Système nerveux
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IRM de diffusion dans des modèles murins de réactivité astrocytaire et de maladie de Huntington
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une partie subit une neurochirurgie stéréotaxique pour injecter un vecteur viral, puis toutes passent deux à trois examens d'IRM sous anesthésie d'une durée pouvant atteindre trois heures, sur des modèles de maladie de Huntington et de réactivité astrocytaire. Le porteur indique que les risques tiennent surtout à l'anesthésie et à la chirurgie, décès compris, et que les souris seront tuées pour prélever les tissus cérébraux. Il situe à long terme l'application à l'humain, l'objectif immédiat restant de valider une méthode d'analyse d'imagerie.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives sont des pathologies qui affectent progressivement la structure et/ou la fonction des cellules du système nerveux. Ces atteintes cellulaires irréversibles conduisent au dysfonctionnement voire à la mort des neurones et créent ainsi des désordres cognitifs, psychiatriques ou moteurs chez le patient. La recherche médicale se concentre sur la recherche de biomarqueurs permettant de prévenir l’évolution des maladies neurodégénératives. De par l’aspect non-invasif de la technique, la pertinence des informations anatomiques et biologiques recueillies ainsi que sa facilité d’utilisation relative, l’IRM (imagerie par résonance magnétique) de diffusion figure parmi les méthodes de choix pour déterminer la microstructure cellulaire et étudier la connectivité anatomique du cerveau. Le but général du projet est de développer des approches innovantes de modélisation de données d’IRM de diffusion, basées sur des simulations numériques et de l’intelligence artificielle, pour extraire différents paramètres décrivant la morphologie des cellules. Le projet aura notamment pour objectifs d’évaluer et valider les méthodes d’analyse IRM dans des modèles murins pour lesquels des altérations de la morphologie cellulaire sont attendues : un modèle de maladie de Huntington (pour lequel on attend essentiellement des altérations neuronales), et un modèle de réactivité des astrocytes, des cellules qui assurent notamment la protection des neurones .
Bénéfices attendus
A court terme, le projet permettra de mieux cerner la sensibilité de l’IRM de diffusion à des variations de morphologie cellulaire, et fournira des méthodes d’analyses pour mesurer de façon quantitative certains paramètres décrivant cette morphologie. A long terme, ces méthodes pourront être appliquées à l’Homme, ce qui offrira de nouveaux outils pour la compréhension et le diagnostic des maladies cérébrales.
Procédures
Certains animaux seront soumis à une neurochirurgie de haute précision (durée d’environ 30 minutes) pour injecter un vecteur viral permettant un transfert de gène. Les animaux seront soumis à deux ou trois examens IRM non-invasifs, réalisés sous anesthésie, d’une durée maximale de 3h, et espacés au minimum de deux semaines.
Impact sur les animaux
Pour le modèle Huntington : Ces souris présentent seulement des changements subtils de leurs capacités motrices et cognitives qui ne peuvent être mis en évidence qu’avec des tests très sensibles et adaptés. . Les seuls nuisances et effets indésirables prévus sont liés aux examens IRM (stress, risque de décès lors de l’anesthésie générale, possible douleur suite à l’utilisation de barres d’oreille). Pour le modèle murin d’astrocytes réactifs. Les seuls nuisances et effets indésirables prévus sont liés à la chirurgie stéréotaxique (stress, décès lors de la chirurgie, risque de douleur et complication de type infection à la suite de la chirurgie) et au protocole IRM (stress, risque de décès lors de l’anesthésie générale, possible douleur suite à l’utilisation de barres d’oreille).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus cérébraux pour analyse histologique.
Remplacement
Le recours à l’animal est nécessaire car aucun milieu de culture ou système synthétique ne permet aujourd’hui de reproduire de façon fidèle la complexité des cellules du cerveau, notamment la perméabilité des membranes cellulaires, la contribution vasculaire au signal IRM, ou la microstructure exacte du tissu cérébral.
Réduction
Les mesures IRM seront moyennées sur des groupes de 15 souris, nombre minimal permettant d’obtenir des données statistiquement fiables et exploitables, selon notre expérience et les pratiques habituelles.
Raffinement
- Les imageries IRM seront réalisés sous anesthésie générale et les douleurs seront minimisées par application d’anesthésique local. - Les souris seront anesthésiées lors des interventions de neurochirurgie, avec injection d’analgésique au point d’incision pour diminuer la douleur. Une injection sous-cutanée de sérum physiologique chaud sera réalisée pour réhydrater durant la chirurgie. La plaie fermée sera désinfectée. Après l'opération, une deuxième injection sera effectuée puis la douleur sera évaluée après 24h avec si besoin une troisième injection d’analgésique. - Les animaux seront hébergés en groupe, dans environnement à température contrôlée, avec des cycles diurne-nocturne de 12h. Eau et nourriture seront fournies à volonté. Les animaux seront examinés quotidiennement par les donneurs de soin, sous supervision permanente du vétérinaire du centre, également en charge du bien-être animal. L’environnement sera enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire. - Des procédures d’évaluation du bien-être et de la santé des animaux (points limites) seront mises en place afin de détecter au plus vite la dégradation éventuelle de l’état des animaux et d’agir en conséquence.
Choix des espèces
Les modèles murins sont pertinents car ils peuvent être observés in vivo par des scanner IRM à haute performance et ce, malgré la petite taille des cerveaux murins, tout en offrant une similarité suffisante avec le cerveau humain, en termes d’organisation générale et de diversité cellulaire. Les souris zQ175 hétérozygotes sont choisies comme modèle d’étude de la maladie de Huntington car elles miment le défaut génétique observé chez les patients atteints de la maladie. Elles constituent donc un modèle intéressant pour étudier la sensibilité d’une méthode d’IRM de diffusion à des altérations cellulaires, essentiellement neuronales, tout en offrant des perspectives pour la santé humaine, comme outil de suivi de la maladie de Huntington. Des données préliminaires prometteuses ont été obtenues chez ces souris, qui ont de plus l’avantage de ne pas être de phénotype dommageable. Le modèle de réactivité astrocytaire est choisi car il est connu pour causer une hypertrophie sélective des astrocytes, et constitue donc un modèle de choix pour ce projet visant à détecter des variations de morphologie cellulaire par IRM. Les souris étudiées seront des souris adultes de 3 à 12 mois (le projet ne portant pas sur le développement cérébral, et l’évolution de la morphologie cellulaire pouvant prendre du temps).
Effet d’un inhibiteur double des enkephalinases sur la depression corticale envahissante chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Ils subissent une ouverture du crâne et l'application d'un sel sur les méninges pour déclencher des ondes cérébrales associées à la migraine, avec enregistrement de l'activité électrique. Le porteur indique qu'aucun réveil n'est possible du fait de l'ouverture du crâne et des risques irréversibles. Il teste un inhibiteur d'enzymes comme piste contre la migraine, les retombées thérapeutiques restant renvoyées à des travaux futurs.
Objectifs
L'objectif est d'evaluer la faculté d'un inhibiteur de certaines enzymes ( en favorisant l'action des opioïdes endogènes) à diminuer les ondes d'inhibition électrique corticale déclenchées par application meningée de chlorure de potassium. Ces ondes d'inhibition corticale sont caractéristiques des évenements survenant lors dudéclenchement des crises de migraine et constitue dans la littérature un modèle de migraine reconnu. Le produit étudié ici a montré dans une étude récente son efficacité dans un autre modele de migraine chez le rat vigile mesurant l'hypersensibilité cutanée à la douleur induite par injection systémique d'un donneur de monoxyde d'azote.
Bénéfices attendus
Par ce projet nous escomptons apporter de nouvelles données significatives sur le potentiel antimigraineux de cet inhibiteur d'enzymes pouvant ( avec les travaux antérieurs et futurs) à terme deboucher sur un traitement efficace de cette pathologie
Procédures
Une procedure chirurgicale sous anesthésie ( isoflurane) sans reveil est appliquée par animal.
Impact sur les animaux
Aucun effet indesirable n'est envisagé sachant que les animaux seront sous anesthésie générale avec un monitoring des parametres physiologiques (tout au long de la chirurgie préparatrice et de l'enregistrement électrophysiologique) et mis à mort avant reveil.
Devenir
impossibilité de récuperer les animaux du fait de la craniotomie effectuée et des risques irreversibles (infectieux traumatiques) en cas de reveil.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il n'existe pas dans la littérature aucune methode alternative (in vitro ou in silico) pouvant répondre à l'efficacité d'un produit à potentiel thérapeutique antimigraineux. Un animal entier avec un système nerveux intégre , même sous anesthésie, est un préalable à une etude pertinente dans le domaine de la douleur. Une methode in vitro ne pourrait rendre compte de la douleur car elle supprimerait de nombreux parametres (regulations...) et rendrait le résultat réducteur voir inadapté. Les études in silico constituent dans le domaine de la migraine encore une étape encore trop primaire aujourd'hui.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Dans ce but, les animaux (rats adultes de la souche Sprague-Dawley) sont placés dans des cages enrichies (rouleaux permettant de se cacher) ce qui permet de réduire le stress des animaux tout le temps précédant la chiurugie et l'enregistrement électrophysiologique. Pendant six jours, ils serontacclimatés à l’animalerie. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. La chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, les animaux sont placés sur une couverture chauffante pendant tout le temps de la chirurgie et leur cornée est protégée par une couche de vaseline. Statistiques : le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. D’après les données du laboratoire nous observons un maximum de 20 % de rats qui doivent être écartés de l'étude.
Raffinement
La douleur de la chirurgie est contrôlée car elle s'effectue sous anesthésie générale avec un contrôle permanent (capteurs et alarmes dédiés) des paramètres physiologiques (ventilation , taux de O2 , CO2 , température, fréquence cardiaque et pression artérielle) Pendant l'enregsitrement électrophysiologique, la cornée est protégée par de la vaseline. Pour améliorer le bien-être des animaux avant la chirurgie, les cages (logées dans des salles de stabulation pour lesquelles la température 22°C +/- 2 et l'hygrométrie 55% +/- 5 sont monitorées) sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher. Ils beneficient de l'enrichissement social reglementaire en respectant la taille des cages et la surface disponible par animal prevues par la directive européenne 2010 ( 3 animaux par cage de 800 cm2).
Choix des espèces
La souche Sprague Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires . C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur.
Modification des effets du stress juvénile sur le comportement à l’âge adulte
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un stress subi en début de vie, elles reçoivent deux injections d'un vecteur viral dans le cerveau par chirurgie, une puce sous la peau, puis sont soumises à des tests dont une suspension par la queue de six minutes, avant d'être tuées pour analyse du cerveau. Le porteur décrit la suspension par la queue comme génératrice de stress et une douleur locale après l'opération. L'objectif est de comprendre comment un stress juvénile installe l'anxiété à l'âge adulte, avec l'espoir de cibles thérapeutiques.
Objectifs
Pendant la petite enfance, l'enfance et l'adolescence, l'expérience et l'environnement façonnent l'organisation des neurones qui forment la base de la perception et du comportement des adultes. Les circuits cérébraux s'adaptent en fonction des stimulations sensorielles, motrices et sociales pendant des périodes dites critiques. Un certain nombre de troubles neurodéveloppementaux, notamment les troubles du spectre autistique et la schizophrénie, sont connus pour être associés à des anomalies de ces voies cérébrales. Certains neurones du cerveau sont impliqués dans ces périodes critiques et participent à la consolidation des circuits. Un facteur de transcription est capté par ces neurones dans le cerveau, et cela de manière concomitante avec le début de la période critique. Des souris soumises à un stress juvénile précoce présentent des comportements de type « anxieux » à l'âge adulte. Chez ces souris, des changements d'expression de ce facteur dans le cerveau sont aussi observés. De manière générale, le but de ce projet est donc de savoir comment le stress juvénile affecte le cerveau et les troubles de l’humeur comme l’anxiété. Ce projet étudiera les changements du comportement lors de l'installation de l’anxiété chez les souris adultes ayant subi un stress postnatal. De cette façon nous pourrons identifier les mécanismes qui se mettent en place lors de périodes critiques. Ainsi, des souris naïves subiront un stress postnatal précoce. Nous réaliserons ensuite des injections avec un outil viral qui permettra de rapporter une molécule d’intérêt pour augmenter l’expression du facteur de transcription. Grâce à une batterie de tests comportementaux, nous étudierons le comportement anxieux de ces souris à l’âge adulte. Nous nous attendons à obtenir une réduction du comportement anxieux chez les souris ayant reçu les injections de l’outil viral. De plus, une modification dans le fonctionnement et le développement des neurones est attendue.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l'origine des symptômes liés à l'anxiété. Il fournira aussi de nouvelles cibles de traitement pour les troubles du développement du cerveau caractérisés par une maturation et un fonctionnement défectueux d'une population de neurones appelés les interneurones.
Procédures
Deux injections (une par hémisphère) seront réalisées dans le cerveau avec des outils viraux chez chaque souris au début de l'âge adulte. Le temps total de la procédure de chirurgie est d'environ 30 min (incluant 10/15 min d'injection). Implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes). Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. Un test comportemental étudiant le stress durera 6 minutes. Une injection de produits anesthésiques : durée moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Ce projet comprend des injections intracérébrales, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'injection. Lors du test étudiant le stress, les souris seront suspendues par la queue pendant 6 minutes, ce qui peut engendrer un stress.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
Nos recherches portent sur les effets du stress postnatal sur la plasticité du cerveau. Elles nécessitent des modèles animaux pour comprendre comment l'environnement juvénile affecte le comportement à l'âge adulte. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent du développement du cerveau de la naissance à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'étudier un système dans son ensemble, à cet égard la souris est un modèle pertinnent car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme.
Réduction
Des travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections intracérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales ainsi que des prérequis statistiques nous ont permis de démontrer qu'un nombre de 12 souris par condition expérimentale est nécessaire. Ceci nous permet d'obtenir une puissance statistique satisfaisante tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. En fonction de la répartition en cloche des données nous utiliserons un test statistique paramétrique ou non paramétrique pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux (stressée, contrôles et stressées + traitées avec un vecteur viral).
Raffinement
Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Toute la procédure chirugicale sera réalisée sous anesthésie. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les injections pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. En post-opératoire une solution d’une crème cicatrisante sera appliquée localement sur les plaies. Une surveillance du site d'injection après les injections et de l'état des animaux sera réalisée pour réagir à tout signe de souffrance La modification du comportement (posture voûtée, poil hirsute, lenteur des mouvements, rétrécissement orbitaire) sera traitée par analgésique en intrapéritonéale. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure.
Choix des espèces
La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'Homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la plasticité du cerveau et des effets du stress en début de vie. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines, en particulier dans le cadre de maladies neurologiques étant donné que la souris présente une organisation du système nerveaux proche de celle de l'Homme. Les animaux seront utilisés à l'adolescence. Des injections intracérébrales seront effectuées pour modifier l'effet du stress reçu lors de la période postnatale car à cet âge cette région du cerveau est encore plastique. Le comportement sera évalué à l'âge adulte, lorsque le phénotype anxieux se manifeste.
Etude de l’utililsation de molécules vasodilatatrices pour le traitement d’une neuropathie périphérique chimiquement induite à un stade chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de modéré à sévère. Elles reçoivent huit injections d'oxaliplatine, une chimiothérapie, sur huit semaines pour développer une douleur neuropathique chronique, évaluée par les tests de von Frey et de la plaque froide. Le porteur indique qu'aucun médicament ne permet de soulager cette douleur et que les souris sont donc tuées à la fin plutôt que traitées. Il teste des molécules vasodilatatrices dont l'effet observé jusqu'ici reste limité aux phases précoces de la maladie.
Objectifs
Les neuropathies périphériques chimiquement induites (NPCI) sont un effet secondaire de nombreux traitements de chimiothérapie. L’oxaliplatine, notamment employée pour traiter les cancers du côlon, engendre des douleurs neuropathiques chez près de 80% des patients. Il n’existe pas de traitement spécifique à ces douleurs, et faisant face à une qualité de vie réduite, les patients n’ont pas d’autre choix que de réduire ou d’arrêter le traitement anti-cancéreux. La chimiothérapie étant administrée par voie intraveineuse, nous émettons l’hypothèse d’une implication des vaisseaux sanguins dans ce processus pathologique. Pour étudier l’impact de la pathologie sur la composante vasculaire, nous avons développé un modèle murin de NPCI aigue. Il nous a permis d’identifier certains mécanismes vasculaires pouvant être impliqués dans la mise en place de la pathologie. Cependant chez l’Homme il existe une forme chronique avec des symptômes plus lourds. Nous souhaitons donc approfondir nos connaissances de la pathologie en développant un modèle murin de NPCI chronique. Nous aurons ainsi une idée plus précise des mécanismes impliqués aux différents stades de la maladie. De plus, nous posons l’hypothèse qu’un flux sanguin modifié pourrait participer aux symptômes des NPCI, au moins dans les premiers stades de la pathologie. Développer un modèle murin chronique nous permettra d’évaluer cette piste thérapeutique à plus long terme. Pour ce faire, nous administrons par voie intraveineuse l’oxaliplatine 1 fois par semaine et différentes molécules vasodilatatrices tous les jours ou tous les deux jours par voie orale sur une période de 8 semaines. Les symptômes neuropathiques sont évalués grâce aux tests comportementaux de Von Frey et de la plaque froide. A la fin des procédures, des études post mortem seront conduites pour évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués à partir des nerfs sciatiques des animaux.
Bénéfices attendus
Les neuropathies périphériques chimiquement induites sont un problème de santé publique majeur. Pour l’oxaliplatine, traitement majoritairement utilisé pour traiter les cancers du côlon, 80% des patients développeront des symptômes neuropathiques à la suite des cycles de chimiothérapie. Ces patients ont une qualité de vie réduite avec des symptômes douloureux qui peuvent devenir insupportables et conduisent alors à la réduction ou à l’arrêt du traitement anticancéreux. Avec ce projet, nous souhaitons approfondir notre compréhension des mécanismes menant au développement de la pathologie. Nous avons déjà identifié des facteurs pouvant être impliqués dans les stades précoces de la pathologie ; nous étudions notamment l’impact du flux sanguin sur l’apparition des symptômes neuropathiques. Nos données suggèrent que l’administration de molécules vasodilatatrices permet d’atténuer les symptômes neuropathiques dans une phase précoce. Nous souhaitons alors développer un modèle de neuropathie périphérique chronique, afin de déterminer si cette piste thérapeutique peut être envisagée à long terme pour prévenir, soulager ou retarder les symptômes neuropathiques. De plus, l’étude du modèle chronique pourra mettre en évidence des mécanismes cellulaires et moléculaires différents de ceux menant aux symptômes précoces et ainsi mieux définir l’étiologie de cette neuropathie. Le développement d’un tel modèle complètera ainsi notre compréhension des mécanismes pathologiques à différents stades et degrés de sévérité et permettra d’affiner les stratégies thérapeutiques pouvant être proposées chez l’Homme.
Procédures
Les animaux recevront 8 injections intraveineuses d’oxaliplatine ou de glucose pour les animaux du groupe contrôle au cours de 8 semaines. Ils seront éveillés pendant la procédure d’injection, maintenus dans un dispositif de contention laissant libre accès à leur queue, endroit de l’administration. Ces animaux pourront recevoir, tous les jours ou tous les deux jours, par voie orale, des molécules vasodilatatrices dans le but de réduire les symptômes neuropathiques induits par l’oxaliplatine. Leurs symptômes seront régulièrement évalués, deux fois par semaines, lors de tests comportementaux établissant leur sensibilité aux stimuli tactiles et froids. Selon les besoins expérimentaux, les animaux pourront faire l’objet d’une anesthésie profonde et d’une analgésie préalable à la perfusion intracardiaque et l’exsanguination. Certains animaux recevront également une injection intraveineuse de fluorescéine 15 minutes avant la procédure de perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les souris recevant une dose cumulée de 80 mg/kg d’oxaliplatine sur 8 semaines, nous pouvons nous attendre à une petite perte de poids de nos animaux. Les souris traitées à l’oxaliplatine développeront une neuropathie périphérique avec des sensations d’inconfort au niveau des pattes lors des tests comportementaux. Nous étudions cette pathologie car il n’y aucun moyen de traiter les symptômes neuropathiques chez les patients. Les souris ne pourront donc pas être soulagées avec des médicaments qui se sont avérés inefficaces. Leur comportement et douleurs potentielles seront suivis quotidiennement et une euthanasie éthique sera effectuée si un des points limite venait à être franchi.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chacune des procédures car nous prélevons les organes (cerveaux, nerfs sciatiques et peaux de pattes) à l’issue des procédures afin de conduire des études post mortem. De plus, nous ne pouvons pas laisser les animaux en vie en fin de procédure car l’administration d’oxaliplatine entraine une douleur neuropathique qui peut durer dans le temps chez certains animaux. Cette douleur ne pouvant être prise en charge par aucun médicament, nous euthanasions les animaux à la fin de la procédure pour leur éviter des souffrances inutiles.
Remplacement
Ce projet modélise une pathologie humaine, la neuropathie périphérique chimiquement induite à un stade chronique et l’effet d’une potentielle solution thérapeutique. Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres comportementaux et physiologiques ; il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé correspond au minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifique valide. Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques afin d'étudier les différences entre nos différents groupes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans un milieu enrichi en coton de nidification et avec un enrichissement de type dôme. Toutes les précautions sont prises afin d’assurer au mieux le bien-être de l’animal en réduisant au minimum leur stress lors des manipulations. Nous avons déterminé des critères d’arrêt précoce pour lesquels les animaux seront pris en charge et sortis des procédures. Pour ce faire, l’état général et le comportement des animaux seront suivis tout au long des procédures. Nous étudions une pathologie, la neuropathie périphérique induite par l’oxaliplatine car aucun traitement actuel ne permet de soulager les douleurs. Il sera donc impossible de soulager pharmaceutiquement un animal présentant ces symptômes. Tout animal présentant des signes de stress ou de douleur sera exclu de la procédure. Les signes à surveiller sont notamment les suivants : • Absence de toilettage • Changements dans la posture et la démarche • Absence d’interactions avec les congénères • Perte de poids supérieure à 25% du poids de l’animal avant le début des expérimentations • Refus de se faire manipuler, agressivité • Réponses anormalement importantes aux tests comportementaux Les animaux seront surveillés et pesés 3 fois par semaine. Si une anomalie venait à être détectée, un suivi quotidien des animaux sera mis en place les jours suivants jusqu’à un retour à un état normal. Si les signes cités ci-dessus ne sont pas atténués dans les deux jours suivant l’exclusion de l’animal, ce dernier sera euthanasié par élongation cervicale. D’après la littérature et notre retour d’expérience, les souris se comportent normalement et il est rare de devoir exclure et euthanasier un animal.
Choix des espèces
Nos données préliminaires concernant le rôle du système vasculaire intra-nerveux dans le développement d’une neuropathie périphérique induite par l’oxaliplatine à un stade aigu ont été obtenues sur un modèle murin de cette pathologie. Ces premiers résultats suggèrent un lien entre la vasoconstriction et les premières étapes de la maladie puisque l’administration de molécules vasodilatatrices semble atténuer les symptômes neuropathiques. Nous souhaitons maintenant étudier la pathologie à plus long terme, pour comprendre les mécanismes impliqués et évaluer l’efficacité de cette piste thérapeutique à un stade chronique. Ces études seront à la fois comportementales mais également cellulaires et moléculaires en post-mortem. Il n’est donc pas possible d’étudier les interactions entre les systèmes vasculaires et nerveux en utilisant des cultures cellulaires. Cette étude doit être réalisée in vivo et requiert le recours à des animaux vivants. La neuropathie périphérique chimiquement induite est un effet secondaire de nombreux traitement anti-cancéreux. C’est donc une pathologie qui touche majoritairement les adultes. Nous travaillons alors chez la souris adulte, âgée entre de 3 et 6 mois.
Etude comportementale d’un modèle de neuro-inflammation périnatale chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Une inflammation cérébrale est provoquée chez le raton entre le premier et le cinquième jour de vie, puis les animaux passent à l'adolescence une série de tests comportementaux, activité spontanée, activité locomotrice et mémoire de travail, avant d'être tués pour prélever le cerveau. Le porteur présente l'isolement de deux heures comme "indispensable" pour mesurer l'activité de chaque individu. Le modèle reproduit les lésions cérébrales du grand prématuré, avec l'espoir de tester à terme des thérapies cellulaires.
Objectifs
Lorsque le cerveau est en développement et qu'il subit un stress inflammatoire des lésions peuvent apparaître. Cela peut être délétère pour son développement. La conception de thérapies est donc une priorité. Chez le rat, l’injection d’une protéine entre les jours 1 et 5 induit une inflammation du cerveau à un stade du développement cérébral correspondant au 3° trimestre de grossesse chez l’homme. Le modèle constitue donc un outil efficace de compréhension des processus inflammatoires affectant le cerveau du prématuré et permet d’évaluer de nouvelles stratégies protectrices. Ce modèle a été mis au point dans le cadre d’une collaboration par un autre établissement utilisateur. Dans ce projet nous allons caractériser le comportement des ratons à l’adolescence. Nous étudierons l’activité spontanée des animaux, leur activité locomotrice ainsi que leur mémoire de travail. L’objectif sera de déterminer l’impact des lésions cérébrales sur le comportement des rats. A la fin de ce projet les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir analyser leurs cerveaux en IRM.
Bénéfices attendus
La prématurité est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Les lésions cérébrales sont majoritairement la conséquence de la présence d’une inflammation, qui peut être induite par différentes causes, par exemple une infection, pendant la fin de la grossesse et dans les jours suivant la naissance. Ce stress inflammatoire périnatal, subi par une grande majorité des enfants prématurés, atteint les cellules cérébrales qui sont encore en développement, et donc particulièrement vulnérables. Les lésions cérébrales induisent des handicaps moteurs, des déficits cognitifs et des troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte. Malheureusement, aucune thérapie spécifique de ces lésions n’existe à ce jour. L’amélioration du pronostic de cette pathologie repose donc sur la découverte de nouvelles stratégies. Ce projet vise à tester les effets potentiellement thérapeutiques des cellules capables d’agir sur la réparation et la régénération des tissus, dans les lésions cérébrales induites par la neuro-inflammation. Pour cela, nous utiliserons un modèle de neuro-inflammation chez le raton. Ce modèle reproduit la pathologie humaine de l’enfant prématuré. Nous pourrons ensuite dans ce projet tester l’effet d’administration des cellules sur le comportement des animaux. Cela permettra à long terme d’améliorer les futures thérapies pour ces lésions cérébrales.
Procédures
Les tests comportementaux auront les durées suivantes : -Activité spontanée des animaux durée du test : 2h - Activité locomotrice durée du test : 30 minutes - Test de la mémoire de travail : 5 minutes Les animaux seront anesthésiés avec des anesthésiques (durée de l’injection moins d’une minute) avant d’être perfusés par voie intracardiaque avec une solution tampon afin de prélever leurs cerveaux pour réaliser des analyses IRM (durée 30 minutes).
Impact sur les animaux
Pour connaitre l’activité spontanée des animaux, ils seront isolés pour une période de 2h. Cet isolement permet de connaitre la valeur de chaque individu et est indispensable pour pouvoir conclure sur ce paramètre.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses IRM.
Remplacement
Le remplacement total des analyses in vivo par des stratégies in vitro n’est pas envisageable actuellement, car les mécanismes impliqués dans les lésions cérébrales mettent en jeu l’interaction de plusieurs types cellulaires au cours du développement cérébral qu’il est impossible de reproduire en culture. Il est donc indispensable d’associer, aux études in vitro, des études chez l’animal soumis à un stress inflammatoire qui reproduit ces lésions.
Réduction
Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 15 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. En fonction de la répartition des données nous utiliserons un test statistique paramétrique ou non paramétrique pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (Lésions cérébrales, contrôles, Lésions cérébrales+ traitement) : activité exploratoire, locomotrice, mémorisation.
Raffinement
Afin de réduire l'inconfort des animaux et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupération, d’au minimum une semaine, entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Au vu de la littérature, le rat est une espèce très utilisée pour la réalisation des modèles de neuro-inflammation et de lésions cérébrales. L’étude au sein de laquelle ce projet est intégré regroupe par ailleurs d’autres modèles animaux (2 modèles chez le rongeur et deux modèles chez le mouton). L’inflammation du cerveau sera induite chez le raton entre le jour 1 et le jour 5, stade correspondant au 3ème trimestre de grossesse chez l’homme, soit la période de naissance prématurée. Les animaux seront ensuite testés autour du 40 ème jour de vie afin d’analyser les effets comportementaux des lésions et les effets du traitement.
Etude des effets d’un édulcorant diffusé dans le cerveau sur le métabolisme glucidique et la prise alimentaire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
29 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie pour implanter une mini-pompe qui diffuse un édulcorant directement dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins répétés sur animal vigile lors de tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur signale une perte de poids après l'opération et prévoit la mise à mort de tout animal perdant plus de 10 % de son poids. L'objectif reste de comprendre pourquoi les édulcorants dérèglent le métabolisme du glucose, sans application thérapeutique annoncée.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont l’une des principales causes de décès des personnes atteintes de diabète de type 2 ou d’obésité. Plusieurs études scientifiques ont montré un lien de cause à effet entre l’apparition de ces pathologies et la consommation excessive de sucre. C’est pourquoi, l’utilisation de substituts de sucre, les édulcorants (sucres non nutritifs : SNNs) est en augmentation. L’utilisation de ces édulcorants tout en remplaçant la saveur sucrée n’entraine pas d’augmentation de la glycémie à court terme. Cependant, consommés régulièrement, les substituts de sucres non nutritifs (SNNs) peuvent provoquer une augmentation de la prise alimentaire et une augmentation de la glycémie. Il a été montré que la consommation de SNN sur une courte période pouvait diminuer la sensibilité à l’insuline en réponse à un test de tolérance au glucose réalisé chez des sujets sains. Ces dysfonctionnements métaboliques seraient dus aux récepteurs au goût sucré qui lient ces SNNs. Ces récepteurs sont retrouvés sur la langue mais aussi dans tout l’organisme et en particulier dans le cerveau, au niveau de l’hypothalamus. L’objectif de ce projet sera d’étudier l’effet (les effets) d’un édulcorant à long terme sur la (les) réponse(s) de l’hypothalamus, en particulier de déterminer si les SNNs diffusés dans le cerveau induisent une augmentation de la glycémie, augmentent l’expression des récepteurs liant les SNNs dans l’hypothalamus et si l’hypothalamus joue un rôle primaire ou secondaire dans la commande qui entraîne le contrôle nerveux de la sécrétion d’insuline et la prise alimentaire. Un ensemble de marqueurs sanguins pouvant également affecter la réactivité des vaisseaux sanguins sera dosé. Ce projet sera réalisé chez 29 rats.
Bénéfices attendus
Ces expérimentations nous permettront de mieux comprendre pourquoi et comment la consommation d’édulcorants entraine un dysfonctionnement du métabolisme du glucose et quel est le rôle de l’hypothalamus.
Procédures
Les 29 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse en présence d’analgésique et d’antiinflammatoire. Cette chirurgie devrait durer ½ heure par animal. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles sont prévus : 5 fois 55 à 105 µl durant deux heures pour le test de tolérance au glucose pour les 29 rats, quatre jours plus tard, 5 fois 5 µl durant deux heures pour le test de sensibilité à l’insuline pour 20 rats, 5 fois 55 à 105 µl pendant 10 minutes à la fin de la procédure 2.
Impact sur les animaux
Les 29 rats subiront des chirurgies. Des injections ainsi que des prélèvements de sang sur animaux vigiles sont prévus. L’effet indésirable attendu est la perte de poids après chirurgie : c’est pourquoi les rats seront observés quotidiennement, pesés tous les 2 jours après la chirurgie et la consommation de nourriture et de boisson mesurées tous les deux jours. L’état général des animaux sera examiné minutieusement (poids, posture, comportement, cicatrisation, état de la plaie). Dans le cas de signes de douleur (posture, mobilité) le traitement analgésique pourra être prolongé et le début des tests retardés. Si un animal présentait une perte de poids persistante pendant plus de deux jours (10% du poids initial), il sera écarté de l’étude et mis à mort (par inhalation progressive de CO2) si son état ne s’améliorait pas.
Devenir
Les 29 rats ayant subi une chirurgie pour la mise en place d’une mini pompe osmotique ne pourront être utilisés dans un autre projet. C’est pourquoi ils seront tous mis à mort.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez le rat, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
Les procédures concernant l’installation du modèle expérimental et les prises de mesures ont été optimisées et standardisées. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier les différences significatives entre les groupes expérimentaux ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Les analyses simultanées des groupes expérimentaux seront réalisées par. Les conditions d’application des analyses seront vérifiées (seront réalisés selon ces conditions. Des études précédentes ont servi à définir le nombre d’animaux par groupe. Les expériences à mener imposent de tester différentes doses d’édulcorants. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet, la dose la plus faible sera étudiée en premier. Si celle-ci s’avérait suffisante pour induire une hyperglycémie(différence significative par rapport au lot contrôle), les autres concentrations ne seront pas testées.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h inversé. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à bâtonnet de bois et rouleaux de carton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent le bien-être des animaux. Le personnel a été formé et maîtrise tous les actes à réaliser. Le travail avec les animaux s’effectue en conditions calmes et maitrisées. Les chirurgies seront réalisées par des personnes compétentes sous anesthésie générale gazeuse. Du matériel stérilisé sera utilisé. Un traitement analgésique et antiinflammatoire sera donné en pré-opératoire, ce qui réduit la douleur post-opératoire. Une injection d’anesthésique local sous cutanée sera réalisée avant incision. Un traitement analgésique et antiinflammatoire post-chirurgical sera donné pendant 2 jours après chirurgie. La chirurgie sera réalisée en maintenant la température corporelle (tapis chauffant). Un gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement des yeux pendant l’opération. Le champ opératoire sera filmé avec un microscope et l’opération sera suivie sur un écran afin d’augmenter la précision des gestes chirurgicaux. Des lampes froides seront utilisées pour éclairer le champ opératoire. Une injection dans la cavité abdominale de liquide physiologique réchauffé sera donnée en fin d’opération pour réhydrater les animaux et favoriser l’élimination des toxines. Après opération, les animaux seront allongés dans des cages de réveil chauffées puis transférés dans leur cage individuelle standard avec enrichissement du milieu (rouleau de carton et bâtonnet de bois). Des croquettes humides seront disposées sur la litière. Habituellement, cette chirurgie n’entraine pas de mortalité postopératoire et montre un retour au poids normal après 2 jours. Une surveillance particulière quotidienne (2x par jour, avec inspection approfondie) sera faite pour s’assurer du bien-être de chaque individu.
Choix des espèces
Le rat est une espèce très étudiée par la communauté scientifique, la bibliographie est abondante nous apportant des données d’intérêt dans notre projet, et permettant ainsi la réduction du nombre d’animaux utilisés. Les expériences seront réalisées sur des rats jeunes adultes, âgés de 8 semaines lors de la chirurgie, cet âge correspond aux coordonnées fournies par l’atlas stéréotaxique du rat, et de 12 semaines à la fin des tests ce qui nous permettra de comparer ces résultats à ceux des rats ayant consommés les édulcorants par voie orale que nous avons obtenus dans un autre projet.
Internalisation des fonctions hippocampiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 598 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles subissent jusqu'à deux chirurgies crâniennes, une fixation de la tête pendant l'exploration d'un environnement virtuel sous privation d'eau, des injections d'oxytocine dès la naissance et un test d'anxiété en arène ouverte, pour étudier comment se forment les séquences neuronales de l'hippocampe au cours du développement. Une partie des souris porte une mutation reproduisant l'autisme, avec une surmortalité et une anxiété accrue décrites par le porteur. Sur le remplacement, il affirme que ces mécanismes ne peuvent s'étudier hors de "l'organisme entier" et conclut que la souris est "indispensable", les retombées pour l'autisme et Alzheimer restant renvoyées au conditionnel.
Objectifs
Au cours du développement, les neurones se connectent en réseaux locaux et à grande échelle pour produire notre cerveau fonctionnel capable d'acquérir des connaissances et de guider le comportement. La manière dont ces fonctions et les réseaux neuronaux sous-jacents émergent au cours du développement reste mal comprise. Cette information est essentielle non seulement pour comprendre le développement du cerveau mais aussi les maladies associées au developpement telles que l'autisme ainsi que la maladie d’Alzheimer. Dans ce projet, nous proposons d'aborder ces questions chez les rongeurs en développement. L'hippocampe est une partie du cerveau clé impliquée dans la mémoire, la planification et l'imagination chez les humains et la navigation spatiale chez les rongeurs. Ces processus reposent sur la capacité de former des représentations. Les neurones de l'hippocampe (appelées cellules de lieu) déchargent séquentiellement en présence d'informations sensorielles externes pendant l'exploration spatiale. Cependant, l'activation séquentielle des neurones hippocampiques peut également être observée lorsque les entrées externes sont réduites au minimum (lorsque nous dormons par exemple). Ces observations suggèrent que les séquences hippocampiques ne résultent pas simplement des indices sensoriels externes rencontrés séquentiellement au cours de l'exploration, mais pourraient remplir des fonctions supplémentaires dans la formation de la mémoire et la planification. Dans ce projet, nos objectifs sont de 1) comprendre comment ces séquences générées de façon interne émergent au cours du développement, 2) quels mécanismes sous-tendent leur maturation et 3) d'étudier comment ils sont affectés dans les troubles du spectre autistique et la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
L'étude proposée aura un impact majeur dans le domaine des neurosciences du développement. L'hypothèse dominante est que, au début du développement, l'activité spontanée est principalement générée en interne, suivie d'un raffinement dépendant des sens. Pendant longtemps, cette hypothèse a dominé le domaine du développement de l'hippocampe. Le projet actuel, qui implique des explorations chez des animaux en comportement, vise à réviser ce concept influent et classique en proposant un modèle très différent, dans lequel les formes précoces de l'activité hippocampique et ses fonctions de mémoire élémentaires sont principalement contrôlées par des entrées sensorielles externes, tandis que les modèles internes, impliqués dans les souvenirs durables, sont retardés au cours du développement. S'il est prouvé, ce concept aura également un impact majeur dans le domaine du développement cognitif en fournissant une compréhension mécanistique de l'amnésie infantile, qui reste l'un des phénomènes les moins bien compris. Ce projet apportera également une contribution majeure à la compréhension mécaniste des déficits cognitifs chez les patients autistes et pourrait ouvrir de nouvelles voies pour trouver un traitement contre l'autisme. Ce nouveau concept pourra également permettre de réinterpréter les données obtenues dans d’autre troubles du neurodéveloppement. Nous prévoyons de diffuser les connaissances acquises grâce à cette subvention lors de la "Fête de la science", de la semaine de sensibilisation au cerveau dans les écoles et de la nuit des chercheurs européens. Les résultats seront communiqués à plusieurs associations nationales et internationales de malades atteints de troubles du spectre autistiques et de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Procédures chirurgicales : 2 par animal une longue ne devant pas excéder 3h une courte ne devant pas excéder 1h. Tâche d'orientation et de mémoire spatiale: entrainements de 5 mn 4 fois par jours pendant 5 jours. Test d'anxiété: exploration d'une arène ouverte une fois pendant 10 mn. Injection d'oxytocine: 1 injection en sous cutané une fois pas jours pendant 7 jours à partir du premier jours de vie post-natale. Gavage : 1 fois pas animal.
Impact sur les animaux
Les expériences au cours du développement seront réalisées au cours de la troisième semaine de vie postnatale, avant et après le sevrage. Les animaux seront séparés de leur mère et de leur fratrie pendant la durée des entrainements/enregistrements ce qui peut engendrer un stress même si à ce stade les animaux commencent à sortir du nid pour explorer spontanément leur environnement. Entre deux entrainements/enregistrements les animaux seront remis dans leur cage en présence de leur mère et de leur fratrie jusqu’au sevrage. Ces enregistrements nécessitent une chirurgie qui entraine un stress physiologique atténué par les procédures d’analgésie et soins pré et post-opératoire. Une perte de poids peut être observée post-chirurgie diminuée par des mesures spécifiques détaillées plus bas. Le modèle de neurodéveloppement avec troubles du spectre autistique que nous utilisons (souris mutante pour le gène Magel 2) présentent une sur létalité post-natale liée à un déficit de succion, une hypotonie généralisée, une perte de poids dans les premiers jours de vie puis une hyperphagie, un déficit de comportements sociaux et une anxiété accrue. L’immobilité forcée peut être perçue comme un événement stressant si elle n’est pas mise en place de façon adéquate. De plus s’ils ne sont pas habitués à cette procédure, les animaux peuvent se débattre et se blesser. Pour éviter tout désagrément, les souris sont habituées progressivement à cette condition. De plus, l’apport de récompense hydrique permet d’associer cette situation à un renforcement positif pour l’animal. De plus la possibilité de courir sur la roue limite l’impression d’immobilité forcée et le stress associé. Tout signe de stress, caractérisé par une rigidité des membres, une posture arrondie du dos, une réaction anormale aux stimuli environnementaux (sursauts) ou de vocalisations, induira l’interruption de la procédure et le retour une étape antérieure d’habituation. Certaines souris peuvent présenter des complications post-opératoire (inflammation, infection) diminuée par injection d'anti-inflamatoires et d'antibiotiques si besoin. Chez l’adulte une privation hydrique est instaurée pour motiver les animaux à explorer l’environnement virtuel. Les animaux sont tête fixée ce qui peut être une source de stress même si ils peuvent courir sur une roue et voient défiler une environnement virtuel leur donnant une impression de déplacement.
Devenir
Pour les animaux enregistrés le cerveau doit être fixé par perfusion intracardiaque sous anesthésie générale/ analgésie pour vérifié la localisation correcte des électrodes. Pour les animaux utilisés pour le comportement ils seront mis à mort car aucun système ne permet leur adoption.
Remplacement
Nos expériences visent à identifier les circuits neuronaux qui permettent à un animal d’acquérir des connaissances sur son environnement et de les utiliser afin de se déplacer efficacement dans son environnement. Il n'existe pas aujourd’hui de méthode de substitution in vitro ou en culture cellulaire pour étudier les activités neuronales du réseau hippocampique en situation de comportement où les informations externes et internes sont impliquées. De plus, les enjeux propres de ce projet ne peuvent pas être envisagés hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, ces connaissances fondamentales ne pouvant pas être transposées sur des modèles ex-vivo ou organoïdes, le remplacement d’êtres vivants n’est donc pas possible. De plus, nous privilégions les rongeurs plutôt que des humains, car 1) les méthodes d’investigation des corrélats neurophysiologiques de l’espace sont souvent indirectes chez ces derniers (et purement indirectes chez l’individu sain) 2) les approches expérimentales actuelles chez l’humain ne sont pas compatibles avec des études causales 3) les études développementales des corrélats neurophysiologiques de l’espace sur individu sain n’est pas envisageable chez l’enfant humain du fait des très fortes contraintes éthiques et techniques. Les activités neuronales des patients souffrant de troubles du spectre autistique avec une mutation du gène Magel2 ne peuvent être recueillies chez l’humain du fait de l’absence de phénotype épileptique lié à cette mutation et du principe de non-malfaisance envers ces patients. Enfin, le modèle rongeur nous paraît approprié car les corrélats neurobiologiques de l’espace identifiés chez celui-ci l’ont aussi été chez l’humain. Ce parallélisme suggère que les rongeurs sont un modèle pertinent pour identifier la façon dont les réseaux neuronaux codent la position spatiale et encodent nos souvenirs. Or, la connaissance de ces mécanismes est aussi indispensable pour identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques, notamment dans la maladie d’Alzheimer qui affecte en premier les régions cérébrales essentielles dans la navigation spatiale et la mémoire des évènements de la vie. L’emploi de souris comme modèle d’étude des processus d’internalisation est une méthode pertinente dans l’étude de certains déficits connus, notamment sociaux, chez les personnes souffrant de troubles du spectre autistique.
Réduction
Pour comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux hippocampiques dans des tâches de navigation, il est essentiel de pouvoir enregistrer simultanément une grande population de neurones ou de les enregistrer sur une certaine durée ; le tout chez un animal effectuant une tâche de navigation spatiale. Cet objectif est conditionné par le nombre de sites d’enregistrement (ou ‘canaux’) : plus il y a de canaux, plus grande sera la population neuronale enregistrée. Actuellement, nous utilisons soit des électrodes à 64 canaux (Neuronexus) de façon aiguë, juste avant les enregistrements, soit des enregsitrements en chronique. Ces techniques nous permettent alternativement d’enregistrer d’une part jusqu’à 200 neurones en aigu tout en effectuant plusieurs sessions d’enregistrement chez un animal. D’autre part, les enregistrements chroniques permettent de suivre une population neuronale dans le temps et au cours d’un apprentissage. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé est fortement diminué. Nos recherches concernant différents stades du développement, les animaux issus d’une même portée pourront donc être utilisés pour différentes étapes de procédures : les juvéniles non utilisés pour les études développementales seront utilisés plus tard dans le cadre d'études menées chez l'adulte. Pour les souris des portées de modèles autistiques ou de la maladie d'Alzheimer, les animaux présentant le génotype requis par l’étude constitueront la population cible ; les animaux ne présentant pas le génotype requis seront aussi étudiés en tant que contrôles de la population cible, réduisant le nombre de portées à produire dans le cadre de cette procédure. De même, les mâles et femelles seront étudiés dans le cadre des procédures TSA, aboutissant à une utilisation de l’ensemble des animaux de chaque portée. Enfin, les données obtenues au cours du projet seront mises à disposition de la communauté scientifique pour analyses complémentaires et utilisation dans des modèles computationnels.
Raffinement
Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Une attention particulière sera portée aux juvéniles cours des chirurgies pour réduire douleur et stress (anesthésie générale et locale, tapis chauffant, suivi strict post- chirurgie en particulier après leur réintroduction au sein de la portée). Les mères et leur juvéniles opérés ou non seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux et de papier permettant aux femelles de faire des nids. Les enregistrements auront lieu dans une salle chauffée pour éviter tout stress du au froid et isolée phonétiquement. Les juvéniles et adultes seront habitués aux expérimentateurs et aux salles/conditions d’expérimentation pendant de longues sessions d’habituation quotidiennes. De la nourriture humidifiée sera fournie en poste opératoire pour les juvéniles après sevrage et les adultes pour faciliter la reprise de poids. Les animaux seront pesés et observés quotidiennement et une échelle de Morton et Griffiths, 1985, Vet. Rec. 116 : 431-36 sera utilisée pour décider d'intervention nécessaire pour améliorer le bien-être des animaux en fonction des observations (mise en pause de l’expérimentation si signes de stress trop importants, analgésie générale ou locale si signes de douleur, administration d’anti-inflammatoires si signes d’inflammation, antibiotiques si signes d’infection, arrêt de la privation hydrique si perte de poids >20% du poids initial) ou déterminer le point limite au-delà duquel l'expérimentation sera interrompue le cas échéant.
Choix des espèces
Cette étude s’effectuera sur des souris. Le modèle murin permet de tirer des conclusions générales sur le fonctionnement de l’hippocampe et son rôle dans la cognition spatiale et plus largement la mémoire. Les cellules de lieu et les séquences internes ont été décrites dans de nombreuses espèces de mammifères, y compris chez l’homme. Le cycle de reproduction rapide de la souris permet de travailler facilement à différents stades de développement. De plus le développement de lignées transgénique nous permettra d’utiliser des outils indispensables pour l’identification des cellules enregistrées comme les stimulations optogénétiques et de travailler sur des modèles murins de troubles du neurodéveloppement avec troubles du spectre autistique.
Evaluation du potentiel thérapeutique des astrocytes dans les maladies psychiatriques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Elles sont soumises à un isolement social de cinquante jours pour modéliser la schizophrénie, à une injection de vecteurs viraux dans le cerveau et à une restriction d'eau de quinze jours, pour tester le rôle des astrocytes dans cette maladie. Le porteur décrit l'isolement social comme la nuisance "nécessaire" à l'apparition des symptômes. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort.
Objectifs
Le cerveau est constitué de neurones ainsi que d'un autre type cellulaire au moins aussi abondant appelé astrocyte. Alors que le rôle des neurones dans le fonctionnement cérébral est largement reconnu et étudié, le rôle des astrocytes et leurs interactions avec les neurones reste très largement méconnu. Néanmoins, les données récentes suggèrent qu’ils seraient aussi impliqués dans le contrôle des états comportementaux et des fonctions cognitives et dans certaines situations pathologiques. Nous avons montré que les astrocytes du cortex préfrontal regulent les niveaux extracellulaires de dopamine, malgré leur incapacité à produire ce neuromodulateur. Plusieurs maladies psychiatriques telles que la schizophrénie sont associées à une hypodopaminergie du cortex préfrontal, c’est à dire un déficit des niveaux de dopamine du cortex préfrontal. Le présent projet vise donc à évaluer la possibilité de corriger l'hypodopaminergie préfrontale en permettant la production de dopamine par les astrocytes. Nous chercherons également à déterminer si cette correction est suffisante pour restaurer la physiologie du cortex préfrontal ainsi que les fonctions cognitives qui y sont associées.
Bénéfices attendus
Le projet consistera à produire un modèle murin développemental de la schizophrénie par isolement social puis à déterminer les dysfonctionnements physiologiques et comportementaux associés à ce modèle. Une seconde phase consistera à corriger le manque de dopamine du cortex préfrontal de « souris schizoprene » par transfection de l'enzyme tyrosine hydroxylase dans les astrocytes du cortex préfrontal puis à déterminer les potentiels effets bénéfiques de ce traitement sur des paramètres électrophysiologiques et comportementaux déficitaires dans ce modèle. Ce projet permettra de tester si les astrocytes du cortex préfrontal peuvent être une cible thérapeutique de choix dans les traitements des maladies psychiatriques associées à un manque de dopamine préfrontale. Il apportera potentiellement la preuve de concept que le manque de dopamine et ses conséquences physiologiques et comportementales peuvent être corrigées par production astrocytaire de dopamine.
Procédures
Intervention chirurgicale d'injection intracerebrale de vecteurs AAV (Virus adéno-associé): la durée de la procédure est de 1 heure et elle n'est réalisée une seule fois par animal. Isolement social: la durée de la procédure est de 50 jours et elle n'est réalisée qu'une seule fois par animal. Restriction hydrique: la durée de la procédure est de 15 jours maximum et elle n'est réalisée qu'une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
L'isolement social pourra provoquer un inconfort dû au manque de stimulation de l'animal. Cette nuisance est necessaire au présent projet puisque c'est elle qui permet le développement des symptomes cognitifs permettant de modéliser la schizophrenie. Certains animaux seront soumis à une chirurgie pour l'injection intracerebrale de vecteurs viraux ce qui entrainera une douleur modérée post-opératoire. Certains test comportementaux necessiteront une restriction hydrique (pour motiver les animaux à utiliser les stratégies cognitives permettant l'obtention d'une récompense) ce qui entrainera une sensation de soif et donc un inconfort physiologique. Les souris seront cependant hydratée quotidiennement.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés pour réaliser: 1/ des expériences d’immunohistochimie permettant d'identifier les changements moléculaires liés à la schizophrenie, 2/ des expériences d'imagerie des monoamine, permettant de déterminer les déficits ou abbération dans les dynamiques de libérations de neuromodulateurs essentiels aux activités cérébrales, 3/des expériences d'électrophysiologie permettant d'évaluer les modifications physiologiques liées à la schizophrénie, 4/ des expériences comportementales permettant des tester les changements cognitifs associés à la schizophrénie.
Remplacement
Le remplacement du modèle animal n'est pas possible dans ce projet puisqu'il s'agit de tester le potentiel thérapeutique de la dopamine astrocytaire sur les paramètres physiologiques et comportementaux déficients dans la schizophrenie. Ces paramètres ne peuvent êtres mesurés in vitro.
Réduction
Afin d'optimiser de nombre de souris utilisé pour ce projet, plusieurs tests comportementaux seront effectués sur les mêmes souris. Enfin, sur chaque cerveau perfusé, plusieurs marquages immunohistochimiques seront réalisés. Nous avons par ailleurs effectué un test de puissance pour évaluer un nombre optimal d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux (l’approche statistique prévue, et les tests choisis sont indiquées au sein de chaque procédure expérimentale dans la rubrique "Indiquez le nombre de lots et le nombre d'animaux par lot, et les justifier").
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, l'environnement d'élevage de tous les animaux sera enrichi au minimum avec des cotons permettant de réaliser des nids et des bâtonnets de bois quand cela sera possible avec en plus des cachettes. Pour toute chirurgie, les animaux recevront les doses nécessaires d’anesthésiques, analgésiques et antalgiques en pré- et post-opératoire. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler des signes de douleur sur la base de la grille d'évaluation de la douleur. L’animal serait euthanasié par dislocation cervicale s’il présentait des signes évidents de douleur, c’est-à-dire le niveau 3 de la grille de score utilisée.
Choix des espèces
La souche utilisée dans ce projet d'étude est la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd'hui. De plus, elle présente une reproduction facile et une bonne stabilité malgré une reproduction par croisement consanguin. Elle a été ici choisie pour pouvoir comparer nos résultats avec ceux publiés dans la littérature. De plus, le fond génétique de cette espèce est celui qui a été utilisé pour créer les souris modifiées génétiquement que nous souhaitons utiliser dans ce projet. Nous utiliseront également la lignée Aldh1l1-GFP, qui exprime la GFP (Green Fluorescent Protein, une protéine qui, lorsqu’elle est exprimée dans les cellules, émet de la fluorescence verte qui rend les cellules visibles) spécifiquement dans les astrocytes et permettra donc d'en examiner les changements morphologiques. Les animaux seront utilisés entre 3 et 5 mois d'âge puisque la procédure permettant d'obtenir la modèle Scz par isolement social prévoit un isolement d'un minimum de 50 jours après le sevrage.
Rôle de la synthèse de novo des céramides hypothalamiques dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique par la résistine : implication d’une inflammation centrale et hépatique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies cérébrales, la pose d'une pompe pour des perfusions dans le cerveau et des tests de tolérance au glucose, une partie soumise à un régime gras, pour étudier une voie moléculaire liée au diabète de type 2. Elles sont hébergées seules et tuées par dislocation cervicale pour prélèvement des tissus. Le porteur qualifie de "besoin crucial" la recherche de nouvelles cibles et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les échanges entre organes.
Objectifs
L’obésité participe au développement de pathologies chroniques tel que le diabète de type 2 (DT2). Le DT2 se caractérise par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion et d’action de l’insuline. Au cours de l’obésité, une saturation de la capacité de stockage du tissu adipeux (TA) favorise une hyperlipidémie qui conduit à l’accumulation des acides gras en excès dans les tissus périphériques insulino-sensibles favorisant l’altération de leur fonctionnement. Cette lipotoxicité peut notamment être induite via la synthèse de dérivés lipidiques tels que les céramides : des médiateurs clés de l’insulino-résistance (IR) qui constitue le principal facteur de risque du DT2. Le traitement du DT2 est une priorité de santé publique mondiale, un certain nombre de médicaments antidiabétiques sont arrivés sur le marché mais ont échoués en raison de problèmes de toxicité. Nous avons un besoin crucial de nouveaux paradigmes pour développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Aussi, il est actuellement reconnu que l’hypothalamus joue un rôle crucial dans la régulation de la prise alimentaire et le contrôle de l’homéostasie glucidique via l’intégration de signaux métaboliques périphériques tels que la leptine et l’insuline. L'homéostasie glucidique est principalement contrôlée par la sécrétion d'insuline qui maintien la glycémie en favorisant le stockage du glucose en excès dans la circulation sanguine dans les tissus cibles insulino-sensibles. Il est également reconnu que l’expansion du TA au cours de l’obésité s’accompagne d’une altération de la sécrétion d’adipokines (molécules produites par le TA) notamment la résistine, une hormone connue pour son rôle causal dans le développement de l’IR et du DT2. La résistine agit au niveau de l’hypothalamus en promouvant l’IR et de la neuro-inflammation participant ainsi à la dérégulation de l’homéostasie glucidique. Compte tenu de l’implication de l’hypothalamus dans la pathogénèse du DT2, il est primordial de comprendre quels sont les mécanismes sous tendant des dysfonctionnements hypothalamiques induits par l’action de la résistine et comment ils précèdent et provoquent la survenue de l’IR et du DT2. Nous évaluerons l’implication potentielle de la synthèse de novo des céramides dans la médiation des effets insulino-résistants et inflammatoires de la résistine au niveau hypothalamique et leurs conséquences sur le contrôle de l’homéostasie glucidique.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l’implication de la synthèse de novo des céramides hypothalamiques dans l’inflammation hypothalamique et la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par la résistine. Cette étude vise à mettre en évidence la synthèse de novo des céramides comme nouvelle voie de signalisation participant à la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par l’action hypothalamique de la résistine en situation d'obésité. Cette voie de signalisation contribuerait ainsi à la dérégulation du contrôle hypothalamique de l’homéostasie glucidique induite par la résistine. Le rôle de la synthèse de novo des céramides a été clairement établit dans la lipotoxicité touchant les tissus périphériques. Des recherches préliminaires déjà effectuées au laboratoire laissent apparaitre un nouveau concept dans les dysfonctionnements moléculaires hypothalamiques qui impliquent une interaction entre une adipokine, la résistine, et la synthèse de novo des céramides. Ainsi, cibler la synthèse de novo des céramides au niveau central permettrait de prévenir l’insulino-résistance et l’inflammation hypothalamique et d’en éviter les répercussions néfastes sur l’homéostasie glucidique. Il apparait alors que comprendre plus en profondeur le rôle du métabolisme des céramides hypothalamique permettrait de générer de nouveaux inhibiteurs moléculaires ciblant la synthèse de novo des céramides ou ses dérivés pour prévenir les effets de l’obésité au niveau hypothalamique et ainsi éviter le développement du DT2.
Procédures
Les souris de toutes les procédures (P) subiront 2 chirurgies stéréotaxiques, sauf la moitié des souris de la P1 qui, après les 10j suivant l'injection de l'adénovirus, seront soumises à un régime riche en graisse : - Une 1ère chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) afin d'injecter les adénovirus dans le troisième ventricule. - Une 2ème chirurgie stéréotaxique (30 min/souris) 10j plus tard pour poser le système de pompe et de canule ALZET pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires (15j). Les souris de la P1 subiront, à la fin des 15j de perfusion ou de régime riche en graisse, un test de tolérance au glucose (GTT) (120 min). Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvement à la queue de sang afin de mesurer l’insulinémie. Les souris de la P2 subiront, à la fin des 15j de perfusion, un test de sensibilité à l’insuline (ITT) (120 min) ainsi qu’un GTT 2 jours après l’ITT. Pendant l’ITT, aux temps 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Pendant le GTT, aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvement à la queue de sang afin de mesurer l’insulinémie. Les souris de la P3 subiront, à la fin des 15j de perfusion, un test de tolérance au pyruvate (PyTT) (120 min) ainsi qu’un test de tolérance au glycérol (GyTT) (120 min) 2 jours après le PyTT. Pendant le PyTT et le GyTT, aux temps 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d’une goutte de sang afin de mesurer la glycémie (7x5µl de sang = 35µl). Les souris de la P4 subiront, en parallèle de la pose des pompes, l’implantation d’un cathéter intraveineux dans la jugulaire de chaque souris de la procédure dans le but de réaliser un clamp euglycémique hyperinsulinémique (2h) : prélèvement de sang toutes les 20min pendant 2h pour suivre la glycémie. Les souris de la P5 subiront, à la fin des 15 jours de perfusion, une mesure de l’activité nerveuse autonome au niveau de la branche thoracique du nerf vague et du tronc sympathique le long de l’artère carotide (20 min) grâce à une incision de la peau et de la couche musculaire.
Impact sur les animaux
Les procédures font intervenir des injections et perfusions stéréotaxiques, chirurgies qui peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux tels qu’une perte de poids, des troubles alimentaire, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crâne.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de collecter les tissus pour de réaliser des RTqPCR sur l'hypothalamus et le foie, des immunohistochimies sur coupes de cerveau, une analyse lipidomique de l'hypothalamus et estimer l'incorporation du glucose par les tissus insulino-sensibles.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscle, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l’organisme des besoins énergétiques. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions, c’est pour cela que l’utilisation de modèles animaux est encore nécessaire. Cependant, des données préliminaires ont été obtenues sur une culture cellulaire in vitro sur une lignée cellulaire neuronale hypothalamique murine adulte (mHypoA) afin de mettre en évidence l’implication du métabolisme des céramides dans l’inflammation et l’altération de la sensibilité à l’insuline chez ces modèles cellulaires, il nous reste à démontrer que cela est bien le cas in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux nous avons effectué un travail préliminaire qui nous a permis d’identifier l’enzyme SPT, première enzyme de la synthèse de novo des céramides comme étant impliqué dans la médiation des effets pro-inflammatoire et insulinorésistant de la résistine dans la lignée cellulaire neuronale hypothalamique murine adulte (mHypoA). Le nombre d’animaux a été calculé pour que le test statistique de Kruskal-Walllis puisse être fiable et robuste, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d’animaux le plus faible possible.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en cage individuelle puisqu’il est primordial pour notre étude de contrôler quotidiennement et individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (maison, nid, bâtons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Il est indispensable d'avoir un suivi personnalisé du poids corporel et de la prise alimentaire, en effet, si nous n'obtenons pas de résultats homogènes au sein d'un groupe expérimental lors de l'analyse d'un GTT ou d'une RTqPCR par exemple, nous remonterons l'historique de l'animal en comparant sa prise alimentaire et son poids corporel notamment afin de vérifier s'il a plus ou moins mangé/pris de poids qu'un autre individu du même groupe expérimental, ce qui permettra d'expliquer certaines différences. Bien que les procédures chirurgicales soient lourdes et douloureuses, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. En effet, les chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous Isoflurane accompagnée d'une injection de Lidocaïne au niveau de site de l'incision avant en tant qu'anesthésique local. Durant toute la procédure chirurgicale, les animaux reposent sur un tapis chauffant et reçoivent une injection de solution saline (NaCl 0,9%, 10ml/kg/h) en sous-cutanée pour prévenir leur déshydratation. Aussi, lors de la phase de réveil, les animaux, toujours sur un tapis chauffant, reçoive une injection intrapéritonéale de glucose 5% (2g/kg). De plus, en période post-opératoire, pour suivre l'antalgie, dès la fin des sutures, du Ketoprofene (2mg/kg) est injecté en sous-cutané, ainsi que le jour suivant l'opération. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux. Elle se compose de score et d'actions à réaliser selon le score. La grille de contrôle du poids est la suivante : normal : score = 0 ; perte de 5 à 10 % : score = 1 ; perte > 15 % : score =2. La grille de contrôle du comportement est la suivante : normal : score = 0 ; prostration, manque de toilettage : score = 1 ; hyperactivité lors de la manipulation, vocalisations sonores répétées : score = 2. Un score égal à 1 dans les deux grilles déclenche la sortie de l'animal de la procédure. Un score égal à 2 dans les deux grilles entraine la sortie de l'animal de la procédure et l'euthanasie si absence d'amélioration des scores.
Choix des espèces
Le modèle de souris est un outil complémentaire essentiel, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.
Les techniques d’embryologie réalisées sur des modèles génétiquement modifiés
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 12000
87 000 rongeurs, 75 000 souris et 12 000 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie tuée en fin de procédure et les femelles réimplantées avec succès transférées en élevage. Ils subissent vasectomies, réimplantations d'embryons et chirurgies sous anesthésie, avec prélèvements sanguins et injections, pour créer, congeler et régénérer des lignées génétiquement modifiées destinées à la communauté scientifique. Le porteur présente la cryoconservation et la fécondation in vitro comme des avancées réduisant le nombre d'individus utilisés. Il affirme que seul le recours à des "organismes entiers" vivants permet d'étudier les conséquences d'une modification génétique.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la création, la cryoconservation et la redérivation de lignées de rongeurs génétiquement modifiés pour le compte de la communauté scientifique. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche ou pour le développement de médicaments. À la vue du nombre croissant de modèles génétiquement modifiés, la cryoconservation de ceux-ci est devenue indispensable pour réduire le nombre d’animaux vivants utilisés pour une conservation du modèle génétique et sécuriser les lignées des éventuelles dérives génétiques, contaminations, catastrophe naturelle …
Bénéfices attendus
La création de lignées par réimplantation d’embryons permet l’obtention de modèles génétiquement modifiés ciblant un ou des gênes d’intérêt, modèle capital dans la compréhension des mécanismes physiologiques et physiopathologies des maladies, des médicaments et autres domaines de recherche. La cryoconservation des modèles génétiquement modifiés est devenue indispensable pour réduire le nombre d’animaux utilisés pour une conservation du modèle génétique et sécuriser les lignées des éventuelles dérives génétiques, contaminations, catastrophe naturelle… La redérivation de lignées génétiquement modifiées par réimplantation d’embryons permettra aux chercheurs d’avoir des animaux dont le statut sanitaire sera maitrisé et évitera ainsi tout éventuel impact du statut sanitaire sur l’expression du phénotype. Les résultats des essais réalisés sur cette lignée redérivée seront alors plus précis et limiteront donc le nombre d’animaux utilisés. La stimulation des femelles par traitement hormonal permet de synchroniser les individus et augmenter le nombre d’ovocytes collectés par femelle. Cette approche présente une avancée éthique considérable.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans le cadre de vasectomie ou de réimplantation d’embryons seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée de 20 minutes à 1 heure sous anesthésie générale. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Selon le besoin des projets, les animaux pourront être soumis à des injections intrapéritonales. Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions,aux injections de stimulations (72h max) et aux transferts entre les différentes zones. Douleur, stress et perte de poids dûs aux procédures chirurgicales et à la récupération post-opératoire (12h max).
Devenir
Les animaux sont transférés en zone d’élevage interne pour les femelles réimplantées avec succès. Tous les autres animaux sont mis à morts en fin de procédure expérimentale ou dans le cas d’atteinte d’un point limite.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne peut remplacer ce projet qui vise à fournir aux scientifiques les animaux qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. L’intérêt de disposer d’organismes vivants et entiers est de pouvoir observer ceci dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques.
Réduction
Basé sur nos données historiques, nous évaluons le nombre d’animaux requis pour répondre aux besoins des scientifiques. La technique de production d’embryons par Fécondation In Vitro pour les souris présente une avancée éthique considérable pour la réduction du nombre d’individus utilisés comparée à une technique d’accouplement naturel. La cryoconservation du potentiel génétique permet de réduire le nombre d’animaux requis pour la conservation ou la redérivation d’une lignée. La réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet repose sur : l'expertise de l’équipe embryologie et sa maitrise des procédures, les conditions expérimentales, le suivi des données techniques, l’observation de l’état clinique de l’animal afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle.
Raffinement
Le contrôle de la douleur est réalisé lors des procédures chirurgicales par une administration d’analgésique avant et après la chirurgie ainsi qu’en cas de besoin. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée après la chirurgie pour tous les animaux. La technique chirurgicale est régulièrement raffinée (dilacération plan musculaire vs incision …) afin de minimiser les nuisances liées à l’acte. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes Pour la stimulation hormonale, sont concernés que les animaux de 3 semaines minimum, dont la taille et le poids sont compatibles avec l’injection d’hormones, selon les recommandations éthiques en vigueur. Pour la vasectomie, sont concernés des animaux de 3 à 10 semaines. Pour la réimplantation d’embryons, sont concernés des animaux de 7 à 14 semaines
Imagerie et enregistrements simultanés dynamiques multi-sites lors de tâches cognitives chez un modèle murin précoce de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Ces souris transgéniques modèles d'Alzheimer subissent une chirurgie cérébrale de une à cinq heures, une restriction d'eau, puis des épreuves de mémoire dans un labyrinthe en T, une partie tête immobilisée sur une boule flottante en réalité virtuelle. Elles sont toutes tuées pour vérifier le placement des dispositifs d'enregistrement dans le cerveau. Le porteur renvoie au conditionnel les bénéfices d'un traitement par stimulation lumineuse, qu'il envisage à terme de recommander au plus grand nombre.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est la cause la plus fréquente de démence. La prise en charge des patients dès le stade précoce améliore grandement leur qualité de vie. La phase précoce se traduit chez les patients par des altérations de la flexibilité mentale et notamment de leur capacité à s’orienter dans un environnement. En effet, la navigation spatiale d’un individu peut être réalisée avec deux types de stratégies. La première est l’orientation à l’aide d’indices extérieurs nécessitant de la flexibilité et des choix dit « souples ». L’autre stratégie s'appuie davantage sur des habitudes motrices (ex : tourner à sa gauche) et conduit à des choix dit « rigides ». Les malades au stade précoce présentent des difficultés à utiliser la stratégie avec flexibilité. Ce projet propose d’examiner les altérations cérébrales accompagnant ces symptômes précoces sur un modèle animal. Tout d’abord, nous caractériserons les circuits cérébraux responsables des comportements « flexibles » et « rigides » lors de tâches mnésiques à l’aide d’outils d’imageries à très haute résolution. Puis, nous utiliserons des souris transgéniques, pour mimer la phase précoce de la MA et les testerons dans des tâches comportementales solicitant la flexibilité mentale : test d’association place-objet et d’orientation spatiale dans un labyrinthe en T. Le premier test consiste pour l’animal à mémoriser 2 objets selon leur nature et leur localisation. Le deuxième test consiste à explorer un labyrinthe en forme de T pour trouver des récompenses d’eau sucrée. L’animal choisira d’utiliser les repères spatiaux ou bien de tourner systématiquement vers un côté. Notre modèle murin préférera se tourner automatiquement. Par comparaison entre souris, nous révèlerons ainsi les réseaux neuronaux altérés dans la phase précoce de la MA. L’originalité de ce projet est la révélation de la communication en temps réel entre plusieurs zones du cerveau. Des dispositifs d’imageries ultra-innovants permettront de suivre des marqueurs moléculaires d’activité à différentes résolutions. Par ailleurs, nous testerons aussi un nouveau traitement qui semble très prometteur chez les patients : une stimulation visuelle oscillatoire d’une heure par jour, appelée vGENUS. Nous regarderons si ce traitement lumineux permet à nos souris d’apprendre mieux (comme chez les patients) et caractériserons les modifications sur les réseaux neuronaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux d’identifier et comprendre de nouveaux marqueurs précoces de la maladie d’Alzheimer. En comprenant les mécanismes d’action du nouveau traitement vGENUS sur un modèle animal, nous pourrions envisager d’optimiser son efficacité ou trouver des nouveaux traitements similaires et vérifier qu’il n’induit pas d’effet indésirable. Si aucun effet secondaire n’est révélé (comme il semblerait d’après les premières études), nous pourrons recommander ce traitement, d’une extrême simplicité, non invasif et peu onéreux, au plus grand nombre de patients possibles, dès que le diagnostic est réalisé, et idéalement au stade le plus précoce de la maladie, voir envisager de l’utiliser en préventif sur des sujets sains âgés, dès les premiers signes de dégradation de la mémoire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie de 1h à 4-5h selon la procédure sous anesthésie générale et analgésie pré- et post-opératoire. Les animaux auront un repos post-opératoire pendant quinze jours dans une cage individuelle avec du matériel de nidation (frisure en carton) et enrichissements (batônnets à ronger, tunnel). Puis, les animaux commenceront l’habituation à la manipulation et réaliseront deux tests comportementaux. Au cours de la procédure, les animaux pourront recevoir une stimulation lumineuse blanche, d’une 1h par jour le matin pendant 2 semaines, comme traitement potentiel contre les symptômes de la MA. Le premier test comportemental durera deux jours avec 1 à 2 sessions par jour de 10 minutes où l’animal doit explorer et mémoriser des objets. Puis, le deuxième test comportemental sera réalisé sur 3 semaines avec des sessions 10 à 30 minutes par jour pendant 5 jours ouvrés dans un labyrinthe en forme de T. Pour cette période de 3 semaines, les animaux seront habitués au préalable à boire sur 2 tranches horaires dans la journée : le matin, pour que les animaux recherchent de l’eau sucrée dans le labyrinthe, ainsi qu’en fin de journée. Une partie des animaux réaliseront ce test dans un espace virtuel dans lequel l’animal est maître de ses mouvements en se déplaçant sur une grosse boule flottante, tout en ayant la tête immobilisée pour réaliser les enregistrements optiques à très haute résolution. Les animaux sont pesés quotidiennement sur ces 3 semaines. Les mesures de l’activité cérébrale ont lieux sur les animaux vigiles pendant les tâches comportementales puis pendant le sommeil sur 4h. Les animaux seront câblés 24h/24h, 7 jours sur 7 à partir des tests comportementaux jusqu’à la fin de la procédure, 2 à 3 mois plus tard.
Impact sur les animaux
Les souris modèles de la maladie d’Alzheimer développent avec l’âge l’apparition de marqueurs moléculaires de la maladie et des déficits de mémoire comparable à ceux des patients. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et traitements analgésiques et anti-inflammatoires pré- et post-opératoires. Des points limites ont été établi permettant de soustraire l’animal à la souffrance. L’hébergement est réalisée en cage individuelle depuis la chirurgie jusqu’à la fin de la procédure. Les animaux auront un accès restreint à l’eau de boisson sur 2 plages horaires quotidiennes lors du test comportemental dans le labyrinthe en T. Une déshydratation modérée peut alors apparaître et avoir un impact sur la prise alimentaire (risque perte de poids limitée à 15% du poids initial). Une partie des animaux réaliseront ce test dans un espace virtuel avec la tête immobilisée nécessitant une habituation progressive renforcée. La stimulation visuelle utilisée comme traitement potentiel ne produit pas d’effets indésirables connus à ce jour chez le rongeur et pourrait être bénéfique pour l’animal en retardant l’apparition des premiers symptômes de la maladie.
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort à la fin de toutes les procédures pour vérification du placement dans les structures cibles du cerveau des systèmes de stimulation et d'enregistrement.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro (cellules, organes isolés) ou in sillico (par ordinateur). En effet, ce projet utilise une approche innovante d'imagerie à grande échelle, basée sur l'enregistrement simultané de plusieurs zones cérébrales en activité chez la souris. De plus, ce projet nécessite une observation comportementale lors d’épreuves de mémoire, ainsi qu’une prise de décision d’adaptation, de choix de stratégie, uniquement possible chez l’animal vivant et éveillé.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats fiables et robustes à l’issue de l’étude tout en tenant compte des variabilités entre individus, le nombre d’animaux utilisés a été déterminé statistiquement. Toujours dans l’idée de réduire au maximum, les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Un maximum d’enregistrements sera réalisé pendant l’éveil et le sommeil, afin d’obtenir le plus d’informations possible.
Raffinement
Les animaux seront hébergés seuls à la suite de la chirurgie et tout le long de la procédure. Toutefois, les souris garderont le contact visuel, auditif et olfactif avec leurs congénères dans la salle d’hébergement grâce à des cages transparentes et avec des grilles laissant passer les odeurs. L’isolement permet d’éviter que les animaux ne rongent, ne détériorent les implants ou les dispositifs d’enregistrement et ne se blessent. Des enrichissements (matériel de nidification, batônnet à ronget) sont placés dans la cage pour favoriser le bien-être animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et traitement anti-douleur pré- et post-opératoires. Des points limites ont été établis permettant de soustraire à l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris dans cette étude, car c’est l’espèce dans laquelle il existe le meilleur modèle animal de la phase précoce de la MA connu à ce jour. En effet, ces souris transgéniques choisies présentent la physiopathologie et des symptômes les plus proches des patients Alzheimer à ce stade précoce. Ces souris ont déjà été soigneusement caractérisées dans les tâches comportementales nécessitant de la flexibilité mentale et montrent des déficits de mémoire avant l’apparition des marqueurs moléculaires ou cellulaires tels que des plaques amyloides ou mort neuronale. Nous n’utiliserons que des animaux adultes à partir de l’âge de 3 mois avec des structures cérébrales mâtures. L’âge pourra être réajusté selon les résultats obtenus (5 ou 7 mois).
Etude des comportements socio-cognitifs chez le ouistiti (Callithrix jacchus)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
30 ouistitis vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés d'une étude à l'autre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des captures, des contentions, des séances d'IRM sous anesthésie et une biopsie de peau sous anesthésie, pour caractériser leurs capacités socio-cognitives et établir des corrélats cérébraux et génétiques. Le porteur classe les tests comportementaux, réactivité à l'humain et à la nouveauté, hors du champ des procédures réglementées, ne comptant comme telles que l'imagerie et la biopsie. Il affirme que le primate non-humain est "nécessaire" en neurosciences et que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
Ce projet vise à caractériser le phénotype des ouistitis hébergés dans notre établissement. Pour cela, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux. La plupart des tâches comportementales seront réalisées grâce à des dispositifs installés sur les cages d'hébergement. Ces tests ne sont pas considérés comme des procédures selon la définition de la Directive, car ils n'entraînent pas de stress/souffrance/angoisse supérieurs à ceux causés par l'introduction d'une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires. En parallèle de ces tests comportementaux, certains animaux pourront être amenés à être testés dans un dispositif en 3 dimensions ou dans un dispositif de réalité virtuelle, qui se situent en dehors de la zone d'hébergement et nécessitent donc une capture et un isolement des animaux. De plus, afin de caractériser au mieux nos animaux, nous pourrons être amenés à réaliser des imageries cérébrales anatomiques (IRM) sous anesthésie afin d'avoir un corrélat entre le comportement et les structures cérébrales. Pour compléter la caractérisation, nous réaliserons le génotypage des animaux étudiés grâce à une biopsie de peau, sous anesthésie.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux caractériser les capacités cognitives des ouistitis en captivité et d'établir des corrélats neuroanatomiques et génétiques avec ces capacités. Les observations des animaux dans leur groupe permettront de compléter cette caractérisation avec des informations sur l'organisation sociale des groupes.
Procédures
Les captures sont réalisées en quelques minutes.Si les animaux doivent être identifiés par rasage, la contention durera 5 minutes au maximum, environ une fois par mois (au maximum, en fonction de la visibilité de l'identification). Le transport dans les pièces de test durent entre 2 et 5 minutes. Chaque animal sera impliqué dans les tests comportements de réactivité à l’humain ou à la nouveauté sur la même période de temps, environ 5 fois/mois mais jamais dans la même journée. Ils resteront une heure au maximum dans les dispositifs. La procédure d’imagerie sera réalisée 2 fois (renouvelée une fois si les images recueillies ne sont pas correctement exploitables). Une session dure 3 heures environ (de la capture au réveil). L'isolement suivant le réveil dure environ 30 minutes. Une seule biopsie sera réalisée par animal (30 minutes d'anesthésie environ si réalisée en dehors d'une autre intervention).
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet les nuisances attendues seront liées - à la capture, le transport et l'isolement des animaux lors des tests dans les dispositifs extérieurs aux hébergements, - au stress lié à la présentation d'intrus/d'objets nouveaux, - au stress éventuel lié au retour dans le groupe, - à la capture et le rasage d'une petite partie de la queue ou du dos pour l'identification des animaux si cela s'avère nécessaire. - à la capture et l'anesthésie lors des biopsies de peau, - à des infections qui pourraient survenir suite à la biopsie, - à la capture et l'anesthésie et au retour dans le groupe pour les sessions d'IRM
Devenir
Les animaux seront gardés en vie pour poursuivre leur caractérisation comportementale et les observations pour déterminer les interactions sociales.
Remplacement
D’une manière générale le modèle primate non humain est nécessaire en neurosciences pour des raisons de proximité anatomiques, physiologiques et éthologiques avec l’Homme. Ce projet a pour objectif de caractériser les comportements socio-cognitifs chez le ouistiti, cette étude nécessite donc l'utilisation d'animaux en comportement, et ne peut pas être remplacé par une étude in silico ou par une étude comportementale chez l'Homme. L'utilisation d'animaux est donc indispensable.
Réduction
Des statistiques descriptives seront utilisées pour l'évaluation des comportements et pour calculer un score pour les tests de réactivité (comptages, pourcentages, moyennes et modes) et des comparaisons pourront être effectuées entre individus. Ces données pourront être utilisées comme données contrôle pour des études ultérieures. Le nombre d'animaux utilisés est estimé à N=30 sur 3 ans. Ce nombre correspond au nombre d'individus hébergés dans notre animalerie et du turn-over potentiel. Le projet vise à caractériser l'ensemble des individus de notre colonie.
Raffinement
Afin de réduire le stress lié à la manipulation des animaux, des visites préalables seront réalisées pour que les animaux s'habituent à l'expérimentateur. En ce qui concerne la capture, deux solutions sont possibles et seront choisies en fonction de la tolérance des individus au contact humain : soit ils seront capturés à la main ou au filet, soit ils seront conditionnés à entrer dans une boîte de transport. Les observations comportementales ne pourront être réalisées et correctement interprétées qu'à la condition que les animaux ne présentent pas un niveau de stress important. Si les animaux sont capturés à la main/au filet, de la gomme arabique leur sera systématiquement proposée immédiatement après la capture. Généralement, lors des premières captures, les animaux peuvent vocaliser (cris d'alerte/cackles) mais ce comportement peut être réduit en les plaçant dans l'obscurité (creux de la main), ou en leur proposant des friandises. Ce comportement indicateur de stress disparaît en général lors des captures suivantes si aucun acte pouvant entraîner une gêne n'est pratiqué lors des premières. Si ce comportement venait à se prolonger, la capture serait alors systématiquement réalisée via une boîte de capture, qui sera ensuite placée dans une boîte de transport qui sera elle-même recouverte de tissu opaque lors du transport dans la pièce de test. De la même façon, une fois les animaux capturés à la main ou au filet, ils seront placés dans cette boîte. Les imageries seront réalisées sous anesthésie générale ainsi que les biopsies de peau. Dans la mesure du possible ces biopsies seront réalisées lors d'une anesthésie prévue par ailleurs (session IRM ou acte zootechnique - pose de puce ou contrôle sanitaire). La réintroduction dans le groupe après toute sortie sera monitorée afin de s'assurer qu'aucun conflit ne survienne. Dans le cas où des tensions seraient détectées une surveillance accrue serait mise en place.
Choix des espèces
Nous avons choisi le ouistiti pour les similarités qu'il présente avec l’Homme en terme de structure sociale et de capacités sociales (prosocialité) et cognitives. Le ouistiti est un modèle émergent dans le domaine des neurosciences, il est important de caractériser au mieux ses comportements cognitifs, ses interactions sociales, ainsi que son tempérament en lien avec le génotype des individus afin de mieux connaître l'espèce et de pouvoir raffiner les procédures expérimentales qui impliquent des individus de l'espèce. Tous les individus de notre colonie seront observés et étudiés, quel que soit leur stade de développement. En effet, cela permettra de suivre les modifications comportementales lors de la caractérisation de la colonie. Les tests comportementaux nécessitant un isolement des animaux ne débuteront pas avant 18 mois (âge adulte). Une session d'imagerie pourrait être réalisée avant atteinte de l'âge adulte afin d'étudier d'éventuels changements au cours du développement.