moteurs comme la maladie de Parkinson. Les rats sont des sujets de choix (par rapport au souris) pour toutes les expériences de comportements car ils sont moins sujet au stress et peuvent apprendre des tâches motrices plus complexes. La disponibilité et l'utilisation de rats transgéniques représente un outil précieux pour nos expériences d'optogénétique car elles permettent de manipuler de manière sélective des populations neuronales cibles. Dans ce projet nous utiliserons des rats génétiquement modifiés de type afin de manipuler différentes populations neuronales des ganglions de la bases. Le projet sera réalisé sur des rats agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des sites d’injection

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une neurochirurgie pour implanter un dispositif d'enregistrement, puis des séances d'électroencéphalographie hebdomadaires pendant deux mois et, pour une partie, des injections quotidiennes dans l'abdomen, avant la mise à mort pour analyser le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-opératoires et un hébergement en cage individuelle pour éviter que les animaux ne rongent le dispositif. Il présente cette technique comme un futur outil de diagnostic précoce chez l'humain, et affirme que ni la culture cellulaire ni les modèles informatiques ne reproduisent les interactions neurones-astrocytes visées.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une évolution lente mais progressive de l'atteinte neuronale affectant les capacités de mémorisation et de cognition des patients réduisant progressivement leur autonomie. Cette pathologie complexe est liée à un dysfonctionnement des connections entre neurones qui aboutit à la dégénérescence des neurones de l'hippocampe (structure impliquée dans la mémoire) puis de l'ensemble du cerveau. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cognitives puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Ce constat est notamment dû au fait qu’on ne peut pas diagnostiquer la maladie suffisamment tôt pour proposer un traitement dans la phase de mise en place, encore réversible, de la maladie. Il a été récemment identifié un stade auquel il est possible de stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Ce stade est notamment caractérisé par une activité anormale de l’hippocampe chez la souris. De manière intéressante, cette activité anormale de l’hippocampe a également été identifiée chez l’homme par des techniques d’imagerie médicale, qui restent couteuses et invasives. Cette activité de l’hippocampe est prédictive de l’apparition ultérieure de la pathologie chez l’homme. Ce projet vise à étudier la mise en place de cette activité par des techniques in vivo d’électroencéphalographie chez la souris afin de proposer cette technique en complément des techniques de diagnostic actuelles (reposant essentiellement sur des questionnaires cliniques) ou futures (marqueurs sanguins en cours de développement) mais également en suivi de l’efficacité d’un traitement. Des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer qui manifestent, in vitro, cette activité anormale de l’hippocampe entre 1 mois et 3 mois post-natal seront utilisées. Cette technique in vivo d’enregistrement éléctroencéphalographique pourrait être facilement adaptable à l’homme et proposée en médecine de ville afin de statuer précocement sur la mise en place de la pathologie et proposer des thérapeutiques curatives précoces.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de proposer une méthode diagnostique non invasive et peu couteuse, facilement mise en œuvre en médecine hospitalière et en médecine de ville et visant à mesurer l’activité hippocampale chez des patients susceptibles de présenter des troubles associées à la maladie d’Alzheimer. Chez l’homme, cette activité (mise en évidence par IRM) a été récemment associée aux phases précoces réversibles de la pathologie et est prédictive de l’évolution de la pathologie. Généraliser sa détection, par des techniques non invasives, pourrait permettre de proposer des traitements curatifs empêchant ou retardant l’évolution de la maladie. A l’heure actuelle, le diagnostic de la maladie est tardif car il est essentiellement clinique et s’appuie peu sur les techniques d’imagerie médicale qui restent couteuses. La technique d’électroencéphalographie pourra être envisagée à large échelle et proposée en médecine de ville ou en ambulatoire. Elle pourra également être associée aux méthodes de diagnostic en cours de développement (marqueurs sanguins, etc) pour confirmer le diagnostic, attester du stade de la maladie et proposer des thérapeutiques adaptées. Elle permettra également de suivre l’efficacité des thérapeutiques futures puisque la mise en place de l’activité anormale hippocampale semble être une des étapes critiques induisant l’irréversibilité de la neurodégénérescence.

Procédures

Les souris subissent une neurochirurgie pour une durée de 45 minutes, anesthésie incluse. L'activité des neurones cérébraux des souris sera enregistrée une fois par semaine pendant 1 heure sur une durée de 2 mois. Une partie des souris aura également des injections dans l'abdomen (durée 30 secondes) une fois par jour pendant 2 mois et demi.

Impact sur les animaux

Lors de l'installation du dispositif pour enregistrer l'activité des neurones, sous anesthésie générale, les nuisances ou effets indésirables pourront concerner d'eventuelles douleurs post-opératoires. Cet équipement nécessite de maintenir les animaux isolés en cages individuelles afin d’empêcher que les animaux ne cherchent à ronger le dispositif de leurs congénères. La perte du dispositif est un effet indésirable rare qui conduira à la mis eà mort de l'animal. L’injection quotidienne d’un traitement pharmacologique en intrapéritonéal peut éventuellement induire une douleur légère.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour effectuer des analyses des tissus cérébraux.

Remplacement

Notre approche méthodologique permet d'avoir accès à l’activité d’une structure dans un réseau complexe au sein du cerveau. L'activité des neurones est fortement influencée par la région à laquelle ils appartiennent mais également par l'interaction de ces neurones avec d'autres types cellulaires comme les astrocytes, notamment au sein de l'hippocampe. Ce modèle ne peut donc pas être remplacé par un modèle dépourvu de cette régionalisation et de ces interactions comme la culture cellulaire (in vitro). Même les modèles in vitro les plus performants (cultures tri-dimensionnelles ou organoïdes) ne permettent pas de reconstituer les interactions neurone-astrocyte qui sont impliquées dans la mise en place de l'hyperactivité de l'hippocampe. Par ailleurs, s'agissant des modèles computationnels, ceux-ci ne permettent pas de reproduire l'environnement physiologique dans lequel le peptide β-amyloide est libéré. Ils ne permettent pas non plus d'inclure tous les acteurs potentiels perturbés par cette pathologie.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupes et le nombre de répétitions des expériences sont réduites au maximum tout en optimisant l'interprétation statistique des résultats. Nous testerons 4 lots d'animaux transgéniques et contrôles que nous suivrons de manière hebdomadaire pour les enregistrements EEG : 1) Souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer suivis de 1 mois à 3 mois (périodes d’hyper puis d’hypoactivité hippocampique) : 15 animaux, 2) Souris non transgéniques contrôles suivis de1 mois à 3 mois : 15 animaux, 3) Souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer traitées par HC 030031 (Tocris) en injection ip (5 mg/kg/jour) de 14 jours post-natal à 3 mois : 15 animaux. 4) Souris non transgéniques contrôles traitées par HC 030031 (Tocris) en injection ip (5 mg/kg/jour) de 14 jours post-natal à 3 mois : 15 animaux. Soit, au total, 60 animaux sur 5 ans. Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nous commencerons les enregistrements sur les animaux de 1 mois : si l’hyperactivité n’est pas mise en évidence ou peu perceptible, le projet ne sera pas poursuivi.

Raffinement

Deux jours avant la phase d’implantation, de la nourriture hydratée appétante est disposée dans la cage des animaux à opérer afin de les conditionner à cette prise de nourriture pour une meilleure récupération post-opératoire. L’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement tout au long de l’expérience, notamment suite à la chirurgie qui sera effectuée sous anesthésie générale. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par injection systématique d’un antalgique. Les cages sont enrichies selon un programme mis en place dans l'animalerie. L'isolement sera limité par le fait que nous utilisons des cages avec grilles, en portoir ouvert, proches les unes des autres. Ainsi, des interactions soaciales persitent, notamment à travers l'olfaction (essentielle), la vision et l'audition. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés avant chaque enregistrement. Les critères de poids, d’apparence physique et de comportement seront pris en compte dans ce suivi. Nous utilisons des seringues microfines pour éviter des nuisances liées aux injections quotidiennes. Les injections seront réalisées en amont des procédures d’implantation et d’enregistrement électroencéphalographique pour éviter d’interférer avec celles-ci (au moins deux heures avant).

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés dès 14 jours post-natal (groupe traité pharmacologiquement) car c'est le stade correspondant à la mise en place de la pathologie dans ce modèle. Les implantations seront effectuées à 26 jours post-natal pour démarrer les enregistrements à 1 mois qui correspond au stade pré-symptomatqiue de la maladie dans notre modèle. Les enregistrements seront effectués de manière longitudinale (1 fois/semaine) entre 1 et 3 mois post-natal, qui correspondent respectivement à la phase d’hyperactivité (phase critique réversible) et d'hypoactivité (phase irréversible) dans l’évolution de la maladie d’Alzheimer. La phase d'hyperactivité semble être une étape critique dans le développement de la maladie et son identification par enregistrements électro-encépaholographiques permettrait un diagnostic précoce chez l'homme.

2 344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie cérébrale d'une heure à une heure trente, d'autres reçoivent des injections répétées de cocaïne dans un test de préférence de place ou des injections intracérébrales par canule, avant le prélèvement de leur cerveau. Le projet étudie les synapses à dopamine impliquées dans la maladie de Parkinson, la dépendance et la schizophrénie. Le porteur affirme que ces dimensions ne sont pas modélisables in vitro ou in silico, tout en prévoyant de remplacer certaines validations par de la culture cellulaire.

Objectifs

Les neurones du cerveau communiquent entre eux grâce à des neurotransmetteurs au niveau de structures très petites appelées « les synapses ». Un de ces neurotransmetteurs est la dopamine. Les synapses qui libèrent de la dopamine sont impliquées dans le contrôle de nos mouvements et la sensation de « bien-être ». Elles sont affectées dans la maladie de Parkinson ainsi que dans les troubles psychiatriques comme la dépendance aux drogues et la schizophrénie. Il est donc très important de connaître cette synapse précisément afin de permettre le progrès des approches médicales à ces maladies graves. Le but de ce projet est donc d’étudier ces synapses au sein du système cérébral de la locomotion, de la récompense, et de la prise de décision (système nigrostrié et mésocorticolimbique). Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique, et/ou une approche de marquage viral. Nous utiliserons aussi une approche de manipulation pharmacologique par la cocaïne, ou une déficience en acides gras polyinsaturés de type n-3. Ces approches seront suivies de tri par fluorescence des synaptosomes, d’analyses par immuno-blot, immuno-fluorescence et spectrométrie de masse. Ces différentes approches permettront d’analyser l’impact de ces manipulations sur la structure moléculaire et la fonction de la synapse dopaminergique. Nous testerons également les processus de récompense en utilisant des tâches comportementales de conditionnement à la préférence de place. Lors de ce test la préférence de compartiment dans lesquelles des souris reçoivent une dose de cocaine ou une solution saline est analysé.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre le rôle de SynCAM 2 (molécule d’adhésion cellulaire synaptique 2) dans la formation et la maintenance des synapses dopaminergique, de comprendre quelles sont les altérations synaptiques induites par l’apprentissage conditionné par la cocaïne, et comment le statut cérébral en acides gras polyinsaturés influence la synapse dopaminergique. Ces données seront fondamentales d’un point de vue physiopathologique étant donné que : la dégénérescence des voies dopaminergiques est centrale dans la maladie de Parkinson, la plasticité des synapse striatales doit être comprise pour mieux appréhender les altérations induites par l’abus de drogues chez les patients dépendants, l’équilibre central en acides gras polyinsaturés n-3 est affecté dans les troubles psycho-affectifs. Nos données constitueront un socle de connaissances pour l’ensemble des laboratoires impliqués dans l’étude cellulaire et moléculaire de la physiopathologie du système dopaminergique central.

Procédures

Une partie des animaux subira des procédures chirurgicales (1 fois, durée de 1h à 1h30) afin d'exciser la protéine SynCAM 2, d’exprimer des protéines fluorescentes et ou de re-exprimer la protéine SynCAM 2. Une partie des animaux recevra une injection de solution saline intrapéritonéale par jour pendant 4 jours. Une partie des animaux subira quatre injections intrapéritonéales de cocaïne et/ou de solution saline. Deux injections par jour, une le matin et une le soir et sont placées à chaque fois dans une boite d’analyse de la préférence de place pendant 20 minutes. Une partie des animaux subira 2 injections intra-canules d'agents pharmacologiques. Une injection 30 minute avant chaque injection de cocaine du protocole CPP. Les injections intra-canules durent 10 minutes, 5 minutes d'injection et 5 minutes d'attente après injection pendant lesquelles l'injecteur est laissé en place pour permettre la diffusion des agents pharmacologiques. Les injections intra-péritonéales durent 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale peut causer une perte de poids ou une infection cutanée. Le régime alimentaire peut aussi impacter le poids de l’animal. Tous ces effets indésirables seront évités par le protocole de suivi mis en place et l’expertise de l’expérimentateur habitué à ces pratiques. Enfin une accoutumance et les effets de manque qui peuvent se produire suite aux injections de cocaïne seront évités par le sacrifice des animaux 24h après la dernière injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet, soit par dislocation après induction par isoflurane, soit par l'injection d’un euthanasiant (exagon) avec sédation préalable par méloxicam suivi d'une perfusion intracardiaque afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses protéomiques, biochimiques et histologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions non modélisables sur des modèles in-vitro ou in-silico. Nous remplacerons certaines validations par la mise en place culture cellulaire de neurones dopaminergiques.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum pour obtenir assez de matériel biologique ainsi que le nombre de répétitions indépendantes pour éliminer les biais expérimentaux a été déterminé par nos expériences précédentes ainsi que celles de nos collaborateurs. Basé sur nos précédentes études ce nombre est aussi suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes.Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de la plupart des animaux de la descendance et utiliseront les mâles et les femelles. Les animaux restants dont le génotype n’est pas directement utilisable seront utilisés en contrôle de fluorescence lors du tri de synaptosomes. Du fait de cette stratégie, la grande majorité des animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. D’autre part nous réduiront le nombre de souris qui passeront en chirurgie stéréotaxique par l’emploi de souris génétiquement modifiées exprimant déjà une fluorescence (VGLUT1venus). Enfin la mise en place de protocoles aseptiques de chirurgie nous a permis de réduire d’un facteur deux le nombre d’animaux utilisés lors de notre précédente étude.

Raffinement

Afin de minimiser la souffrance des animaux, les procédures suivantes sont mise en place: les animaux sont logés dans des cages communes (3 à 5 par cage de 612,5 cm2), pourvues de litière pour leur permettre de reproduire un comportement naturel de recherche de nourriture et d'un enrichissement composé d'un nid de plantes et de tube en carton pour leur permettre de ronger. Ces cages leur donnent beaucoup d'espace pour se tenir debout. Concernant la chirurgie stéréotaxique : L’ensemble de la chirurgie sera réalisée à deux opérateurs pour maintenir l’asepsie. Prévention de l'hypothermie : l'animal sera placé sur un tapis chauffant permettant d'ajuster la température du tapis en fonction de la température corporelle de l'animal (maintien à 37°C). Prévention de la déshydratation : administration d'une solution saline chaude et stérile à la fin de l'opération. Suivi, soins et hébergement, phase d'éveil: l'animal sera placé sur un tapis chaud dans une cage de récupération (~15min), avec accès à de l'eau et à de la nourriture humide, sous observation étroite pendant au moins 1h. Suivi postopératoire: l'état de santé des animaux sera évalué quotidiennement pendant au moins 2 jours (pesée, observations, évaluation des points limites) sur un formulaire de suivi individuel. Si des signes d'infection ou de saignement apparaissent au niveau du site chirurgical, la plaie sera nettoyée et un antiseptique local sera appliqué. L'administration d'un anti-inflammatoire non stéroïdien sera également systématiquement effectuée toutes les 24h après la chirurgie afin de garantir 48h de soins pour chaque souris après la chirurgie. Si nécessaire, la douleur sera soulagée par l'administration d'une injection de de ce même anti-inflammatoire 72h après la chirurgie. Pour limiter le stress des animaux lors de la procédure de perfusion les souris recevront une sédation par un anti-inflammatoire suivie 10 minutes plus tard de l'injection d'un euthanasiant. Après vérification de l'anestésie par pincement de la patte, les animaux seront perfusés en intracardiaque. Cette procédure sera effectuée par un personnel formé et compétent, ce qui garantira la précision et limitera le stress de l'animal avant la perte de conscience.

Choix des espèces

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles génétiquement modifiés disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations sur le cerveau mature

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie sous anesthésie pour injecter un produit dégradant un réseau de molécules cérébrales, un isolement individuel pendant toute l'étude, une contention en tube pour mesurer la composition corporelle et un test de glycémie, avant le prélèvement de leur cerveau. Le projet vise à comprendre le rôle de ce réseau dans l'obésité et le diabète, dans une perspective thérapeutique que le porteur renvoie au "plus long terme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal pour ces interactions complexes.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 sont des problèmes majeurs de santé publique. Le poids corporel d’un individu est fortement influencé par l’activité de différents neurones, qui agissent sur la prise alimentaire, le stockage de graisse, la dépense d’énergie et participent à la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang). Certains de ces neurones sont entourés d’un réseau de molécules qui forment comme un filet autour d’eux. Ce filet est appelé filet périneuronal (FPN), et participe à la fonction et la maturation des neurones qu’il enveloppe. Dans le contexte de l’obésité, le rôle de ce FPN est encore mal connu. Notre objectif dans cette étude est de dégrader le FPN dans une région cérébrale impliquée dans le contrôle du poids, de la prise alimentaire et de la régulation de la glycémie, afin d’en étudier les conséquences, en particulier en situation d’alimentation hypercalorique. Nous souhaitons notamment connaître le rôle joué par le FPN dans la susceptibilité à développer une obésité et à dérégler le contrôle glycémique. Pour ce faire, nous utiliserons au total 80 souris mâles et femelles, chez lesquelles nous injecterons un produit qui dégrade le FPN par neuro-chirurgie. Certaines de ces souris seront nourries avec une alimentation hypercalorique pour rongeur et comparées à celles qui resteront sous une alimentation standard. Nous mesurerons l’évolution du poids, de la prise alimentaire, de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre), ainsi que le contrôle glycémique. À la fin de l’étude, nous récupèrerons les cerveaux de ces souris pour des analyses in vitro complémentaires.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle du filet périneuronal dans le développement de l'obésité et du diabète de type II, en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements moléculaires associés au niveau cérébral. De plus, le FPN est présent aussi bien chez la souris que chez l’Homme, ce qui renforce la portée translationnelle de ces résultats. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de restauration du FPN, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. Tous les animaux de cette étude (80) sont concernés par l’ensemble des gestes suivants : 1) Analyse de la composition corporelle : cette analyse nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées de 3 semaines. 2) Neuro-chirurgie : cette technique est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 1 heure. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée durant toute l’étude. 3) Test de régulation de la glycémie : ce test nécessite de réaliser sur les souris une injection après un jeûne de 5 heures, puis de mesurer leur glycémie à 7 temps différents temps post-injection, par pélèvement d'une goutte de sang. Ce test est réalisé sur souris vigiles, avec un intervalle de temps d’au moins 15 minutes entre chaque mesure. Un seul test sera réalisé durant toute l’étude. 4) Hébergement : les souris de cette étude seront hébergées de manière individuelle, pour nous permettre de mesurer la prise alimentaire de chaque animal. L’isolement débutera dès l’arrivée des souris et jusqu’à la fin du projet.

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte. Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal. Afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Pour réduire au maximum le stress ressenti par les animaux, nous avons prévu une période d’habituation d’une semaine à l’expérimentateur. De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement ou de façon hebdomadaire, nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale. Au-delà de du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. Notre protocole d’analgésie le jour de la chirurgie et les jours suivants permet cependant une prise en charge efficace des douleurs post-opératoires liées à l’incision de la peau du crâne. Les animaux seront suivis quotidiennement la semaine suivant la chirurgie et toute aggravation de leur état fera l’objet d’une évaluation, avec des points limites précoces qui déclencheront une prise en charge analgésique supplémentaire et des points limites terminaux qui entraîneront la mise à mort immédiate de l’animal pour éviter toute souffrance inutile.

Devenir

À l’issue de l’unique procédure de cette étude, tous les animaux (80) seront mis à mort par une injection d’euthanasiant. Nous récupérerons par la suite leur cerveau, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les changements neuro-moléculaires associés à la dégradation du filet périneuronal.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre l’effet de la dégradation du filet périneuronal sur un ensemble de phénomènes, tels que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre tous ces acteurs. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différentes expériences sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique, qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 7 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une neuro-chirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 3 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de mofication de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le contrôle de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, le filet périneuronal est présent à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront à l’âge de 7 semaines dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.