Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Utilisation de la souris TCYT5*NUC4 pour étudier le devenir des cellules progénitrices dans le gyrus denté
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie pour introduire de l'ADN dans le cerveau des embryons, geste qui peut provoquer un avortement, ou reçoivent du tamoxifène par gavage, tandis que des souriceaux sont opérés à la naissance sous anesthésie sur glace. Les mères comme les petits sont ensuite tués pour prélever les cerveaux, le porteur jugeant les femelles non réutilisables après ces interventions. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'architecture de la région cérébrale étudiée.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer si les différents types de neurones dans une structure du cerveau appelée gyrus denté sont générés à partir des mêmes cellules ou de populations distinctes et à quel moment de la vie ils sont générés. Pour se faire, nous utiliserons une souris particulière qui permet l'expression de multiples protéines fluorescentes (les cellules d'une même couleur sont issues d'une même cellule).
Bénéfices attendus
Ce projet devrait contribuer à terme à élargir nos connaissances fondamentales sur le développement du gyrus denté, une structure du cerveau particulièrement impliquée dans la mémoire. Aussi cette compréhension sur l'origine des cellules du gyrus denté, permettra à terme de mieux les cibler pour éventuellement les manipuler et étudier leurs fonctions spécifiques.
Procédures
Les animaux seront soumis soit 1) à une chirurgie pendant la gestation pour faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des embryons et ainsi induire l'expression des multiples protéines fluorescentes pendant la vie embryonnaire (30 min maximum), 2) soit à une chirurgie à la naissance pour faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des souriceaux et ainsi induire l'expression des multiples protéines fluorescentes à la naissance (5 min), 3) soit à une injection pendant la gestation (1 injection, mois d'une minute) ou 4) après la naissance (1 injection, mois d'une minute)
Impact sur les animaux
La chirurgie sur souris gestante pour faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des embryons peut conduire à un avortement si l’intégrité des vaisseaux sanguins ou de la paroi utérine est altérée lors de la procédure. Aussi, cette procédure sera effectuée par une spécialiste de ce type de chirurgie, ce qui garantit des gestes précis respectant l'intégrité de l'animal. Les sutures de la peau et des muscles peuvent s’ouvrir à la suite de cette procédure. Si les sutures de la peau ne se sont pas maintenues le jour suivant la chirurgie, de nouvelles sutures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Si les sutures de l'abdomen ne sont à nouveau pas maintenues le jour suivant, l'animal sera mis à mort. L’anesthésie sur glace, nécessaire à faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des souriceaux à la naissance, pourrait entraîner la mort des animaux si prolongée. Cependant, dans notre procédure, l’acte à réaliser pendant cette anesthésie est très court (moins de 1 minute) ce qui diminue très fortement cette éventualité. L’injection de tamoxifène par gavage chez les souris gestantes peut conduire à un stress des animaux. Pour réduire au maximum l’angoisse liée à cette injection, celle-ci sera effectuée par une personne expérimentée pour ce type d'approche. Chez la souris gestante, l'injection de tamoxifène peut conduire à un avortement ou à un problème de mise bas. Les femelles seront maintenues sous surveillance par l’expérimentateur jusqu’à la naissance. En cas de fausse couche, la mère sera mise à mort par dislocation de même en cas de problème de mise bas. Dans ce dernier cas, les souriceaux seront adoptés par des souris CD1/Swiss, préalablement gestantes au même stade. Les souriceaux seront sous surveillance lors de leur première semaine de vie. A la suite ce chaque procédure, nous réaliserons un suivi systématique quotidien des animaux. Nous utilisons des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l’animal par la mesure de son poids et l’évaluation de son apparence et de son comportement. A partir d’un score de 2, nous administrerons un analgésique (buprénorphine, 0.1mg/kg, sc, toutes les 6 à 12h jusqu'à amélioration) et à partir de 5, les animaux sont mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car les cerveaux des animaux sont récupérés pour des analyses anatomiques. De plus les mères initialement gestantes seront également sacrifiées car elles auront déjà subi une incision de la peau et des muscles abdominaux ou une injection de tamoxifène. L’injection de tamoxifène peut engendrer des effets secondaires non compatibles avec la réutilisation de ces femelles quel que soit le protocole expérimental (reproduction ou autre).
Remplacement
N'existant pas de modèle in vitro ou in silico permettant de reproduire l'environnement complexe (multiples types cellulaires, architecture complexe…) caractéristique de la structure cérébrale d'intérêt (le gyrus denté), cette étude ne peut être réalisée que chez l'animal in vivo.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes, nombre dépendant de la technique utilisée. De plus, mâles et femelles seront utilisés. La taille de nos groupes expérimentaux est définie sur la base de nos expériences antérieures et en respectant des conditions statistiques précises. Pour les études anatomiques, notre expérience nous a permis de déterminer qu'un effectif de 8 animaux par groupe est nécessaire pour effectuer des analyses statistiques cohérentes.
Raffinement
Un soin particulier sera accordé à l’observation des animaux, en particulier lors des périodes post-chirurgie et post-injection. Pendant ces périodes, nous utiliserons des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence et du comportement. A partir d’un score de 2, nous administrerons un analgésique (buprénorphine, 0.1mg/kg, sc, toutes les 6 à 12h jusqu'à amélioration) et à partir de 5, les animaux seront mis à mort. En cas de fausse couche des souris gestantes, la mère sera mise à mort par dislocation. Si les sutures de l'abdomen ne sont pas maintenues 2 j après la chirurgie, l'animal sera mis à mort. En cas de problème de mise bas suite à l'injection de tamoxifène, la souris gestante sera mise à mort par disolocation et les souriceaux seront adoptés par des souris CD1/Swiss, préalablement gestantes au même stade. En dehors de ces périodes, les points limites reposent sur des critères généraux de bien être qui seront évalués à travers la surveillance quotidienne effectuée par les zootechniciens. De plus, des traitements appropriés (anesthésie, anti-douleur) seront utilisés pour pallier à la douleur associée aux opérations chirurgicales. Concernant l’hébergement, les animaux seront hébergés dans des cages en présence de litière favorisant l’absorption des liquides vers le bas (par conséquent, la surface de la litière reste saine plus longtemps). Ces cages sont transparentes afin de favoriser le contact visuel. Ils auront également à leur disposition des formes d’enrichissement (carrés de coton) afin de réduire l’ennui et le stress. Les souris seront hébergées en cage collective. Seules les souris gestantes seront isolées sur une courte période, à partir de l'injection de tamoxifène ou le jour de la chirurgie (donc à E12.5, E13.5 ou E14.5). Cet hébergement permet d'identifier correctement les portées, ce qui est difficilement possible dans le cas d'un hébergement collectif de femelles gestantes.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris car il fait appel à une lignée génétiquement modifiée développée uniquement chez la souris. Dans la structure cérébrale étudiée, différents types de neurones sont générés de la vie embryonnaire à l'âge adulte. Nous ciblerons les cellules à l'origine de ces neurones et ce à différents moments de la vie de l'animal: 1) pendant la vie embryonnaire, 2) à la naissance , 3) en période juvénile (à 3 semaines de vie) et à 4) l'âge adulte (à 12 semaines de vie). Ces temps précis d'analyse ont été choisi en fonction de la littérature et de nos études précédentes.
Rôle des cellules immunitaires des méninges dans le développement et la physiopathologie du Système Nerveux Central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
11 232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, une partie sous anesthésie sans réveil. Adultes et nouveau-nés reçoivent des injections sous-cutanées, intra-péritonéales ou intracérébrales de vecteurs viraux, certains souriceaux subissant une imagerie sous anesthésie dont ils ne se réveillent pas, pour étudier le rôle des cellules immunitaires des méninges dans le développement du cerveau. Le porteur mentionne des études comportementales vers trente jours sans en préciser la nature. Il affirme qu'on "ne peut pas se passer" du modèle animal, tout en évoquant des cultures de neurosphères qui pourraient réduire le nombre de souris.
Objectifs
La surface du système nerveux central (SNC) est protégée par des membranes : les méninges. La découverte récente de la diversité des populations immunes y résidant et leur capacité à interagir avec le cerveau (influence sur le comportement, migraine, méningites, sclérose en plaque, …) ouvre de nouvelles perspectives en termes de recherche fondamentale et thérapeutique. Les cellules immunitaires les plus représentées dans les méninges sont les macrophages. D’autre part les méninges pénètrent profondément dans le cerveau entre les sous structures majeures du cerveau dont l’hippocampe, le siège de la neurogénèse. Dans ce contexte, mon projet a plusieurs objectifs : -1 : étude de l’implication des Macrophages Méningés (MM) et autres cellules immunitaires méningées au cours de la neurogénèse cérébrale physiologique- 2 : étude de leur implication dans la coordination de la croissance cerveau/crâne (rôle d’interface très important) -3 : étude de leur implication dans les troubles cognitifs postnataux dus à une inflammation au cours du développement cérébral (correspondante au troisième trimestre de gestation chez l’homme). Notre première stratégie sera de supprimer les macrophages méningés (MM) : soit par injection sous cutanée locale dde drogue dans des souris de type sauvage (déplétion chimique) ; soit par une approche génétique utilisant différents modèles de souris transgéniques. La seconde stratégie sera d’inactiver localement les gènes trophiques exprimés spécifiquement par les macrophages. Ces deux stratégies seront réalisées d’une part chez des souris adultes stimulées par activité physique, et d’autre part à des stades développementaux clés dans la maturation du système nerveux central. Nous évaluerons les conséquences de l’absence ou du dysfonctionnement des macrophages sur la neurogenèse cérébrale et le comportement.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce travail est de comprendre comment les cellules immunitaires des méninges interagissent avec le développement du cerveau. Du fait de la complexité des interactions cellulaires ainsi que du rôle de la vascularisation dans ce procédé (pour l’apport des cellules immunes), il n’est pas possible de se passer d’un modèle animal, et les études in vitro et in silico, bien qu’intéressantes, ne suffiront pas à comprendre la réponse immune du système nerveux central (SNC) dans son ensemble. L’organisation physique des tissus entre eux est cruciale et ne peut pas être modélisée in vitro. Les retombées de ces recherches au niveau fondamental mais aussi appliqué (découverte de thérapies ciblant les maladies inflammatoires et neurodégénératives) pour l’Homme constituent une justification éthique importante pour faire valoir notre projet impliquant des expériences sur animaux in vivo. Concrètement, nous espérons que ce projet nous apportera les bénéfices suivants : - A court/moyen terme, une meilleure compréhension du rôle physiologique des macrophages méningés (MM) dans 1) le neurodéveloppement, 2) la formation biomécanique du crâne et des méninges, 3) le comportement. - A moyen/long terme : permettre l’identification de candidats exprimés/sécrétés par les macrophages méningés (MM) impliqués dans la neurogénèse afin de pouvoir développer des stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des MM dans les troubles neurodéveloppementaux ou dans des maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous cutanées, intrapéritonéales, de molécules non toxiques à des volumes et des doses en accord avec l'âge et le poids des souris. Une minorité d’animaux seront soumis à des injection intracérébrales. Chez les adultes de 6 à 8 semaines : i) Injection sous cutanée sous la peau du crâne (acte de 30s sur animal vigile) d’un composé non toxique permettant de dépléter uniquement les macrophages des méninges tous les 2 jours pendant 15 jours soit 7 injections chez les animaux de type sauvage, ou 2 injections à 24 h d’intervalle juste avant la fin de l’expérience chez les animaux transgéniques. ii ) Injection unique intra- péritonéale (acte de 30s sur animal vigile) d’un composé non toxique permettant de tracer la formation des nouveaux neurones. iii) Injection intracérébrale de vecteurs viraux (virus inactivé transporteur de molécules) chez certains animaux de type sauvage : injection unique avec analgésie préventive sous anesthésie générale (durée 1h). iiii) prélèvement sanguin unique au coin de l’œil : sous anesthésie générale gazeuse en un geste de 30s juste avant la mise à mort de l’animal. Chez les souriceaux 0 à 10 jours : i) Injection sous la peau de la nuque (acte de 30s sur animal vigile) 3 injections maximum (une injection tous les 2 jours) chez les animaux de type sauvage et 2 injections chez les animaux transgéniques) dans le cas d’un composé non toxique permettant de dépléter uniquement les macrophages des méninges. 2 injections à 8 jours d’intervalle dans le cas de l’injection d’un marqueur de calcification. ii) Injections intra- péritonéales (acte de 30s sur animal vigile) : une injection unique dans le cas d’un composé non toxique permettant de tracer la formation des nouveaux neurones, 2 injections à 24h d’intervalle dans le cas d’un composé activant le système transgénique (uniquement pour certains modèles), une injection unique de toxine bactérienne ou alternativement 2 injections par jour à 6 h d’intervalle pendant 5 jours soit 10 injections totales d’une cytokine pour les animaux rentrant dans l’étude sur l’inflammation périnatale. iiii) Injection intracérébrale de vecteurs viraux (virus inactivé transporteur de molécules) chez certains animaux de type sauvage : injection unique avec analgésie préventive sous anesthésie générale (durée 20mn). V) Imagerie intra-vitale dans une procédure : pendant 1h sous anesthésie générale sur des souriceaux de 15 jours qui ne seront pas réveillés.
Impact sur les animaux
Les différents effets indésirables pouvant intervenir sont : une douleur au site d’injection en particulier pour les injections sous cutanées sous la peau du crâne ou sous la peau de la nuque, une mauvaise réaction à la molécule injectée ou un impact sur la croissance, du stress en particulier au moment des études comportementales à 30 jours, du stress pour la mère et pour les souriceaux, de la douleur au réveil lors des injections intracérébrales. Un contrôle quotidien de l’état de santé des souris, avec une grille de score pour chaque procédure permettra la détection d’anomalies. Si nous détectons une douleur, souffrance ou détresse, que nous n’arrivons pas à réduire par analgésie, l’animal sera euthanasié immédiatement. Dans le cas particulier des souriceaux, nous vérifierons également le comportement maternel, l’allaitement et la croissance des souriceaux. A la fin de chaque procédure les souris seront euthanasiées selon les méthodes réglementaires pour prélever méninges et cerveau.
Devenir
Chaque procédure nécessite l'euthanasie de tous les animaux selon les méthodes réglementaires pour prélever méninges et cerveau afin de les analyser.
Remplacement
L’objectif de ce travail est de comprendre comment les cellules immunitaires des méninges interagissent avec le développement du cerveau. Du fait de la complexité des interactions cellulaires ainsi que du rôle de la vascularisation dans ce procédé (pour l’apport de cellules immunes), il n’est pas possible de se passer d’un animal modèle, et les études in vitro et in silico, bien qu’intéressantes, ne suffiront pas à comprendre la réponse immune du SNC dans son ensemble. L’organisation physique des tissus entre eux est cruciale et ne peut pas être modélisée in vitro. Les retombées de ces recherches au niveau fondamental mais aussi appliqué (découverte de thérapies ciblant les maladies inflammatoires et neurodégénératives) pour l’Homme constituent une justification éthique importante pour faire valoir notre projet impliquant des expériences sur animaux in vivo. Puisque nous ne pouvons pas nous affranchir du modèle animal, nous réduirons au maximum le nombre d’animaux utilisés en suivant la règle des 3R. Certains axes du projet seront développés en utilisant en parallèle une approche de culture de neurosphères afin d’évaluer l’effet sur la neurogenèse de certains facteurs protéiques sécrétés par les macrophages présélectionnés par notre étude in vivo. Ceci nous permettra, nous l’espérons, de réduire encore le nombre de souris et les remplacer par un modèle in vitro.
Réduction
Nous tenterons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en effectuant des expériences pertinentes et complètes. Nous utiliserons des tests statistiques adéquats pour planifier nos expériences en fonction de la littérature et des données internes de l’équipe. Nous utiliserons plusieurs tissus du même animal (méninges, cerveau, crâne et sang). Les données quantitatives générées seront analysées statistiquement par le test de t de Student. Pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, le nombre d’individus nécessaire est de 20 animaux par groupe dans chaque procédure et 40 animaux par groupe pour les études comportementales. Nous utiliserons donc 11232 souris pour l’ensemble de ce projet sur cinq ans. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les études comportementales seront réalisées avant l'euthanasie de l'animal et le prélèvement des structures cérébrales. Les souriceaux utilisés pour l’étude de la neurogénèse (déplétion génique ou chimique des macrophages et mastocytes des méninges) se verront prélever les méninges et le crâne dans le cadre de l’étude sur la formation du crâne. Les souris proviendront d’établissements éleveurs, fournisseurs localisés et de collaborateurs.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, concues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. Les conditions de l’animalerie sont contrôlées (température, hygrométrie, photopériode). Les cages de 530cm2 seront utilisées pour limiter le stress des animaux (100cm2 de surface par animal au minimum, dômes protecteurs et matériel pour la confection de nids). Des précautions supplémentaires seront prises sur les souriceaux : après manipulation l’utilisateur se frottera les mains avec la sciure en provenance de la cage de la mère, ce qui limitera les dépôts d’odeur et favorisera la réintégration au sein du nid. Les souriceaux seront réchauffés grâce à une lampe à infra-rouge, avant d’être replacés. Les injections seront réalisées par des personnes formées à la manipulation des nouveaux nés avec du matériel adapté aux nouveaux nés. L’état de santé des animaux sera évalué quotidiennement selon 5 grands critères : 1-apparence globale (apparence physique et grimace), 2- Respiration et oxygénation (fréquence respiratoire et/ou coloration des extrémités), 3- évolution pondérale individuelle 4 – comportement (provoqué ou non) et continuité de l'accouplement, 5- autres observations (saignement ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté). Une grille de score spécifique à l'âge avec évaluation de la douleur sera complétée. Les points limites nécessitant l’observation accrue, soulagement de l’animal (buprénorphine sous cutanée 0,1mg/kg qui sera répétée toutes les 12 heures) ou l'arrêt de la procédure avec euthanasie seront détaillés dans chaque procédure. Ce sont : poils hirsutes, dos arrondi, fréquence respiratoire augmentée et rythme instable, pâleur ou cyanose, perte de poids individuelle >20%, comportement anormal, hypo-mobilité, isolement, défaut d’alimentation ou d’hydratation, diarrhées, saignements, et en particulier pour les souriceaux, abandon par la mère, décoloration.
Choix des espèces
De nombreux modèles physiopathologiques étant partagés entre l’homme et la souris, nous utiliserons des souches de souris consanguines ainsi que des lignées génétiquement modifiées. De plus, le vaste développement de modèles transgéniques (pour cibler et visualiser des populations cellulaires précises) et l’utilisation d’une grande variété de drogues déjà testées chez la souris permet de tester plus rapidement et plus efficacement nos hypothèses. Enfin, nos modèles d'étude sont fréquemment utilisés chez la souris et leur physiopathologie est donc bien décrite. Pour toutes ces raisons, le modèle murin représente le modèle le plus prometteur pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris de 6 à 8 semaines (J42 à J56) mâles et femelles afin d’évaluer l’impact des macrophages méningés sur la neurogénèse adulte avec ou sans activité physique. Nous utiliserons également des souriceaux à des âges clés du développement neuronal. Ainsi pour les études de neurogenèse et de croissance cerveau-méninges- crâne, les gestes techniques seront réalisés entre J0 et J9 avec analyse à J3 ou J7 ou J10 en fonction des questions posées. Pour les études cognitives, les gestes techniques seront réalisés de J1 à J5 (correspondant au 3ème trimestre de gestation chez l'homme) avec analyse à J8 ou J30.
Rôle de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans le contrôle de la prise alimentaire, étude genetique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une partie porte des mutations d'obésité génétique, décrite par le porteur comme un "phénotype dommageable", et l'ensemble est soumis à des cycles de jeûne de deux heures puis à des régimes standard ou enrichis en gras, pour étudier une réaction inflammatoire cérébrale après les repas. Les souris sont ensuite euthanasiées afin de prélever le cerveau et de disséquer l'hypothalamus. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier le comportement alimentaire de façon intégrée et revendique la souris comme "modèle de référence".
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs pro-inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Au niveau cellulaire, les nutriments activent un senseur moléculaire intracellulaire sui active une cascade de réactions intracellulaires faisant intervenir un facteur F pro-inflammatoire. Tant qu’elle n’est pas chronique, la production du facteur F semble exercer un rôle positif sur le métabolisme, en stimulant la sécrétion d’insuline et favorisant l’utilisation de glucose, améliorant in fine le contrôle glycémique périphérique. Récemment, l’équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, en particulier dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. La PIR cérébrale se caractérise par une activation des cellules spécifiques chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Encore maintenant le rôle de la PIR cérébrale est totalement inconnu. Afin de compléter nos connaissances, dans ce projet nous étudierons : - la PIR à l’échelle moléculaire dans les cellules activées, - la PIR dans un contexte d’obésité génétique. Pour cela, nous devons héberger des colonies d’animaux porteurs de mutations affectant notamment le facteur F. Les cerveaux de ces animaux seront étudiés post-mortem dans différentes conditions prandiales. L’étude prévoit 300 individus.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les caractéristiques de la PIR cérébrale et donnera des informations nouvelles sur l’intégration cérébrale de l’état métabolique chez l’individu obèse. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
La procédure implique une mise en cage individuelle pendant 3 jours afin de mesurer la prise alimentaire de chaque individu. Afin de synchroniser la prise alimentaire, les animaux seront mis à jeun pendant 2 heures en fin de période de jour durant 3 jours, à la fin du jeûne la nourriture sera mise à disposition ad libitum. A la fin de cette période de synchronisation, les animaux seront à nouveau mis à jeun durant deux heures, puis seront répartis en 3 groupes : préprandial, postprandial soumis pendant 3 heures aux régimes standard ou enrichi en gras.
Impact sur les animaux
L’obésité génétique inhérente aux modèles ob/ob et MC4R KO peut être considérée comme un phénotype dommageable pour ces animaux. En revanche, le phénotype des souris RiboTag n’est pas dommageable. Le projet en lui-même n’entraine pas de nuisances particulières chez ces animaux. Les animaux seront élevés, et étudiés dans des conditions prandiales définies. Excepté l’injection ip d’anesthésique avant la mise à mort, les animaux ne subiront aucune manipulation. Le projet consiste donc en un élevage d’animaux OGM et en la définition de situations prandiales standardisées.
Devenir
Les 300 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever le cerveau et disséquer l’hypothalamus en vue d’analyses moléculaires.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
La procédure décrite (mise en place de conditions prandiales définies) a été optimisée, standardisée et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier les différences significatives entre les groupes expérimentaux (puissance de 80% avec un risque alpha de 5%), ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Dans le détail, les analyses simultanées des groupes expérimentaux seront réalisées par ANOVA et tests de comparaison a posteriori. Pour cela, les conditions d’application des analyses seront vérifiées (nombre d’individus par lot, tests de normalité, test d’égalité des variances). Les tests de comparaison a posteriori (paramétriques ou non paramétriques) seront réalisés selon ces conditions.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées de 10 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.
Création de modèles de cathétérisation vasculaire et non vasculaire chez le rongeur destiné à des études toxicologiques, pharmacodynamiques ou pharmacocinétiques
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 12000
15 500 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale pour poser à demeure un cathéter dans un vaisseau, un organe ou le cerveau, puis peut recevoir jusqu'à quatre prélèvements sanguins ou gavages par jour, avec un hébergement isolé jusqu'à sept jours. L'établissement décrit une activité de fourniture de rongeurs cathétérisés "prêts à l'emploi", les animaux étant ensuite expédiés vivants aux laboratoires ou tués en cas d'atteinte d'un point limite ou pour contrôle qualité. Il justifie l'élevage d'animaux "surnuméraires" par les taux d'échec chirurgical et conclut que la complexité des mécanismes exclut un modèle in vitro.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique de modèles de rongeurs équipés de manière permanente (par technique chirurgicale) de cathéters dans des vaisseaux, des organes ou le cerveau permettant soit la libération de substances (comme des médicaments ou des hormones) de manière répétée ou continue, soit le prélèvement de fluides biologiques (sang, bile, liquide cérébro spinal)
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles cathétérisés permet l’administration répétée ou continue de substances d’intérêts (comme des médicaments ou des hormones) ou la mesure et le suivi de paramètres biologiques grâce au prélèvement de fluides biologiques comme le sang, la bile ou le liquide cérébro spinal chez l’animal tout en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie. Cela permet donc la réduction très importante du stress provoqué chez l’animal par des injections ou des prélèvements de manière répétée à différents sites d’injection ou de prélèvement. Ces administrations et mesures pourront permettre à la communauté scientifique d’augmenter leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines de recherche (devenir d’un médicament dans le corps, toxicité d’un médicament, maladies cardiaques, maladies du cerveau, hypertension, cancer, infertilité, ...) tout en réduisant les nuisances possibles sur l’animal.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure sous anesthésie générale et à la mise en place d’un matériel cathétérisé. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins ou à des gavages (maximum 4 prélèvements sanguins/gavages par jour). Les actes de prélèvements, de gavages et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 7 jours. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux font suite à la mise en place du cathéter suite à la chirurgie : douleur, stress et perte de poids possible chez tous les animaux dus aux contentions, aux procédures chirurgicales, à la présence du matériel cathétérisé. Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Les animaux sont à la demande, expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
La production de modèles cathétérisés a pour objectif de mettre à disposition des modèles prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Ces programmes visent à étudier les réactions des organes ou leurs interactions face à une substance, de comprendre la vie d’une substance à l’intérieur d’un organisme ou sa toxicité, ce qui entraine l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels programmes sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Les cathétérisations permettent le suivi de paramètres biologiques ou encore l’administration de substances répétées ou en continu en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie ce qui permet une réduction très importante pour l’animal du stress provoqué par des prélèvements ou des injections répétés à différents sites. Le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation des animaux peut être effectuée dès la phase d’acclimatation (en fonction du stress observé de l’animal à réception, par exemple). Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique mais l’équipe de chirurgie se réserve le droit de proposer des changements de modèles sur la base de son expérience. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec la pose du matériel cathétérisé, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Étude du vieillissement précoce dans un modèle de lésions cérébrales associées à la prématurité chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
950 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et quelques-unes transférées vers un autre projet, dont 290 dans des procédures classées sévères. Nouveau-nées, elles reçoivent des injections d'une substance pro-inflammatoire deux fois par jour pendant cinq jours, puis selon les groupes une chirurgie du crâne, une perfusion intracardiaque ou l'implantation d'électrodes suivie d'une crise d'épilepsie provoquée, pour étudier un vieillissement cérébral précoce lié à la prématurité. Le porteur indique une surmortalité inférieure à 10 % pendant les injections et des hématomes douloureux, les crises d'épilepsie étant volontairement déclenchées lors des enregistrements. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit les interactions du système nerveux et que le recours à la souris est "nécessaire".
Objectifs
La prématurité est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons de très faible poids de naissance qui survivent au delà de l’enfance est en hausse. Cependant, le cerveau de ces prématurés reste extrêmement vulnérable et peut ainsi présenter des lésions. L’inflammation périnatale que subissent dans 20 à 40% des cas les enfants prématurés et la grande vulnérabilité des cellules cérébrales en développement à ce stress inflammatoire est à l’origine de l’apparition de la plupart de ces lésions. Elles induisent des handicaps moteurs, des déficits cognitifs et des troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte qui sont regroupées sous le terme d' "Encéphalopathie du Prématuré". Certaines cellules cérébrales, appelées cellules gliales, sont les relais majeurs des modifications environnementales dans le cerveau, dont les réponses inflammatoires. Ces cellules résidentes du système nerveux central, analysent de manière continue leur environnement et participent à la stabilisation de ce dernier. On sait aujourd’hui que les mécanismes qui permettent la maturation cérébrale sont les mêmes que ceux qui sont perturbés au cours du vieillissement. Nous cherchons donc à comprendre l’impact de l’inflammation périnatale sur le vieillissement en émettant l'hypothèse que celle-ci peut être à l'origine d'un vieillissement prématuré.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait la caractérisation des conséquences à long terme des lésions cérébrales du prématuré et ainsi la mise en place d'outils de prévention chez les individus concernés. Par ailleurs, si nos hypothèses sont avérées, nous aboutirions à la mise en place d'un modèle de neurodégénérescence chez des souris issues d'un brassage génétique par opposition aux modèles habituellement consanguins, présentant des modifications génétiques ciblées et à 7 mois de vie.
Procédures
Les souriceaux recevront l’injection d’une substance pro inflammatoire 2 fois/ jour pendant 5 jours (animal vigile, moins de 30s par injection). Après ces injections, un premier groupe de souris subira une procédure chirurgicale sous anesthésie générale pour sectionner une partie de la boite crânienne et réaliser ensuite une échographie doppler pour mesurer le débit sanguin (l'ensemble chirurgie et échographie durera une heure maximum). Une perfusion intra-cardiaque sera réalisée sur un 2e groupe à différents stades et sous anesthésie (3 min en moyenne de perfusion). Au sein de ce groupe, certains animaux auront subi un prélèvement sanguin 2 jours avant l'étape de perfusion (sous anesthésie, durée de moins d'1 minute). Une étude comportementale dans un espace défini sera réalisée sur un 3e groupe à différents temps et d’une durée variable en présence d’autres souris ou non. Et enfin sur le 4e groupe, une intervention chirurgicale sous anesthésie d’une durée de 15 à 25 mn, sera réalisée pour implanter des électrodes au niveau du crâne. Le lendemain de l’intervention il sera injecté un produit provoquant une crise d’épilepsie (trouble neurologique provoquant des convulsions) et il sera ensuite procédé à un électroencéphalogramme pendant une heure.
Impact sur les animaux
Les effets des injections de la substance induisant une inflammation sur les souris sont connus et modérés. On rapporte ainsi une surmortalité estimée à moins de 10% lors de la période d'injection ainsi qu'un retard de croissance chez les animaux recevant de la substance pro-inflammatoire. Cette surmortalité est principalement dûe à un éventuel rejet du souriceau par la mère ainsi que dans quelques cas par l'invasivité même de l'injection pouvant occasionner l'apparition d'un hématome douloureux pour l'animal. Ces deux événements indésirables constituent des points limites entrainant l'euthanasie de l'animal. Aucune nuisance particulière n'est attendue au cours du vieillissement des animaux ni n'ont été observé précédemment lors du vieillissement d'animaux de ce modèle. Ainsi, passé la periode d'injection de 5 jours, les effets indésirables classiques : cyanose, perte de poids, troubles respiratoires ne sont pas attendus de même que des crises d'épilepsie spontanées (elles sont induites lors de l'enregistrement à l'encéphalogramme) et constituent donc des points limites. L'étape d'imagerie cérébrale se déroule entièrement sous anesthésie et analgésie. Pendant cette période,aucun effet indésirable particulier n'a été mis en évidence et l'animal est euthanasié dès la fin de l'acquisition, avant réveil. Aucun effet indésirable n'est dès lors attendu lors de cette procédure. Lors de la procédure d'électroencéphalogramme, les animaux subissent la chirurgie d'implantation des électrodes 24h avant l'acquisition des données pendant laquelle ils sont éveillés. Ainsi, pendant cette période de 24h + temps d'analyse, ceux-ci peuvent montrer des signes de gène du fait du dispositif d'électrodes et sont donc étroitement surveillés. L'arrachage du dispositif ou la présence de saignements post-opératoires sont des évènements indésirables rares mais possibles entrainant l'euthanasie de l'animal. Aucune surmortalité du fait du dispositif n'a été observée du fait de cette chirurgie et l'animal est euthanasié dès la fin de l'acquisition. L'acquisition se fait à la suite de l'injection d'une molécule induisant des crises d'épilepsie. Leur survenue est donc attendue.
Devenir
L'euthanasie des animaux en fin des procédures d'échographie cérébrale fonctionnelle et d'électroencéphalogramme répond à une nécessitée d'ordre éthique puisque celles-ci imposent une chirurgie au niveau du crane de l'animal. Par ailleurs, à la fin des autres procédures, les animaux seront euthanasiés et les cerveaux prélevés pour analyses.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication de la neuroinflammation dans le développement d'un vieillissement précoce. Cela suppose des interactions complexes entre types cellulaires bien distincts du système nerveux central : les cellules gliales responsables de l'activité immunitaire et de fonctions de nutrition des neurones d'une part, et les neurones d'autre part. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions complexes in vitro ou dans un système de cellules en culture, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal présentant un système nerveux central fonctionnel dont la structure est proche de celle de l'homme pour reproduire ces interactions complexes.
Réduction
Le nombre d'animaux estimé et les tests statistiques utilisés sont basés sur notre expérience pour ce type d'étude. Ce nombre minimum nous permettra d'être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet. L'analyse statistique de nos données peut nécessiter un nombre d'animaux différents selon l'hétérogénéité des résultats attendus de chaque procédure. Pour autant, les tests étant organisés en plusieurs séries, s'il advenait que l'accumulation des résultats montre une différence assez importante pour conclure à un résultat avant la réalisation de toutes les séries d'une expérience, alors, les dernières séries (devenues inutiles) seraient annulées. Quelques animaux de ce projet seront réutilisés dans un autre projet pour approfondir certaines analyses.
Raffinement
Hébèrgement : Les animaux seront hébergés en groupe, en milieu enrichi (sopalin , maisons en pexiglas) pour minimiser leur stress. Suivi quotidien : Pendant la période d'injection les animaux seront remis dans leur nid et on vérifiera quotidiennement que le retour au sein du nid se fait bien. A la fin de l'étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Des grilles de scoring cliniques seront proposées en fonction de l'âge des animaux. Ces grilles définissent des points limites à différents stades. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux sera réalisée par les équipes animalières et le scoring clinique sera effectué tous les jours jusqu'au 10ème jour de vie des animaux, puis 3 fois par semaine jusqu'au jour 21 puis 2 fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude. Si l'un des points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Gestion de la douleur : tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale et un analgésique sera administré après le réveil d’une intervention chirurgicale. Enfin, le transport des animaux est effectué par un transporteur agrée fournissant des cages adaptées ainsi que des géloses nutritives pour les animaux.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre microglie et neurones lors des processus de neurodégénérescence, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition car elle présente un hippocampe (la structure anatomique responsable des processus de mémorisation dans le cerveau et qui est préférentiellement touchée par le vieillissement) dont la circuiterie neuronale est très proche de celle de l'homme. Le modèle d'inflammation périnatale utilisé ici a été développé au sein de notre laboratoire et caractérisé jusqu'à 2 mois de vie des animaux. Notre objectif étant l'étude du vieillissement de l'animal et, notamment, de confronter notre hypothèse d'un vieillissement précoce nous nous intéressons à 3 temps de vie plus tardifs de nos animaux : 7, 12 et 16 mois de vie. Ces temps correspondent, à peu de choses près, respectivement chez l'homme au milieu de vie (40-45 ans), à la fin de phase active (60-65 ans) et à la personne âgée (80 ans).
L’impact de la valence sur l’engramme olfactif 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 20 dans des procédures classées sévères et les autres modérées. La tête fixée par une pièce métallique vissée au crâne, elles subissent des tests olfactifs en réalité virtuelle sous restriction d'eau pendant un à quatre mois et des privations de nourriture de 16 heures, et sont hébergées seules, pour étudier la mémoire émotionnelle des odeurs. Le porteur reconnaît que l'isolement social peut provoquer stress, agressivité et déficits immunitaires, qu'il dit réduire au minimum. Il justifie l'effectif par les nombres "habituellement utilisés dans les études de référence" plutôt que par un calcul de puissance statistique.
Objectifs
Les odeurs ont une capacité unique à nous transporter dans des moments reculés de notre passé, notamment ceux associés à des émotions fortes. Elles jouent également un rôle très important dans les choix que nous faisons au jour le jour, notamment lorsqu’il s’agit de notre alimentation. Mais qu'est-ce qui, dans le système olfactif, confère aux odeurs ces propriétés particulières ? Dans cette étude, nous étudierons les voies anatomiques et les mécanismes physiologiques par lesquels les odeurs laissent une empreinte émotionnelle si forte dans nos mémoires.
Bénéfices attendus
Cette recherche peut fournir des indications importantes sur les mécanismes neuronaux qui attachent une valence hédonique à un objet. Dans de nombreux troubles neurodégénératifs, à mesure que la maladie progresse (en particulier dans le cas de la dégénérescence du lobe frontal), les patients souffrent car ils sont moins connectés au monde qui les entoure. La valeur qu'ils attribuent à différents éléments peut être déformée, ce qui peut entraîner des changements radicaux dans leur personnalité, inquiétants pour eux et leurs proches. Si cette recherche permet de découvrir l'ensemble des connexions qui attribuent une valeur émotionnelle aux odeurs, elle peut donner un aperçu de la physiopathologie de ces troubles. Outre les maladies neurodégénératives, des études récentes ont également montré que les enfants atteints de troubles du spectre autistique (TSA) n'adaptent pas leur comportement de reniflage lorsqu'on leur présente des substances odorantes aversives ou appétissantes, alors que les enfants au développement normal le font. Cela suggère une déconnexion entre l'intégration des informations sensorielles et les processus de mémoire émotionnelle dans les TSA, et ce travail pourrait permettre de comprendre comment les odeurs se voient attribuer une signification émotionnelle qui conduit à un comportement adaptatif.
Procédures
Dans cette étude, toutes les souris (490) seront fixées à la tête et soumises à des tests comportementaux, 90 d'entre elles seront euthanasiées sans autres manipulations et 400 d'entre elles verront leurs tissus préservés pour des études anatomiques. Les tests comportementaux consisteront à présenter des odeurs à des souris qui décideront de s'en approcher ou de les éviter dans la réalité virtuelle. Les animaux ne recevront de l'eau que pendant le comportement (restriction hydrique) afin de maintenir leur motivation et, dans certains cas, ils seront privés de nourriture pendant 16 heures avant les tests comportementeaux. Ils seront logés individuellement pendant la restriction d'eau (généralement 1-2 mois, 4 mois maximum) et de nourriture afin d'éviter les brimades et les combats.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les souris seront placées dans un appareil comportemental dans lequel elles devront utiliser leur odorat pour trouver une récompense hydrique et éviter les petites bouffées d'air ou d'eau salée. Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir les souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. Au début, la fixation dans l'appareil peut être stressante, mais les souris s'habituent rapidement et restent calmes dans ces conditions. Pour les motiver à effectuer des tâches dans l'appareil, la totalité de l'apport en eau quotidien nécessaire aux souris sera fournie pendant les tests comportementaux. La restriction d'eau, si elle est bien contrôlée, permet de maintenir la motivation des animaux sans qu'ils soient trop déshydratés. Des contrôles quotidiens de l'état de santé permettent de s'assurer que les souris restent dans des conditions saines. Une restriction calorique de 16 heures à certaines occasions ne provoquera pas d'effets indésirables chez des animaux par ailleurs en bonne santé, car les souris seront nourries ad libitum pendant au moins 2 jours après les expériences. Les souris seront logées individuellement pendant la restriction d'eau afin d'éviter les combats, mais elles seront manipulées tous les jours par l'expérimentateur et exposées aux images, aux sons et aux odeurs du laboratoire, qui impliquent d'autres souris. L'isolement social peut provoquer du stress, de l'agressivité et des déficits immunitaires, il sera donc réduit au minimum.
Devenir
Sur les 490 souris soumises à une restriction hydrique, 90 seront mis à mort et 400 seront gardé en vie. Ces 400 pourront être mises à mort et utilisé pour contrôles histologiques en fin d’expérimentation.
Remplacement
La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront une tâche comportementale : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.
Réduction
Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 490 souris sur 5 ans. Les techniques d’enregistrement (électrodes très fines et lentilles à gradients d'indices) que nous prévoyons d’utiliser permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés car un grand volume de données pourra être collecté sur plusieurs jours au sein d’un même animal. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences. Notre estimation du nombre d’animaux ne peut se baser sur une étude de puissance statistique car notre étude ne reposera pas sur un test unique. Dans ce type d’étude, les valeurs comparées dans les tests statistiques sont rarement basées sur les individus, mais plutôt sur la totalité des neurones enregistrés ou bien sur des groupes de neurones. Ainsi, les effectifs indiqués correspondent aux nombres d’animaux habituellement utilisés dans les études références du domaine.
Raffinement
Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début de leur entraînement, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L'accoutumance à l'expérimentateur et aux conditions expérimentales permettra également aux animaux d'accomplir les tâches comportementales avec un minimum de stress.
Choix des espèces
Ce projet vise à comprendre les mécanismes neuronaux qui explique comment la valence hédonique d'une odeur affecte son encodage dans le cortex olfactif, et comment cette information est acheminée pour guider les comportements adaptatifs. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que la souris est en train d’apprendre et d'exprimer leur préférences olfactifs : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles. La souris est la seule espèce de mammifère qui possède un système olfactif très similaire à celui des humains dans lequel nous pouvons entraîner les animaux à s'approcher et à éviter différentes odeurs tout en enregistrant et en manipulant l'activité dans des groupes de neurones génétiquement et anatomiquement circonscrits. La boîte à outils pour ces manipulations chez la souris est bien plus développée que pour tout autre organisme modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Par précaution par rapport à ce dernier point, nous utiliserons uniquement des animaux dont le poids est compris entre 20 et 45g.
Implication de l’habenula latérale et du système de phototransduction mélanopsinergique dans l’effet de différentes conditions de lumière sur le comportement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'une fibre optique dans le cerveau, puis une exposition à différentes lumières et des tests dits de comportement dépressif, avant prélèvement de tissus, pour étudier une voie neuronale reliant la lumière à l'humeur. Le porteur indique une douleur possible après la chirurgie et un mal-être lié à l'isolement, qu'il dit inévitable en raison du câblage des animaux au dispositif d'enregistrement. Il affirme que la question posée impose l'usage de l'"animal entier".
Objectifs
En plus de son rôle dans la vision, la lumière exerce une influence importante sur la physiologie et le comportement. Son influence directe non circadienne sur le sommeil et la vigilance a maintenant été largement démontrée . Or, le sommeil joue lui-même un rôle critique sur l’humeur ainsi que sur les processus cognitifs. De plus, la lumière pourrait également avoir une action directe sur les comportements de type anxio-dépressif et sur les capacités d’apprentissage. L'habenula latérale semble être une structure centrale permettant ces effets : en effet, elle est particulièrement impliquée dans la modulation de l'humeur et reçoit des entrées directes en provenance de la rétine, plus spécifiquement des cellules ganglionnaires exprimant la mélanopsine (ou cellules ganglionnaires rétiniennes intrinsèquement photosensibles. La « fiber photometry » est une technique en plein essor ces dernières années permettant de mettre en évidence des fluctuations de l’activité calcique au sein d’une structure d’intérêt, reflétant ainsi l’activation ou l’inhibition de la structure en réponse à un stimulus donné. Dans ce cadre d'étude, nous cherchons à mettre en évidence l'implication de l'habenula latérale dans l'effet de l’exposition à différentes conditions de lumière sur le comportement. L'activité calcique au sein de cette structure sera ainsi mesurée lors de l'allumage de la lumière ainsi que lors de l'évaluation de comportements dits "de type dépressifs". Cette étude sera menée à la fois chez des souris sauvages et chez un modèle de souris transgéniques (Opn4-/-) n’exprimant pas la mélanopsine, afin d'identifier une potentielle voie neuronale médiant les effets de la lumière sur le comportement.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de caractériser les effets de différentes conditions de lumière sur l'activité au sein de l'habenula latérale et sur les comportements de type dépressifs et d'identifier l'implication du système de phototransduction mélanopsinergique. Ce projet constitue une étape importante dans la compréhension de la régulation photique du comportement et incitera à réaliser de nombreux travaux complémentaires dans une perspective translationnelle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie d'implantation d'une fibre optique au niveau cérébral. La chirurgie aura lieu une fois et durera environ 45 min. Les animaux seront exposés à différentes conditions de lumière durant la phase claire (3 intensités, 3 couleurs), pendant 1 semaine/condition. A la fin de chacune des 6 expositions, ils seront évalués dans 2 tests non invasifs évaluant leur humeur (un test d'évaluation de la motivation de l'animal à se toiletter après pulvérisation d'eau sucrée sur son pelage) durant 5 min et un test de préférence pour l'eau sucrée (appétante pour l'animal) durant 2 jours.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut induire de la douleur chez la souris, dans le cas d'une inflammation ou d'une infection. La liaison de l'animal au système d'enregistrement par un câble peut créer une gêne. Les animaux seront ainsi habitués au dispositif d'enregistrement avant le début des expériences. L'isolement peut induire un mal-être, mais ne peut être évité du fait du câblage des animaux au système d'enregistrement.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvement de tissus
Remplacement
L’utilisation de l’animal entier est nécessaire au vu de la question posée impliquant des systèmes biologiques divers et complexes allant de la rétine, avec l’intégration du signal lumineux, au comportement de l’animal en passant par des systèmes neuronaux complexes.
Réduction
Le nombre d’animaux à inclure est déterminé mathématiquement pour nous permettre d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement des conditions d’hébergement, les animaux sont maintenus en groupe sociaux jusqu’à la chirurgie, un enrichissement est réalisé par l’ajout de nids. La chirurgie est effectuée sous anesthésie générale et analgésie. Une grille de suivi des animaux est remplie, évaluant l'état général des animaux ainsi que l'apparence de la plaie à raison de 4 évaluations minimum sur une période de 7 jours suivant la chirurgie. L'état général est ensuite surveillé au minimum une fois par semaine en suivant les mêmes critères. Des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Grâce au modèle de souris utilisé, nous pouvons évaluer l’implication d'une voie neuronale spécifique dans les effets de la lumière sur le comportement. Notre étude sera effectuée chez l'adulte jeune (entre 2 et 4 mois). L’étude repose sur l'exploration des comportements et nécessite que les systèmes neurobiologiques soient totalement mâtures (développement total des systèmes visuels et non visuels, des systèmes circadiens et homéostasiques et des structures cérébrales cibles).
Caractérisation longitudinale par IRM et SRM quantitatives de la sclérose en plaque sur le modèle murin EAE (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent deux injections induisant une encéphalomyélite auto-immune, modèle de sclérose en plaques, qui provoque une paralysie progressive des membres, puis des séances d'IRM avant prélèvement du cerveau et de la moelle épinière. Le porteur décrit une paralysie qu'il présente comme réversible et n'attend pas d'effet indésirable de l'imagerie. Il affirme qu'aucun système in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la maladie et que le modèle animal en est la "seule alternative".
Objectifs
De nos jours, l'IRM diagnostique de la sclérose en plaque repose principalement sur la visualisation de manière qualitative des plaques au niveau du cerveau. L’idée de ce projet est de réaliser une étude quantitative afin de calculer un certain nombre de paramètres quantitatifs issus des images IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) et des spectres SRM (Spectroscopie par Résonance Magnétique). Ceci devrait nous permettre de mieux comprendre la pathologie au cours de son développement tant sur le plan cérébral qu’au niveau de la moelle épinière ou du nerf optique. Ce projet n’a pas fait l’objet d’une évaluation par d’autres instances.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont une meilleure compréhension de la mise en place de la pathologie dans le modèle particulier EAE (Expérimental Autoimmune Encephalomyelitis) de réponse autoimmune au niveau du cerveau et de la moelle épinière. Ces résultats seront corrélés avec ceux de nos collaborateurs qui étudient le rôle des lymphocytes Treg dans la mise en place et l'évolution de la sclérose en plaques.
Procédures
La réalisation du modèle EAE implique deux injections : * une première injection de MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) - durée 30s * une deuxième injection de 200ng de toxine de pertussis - durée 30s L'IRM de perfusion nécessite l'injection de DOTAREM (agent de contraste utilisé en routine clinique) : injection en 10s- durée de l'IRM : 1h30 maximum
Impact sur les animaux
Les signes cliniques dans le modèle EAE consistent en une paralysie progressive des membres antérieurs et postérieurs qui apparait dans les 10-14 jours après injection. Cette paralysie est réversible. Aucun effet indésirable n'est attendu pour l'imagerie et la spectroscopie. En effet l'IRM et la SRM sont deux techniques non invasives et atraumatiques largement utilisées en recherche préclinique pour des études longitudinales.
Devenir
Pour chaque procédure ,les animaux seront maintenus en vie jusqu’à J30 pour un suivi longitudinal. A la fin de chaque procédure ils seront mis à mort. Le cerveau et la moelle épinière seront prélevés.
Remplacement
Notre projet porte sur la compréhension de la physiopathologie d’une maladie autoimmune inflammatoire, la sclérose en plaque (SEP). Aucun système in vitro ou in silico ne peut à l’heure actuelle reproduire la complexité des mécanismes cellulaires et moléculaires initiant et entretenant cette pathologie. Les modèles animaux de SEP, dont le principal est l’EAE, miment le développement de l’autoimmunité et le déclenchement de l’inflammation chronique du système nerveux central (SNC). Ils sont ainsi la seule alternative adaptée à l’étude des mécanismes immunitaires de la SEP. Nous ne réaliserons pas de tests in vitro avant sur des cellules cérébrales ou de moelle épinière
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi du développement de la SEP ainsi que la SRM permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Ce projet nécessitera 240 souris. L’étude IRM se fera par mesure des intensités de signal sur les images. Des tests non paramétriques Mann-Whitney seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.
Raffinement
Les souris sont maintenues en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Elles sont hébergées dans des cages enrichies pour améliorer leur bien-être. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs.
Choix des espèces
Le modèle de l’EAE existe chez la souris, le rat et le primate non humain. Il reproduit les signes cliniques, histologiques et immunologiques de la maladie humaine, la SEP. Le choix de la souris est de plus justifié par l’existence d’outils biotechnologiques (anticorps, dosage de molécules..) adaptés à cette espèce. L’induction de l’EAE se fera sur des animaux de 5-10 semaines. L'âge des souris au moment de leur utilisation est déterminé par la maturation du système immunitaire
Maturation des circuits de l’adaptation au stress de l’ontogénie à la pathologie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie générale pour implanter des électrodes ou des fibres optiques dans le cerveau et injecter des virus, puis des tests comportementaux sur animaux vigiles, pour étudier l'influence des hormones de stress sur les circuits sociaux et un modèle du syndrome de Prader-Willi. Le porteur indique des douleurs modérées après les injections et la chirurgie, et un stress appliqué aux souris vigiles lors des tests. Il affirme que l'étude du comportement social suppose l'interaction entre êtres vivants, ce qui rendrait "impossible" le recours à un modèle in vitro.
Objectifs
Le stress est un facteur de risque de plusieurs maladies mentales affectant des millions de gens et imposant un coût socioéconomique important. Comprendre pourquoi certaines personnes sont plus de susceptibles que d'autres aux maladies mentales liées au stress est un défi prioritaire de la communauté Européenne et des associations de malades. Notre hypothèse est que le stress créerait un déséquilibre de perception entre des signaux d'alerte et de sûreté échangés entre partenaires sociaux. L'impact du stress serait d'autant plus important qu'il se rapprocherait de la période sensible du développement du cerveau. La persistence de ce déséquilibre chez l'enfant pourrait entrainer des troubles anxio-dépressifs chez l’adulte. De nombreuses études cliniques sont actuellement menées chez l’Homme dans lesquelles les hormones (ocytocine et vasopressine sont utilisées dans l’espoir de corriger les troubles d'anxiété et de comportements sociaux. Cependant, le mode d’action de ces deux hormones dans le cerveau reste méconnu. Un déficit de sécrétion de ces hormones pourrait avoir des conséquences directes sur le comportement social. C’est le cas par exemple de la maladie rare génétique du syndrome de Prader Willi (PWS) et du syndrome de Schaaf Yang (SY). Les trois quart des malades présentent des troubles du spectre autistique d’ordre cognitif et de sociabilité qui se manifestent chez l’adulte. De plus, l'administration d'un traitement chez les patients atteints de PWS montre un réel bénéfice à l'age adulte tant sur le comportement social que sur les autres troubles associés à la maladie comme par exemple l'hyperphagie. Le projet vise donc à suivre l’influence des hormones de stress sur le développement des cellules impliqués dans la perception des signaux d'alerte et de sûreté échangés avec des partenaires sociaux. Un autre des objectifs de ce projet est de mieux comprendre comment les neurones se mettent en place dans un modèle de PWS et leur impact sur le comportement social et le dernier objectif est de tester un traitement pour les personnes étant malades.
Bénéfices attendus
Cette étude représenterait un progrès significatif afin de comprendre comment le stress ou une maladie génétique influence la mise en place des circuits neuronaux ainsi que le comportement social. Dans un second temps, cela nous permettra de mieux caractériser le fonctionnement du traitement de PWS par l'ocytocine.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales sous anesthésie générale. Cela concerne l'implantation des électrodes électroencéphalographiques ou des fibres optiques ainsi que l'injection de virus pour exprimer des transgènes traceurs ou bien modificateurs. Une facon de réduire les nuisances prévues consiste à poser les implants pendant la même procédure que l'injection de virus. Cette méthode est efficace en terme de résultats et permet de réduire le nombre d'intervention. Chaque procédure ne durera pas plus de 40 minutes et elles seront faites par un experimentateur formé avec soin pour respecter les normes européennes d'expérimentation animale.
Impact sur les animaux
Des douleurs modérées peuvent être constatés chez les souris suite à des piqures d'injection. Sont également à prévoir des douleurs modérés après la chirurgie sous anesthésie générale (des anesthésiques locaux sont administrés systématiquement après la chirurgie afin de diminuer les effets indésirables) et du stress sur animaux vigiles sera appliqué pour les test comportementaux.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en respectant les bonnes pratiques et conformes à la protection des animaux pour vérifier l'inclusions ou non des individus avec les recombinaisons génétiques attendus.
Remplacement
La souris et l’homme partagent environ 98% de leurs 30 000 gènes, cela en fait donc un bon modèle pour étudier certaines maladies génétiques, d'autant que nous savons maintenant comment facilement manipuler leur génome. De plus, l'architecture cérébrale de la souris et de l'homme présente de nombreuses similitudes permettant de mieux comprendre les comportements humains grâce à la caractérisation du comportement de ce rongeur. Ces études du comportement social nécessite l'interaction entre des être-vivants rendant impossible l'utilisation de modèle in-vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit grâce à une approche longitudinale de sorte que chaque individu est son propre controle. Le nombre d’animaux par groupe et par condition est determiné à minima afin d'obtenir des données statistiquement significative.
Raffinement
Les animaux ne sont pas isolés et ont un environnement enrichi. Des points limites ont été clairement établis ainsi que les mesures appropriés afin de prendre en charge la douleur. Les animaux sont manipulés par l'expérimentateur tous les jours de manière douce afin d'eviter le stress avant les procédures experimentales. Les animaux sacrifiés à la fin de l'experimentation seront utilisés afin de corréler les données obtenues lors des test de comportement social aux études de biologie moléculaire permettant ainsi une exploitation optimale des souris.
Choix des espèces
La souris est un animal facile à élever et à manipuler, pour lequel les caractéristiques pharmacologiques des récepteurs de l’ocytocine et de la vasopressine sont bien connues, dont les rythmes électro-encéphalographiques sont bien décrits et rapportés à des comportements caractérisés. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu'à l'âge adulte afin de réaliser des études longitudinales de comportement.
Virus du Nil occidental (West Nile virus) : évaluation dans un modèle animal des facteurs génétiques impliqués dans la virulence
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Infectées par le virus West Nile, elles peuvent développer une perte de poids, une perte d'équilibre, une paralysie et mourir, un point limite de deux signes cliniques déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Le porteur compare la virulence de virus chimériques assemblés en laboratoire pour identifier les facteurs génétiques en cause. Il indique que la capacité du virus à infecter le système nerveux ne peut s'étudier qu'in vivo et présente ce modèle comme "nécessaire".
Objectifs
L’infection au virus West Nile (VWN) constitue un risque majeur pour la santé humaine et animale notamment chez les oiseaux sauvages et les équidés. Les symptômes liés à la maladie vont de la simple fièvre jusqu’à des atteintes neurologiques pouvant être mortelles dans les cas les plus sévères. Ce virus est présent dans de nombreux pays européens, avec 49 cas équins et 1 humain en 2015 ou encore 13 cas équins et 26 cas humains dans le sud de la France en 2018. Le VWN est retrouvé tous les ans dans le sud de la France. Sa transmission est assurée par les moustiques du genre Culex. Le réchauffement climatique impactant la distribution des espèces de moustiques, la répartition géographique de certains agents vectorisés par ces derniers, dont le VWN, peut se voir modifiée dans les prochaines années. La compréhension des mécanismes de la virulence chez l’hôte vertébré permet d’anticiper et de réagir rapidement face aux nouvelles épidémies. Actuellement, malgré la présence de traitement chez l’animal, aucun vaccin n’a été développé chez l’Homme. L’étude des facteurs impliqués dans la virulence s’ancre dans une dynamique de proposition de nouvelles cibles afin de disposer de solutions vaccinales. La souche WN Israël 1998 est considérée comme très virulente chez l’oiseau, tandis que la souche WN Italie 2008 est faiblement virulente. Des outils innovants en laboratoire ont rendu possible la génération de VWN modifiés, appelés chimères, par un assemblage artificiel de régions génétiques d’intérêts issus de ces deux souches et potentiellement impliquées dans la différence de leur virulence. Ces chimères ont déjà fait l’objet d’une étude dans des modèles cellulaires en laboratoire. Mais le VWN a la capacité à infecter le système nerveux. Cette capacité neuroinvasive ne peut s’étudier qu’à l’aide d’un modèle in vivo. L’évaluation de la virulence de ces chimères sur un modèle murin permettra de mieux comprendre le mécanisme de virulence de ces deux souches et d’identifier les facteurs génétiques potentiellement impliqués dans la virulence chez les vertébrés.
Bénéfices attendus
Nous avons choisi d’étudier la différence de virulence (dangerosité, capacité à se répliquer et à entraîner une possible mortalité) engendrée par la souche WN Israël 1998 et la souche Italie 2008 en modifiant leur génome. Pour cela, nous avons décidé d’échanger une partie de génome d’un virus avec une partie du génome de l’autre virus afin de reconstituer un génome entier, modifié, comprenant d’une part des fragments du premier virus et d’autre part des fragments du deuxième virus. Nous avons eu recours à une méthode au laboratoire permettant de remplacer un fragment génomique du virus Israël 1998, par le même fragment mais issu du virus Italie 2008. Ces virus ayant une virulence différente, cela permet de comprendre quel fragment peut être responsable d’une virulence amoindrie chez Italie 2008 par rapport à Israël 1998. A plus long terme, cette étude permettra d’identifier de nouvelles cibles pour la lutte antivirale.
Procédures
Seuls des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles (à la queue ou à la joue) ou sur souris anesthésiés (au sinus rétro orbital) par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement dure quelques secondes par souris. Les souris seront contrôlés tous les jours.
Impact sur les animaux
Les souris sont sensibles à l’infection par WNV. Les signes cliniques décrits sont la perte de poids, perte d’équilibre et de motricité d’un membre, paralysie et la mort. Les animaux seront contrôlés tous les jours puis 2 fois par jour dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un point limite a été défini pour décider de la mise à mort d’animaux, à savoir la présence simultanée de deux des signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte d’appétit, poils ébouriffés, dos voûté, perte d’équilibre, perte de certaines capacités motrices.
Devenir
West Nile est un virus de classe 3, zoonotique. Les souris peuvent mourir de l’infection. Toutefois, un point limite (moment à partir duquel l’expérimentation sera arrêtée) est défini pour cette procédure expérimentale à savoir la présence simultanée de deux signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte d’appétit, poils ébouriffés, dos voûté, perte d’équilibre, perte de certaines capacités motrices. Dans le cas où les souris n’ont pas présenté ces signes avant la fin de l’expérimentation, elles seront mises à mort le dernier jour expérimental, pour permettre la récupération d’organes, et l’analyse de la quantité de virus dans ces différents prélèvements.
Remplacement
Les différences de comportement des constructions virales réalisées entre les virus WN Israël 1998 et Italie 2008 ont d’abord été étudiées sur des modèles alternatifs (culture cellulaire). Cependant, le modèle in vitro ne permet pas d’évaluer le pouvoir infectieux (développement de signes cliniques, présence de virus dans la circulation sanguine), la localisation du virus dans un organisme (« préférence ») et la virulence (mortalité). Le modèle in vivo est nécessaire pour cette étude.
Réduction
Au total 60 souris maximum seront impliquées dans ce projet d’étude. Six groupes seront constitués. Cinq souris seront utilisées par groupe afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement et scientifiquement. Le nombre de 5 souris par groupe nous permettra d’analyser les résultats obtenus au cours de cette procédure expérimentale par des tests statistiques non paramétriques (Kruskal-Wallis pour une comparaison de moyennes d’échantillons indépendants (quantité moyenne de virus retrouvé dans le sang à un temps donné, suivi de mortalité), test t pour une comparaison de moyenne entre seulement deux échantillons,...). Un résultat sera considéré comme statistiquement significatif si la valeur « p » est strictement inférieure à 5% (p < 0,05). Un duplicat pourra être effectué en cas de la non infection des souris ou bien réaliser la même étude pour d’autres virus West Nile modifiés avec des facteurs génétiques d’intérêts.
Raffinement
Les souris seront plusieurs par cage (5/cage) avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier, coton). Une surveillance bi-quotidienne des animaux est mise en place à compter de l’apparition des premiers signes cliniques. Un point limite a été défini pour décider de la mise à mort d’animaux trop sévèrement atteints, à savoir la présence simultanée de deux des signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte de poids, poils ébouriffés, dos voûté, troubles de la coordination des mouvements, perte d’équilibre, perte de motricité.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée comme modèle d’infection pour le virus West Nile, de par sa grande sensibilité à l’infection après inoculation par différentes voies. Elle développe généralement des signes neurologiques quelques jours post-inoculation. La souris représente donc le modèle idéal en laboratoire pour cette étude. Les souris auront entre 7 et 8 semaines. Les souris seront donc des adultes et cela facilitera les prélèvements sanguins car elles seront plus grosses.
Etude des mécanismes de la mort subite et inexpliquée en épilepsie
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
528 souris modèles du syndrome de Dravet vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes et de sondes, des crises d'épilepsie provoquées par inhalation de gaz de façon répétée et des tests comportementaux d'exploration et de mémoire, l'induction augmentant volontairement la fréquence des morts subites. Le porteur étudie les mécanismes de la mort subite en épilepsie, avec une gamme de médicaments protecteurs présentée comme une perspective. Il affirme qu'aucune crise ne provoque de douleur chez la souris et juge l'usage d'animaux vivants "absolument nécessaire".
Objectifs
Le syndrome de Dravet est une maladie développementale et épileptique sévère, due aux mutations d’un gène codant pour un canal laissant passer le sodium, caractérisée par une apparition précoce (
Bénéfices attendus
La SUDEP est la cause principale de décès chez les patients épileptiques et représente une énorme source d’angoisse pour la majorité des patients épileptiques et leurs familles à cause de son caractère imprévisible, sans aucun signe précédent la mort, et de ses conséquences dramatiques. Ce projet permettra une meilleure connaissance des mécanismes sous-jacent, l’identification de biomarqueurs et de cibles pharmacologiques permettant d’inhiber la SUDEP. Cela pourrait ouvrir une voie pour une nouvelle gamme de médicaments qui protègeraient de la SUDEP. La démonstration du rôle d’un neuromédiateur dans le réveil et l’arrêt de l’apnée post-crise représente l’objectif clinique final de notre projet, et toute la partie préclinique que nous réaliserons permettra de mettre en place le modèle d’analyse et de prédiction des crises.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie (maximum 1h30) qui permet d’implanter des électrodes et des sondes pour mesurer les paramètres physiologiques d’intérêt (activité électrique du cerveau et du cœur, ventilation) et récolter un peu de liquide sous-cutané pour mesurer les molécules d’intérêt. Les périodes d’enregistrement seront sur des périodes de 4 jours maximum, avec des pauses de 2 à 4 jours. Pour que les animaux deviennent épileptiques, ils respireront un mélange d’air et d’un gaz qui déclenche une crise au bout de 20 minutes environ. Ce protocole d’induction est répété quotidiennement pendant une première série de 5 jours, puis après une pause de plusieurs semaines, une seconde et dernière série de 5 jours avec ou non des enregistrements en même temps. Certains groupes auront un fin tube implanté qui permettra d’injecter des molécules d’intérêts sans toucher et stresser l’animal (pas de piqure). Un groupe d’animaux suivra des tests comportementaux très peu invasifs (exploration de nouvelles cages, de nouveaux congénères et mémorisation de parcours ou d’objets).
Impact sur les animaux
Les modèles de souris utilisés sont élevés en routine. A noter, aucune douleur n’est associée aux crises d’épilepsie qui se traduisent par une « extinction » de la conscience chez les humains, ce qui est très probablement la même chose chez les souris. Les crises induites artificiellement pendant les procédures et les crises spontanées apparaissant chez les animaux devenus épileptique sont absolument de même nature, elles ont une durée inférieure à 1 minute. Après les crises, les animaux ont une période d’immobilité d’environ 1 minute puis reprennent leur activité normale. La SUDEP est une mort soudaine, il n’y a aucun signe prédictif et donc aucune douleur ou nuisance quelconque avant son apparition. Les anomalies cardiaques mesurées sur des animaux adultes favorisent probablement la SUDEP mais ne se traduit pas par un phénotype visible, les animaux ont une activité physique normale. Les défauts cognitifs observés chez les adultes traduisent notamment des pertes de mémorisation mais cela n’est pas associé à une douleur pour les animaux. Les anomalies cardiaques et cognitives sont des conséquences à moyen terme, observées après plusieurs jours et non pas immédiatement après le début des premières crises. En résumé, les animaux épileptiques ont un comportement normal pendant leur élevage mais meurent soudainement (SUDEP) avec une fréquence faible, 5%. Les inductions artificielles de crises pendant les procédures vont augmenter la fréquence des SUDEP pendant toute la durée des procédures jusqu’à la mise à mort (effet attendu pour pouvoir étudier les SUDEP). Comme expliqué ci-dessus aucun autre comportement ou effet indésirable n’est attendu. Les nuisances principales induites par les procédures seront les chirurgies d’implantations (sondes et électrodes) et les enregistrements chroniques. Les animaux implantés sont étudiés pour une durée maximale de 40 jours avant mise à mort. Les animaux sont isolés pendant les périodes d'inductions et les périodes d'enregistrement et de tests de comportement (moins de 3h à chaque fois).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, la majorité seront ensuite utilisés afin de récupérer le cerveau pour des analyses biochimiques et immunohistochimiques, cela apportera de nombreuses informations supplémentaires aux paramètres mesurés in-vivo.
Remplacement
L’épilepsie est un syndrome complexe avec des mécanismes de mise en place peu connus qui impliquent le système nerveux central, le système nerveux périphérique, le système cardiaque et vasculaire et probablement le système immunitaire. Il est donc impossible d’étudier ces mécanismes dans des systèmes in-vitro et l’utilisation d’animaux vivants est absolument nécessaire.
Réduction
Nous utilisons indifféremment les mâles et les femelles qui seront répartis dans les groupes d’étude, soit une perte minimale. Les croisements ont été optimisés afin que la quasi-totalité des animaux à phénotype dommageable produits soient utilisés dans les procédures expérimentales. Une procédure est exploratoire et permet la mise au point fine des expériences et une optimisation du nombre d’animaux utilisés. Le nombre minimum d’animaux nécessaires dans chaque groupe de chaque procédure a été calculé avec des outils statistiques afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en répondant à la question scientifique. Pour les mises au point, nous réutilisons des souris non utilisées dans les procédures.
Raffinement
Les animaux seront hébergés (au minimum 2 et maximum 5 par cage) avec un abri, de la ouate et une buchette pour leur permette des activités variées. Les conditions de réalisation des chirurgies ont été optimisées afin de réduire au maximum la souffrance des animaux ; tapis chauffant avec sonde rectale pour maintien précis de la température, application d’anesthésique local, cage de réveil chauffée, traitements antalgiques et antiinflammatoire (pendant et après la chirurgie) et une grille de score avec des actions précises mise en place. Nous utilisons des électrodes implantées en routine depuis plusieurs années dans des cages adaptées (connectique souple et rotative) et en alternant les périodes d’enregistrement avec des périodes de repos sans enregistrement pour diminuer la contrainte. Les animaux en enregistrement ne présentent aucun signe de souffrance (enregistrements déjà réalisés sur plusieurs mois). Ils sont enregistrés par 2 dans une cage. Ils sont séparés, et non pas isolés, par une paroi métallique munies de nombreux trous de 1 cm de diamètre permettant les contacts, des échanges de ouate et d’odeurs. Les animaux tests sont des animaux sauvages à phénotype non dommageable. Nous utilisons des cathéters implantés pour injecter les animaux sans manipulation et sans piqure ce qui évite tout stress au moment de l’injection.
Choix des espèces
Plusieurs types de souris modèles du syndrome de Dravet sont utilisés, ils reproduisent très bien les symptômes observés chez les patients humains. Nous avons basé ce projet sur un modèle que nous utilisons couramment et connaissons bien, que nous n’avons pas besoin de générer une autre lignée et que nous pouvons sélectivement augmenter le taux de SUDEP à plusieurs âges (après induction). L’utilisation des souris DBA/1 est basé sur leur pertinence en tant que modèle de la SUDEP et parce que cela ne nécessite aucun croisement supplémentaire, les animaux sont tout de suite utilisables dans les procédures, et elles présentent un phénotype normal avant l’induction (élevage classique). Le choix de lignées spéciales avec des mutations qui permettent d’utiliser des outils génétiques couplés à une stimulation chimique ou lumineuse est restreint par la disponibilité de lignées ciblant spécifiquement les neurones d’intérêt qui sécrètent la sérotonine ou le neuromédiateur d’intérêt. Les lignées achetées puis croisées pour aboutir aux génotypes nécessaires sont normales. Seuls les animaux issus des derniers croisements destinés aux procédures devraient avoir un phénotype dommageable. Les crises peuvent être induite sans limite de P19 jusqu’à l’âge adulte. Nous utiliserons les animaux dès le sevrage à l’âge P21 pour avoir des animaux assez robustes et mimer l’apparition des crises chez les jeunes. La plupart des mesures sont sur des animaux plus âgés (P50 ou P70) pour pouvoir comparer aux données de nos collaborateurs sur des patients adultes.
Les oligosaccharides, nouvelle cible pour le traitement des tauopathies, tels que la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris exprimant une forme humaine mutée de la protéine tau reçoivent des injections intrapéritonéales ou orales deux fois par semaine pendant deux mois, avant mise à mort pour analyser le cerveau. Le porteur teste des sucres complexes censés freiner les tauopathies comme la maladie d'Alzheimer, dont il affirme déjà qu'ils "se révèlent utiles". Il présente la souris comme "la seule espèce mammifère" modifiée pour exprimer la tau humaine mutée et juge la confirmation in vivo "nécessaire".
Objectifs
Les tauopathies, auxquelles appartiennent la maladie d’Alzheimer et les démences fronto-temporales, se caractérisent par une perte neuronale due à l’accumulation de la protéine tau sous une forme anormale (=tauopathie) dans le cerveau des patients. À ce jour, aucun traitement curatif de ces pathologies n’existe sur le marché. Dans le but de développer un traitement pour ces pathologies, notre laboratoire étudie le rôle de certains sucres complexes (=oligosaccharides), sur la modification anomale de la protéine tau. Il a notamment été montré que certains sucres complexes sont critiques pour le développement et l’évolution de la maladie d’Alzheimer. La forme anormale de tau dans les cellules neuronales résulte de l’interaction de la protéine avec ces oligosaccharides complexes internalisées dans les neurones des sujets malades. Enfin des études préliminaires ont montré la capacité d'un oligosaccharide mimétique à diminuer le développement des tauopathies en rentrant en compétition avec les sucres complexes de la membrane cellulaire et en diminuant la propagation de la tauopathie. Les oligosaccharides mimétiques se révèlent dès lors être utiles dans le traitement des tauopathies, et tout particulièrement dans le traitement de la maladie d’Alzheimer. Notre objectif va être de démontrer qu'il est possible en utilisant nos oligosaccharides mimétiques de diminuer le développement de la tauopathie dans un modèle murin exprimant la protéine Tau humaine mutée responsable du développement de la maladie. Ainsi en poursuivant l’étude de ces molécules dans ce modèle, sélectionné pour sa capacité à reproduire plusieurs aspects de la maladie (modification de la tau, mort des neurones et troubles cognitifs aux âges avancé…), nous espérons avoir des preuves solides de l’efficacité de cette stratégie thérapeutique pour débuter de premières études chez l’homme. En effet, il est nécessaire d'un point de vue réglementaire de démontrer que notre concept est efficace dans un modèle se rapprochant de l'homme pour débuter des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Actuellement les traitements sur le marché sont uniquement symptomatiques et ont un bénéfice clinique limité pour les patients. Il est ainsi important de développer un traitement capable de stopper ou ralentir les mécanismes impliqués dans le développement de la maldie d'Alzheimer. Ce projet consiste donc à caractériser l'effet d'une nouvelle classe de molécules thérapeutiques ciblant un mécanisme impliqué dans l'agrégation anormale de la protéine Tau, qui mène aux troubles cognitifs de la maladie.
Procédures
Les procédures 1 et 2 consistent en des traitements 2 fois par semaine (les matinées du lundi et jeudi) pendant 2 mois par injection intra-péritonéale ou administration par voie orale des molécules d'intérêt (max 0,1 ml/souris) ou des mises à mort afin de récupérer le tissu cérébrale en vue d'analyses. Pour un groupe d’animaux (6 animaux par cage) il faut environ 10 min par traitement. Cela comprend la pesée et l’injection intra-péritonéale (ou administration par voie orale) des 6 animaux du même groupe.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux dans nos procédures sont liés à l’élevage en captivité des animaux sur plusieurs mois et la manipulation des animaux (contention, change). Pour information, les animaux sont utilisés à des âges inférieurs à 5 mois, c'est-à-dire avant le début des signes cliniques moteurs modérés induits par la tauopathie dans ce modèle. Nos deux procédures sont classées modérées et les nuisances et effets indésirables attendus sont liés à la contention et à l'insertion répétée de l'aiguille en intra-péritonéale même si le site d'injection est alterné (droite et gauche). Pour information l'analyse toxicologique de nos molécules faite chez la souris C57BL6 par un laboratoire pharmaceutique n'a pas montré de toxicité même à forte dose (500 mg/kg) pour la voie orale. Les effets indésirables pourront également être évalués lors des études de biodisponibilité des produits qui seront réalisées par la même société en amont de cette partie expérimentale. Par ailleurs de précédentes études utilisant nos molécules n'ont pas mis en évidence de potentiels effets toxiques de la molécule aux doses utilisées (voie intra-péritonéale, 2 mois, 2x/semaine, 25 mg/kg).
Devenir
Les animaux de l'ensemble des procédures seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les analyses nécessaires à la quantification de nos paramètres biologiques dans le cerveau.
Remplacement
La tauopathie est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine Tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie caractéristique de la maladie d'Alzheimer. Des résultats antérieurs obtenus sur des cellules primaires issues de ce modèle de souris montrent des effets prometteurs de notre molécule d'intérêt. La confirmation dans un modèle murin est maintenant nécessaire.
Réduction
Pour les études chez l'animal, nous avons optimisé le nombre d’animaux par groupe (12 souris / groupe pour la procédure 1 et 20 souris / groupe pour la procédure 2) afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et réaliser des analyses avec un nombre d’animaux réduit au strict nécessaire. Pour chaque animale, différentes régions du cerveau seront étudiés afin de caractériser l'évolution de la pathologie. Ainsi chaque groupe sera subdivisé en sous-groupe de 12 ou 20 animaux, selon leur âge, qui seront maintenus vivants dans les conditions standard d’animalerie pendant 2 et 4 mois. Aux temps correspondants, les différents groupes d’animaux seront mis à mort afin d’étudier l’évolution de la maladie dans le cerveau ainsi que sa corrélation avec notre cible. Pour répondre à ces objectifs au maximum, 256 souris seront nécessaires (sur 5 ans). Les différentes lignées de souris utilisées dans le projet seront disponibles par un élevage en interne. De plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux dans le cadre de la sélection de la dose optimale, la biodisponibilité des molécules les plus efficaces a été réalisée en externe par un laboratoire pharmaceutique.
Raffinement
Afin de détecter et de limiter la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux, nous surveillerons leur état général et leur comportement. Une liste de vérifications contenant l’ensemble de points définis pour identifier la douleur ou la détresse de l’animal est établie : -L’évolution du poids de la souris -L’état de ses poils : poil hérissé -Sa posture, sa démarche et comportement : dos voûté, léthargie ou réticence à se déplacer, état défensif, grattage ou morsure. -On explore son environnement : absence de toilettage, redressement sur ses pattes arrière, diminution de la quantité de nourriture et d’eau ingérée. L’ensemble permet d’identifier si les animaux souffrent. Les animaux sont observés 2 fois/jour jusqu’à leur mise à mort (sacrifice). En cas de douleur : Les souris souffrantes seront transportées dans des cages isolées. Une injection d'un anti-douleur sera réalisée pour un effet antalgique et l’état de l’animal sera suivi. Durant la période d’hébergement, l’eau de boisson sera changée chaque jour et un régime alimentaire normal sera fourni. En cas de non-récupération observée nous allons consulter le personnel vétérinaire du laboratoire afin d’obtenir leur expertise en matière de signes cliniques de la douleur ou de la détresse.
Choix des espèces
Notre objectif est de valider l’importance de certains sucres complexes, dans un modèle mammifère de tauopathie. L’expérimentation sur le rongeur reste une étape indispensable avant toute expérimentation sur des modèles plus proche de l’homme (primate). Les rongeurs sont adaptés aux études scientifiques : 98% des gènes partagés avec l’homme, faibles tailles, grandes fécondités, courtes durées de vie, accessibilité et disponibilité d’outils biologiques. De plus, la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie (modèle reconnu par la communauté scientifique). Les souris qui développent la tauopathie sont utilisées à l'âge adulte à partir de 2 mois et jusqu'à 4,5 mois (mise à mort à 4 et 4,5 mois), c’est -à-dire de l'âge où la tauopathie commence à se développer (2 mois) et sacrifiées avant l'apparition des signes cliniques moteurs (8 mois). Les souris « contrôle » de même fond génétique ne possédant pas la mutation, servant de référence à ces études sont utilisées aux mêmes âges. Les organes périphériques des souris traitées avec les molécules seront également utilisés pour étudier les effets secondaires périphériques possibles des molécules. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte (2-4 mois).