Système nerveux
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Imagerie de la neuroinflammation par ultrasons, chez la souris nouveau-né et la jeune souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 506 souris, dont des souriceaux de 5 jours, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de molécule pro-inflammatoire dans le péritoine ou directement dans le cerveau, subissent une ouverture de la boîte crânienne sous anesthésie et des séances d'imagerie par ultrasons, pour étudier la neuroinflammation du cerveau en développement. Le porteur indique que l'injection provoque un retard de croissance et peut entraîner des troubles comportementaux et moteurs, et décrit trois tests évaluant la communication sociale, la reconnaissance de l'odeur maternelle et le stress. Les retombées annoncées pour le nouveau-né humain prématuré sont renvoyées au long terme, l'objectif immédiat restant l'imagerie du cerveau enflammé.
Objectifs
La neuroinflammation est une réaction inflammatoire (réaction de l'organisme aux lésions et infections) qui se produit dans le cerveau. Lorsqu’elle survient peu avant ou après la naissance, la neuroinflammation peut impacter des phases critiques du développement du système nerveux central et avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu (handicaps moteurs, troubles comportementaux, déficits cognitifs…). Cette étude vise à mieux comprendre l’impact de l’inflammation sur le développement cérébral. Nous nous intéressons ici à trois caractéristiques du cerveau : la connectivité entre différentes régions cérébrales lorsqu'elles sont activées, l’architecture vasculaire et la rigidité. La connectivité analyse l’activation simultanée de plusieurs aires cérébrales structurellement différentes. La neuroinflammation engendre des défaillances de cette connectivité fonctionnelle. L’inflammation modifie également les vaisseaux sanguins de la zone touchée, puisqu’elle se traduit par un afflux important de sang à cet endroit. L’architecture vasculaire à l’échelle des microvaisseaux fera l’objet d’une partie de cette étude. Enfin, la neuroinflammation, de par ses conséquences au niveau vasculaire notamment, pourrait modifier la rigidité du cerveau, et nous chercherons à quantifier cette modification. Les ultrasons biomédicaux, utilisés à des fins d’imagerie diagnostique, sont un moyen parfaitement adapté à l’étude de ces trois caractéristiques. L’essor considérable qu’ils ont connu au cours des dernières années a permis d’augmenter le niveau de détail des images, spatialement et temporellement, et leur sensibilité. Dans notre étude, trois techniques d’imagerie ultrasonore seront utilisées : les ultrasons fonctionnels pour étudier la connectivité fonctionnelle, l’imagerie superrésolution pour cartographier l’architecture cérébrale à l’échelle des microvaisseaux, et l’élastographie pour mesurer la rigidité du cerveau inflammé. L’effet de la neuroinflammation sur le comportement sera également étudié. Trois tests comportementaux seront mis en œuvre pour évaluer la communication sociale des animaux, la reconnaissance de l’odeur maternelle par les souriceaux et le stress des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue à enrichir les recherches faites sur la neuroinflammation chez le souriceau, en utilisant une méthode jusque-là peu utilisée pour étudier ce sujet : l’imagerie par ultrasons. En particulier, l’étude de l’impact possible de l’inflammation sur la rigidité du cerveau constitue la principale avancée de ce projet. A plus long terme, les données collectées serviront à la recherche sur le nouveau-né humain prématuré. La neuroinflammation est en effet une conséquence de la prématurité des enfants, dans 20 à 40% des cas. Elle est à l’origine de la plupart des lésions dans le cerveau du nourrisson, regroupées sous le terme d’encéphalopathie du prématuré. Mieux comprendre les modifications de vascularisation, de connectivité et de rigidité induites par la neuroinflammation contribuera à élargir les outils pronostiques de la prématurité, afin de pouvoir mettre en place des interventions plus précoces et ouvrir la voie à de nouveaux traitements.
Procédures
- Les animaux recevront une injection (à travers le péritoine, sans anesthésie, 1 min ; ou directement dans le cerveau, avec anesthésie, environ 30 min) d’une molécule pro-inflammatoire, à deux stades de croissance différents (5 jours et 30 jours après la naissance). - Les animaux au 30ème jour après la naissance nécessitent une opération chirurgicale d'ouverture de la boîte crânienne, au cours de laquelle ils seront placés sous anesthésie générale (environ 1h). - Toutes les mesures d’imagerie ultrasonore (imagerie fonctionnelle, élastographie, imagerie superrésolution) sont réalisées sous anesthésie générale (durée variable en fonction des mesures à effectuer : entre 15 min et 1h30). - L'imagerie superrésolution nécessite en plus l'injection de microbulles dans la circulation sanguine, réalisée sous anesthésie, à l'aide d'une seringue très fine, adaptée à la taille de l'animal (environ 2 min).
Impact sur les animaux
- L’administration intra-péritonéale (i.e., dans le péritoine) ou intra-cérébroventriculaire (i.e., directement dans le cerveau) peut créer une infection locale dans la zone d’injection. - L’injection de molécule inflammatoire engendre un retard de croissance chez les animaux concernés, qui se traduit morphologiquement par une taille et un poids inférieurs à la normale. De plus, les animaux injectés sont susceptibles de développer des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible…) et moteurs. - Une dose mal estimée d’anesthésie au cours des acquisitions en imagerie peut engendrer le réveil des animaux si trop faible, ou leur mort si overdose, ce qui justifie une étape préalable d'ajustement des doses. - La manipulation des animaux au cours des injections, ainsi que l’injection elle-même, et les tests de comportement sont sources de stress pour les animaux.
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés. Ils auront en effet reçu des injections et/ou subi une craniotomie donc ne pourront pas être maintenus en vie.
Remplacement
Notre étude s’intéresse à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel, qu’il est par conséquent impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques).
Réduction
Au total, notre projet nécessitera au maximum 1506 animaux. Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique.
Raffinement
- Des grilles de scoring en fonction de l’âge des animaux seront proposées pour s’assurer du bien être des animaux et déterminer les points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus des animaux. Suite à l’inflammation, on surveillera régulièrement la prise de poids et l’apparition éventuelle de troubles comportementaux (isolement, agressivité) : la molécule inflammatoire sera injectée le matin, puis les animaux seront surveillés 1h, 6h, 10h, 22h et 24h après l’injection (deux personnes se relaieront pour la surveillance). Si l’un de ces points limites est atteint, et/ou à la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés. - Les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. - Pendant les chirurgies nécessaires pour la mise en place des appareils d’imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l’animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure de chirurgie sera interrompue et l’animal euthanasié. - Au cours des acquisitions en imagerie, sous anesthésie générale, les constantes physiologiques suivantes seront mesurées en continu : fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température.
Choix des espèces
Dans le cas de l’étude de la neuroinflammation, la littérature montre que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; il pourra donc, à plus long terme, être appliqué au cas du nouveau-né humain. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de la neuroinflammation sur certaines caractéristiques du cerveau, à différents stades de croissance : les animaux seront utilisés au cours du développement, à un stade encore immature du cerveau (5 jours après la naissance), et à plus long terme, lorsque le cerveau a atteint sa maturité (30 jours après la naissance).
Etude du métabolisme et de la thermogénèse d’un modèle murin Knock-Out.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
72 souris knockout vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses physiologiques et moléculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent des prélèvements de sang par incision du bout de la queue et une exposition au froid à 10 puis 4 °C, un groupe étant exposé à 4 °C sans nourriture. Le porteur indique que ces procédures peuvent provoquer une baisse de la température corporelle et une perte de poids, et que l'isolement en cage individuelle représente un facteur de stress. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de "système cellulaire pertinent" pour étudier ces deux gènes exprimés dans le cerveau, un nouveau modèle préclinique de la maladie étant renvoyé au long terme.
Objectifs
Dans le cadre de cette demande, nous souhaitons aborder les conséquences physiologiques de la perte de fonctions deux gènes in vivo, en utilisant la souris comme modèle d’étude (souris knockout,KO). Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés uniquement dans le cerveau, avec une expression marquée dans les neurones. Chez l'humain, des données cliniques montrent que des anomalies dans l’expression de ces gènes sont liées à une maladie rare, associée à des troubles métaboliques. Comprendre la fonction de ces gènes, très conservés entre humains et souris, représente un réel enjeu conceptuel et devrait contribuer à améliorer notre compréhension de l’étiologie de la pathologie. A ce jour, il n’existe pas de système cellulaire pertinent permettant d’aborder leurs fonctions. Plus précisément, nous souhaitons tester si l’invalidation de ces gènes que nous étudions influence de potentielles perturbations du métabolisme qui sont caractéristiques de la pathologie chez l’humain.
Bénéfices attendus
Notre programme de recherche vise à combiner génétique inverse et exploration phénotypique pour parfaire notre compréhension de l’importance physiologique de ces deux gènes d'interêt. De nature fondamentale, les expériences proposées sont susceptibles d’avoir des retombées dans le domaine biomédical puisque les données cliniques les plus récentes indiquent que la perte d’expression de l'un deux, et aussi probablement de l'autre, joue un rôle déterminant dans la physiopathologie du syndrome. Cette maladie rare s’accompagne de nombreuses altérations dont métaboliques. Un trait saillant de ce syndrome est une hyperphagie obsessionnelle accompagnée par une baisse de la dépense énergétique qui, le plus souvent, se traduit par une obésité morbide. Comprendre la fonction de ces gènes très conservés entre humains et souris, représente un réel enjeu conceptuel. A court terme, ce travail permettra de mieux définir la contribution des ces gènes dans le contrôle du métabolisme. A plus long terme, notre souris knockout pourrait représenter un nouveau modèle pré-clinique de la maladie.
Procédures
Procédure 1 (N=24 souris): Deux prélèvements de sang sont réalisés par une fine incision à l'extrémité de la queue pour prélever une goutte de sang, dont le volume total est égal à 100uL (durée quelques minutes). Ils seront réalisés une seule fois durant cette procédure. Le premier pour déterminer la glycémie et la cétonémie. Une goutte de sang est déposée sur une bandelette d'un glucomètre et sur une bandelette d'un lecteur de β-Ketone. Puis le deuxième prélèvement de sang est effectué afin de doser les acides gras libres. Procédure 2 (N=48 souris): Deux prélèvements de sang sont réalisés par une fine incision à l'extrémité de la queue pour prélever une goutte de sang, dont le volume total est égal à 100uL (durée quelques minutes) seront réalisés à T0h, T11h et T24h. Le premier pour déterminer la glycémie et la cétonémie. Une goutte de sang est déposée sur une bandelette d'un glucomètre et sur une bandelette d'un lecteur de β-Ketone. Puis le deuxième prélèvement de sang est effectué afin de doser les acides gras libres (uniquement à T0h et T24h).
Impact sur les animaux
Pour la procédure 1 et 2, les animaux sont individualisés dans des cages, cela peut représenter un facteur de stress durant les premières heures d'isolement. Les deux procédures expérimentales consistent à challenger le métabolisme des souris en les exposants au froid (10°C ou 4°C). Une des nuissances attendues est la diminution de la température corporelle. Pour la procédure 2, un groupe de souris par génotype (WT et KO) est exposé au froid (4°C) sans nourriture. Les nuissances attendues sont la perte de poids et la diminution de la température corporelle. Pour les deux procédures expérimenatles une douleur est occasionnée lors des prélèvements de sang par incision du bout de queue.
Devenir
A l'issue de chaque procédure expérimentale, l'ensemble des animaux (soit 72 au total) sera mis à mort pour poursuivre les investigations physiologiques, histologiques, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Nous comptons explorer la fonction biologique de ces deux gènes d'interêt. Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés uniquement dans le cerveau. Il n’existe pas de modèle cellulaire simple permettant d’aborder la fonction de ces derniers, notamment leurs rôles dans le contrôle du métabolisme.
Réduction
L’équipe avec laquelle nous collaborons, dispose d’un recul important concernant le nombre d’animaux à utilisés. Compte tenu de la variabilité des profils métaboliques observée au sein d’un groupe d’animaux, 12 animaux par groupe suffiront pour ces tests afin de réaliser des statistiques fiables sur nos résultats.
Raffinement
Les animaux sont placés en salle d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place des carrés de ouate dans les cages pour amoindrir le stress du transport. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les cages sont passées en revue quotidiennement et les animaux sont observés en détail au moins 3 fois par semaine (2 changes par les zootechniciens, 1 fois par les expérimentateurs). Des points limites ont été définis. Tous les signes de souffrance lors des observations quotidiennes tels que des blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur (une perte de poids >20%), problème de dentition ou une altération de l'état du pelage conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Tous les modèles animaux de cette maladie génétique décrits à ce jour sont réalisés chez la souris. Nous pourrons donc comparer directement nos observations avec celles de la littérature. Cela permet aussi d’éliminer les mises au point potentielles, et donc réduire l’utilisation de souris. Stade adulte. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux.
Etude par imagerie d’un marqueur de neuroinflammation dans un modèle de trisomie 21 chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Souris transgéniques modèles de trisomie 21 et témoins, elles reçoivent un cathéter dans la veine caudale sous anesthésie puis une heure d'imagerie TEP avec traceur radioactif, avant d'être tuées 48 heures plus tard pour prélever le cerveau. Le porteur cherche à valider cette méthode d'imagerie de la neuroinflammation dans ce modèle. Il affirme qu'il est indispensable de tester les composés dans un organisme vivant entier et qu'aucune méthode alternative ne peut s'y substituer.
Objectifs
L'objectif est de développer une nouvelle stratégie thérapeutique pour la trisomie 21 basée sur des nouveaux composés capables d'agir sur l'inflammation du cerveau. Dans une 1ère étape, les propriétés anti-inflammatoires de ces nouveaux composés ont été évaluées par différents tests in vitro, permettant de sélectionner les plus performants. A ce stade, les études alternatives (in-silico/ in-vitro/ex-vivo) ne permettent plus de répondre à l'objectif puisqu'il est indispensable de tester les composés dans un organisme vivant entier (barrière hématoencéphalique, environnemement vasculaire métabolisme hépatique etc) mimant la maladie. Les composés sélectionnés ont été évalués chez l'animal afin de confirmer (ou non) leurs effets bénéfiques ainsi que le schéma expérimental optimal (dose, administration, etc) par l'un des partenaires du projet, dans un modèle animal de trisomie 21 (souris transgénique). Les modalités mises au point précédemment seront utilisées dans le même modèle animal dans notre laboratoire. Nous disposons d'une méthode d'imagerie in vivo chez l'animal qui permet de quantifier l'inflammation cérébrale à l'aide d'un traceur radioactif utilisé dans différents modèles animaux ainsi que chez l'humain. Ce type d’étude ne peut être substitué par une méthode alternative in vitro car l’objectif final est d’utiliser ces mêmes traceurs en imagerie clinique. Dans la demande présente, nous souhaitons valider la méthode d'imagerie que nous avons prévue dans ce modèle animal de trisomie 21, ce qui n'a jamais été réalisé jusqu'à présent. C'est pourquoi notre demande porte sur l'exploration par imagerie d'un groupe d'animaux transgéniques ("Tg", porteur de la trisomie 21) comparé à un groupe de souris témoins ("wildtype",WT, non porteur de la trisomie 21), afin de vérifier que notre méthode permet bien de mesurer l'inflammation cérébrale des animaux "trisomie 21". Cette étape permettra d'évoluer vers un protocole de traitement avec les composés sélectionnés, protocole pour lequel nous ferons une nouvelle demande d'autorisation. Cette neuroinflammation sera explorée par imagerie in vivo en TEP (tomographie par emission de positons), avec une méthode parfaitement maîtrisée au laboratoire.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats du présent projet permettront d’établir le schéma expérimental qui sera utilisé dans la suite du programme ANR : dose de traitement(s), durée, délai entre traitement et imagerie. A plus long terme, le bénéfice attendu est de progresser dans la mise eu point d’un nouveau traitement pour la trisomie 21.
Procédures
Cette procédure durera environ 1h10, elle sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à la mise en place d’un cathéter à la veine caudale sous anesthésie générale, la durée est de 10 min. Les souris seront ensuite imagées pendant 60 min. Pour la mise au point du geste technique, l'expérimentateur aura 3 essais pour la veine caudale de l'animal . La souris sera anesthésiée, , une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant le geste technique. La durée du geste sera d'une durée max de 15 min.
Impact sur les animaux
Le stress est minimisé par l’implication d’un personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Les souris sont facilement stréssées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à être sortis de leur cage et à être manipulés en préhension. Les nuisances ou effets indésirables de la procédure 1 peuvent-être des hématomes suite à la l'introduction du cathéter dans la veine de la queue et un stress suite à la préhension et les bruits ambiants de la salle d'expérimentation. Les animaux seront habitués pendant la phase d'acclimation à la salle de l'imageur. Durant l'expérimentation la respiration, la température et le poids seront mesurés. Les souris seront observées deux fois par jour par la personne en charge de l’étude.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux sont réveillés et surveillés. A la suite de la décroissance radioactive (48h ), les souris seront mis à mort. En effet, il est indispensable de prélever les cerveaux 48h après l'imagerie afin de confirmer les résultats obtenus en imagerie avec des mesures ex-vivo ( immunohistochimie et autoradiographie).
Remplacement
A ce jour aucune expérience de ce type n'a été réalisée dans l'espèce humaine. Ce type d’étude ne peut être substitué par une méthode alternative in vitro ou sur cellules. Le recours à l'expérimentation animale est donc nécessaire, et cela d'autant plus que les études alternatives (in-silico/ in-vitro/ex-vivo) ne permettent plus de répondre à l'objectif puisqu'il est indispensable de tester les composés dans un organisme vivant entier (barrière hématoencéphalique, environnemement vasculaire métabolisme hépatique etc) mimant la maladie de la trisomie 21.
Réduction
L’utilisation de méthode d’imagerie au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmmoins dicté par les groupes expérimentaux réquis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée (degré de neuroinflammation). De plus, les animaux pourront être suivis par imagerie de manière longitudinale dans les prochaines étapes du projet, afin d’évaluer au mieux les nouveaux traitements en utilisant un nombre réduit d’individu.
Raffinement
Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle d’expérimention pour diminuer leur stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les souris seront observées une à 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle. Les animaux seront anesthésiés à 4% dans une cuve d’induction. Lors de l’imagerie les animaux seront maintenus à 2%. Une protection occulaire sera apliquée lors de l’installation du cathéter à la veine caudale. Nous appliquerons également une crème anesthésiante sur la queue de l’animal. L’animal sera maintenu durant toute l’expérimentation sur un tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance accrue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal. En cas de detresse respiratoire, l'anesthesie est arrêtée et l'animal réveillé. Si l'animal est en hypothermie, nous procéderons à une augmentation de la température du lit thermorégulé de l'imageur. Si malgré ces actions, l'état général de l'animal ne s'améliore pas, nous arrêterons l'expérimentation.
Choix des espèces
La souris Tg Dp1Yey est actuellement le meilleur modèle animal de trisomie 21. De plus, la taille du cerveau de la souris est compatible avec la sensibilité et la résolution spatiale de la caméra microTEP (environ 1 mm). Adulte afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole.
Impact des matières grasses laitières sur le métabolisme énergétique cérébral au cours de la croissance et du vieillissement dans le modèle primate non-humain microcèbe
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
60 microcèbes, primates non-humains, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis replacés dans l'élevage. Chaque animal subit une mise à jeun et deux séances d'imagerie cérébrale sous anesthésie, IRM puis TEP avec traceur radioactif, pour évaluer l'effet des matières grasses laitières sur le métabolisme cérébral au cours de la croissance et du vieillissement. Le porteur signale les risques d'hypothermie et d'arrêt respiratoire liés à l'anesthésie. Il affirme que ces interventions nutritionnelles portant sur l'organisme entier ne peuvent être remplacées par des expériences sur cellules.
Objectifs
Les preuves scientifiques permettant de démontrer l'intérêt de l'introduction de matières grasses laitières dans l'alimentation des jeunes et des plus âgés sont peu nombreuses. Toutefois, les études chez les rongeurs laissent penser que la matière grasse laitière pourrait avoir des effets bénéfiques tout au long de la vie, lors de la croissance mais aussi, lors du vieillissement. Des études pilotes suggèrent même que l’ingestion de produits laitier au plus jeune âge pourrait avoir un impact à long-terme bien au-delà de la période pendant laquelle ils sont consommés. Ce projet permettra de mieux comprendre si l’ingestion de matières grasses laitières à différents âges de la vie peut avoir un impact positif sur les fonctions cognitives tout au long de la vie, incluant la phase critique du vieillissement, période pendant laquelle les fonctions cognitives déclinent naturellement. Nous émettons ici l'hypothèse que la matière grasse laitière pourrait avoir un impact favorable sur les fonctions cérébrales, et en particulier sur les fonctions cognitives, à plusieurs moments de la vie. Cet impact positif pourrait être procuré notamment grâce aux acides gras oméga-3 à longue chaîne qu’elle contient, contrairement à la matière grasse végétale qui n’apporte que des acides gras oméga-3 à courte chaîne. Ces acides gras oméga-3 pourraient permettre une meilleure utilisation par le cerveau de sa principale source d’énergie, le glucose. Pour tester notre hypothèse, nous proposons une étude pour déterminer si l'introduction de matières grasses laitières dans le régime alimentaire de primates non-humains omnivores, par rapport à un régime à base d'huiles végétales, a un impact sur le fonctionnement cérébral et en particulier sur l’utilisation par le cerveau de l’énergie apportée par les matières grasses) lors de deux périodes de la vie : la croissance (allant de la conception jusqu’à la maturité sexuelle, soit environ l’âge d’un an) et le vieillissement. Par conséquent, le projet aura pour objectif de démontrer que l’introduction de matière grasse laitière dans l’alimentation de modèles animaux âgés permettrait d’améliorer l’utilisation du glucose par le cerveau. Cette dernière partie sera étudiée en utilisant l’imagerie cérébrale TEP (Tomographie par émission de positrons) afin d’identifier des changements locaux d’activité métabolique cérébrale.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront pour la première fois d’évaluer l’impact de la matière grasse laitière sur le fonctionnement cérébral dans deux contextes importants pour la physiologie humaine en s’appuyant sur les résultats obtenus avec un modèle primate non-humain : 1) au cours de le croissance (jusqu’à l’âge de 12 mois) et 2) au cours du vieillissement. L’étude au cours de la croissance permettra d’évaluer les effets à long terme de la matière grasse laitière. L’étude chez les animaux âgés est aussi importante que celle réalisée en période périnatale. En effet, cette étude visera à décrypter les mécanismes cérébraux associés au vieillissement. Ce projet présente l'avantage d'étudier l'impact de la matière grasse laitière au cours des périodes clés ciblées (croissance et vieillissement). Il s'agit d'un projet unique, original et pertinent, qui permettra d'étudier l'impact de la matière grasse laitière sur les fonctions cognitives mais aussi de décrypter les mécanismes métaboliques, physiologiques et moléculaires qui les sous-tendent. Ces travaux sont menés chez un primate omnivore afin de pouvoir être mieux appliqués à l’Humain par la suite et de participer à élaborer des conseils nutritionnels adaptés à tous les âges de la vie pour une meilleure santé cognitive.
Procédures
Ce projet comporte 1 procédure, comprenant 2 actes expérimentaux par animal, chacun appliqué aux animaux jeunes et âgés. Le premier acte expérimental consiste en une cartographie par imagerie par résonnance magnétique (IRM) de l’anatomie cérébrale des individus (environ 1h), étape nécessaire et préalable au deuxième acte qui consiste en la réalisation d’une mesure de l’utilisation cérébrale du glucose par tomographie par émission de positrons (TEP, environ 1h). L’ensemble des actes expérimentaux sera réalisé sur une période maximale de 4 semaines, incluant les temps d'acclimatation, la mise à jeun, l’imagerie, la décroissance radioactive et la récupération post-anesthésie.
Impact sur les animaux
Le présent projet nécessite la mise à jeune et l'anesthésie d'animaux. Les anesthésies nécessaires aux protocoles d'imagerie IRM et TEP constituent une nuisance potentielle, comme la mise à jeun, ou le risque d’hypothermie et d’arrêt respiratoire, Cependant, les protocoles d’anesthésies sont bien maîtrisés au sein du laboratoire et validé par le vétérinaire. , En en plus, les paramètres physiologiques comme la température corporelle et la respiration sont suivis sur chaque animal sous anesthésie afin d’évaluer en continu l’état de profondeur de l’anesthésie.
Devenir
Les actes expérimentaux décrits ci-dessus n'induisant pas d'effet indésirable à long terme, le replacement de l'ensemble des animaux dans l'élevage est prévu.
Remplacement
Ces expériences ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives puisqu’elles nécessitent l’exposition précoce au régime alimentaire pré-définiet notamment l’allaitement des petits par les mères. Les interventions nutritionnelles ayant par définition des effets sur l’organisme entier (de la digestion à l’utilisation des micronutriments et de leurs métabolites par les différents organes), ces expériences ne sauraient être remplacées par des expériences in vitro sur cellules.
Réduction
Afin de répondre à l’exigence de réduction du nombre d’animaux, ces expériences seront réalisées sur un nombre limité d’animaux (10 animaux par condition expérimentale, soit un total maximal de 60 animaux). Ces animaux sont issus d’une cohorte, dont le descriptif a été détaillé lors d’une précédente saisine. Ce nombre est suffisant pour évaluer les effets de régimes car les deux procédures (IRM et TEP) sont hautement sensibles et répétables. Les effectifs, déterminés à partir d’un test , prennent en compte la variabilité interindividuelle attendue au sein des groupes expérimentaux pour les mesures d’IRM et TEP (paramètres qui présentent la plus grande variabilité) et permettront de réaliser des tests statistiques avec assez de puissance
Raffinement
Les conditions générales de l’élevage seront conservées (fréquence de nourrissage, enrichissement, maintien des groupes sociaux) et les procédures appliquées seront organisées de sorte à laisser des temps de récupération longs entre deux procédures. Toute procédure entraîne un suivi attentif de chaque animal afin de s’assurer de leur bien-être. Des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance de l’animal.
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (12 mois an) pour le groupe « jeune » et à l’âge de 7 ans pour le groupe « âgé ». L’objectif scientifique du projet étant d’étudier l’impact des matières grasses laitières sur les fonctions cérébrales au cours du développement et du vieillissement, ces deux catégories sont nécessaires. Les interventions nutritionnelles nécessitent l’exposition périnatale au régime et notamment l’allaitement des petits. Le microcèbe gris présente la particularité d'être omnivore, se nourrissant aussi bien de végétaux (feuilles et fruits) que d'animaux (petits mammifères ou reptiles, insectes). En tant que mammifère, il se nourrit naturellement de lait maternel (contenant donc naturellement de la matière grasse animale) pendant les 2 premiers mois de sa vie. Les altérations liées à l'âge, comparables à celles observées chez l'homme, apparaissent dès l'âge de 5 ans. De nombreuses études ont montré les similarités des changements cérébraux liés à l’âge entre ces deux espèces. Ce modèle représente donc un parfait compromis entre une longévité relativement longue, des facilités d'élevage dues à sa taille et une bonne proximité phylogénétique et physiologique avec l'homme.
Santé diurne : améliorer le fonctionnement de l’horloge biologique dans la société moderne
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Autres rongeurs : 80
40 rats et 80 rats roussards du Soudan (Arvicanthis) vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent l'implantation chirurgicale d'une électrode dans le cerveau et un protocole de décalage horaire, une partie une restriction d'accès à l'eau et l'administration de fluoxétine, puis des stimulations électriques répétées, l'euthanasie servant à vérifier le site d'implantation. Le porteur étudie le fonctionnement de l'horloge biologique chez une espèce diurne. Il affirme que ces bases neurales ne peuvent être reproduites in vitro ni in silico et nécessitent l'animal vivant.
Objectifs
L'horloge principale est responsable de la régulation de tous les rythmes du corps et permet à l'organisme de s'adapter et d'anticiper les changements environnementaux. La perturbation des cycles externes peut nuire à notre santé. Des études récentes chez l'homme indiquent que la perturbation de l’horloge, tels que ceux causés par l'exposition à la lumière artificielle de nuit, par le jet lag ou par le travail posté, augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires, des troubles du sommeil, de la dépression et maladies métabolique. L'activité électrique de l'horloge biologique est la première étape de la formation de son signal de sortie qui détermine la libération de signaux capable de synchroniser toutes les fonctions rythmiques du corps, y compris l’activité comportementale. Il n’est pas clair quel est l’effet de l’activité électrique de l’horloge sur l’activité comportamentale, et si en stimulant l'activité électrique de l'horloge centrale on peut renforcer l'amplitude du rythme de l'activité comportementale, qui au contraire diminue avec l'âge. Ainsi, le premier objective est de définir l’effet de l’activité électrique de l'horloge sur l’activité comportementale chez une espèce diurne (Arvicanthis) et chez une espèce nocturne (rat) ; et de tester chez des Arvicanthis âgée si la stimulation de l’activité électrique de l’horloge peut augmenter l'amplitude du rythme d'activité comportementale. Un des signaux qui influence l'horloge biologique est la sérotonine qui peut modifier l'activité de l'horloge. Ainsi, le second objective de ce projet est de tester si une augmentation de sérotonine, peut accélérer la resynchronisation de l’activité comportementale de l’animale a un nouveau cycle de lumière /obscurité décalé de 6h.
Bénéfices attendus
Dans la société moderne, les rythmes sont perturbés et de plus en plus de preuves montrent que cela est nocif pour la santé. Les mécanismes de fonctionnement de l’horloge ne sont pas clairs chez les espèces diurnes, interdisant le développement de thérapies pour l'amélioration des fonctions diurnes, y compris humaines. Ce projet améliorera notre compréhension du fonctionnement de l’horloge centrale chez une espèce diurne. Cela fournira des informations utiles pour développer des stratégies efficaces pour améliorer les fonctions de l'horloge chez l'homme jeune et âgé. Plus précisément ce projet : 1. Fournira des informations sur la relation entre l'activité électrique et l'activité locomotrice chez les animaux diurnes, et les éventuelles différences avec les animaux nocturnes. Ces informations peuvent aussi être utilisées pour améliorer les conditions des patients qui présentent des pathologies associées à des troubles circadiens (troubles journaliers comme dans différents troubles de l'humeur, y compris la dépression). 2. Fournira des informations sur comment la signalisation sérotoninergique interagit avec la lumière pour déphaser l'horloge biologique chez une espèce diurne. Ces résultats pourraient permettre le développement de stratégies pour aider à combattre la désynchronisation circadienne chez les travailleurs postés et lors de décalage horaire.
Procédures
16 animaux seront soumis à un protocole de décalage horaire, dont 10 seront soumis à une restriction temporelle d'eau (accès à l'eau 6h par jour), pour un total de 16 jours (4 jours de restriction temporelle d'eau suivis de 5 jours d'accès à l'eau ad libitum). Cette restriction temporelle d’eau est nécessaire pour l'administration de fluoxétine-qui entraîne une augmentation des niveaux de sérotonine-(6 jours au total) à des moments précis de la journée. 6 animaux seront soumis au même protocole (décalage horaire) mais auront toujours accès à l'eau. Ces Arvicanthis seront soumis à une chirurgie de 1 heure 1 mois après la fin du protocole de décalage horaire (durée totale 47 jours). Tous les animaux (120) seront soumis à une chirurgie de 1h qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation de la zone de la zone d'intérêt. 40 jeunes (2-5 mois) Arvicanthis (dont 16 issues du protocole de décalage horaire) et 40 jeunes (2-5 mois) rats, recevront 4 stimulations électriques par jour (durée 2h), pendant 6 jours dans 3 conditions de lumière (2 jours en 12h lumière : 12h d'obscurité, 2 jours en obscurité constante, 2 jours en lumière constante). 40 Arvicanthis âgées (>12 mois) recevront une stimulation électrique par jour (durée 2h-4h), pendant 3 jours (1 jour en 12h de lumière : 12h d'obscurité, 1 jour en obscurité constante, 1 jour en lumière constante).
Impact sur les animaux
La restriction temporelle d’accès à l’eau (6h) est nécessaire pour administrer la fluoxétine à un moment donné du temps journalier. Cependant, cela pourrait entraîner une déshydratation (dont l’importance sera évaluée dans une manipe pilote). Si une diminution de la prise d’eau est constatée, cela pourrait entrainer une diminution de la prise alimentaire et une conséquente perte de poids, entrainant un stress de l’animal. Dans une expérience précédente dans notre groupe de recherche, les Arvicanthis ont été traités pendant 5 jours avec la fluoxétine. Aucun effet délétère n'a été observé sur le bien être des animaux pendant et après le traitement à la fluoxétine. La chirurgie stéréotaxique, qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation, peut entraîner une perte modérée de poids. Compte tenu que la chirurgie comporte une incision cutanée au niveau du crâne, une infection ou une inflammation des plaies cutanées ne peut pas être exclu. La restriction temporelle d’accès à l’eau (6h) est nécessaire pour administrer la fluoxétine à un moment donné du temps journalier. Cependant, cela pourrait entraîner une déshydratation (dont l’importance sera évaluée dans une manipe pilote). Si une diminution de la prise d’eau est constatée, cela pourrait entrainer une diminution de la prise alimentaire et une conséquente perte de poids, entrainant un stress de l’animal. Dans une expérience précédente dans notre groupe de recherche, les Arvicanthis ont été traités pendant 5 jours avec la fluoxétine. Aucun effet délétère n'a été observé sur le bien être des animaux pendant et après le traitement à la fluoxétine. La chirurgie stéréotaxique, qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation, peut entraîner une perte modérée de poids. Compte tenu que la chirurgie comporte une incision cutanée au niveau du crâne, une infection ou une inflammation des plaies cutanées ne peut pas être exclu.
Devenir
Tous les animaux (80 Arvicanthis, 40 rats) seront mis à mort à la fin du projet. L'euthanasie est nécessaire à la vérification du site d'implantation de l'électrode de stimulation.
Remplacement
La compréhension des bases neurales de la diurnalité, qui implique au vu des connaissances actuelles un circuit de plusieurs structures cérébrales interconnectées, dont le schéma ne peut actuellement être reproduit avec une approche in vitro ou in silico, nécessite une approche in vivo chez l'animal vivant pour atteindre l'objectif.
Réduction
Notre approche longitudinale (enregistrement en continu d’un même animal dans différentes conditions expérimentales, animal utilisé comme son propre controle) permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés et de réduire la variabilité inter- individuelle. Le nombre d’animaux utilisés nous permettra d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Les résultats seront exploités avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les Arvicanthis seront gardés en cages ouvertes individuelles pour enregistrement rythmes journaliers, car les animaux adultes sont agressifs entre eux. Les animaux gardent des contacts olfactifs et auditifs avec les congénères dans la même pièce. Les cages sont enrichies avec un bâton à ronger. Les cages d'enregistrement in vivo sont équipées d'un joint tournant permettant à l'animal de rester libre de ses mouvements. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L'état de santé des animaux sera évalué au cours de l'étude et des points limites spécifiques ont été établis permettant d'interrompre les procédures et soustraire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
Rats: Pour comprendre la physiologie de l'horloge chez les animaux diurnes, nous devons aussi étudier les différences avec ll'horloge chez les nocturnes. La comparaison entre nocturne et diurne apporte des informations supplémentaires sur ce qui est différent entre les deux espèces. Cela permet d'améliorer les stratégies biomédicales actuellement en place, qui sont basées sur des informations provenant d'animaux nocturnes. Le choix de cette espèce nocturne est principalement basé sur le fait que le rythme de l'activité électrique de l'horloge biologique chez le rat a déjà été caractérisé. Ceci est nécessaire pour appliquer correctement notre protocole de stimulation Arvicanthis: Comprendre les bases neuronales de la diurnalité nécessite l'étude des animaux diurnes. La disponibilité du Rat roussard du Soudan (Arvicanthis ansorgei), un rongeur diurne élevé au Chronobiotron, est une opportunité unique d'atteindre cet objectif. Rats et Arvicanthis jeunes adulte (2-5 mois), pour étudier un système circadien mature et non-sénescent. Arvicanthis âgés (> 12 mois), pour tester l'effet de la stimulation électrique sur des animaux présentant un rythme faible d'activité comportementale.
Etude d’un réseau nociceptif dans un modèle de souris de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
526 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Rendues parkinsoniennes, elles subissent une ou deux neurochirurgies et des tests comportementaux évaluant leurs capacités motrices et sensorielles, l'état pathologique affectant leur capacité à se nourrir et s'hydrater et provoquant une perte de poids. Le porteur indique vouloir comprendre les mécanismes cérébraux des douleurs de la maladie de Parkinson, dont les retombées thérapeutiques sont présentées comme une première étape. Il affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier ces transmissions de signaux sur animal vivant.
Objectifs
La maladie de Parkinson est classiquement associée à des symptômes moteurs, cependant il est maintenant reconnu que de nombreux symptômes non moteurs, incluant des douleurs chroniques, sont très communs. Ces douleurs dans la maladie de Parkinson suggèrent que les circuits cérébraux permettant de percevoir et traiter les informations douloureuses pourraient être dysfonctionnels. Cependant, il n’y a à ce jour aucune hypothèse permettant de les expliquer car ces réseaux n’ont jamais été étudiés, limitant ainsi les stratégies thérapeutiques permettant de les soulager. L’objectif de ce projet est d’étudier l’état fonctionnel d’un de ces réseaux cérébraux dans un modèle de souris parkinsoniennes.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson se caractérise par de nombreux symptômes incluant des douleurs qui ont un fort impact sur la qualité de vie des patients. Nous cherchons à comprendre certains mécanismes dans le cerveau qui induisent leur développement car ce n’est pas connu à l’heure actuelle. Comprendre la physiopathologie de ces symptômes est une première étape essentielle pour pouvoir ensuite développer des stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces.
Procédures
Les souris subissent des neurochirurgies pour une durée de 30 minutes, anesthésie incluse. Les souris peuvent subir une ou deux neurochirurgies. Les souris participeront également à des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités motrice et sensorielle impactées par le modèle de la maladie de Parkinson. La durée de ces tests est de 1 à 30 minutes et se feront durant une semaine, avec un test tous les deux jours.
Impact sur les animaux
Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur affectant l’autonomie des souris à s’hydrater et se nourrir et donc une perte de poids, n'impactant pas leur taux de survie grâce aux soins apportés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer les structures cérébrales d'intérêt. De ce fait, les animaux ne peuvent pas être réutilisés.
Remplacement
Il n'existe aucune alternative expérimentale nous permettant d'éviter l'utilisation d'animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau tel que dans ce projet ou des stimuli nociceptifs sont appliqués au niveau de la patte du rat. Les études comportementales prévues ne peuvent se faire que sur des animaux vivants.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Des études préliminaires permettent la mise au point des expériences. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur affectant l’autonomie des souris à s’hydrater et se nourrir et donc une perte de poids. Cependant, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience afin d’intervenir immédiatement et de manière appropriée. Les souris reçoivent des soins et une diète spéciale utilisée tel que le lait sucré concentré en plus de la nourriture enrichie humidifiée mise dans une coupelle en inox directement dans la cage. La cage de réveil est mise sur un tapis chauffant pour augmenter sa température. Afin de prévenir toute douleur post-opératoire supplémentaire pouvant affecter la récupération de l’animal, une injection d'un anti-inflammatoire sera effectuée avant la procédure chirurgicale. Une échelle de cotation de souffrance basée sur des signes indicatifs de gêne ou de douleur sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir les points limites adaptés et les critères d'arrêt de l'expérience.
Choix des espèces
L’utilisation de souris offrent des possibilités de manipulations cellulaires et génétiques plus fines que chez le rat, notre modèle actuel, pour manipuler plus spécifiquement différents sous types cellulaires ou différentes projections neuro-anatomique entre nos structures cérébrales d’intérêts dans ce projet, et étudier leurs conséquences sur l'activité des neurones ou le comportement des souris. Des animaux âgés d'au moins 8 semaines seront utilisés car les systèmes nerveux sont matures à ce stade.
Etude des circuits de la valence émotionnelle dans l’anxiété
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie du cerveau avec implantation de fibres optiques, puis un protocole de stress, soit un conditionnement de peur par chocs électriques, soit une limitation de litière chez le juvénile, avant des tests comportementaux d'anxiété dont le détail n'est pas précisé. Le porteur affirme que l'augmentation de l'anxiété est inhérente au "besoin" de la recherche et que la culture cellulaire ne permet pas de mesurer l'activité neuronale in vivo. Les retombées annoncées pour les patients anxieux sont renvoyées au long terme, l'objectif immédiat restant de cartographier des circuits neuronaux.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mettre en évidence les altérations des circuits de neurones contrôlant les émotions dans des modèles de pathologie anxieuses chez la souris. Notre recherche ciblera l'identification d'altérations structurelles (anatomiques) ainsi que fonctionnelles (activité électrique). Ensuite nous utiliserons des techniques de manipulation de l'activité de circuits de neurones pour restaurer les altérations observées, avec l'objectif de restaurer des niveaux d'anxiété normaux.
Bénéfices attendus
A long terme, les connaissances générées par notre recherche permettront de pouvoir envisager des stratégies théropeutiques innovantes chez les patients atteints de troubles anxieux.
Procédures
Chirurgies: grâce à l'utilisation de coordonnées sur la boîte crânienne, des substances permettant de visualiser les cellules sont injectées dans le cerveau et des fibres de verre de moinsn d'un demi milimetre de diamètre sont ensuite implantées afin de visulaiser les cellules. Chaque souris subira une chirurgie, sous anesthésie totale, recevra des traitements analgésiques et son bien être sera surveillé quotidiennement. Les animaux subiront une procédure de stress parmi deux modèles [1] soit un conditionnement de peur chez l'adulte impliquant de légers chocs électriques, [2] soit une limitation de litière chez le juvénile. Enfin, les souris seront ensuite exposées à des tests comportementaux pour mesurer leur niveaux d'anxiété, ce qui n'induit pas de nuisances pour l'animal car ils sont habitués à la présence de l'expérimentateur/trice de façon quotidienne pendant une semaine en amont du test (handling). Les tests durent entre 5 et 20 minutes chacuns, et un seul test par jour est réalisé, sur une durée maximale de 10 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont la douleur potentielle induite pas la chirurgie qui est traitée avec des analgésiques, et un niveau d'anxiété augmenté chez certains individus par les procédures de stress. Cette augmentation de l'anxiété est inhérente au besoin de la recherche de substrat biologiques des troubles anxieux dans des modèles pré-cliniques qui est l'objet de cette saisine (la souris dans notre étude).
Devenir
Nous devons réaliser des vérification histologiques sur tissu cérébral, donc euthanasier l'animal.
Remplacement
Le projet porte sur une analyse de la connectivité des neurones et de leurs propriétés de codage d’informations au cours du comportement. Par conséquent, cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. Des méthodes telles que la culture cellulaire ne permettent pas la quantification des connexions neuronales ou de la mesure de l’activité en réponse à une simulation sensorielle in vivo.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude et des circuits associés. Afin de limiter le nombre d'animaux, nous réalisons plusieurs test comportementaux pour chaque individus, ce qui réduits considérablement le nombre d'animaux nécessaires. Nous réalisons également toutes nos expérience sur les mâles et les femelles afin d'éviter l'euthanasie de masse inutile des femelles.
Raffinement
Avant la mise en place du modèle d’anxiété, les animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Les cages seront également enrichies de nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur. Une partie des animaux (100) subira aussi un stress plus léger que le conditionnement de peur, qui n'implique pas de chocs électriques afin d'améliorer le BEA. Ces 100 animaux seront soumis à un protocole de stress plus léger dès leur naissance, par une limitation de litière du jour 2 au jour 12 (souris non sevrées). A l'age adulte (environ 12 semaines) les souris seront alors testées dans des tests permettant d'évaluer leur niveau d'anxiété. Cette modification de procédure nous permet de tester un modèle de modélisation de l’anxiété plus éthologique et éthique car nous n’imposerons plus de de chocs électriques aux animaux.
Choix des espèces
Les souris sont un modèle largement utilisé pour l’étude des circuits impliqués dans la peur et les troubles anxieux. Dans des projets futurs, nous ferons appel à des souris transgéniques. Dans un souci de continuité et de rigueur scientifique dans nos études, nous avons besoin d'utiliser le même modèle. De plus, la majorité des études se font sur la souris. Il est donc là aussi nécessaire de travailler sur la souris, pouvoir comparer nos résultats avec les publications actuelles. Par ailleurs, la souris est génétiquement très bien définie, offrant ainsi un large panel de choix dans les méthodes utilisables, non au niveau du laboratoire, mais au niveau mondial. Les animaux seront utilisés au stade adule, soit à partir de 10 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les souris adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie.
Implication du récepteur TRPV1 dans l’inflammation cutanée liée au psoriasis chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1600 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par les établissements partenaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après tonte et dépilation sous anesthésie, un produit est appliqué sur leur dos jusqu'à vingt-quatre fois pour induire un psoriasis, avec des injections sous-cutanées et des pesées répétées. Le porteur attend une perte de poids pouvant atteindre 20 %, un érythème, une desquamation et un épaississement de la peau, et précise que l'élevage préalable conduit aussi à tuer les animaux non sélectionnés. Il affirme ne pas pouvoir se passer de l'expérimentation animale pour cette maladie multifactorielle.
Objectifs
Le psoriasis est une maladie pro-inflammatoire chronique et multifactorielle de la peau (démangeaisons, plaques inflammatoires, …), touchant 2 à 4% de la population française, principalement bénigne et actuellement sans traitement curatif définitif. Dans 20% des cas, des formes sévères sont relevées montrant l’augmentation des risques cardiovasculaires et métaboliques chez ces patients. Le récepteur TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloide 1) est un acteur majeur dans la perception et l’intégration des sensations douloureuses (nociception), et est impliqué dans l’inflammation des couches superficielles de la peau (épiderme externe et derme plus profond), dans de nombreuses maladies, mais son rôle précis au niveau vasculaire local et/ou dans les échanges entre les différents types cellulaires, n’est pas clairement démontré à ce jour. Aujourd’hui, parallèlement à des études pharmacologiques en biologie cellulaire (in vitro sur cultures cellulaires) ou par des analyses biochimiques et de biologie moléculaire sur organes isolés (ex vivo, explants de peau ou prélèvements tissulaires de patient), notre objectif est de caractériser in vivo l’implication du récepteur TRPV1 dans un modèle induit de psoriasis chez des souris génétiquement modifiées. Ce projet inclus 2 procédures expérimentales. La procédure 1, de sévérité legère, est une procédure d'élevage permettant de générer 3 nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées « Knock-Out tissu-spécifique », où l’expression du gène TRPV1, soit le complexe protéique constitutif du récepteur TRPV1 exprimé à la membrane cellulaire, est spécifiquement invalidée dans l’un des 3 compartiments cellulaires suivants : vasculaire (microcirculation vasculaire locale), épidermique (relations entre les cellules constitutives de l’épiderme) ou nerveux (relations entre cellules sensitives), et de sélectionner au maximum de 1600 animaux d’intérêt. Ces animaux seront tous inclus dans la procédure 2, de sévérité modérée, permettant d’induire un modèle psoriasique selon 3 modalités : très court terme / précoce – 3 jours, court terme / aigüe – 6 jours et long terme / chronique – 9 semaines. Au terme de l’induction du modèle pathologique, des analyses fonctionnelles et biochimiques permettront de caractériser finement l’implication du récepteur TRPV1 au niveau des 3 compartiments précédents, de proposer une nouvelle approche de développement de traitements du psoriasis et/ou des pathologies dermatologiques similaires.
Bénéfices attendus
Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif définitif, seuls des traitements symptomatiques aux résultats transitoires sont proposés aux patients étant atteint d’un psoriasis. L'idée novatrice de ce projet est d'étudier l'implication fine du récepteur TRPV1 et de le placer au centre de la dérégulation de l'équilibre homéostatique (constantes fonctionnelles régulées et maintenues à des valeurs bénéfiques pour l’organisme), incluant l'ensemble des acteurs, et d'identifier si possible le site d'inflammation privilégié (épithélial, neuronale, vasculaire) permettant d'envisager une possible nouvelle voie de développement d’un traitement diminuant le nombre et l’intensité des poussées.
Procédures
Les souris issues des 3 nouvelles lignées KO tissu-spécifique TRPV1, soit au maximum 1600 animaux, obtenues par la procédure 1 – élevage et obtention des 3 lignées de souris LoxP-Cre Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, seront incluses dans la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris et seront donc soumises à 3 types d’interventions : I – en amont du protocole d’induction (procédure 2), chaque souris sera tondue et dépilée (crème VEET « peaux sensibles »), sous anesthésie gazeuse ; intervention réalisée 1 fois et d’une durée maximale de 5 minutes, II – durant le protocole d’induction (procédure 2), chaque souris vigile recevra une application externe / topique de Vaseline® (condition contrôle) ou d’Aldara™ 5% (condition induite), sur la zone dépilée ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce – 3 jours », 5 fois pour la modalité « aigüe – 6 jours » et 24 fois pour la modalité « chronique – 9 semaines » et d’une durée de moins de 5 minutes, III – Durant la procédure 2, chaque souris vigile recevra une injection sous-cutanée préventive de NaCl 0,9% (300µL), après contention manuelle, pour limiter déshydratation générale liée à la procédure d’induction ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce », 3 fois pour la modalité « aigüe » et 6 fois pour la modalité « chronique », d’une durée d’environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont : I – du stress lors des pesées régulières (entre 2 et 7 fois par semaine, durée inférieure à 30 secondes) diminuant avec l’habituation, II – du stress lors des anesthésies gazeuses générales de préparation (tonte, dépilation) des animaux en amont de l’induction du modèle, de faible intensité (maximum 5 minutes), III – du stress et de l’inconfort lors des manipulations des animaux vigiles pour induire le modèle (application dorsale de crème, injection sous-cutanée préventive, observations comportementales, …), de faible intensité, et se réduisant avec l’habituation à la répétition journalière des opérations (5 minutes par animal et par jour), IV – une perte de poids corporel transitoire, attendue durant les premières 48 heures après début du traitement d’induction et pouvant atteindre 20% maximum, due à une déshydratation générale, soit d’une intensité modérée (maximum durant une semaine), V – L’apparition des « symptômes » induits, caractéristiques du psoriasis (rougeur / érythème, desquamation, épaississement cutané), d’intensité faible à modérée (durée totale de l’expérimentation) et VI - du stress lors de la réalisation des transferts des animaux vers nos partenaires (préparation, conditionnement, nouvel environnement transitoire, vibrations lors du transport, …), de faible intensité, sur 24-48h.
Devenir
Ce projet comporte 2 procédures expérimentales. Lors de la procédure 1 – Elevage et obtention des 3 nouvelles lignées de souris Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, l’apparition éventuelle d’un phénotype dommageable mettrait fin au projet et l’ensemble des animaux seraient mis à mort. Les animaux présentant les génotypes d’intérêt, ainsi que les géniteurs d’intérêt pour la cryoconservation de leurs gamètes, seront gardés en vie. Les animaux non-sélectionnés seront mis à mort. Les animaux sélectionnés en procédure 1, intègreront la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris, où ils seront transférés immédiatement vers nos partenaires (modalité « précoce – 3 jours » et « aigüe – 6 jours ») ou intègreront la modalité « chronique – 9 semaines », où ils débuteront le protocole d’induction du psoriasis, avant d’être transférés, à leur tour, vers nos partenaires, qui se chargeront de finaliser l’induction et de réaliser les expérimentations finales, puis mettrons à mort l’ensemble des animaux. Ils seront donc tous conservés en vie dans notre établissement.
Remplacement
Le psoriasis est une maladie multifactorielle, dont la physio-pathologie implique différents intervenants et composantes au sein de la peau (vasculaires, nerveux, barrière cellulaire, …), ne pouvant être reproduits et étudiés uniquement par le développement de modèles cellulaires et/ou l’utilisation de méthodes alternatives. Nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale et de la mise en place de protocoles in vivo pour prendre en compte l’ensemble de ces aspects.
Réduction
L’ensemble du projet a été conçu afin de réduire au maximum le nombre d’animaux sans compromettre l’interprétation statistique des résultats. De par la variabilité interindividuelle dans les tests fonctionnels finaux, nous devons inclure 20 animaux par double analyse fonctionnelle pour obtenir des résultats robustes. Si les variations des résultats expérimentaux sont « significatives », nous envisagerons de réduire le nombre d’animaux par groupe et ainsi diminuer le nombre global d’animaux nécessaire. De plus, nous limiterons le nombre de groupes « contrôle » dans les 3 modalités d’induction du modèle (précoce - 3 jours, aigüe - 6 jours, chronique - 9 semaines), en utilisant les animaux contrôles de la modalité d’induction « aigüe - 6 jours » pour la réalisation des analyses de la modalité « précoce - 3 jours ».
Raffinement
Les responsables du projet s’assureront du bien-être de l’ensemble des animaux au quotidien, par la réalisation d’observations comportementales et d’évaluations du poids corporel, au minimum 2 par semaine. Si nécessaire et en suivant une échelle de cotation adaptée, les responsables prendront en charge la gestion de la douleur ou du mal-être par une analgésie adaptée, et si un point limite est atteint, pratiqueront la mise à mort immédiate de l’animal concerné.
Choix des espèces
L’utilisation de souris comme modèle d’étude in vivo est courant en immuno-dermatologie. Son système immunitaire, humoral et cellulaire est largement décrit depuis de nombreuses années et font référence, ce qui nous permettra d’expérimenter sans avoir recourt à des espèces de mammifères plus proches de l’homme. Dans notre contexte, il nous semble d’autant plus pertinent d’induire un psoriasis sur cette espèce, car, commercialement, nous pouvons obtenir des animaux génétiquement modifiés d’intérêt (mutant KO total TRPV1, souris LoxP-TRPV1, souris Cre-tissu spécifique), et créer des souris Cre-LoxP KO spécifique TRPV1 par les méthodologies d’inactivation Cre-LoxP développées dans les années 2000. Le modèle inductible d’inflammation cutanée / psoriasis est documenté depuis plus de 10 ans, utilisé par de nombreuses équipes mondialement et nos partenaires sont rompus à son utilisation. Les 3 nouvelles lignées produites permettront de caractériser l’implication du récepteur TRPV1 au sein de 3 compartiments cellulaires impliqués dans le psoriasis induit chez la souris. Le psoriasis touche l’ensemble de la population, du jeune à l’adulte, avec un pic d’apparition de la maladie chez l’homme se situant entre 20 et 30 ans. Notre étude souhaite évaluer les phases précoces d’apparition du psoriasis, puis l’installation de la pathologie à court terme (phase aigüe) et l’évolution à long terme (phase chronique) dans un modèle induit de dermatite psoriasiforme chez la souris. Nous utiliserons donc des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et dont le poids variera entre 20 et 30g au moment de débuter le protocole d’induction du modèle.
Effet de l’assocation méthadone/gabapentine dans le traitement de la douleur neuropathique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la patte leur inflige une douleur neuropathique maintenue pendant sept semaines, avec des tests de douleur répétés et, pour certaines, une injection de naloxone déclenchant un syndrome de sevrage. Le porteur précise que l'allodynie mécanique ne peut être soulagée "car c'est l'objet de l'étude", et attend une perte de poids transitoire, pour évaluer une association méthadone-gabapentine. Il affirme le remplacement "impossible", la douleur ne pouvant être observée que chez l'animal vivant et vigile.
Objectifs
La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel, généralement chronique elle affecterait 5 à 7% de la population française. Les traitements actuels ne sont pas efficaces chez tous les patients et leurs effets secondaires conduisent de nombreux patients à arrêter le traitement. Antidépresseurs, anticonvulsivants (Gabapentine) et tramadol/tapentadol sont parmi ces traitements. En clinique, les opiacés classiques (morphine, fentanyl) sont de moins en moins prescrits pour soulager ce type de douleur du fait de leurs nombreux effets indésirables et de la crise des opiacés qui existe aux États-Unis en particulier. Les médecins se tournent alors de plus en plus vers la méthadone qui est actuellement utilisée dans de nombreux pays, mais pas encore en France, comme traitement antalgique des douleurs complexes liées au cancer. Ces douleurs complexes et chroniques mêlent des douleurs par excès de nociception ainsi que des douleurs neuropathiques, ce qui rend difficile leur évaluation et leur traitement. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de la méthadone seule mais également en association avec un traitement plus courant la Gabapentine dans le soulagement des douleurs neuropathiques périphériques dans un modèle murin. L’association de ces 2 molécules permettra de cibler des cibles moléculaires différentes, de réduire les doses efficaces et donc les effets secondaires avec une même activité antalgique. Plusieurs doses seront testées afin de trouver une association de doses idéale, c’est-à-dire provoquant un soulagement idéal de la douleur neuropathique avec les plus petites doses possibles (ce qui provoquera donc le moins d’effet indésirable possible). Le but final de ce projet sera de proposer une association présentant moins d’effet indésirable pour des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Le projet s'inscrit dans une démarche de raffinement des traitements existants chez l’Homme pour soulager les douleurs neuropathiques. L’association de méthadone et de gabapentine (anticonvulsivants déjà utilisé à plus fortes doses en clinique dans le traitement des douleurs neuropathiques) permettra de cibler des cibles moléculaires différentes, de réduire les doses efficaces et donc les effets secondaires avec une même activité antalgique. Le but final de ce projet sera de proposer une association présentant la meilleure efficacité avec le moins d’effet indésirable pour des essais cliniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une douleur chronique pendant 7 semaines. Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Ces animaux subiront également 6 fois le test de douleur durant une vingtaine de minutes environ avant la chirurgie neuropathique puis trois fois par semaine (délai de 5 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) pendant 5 semaines. Les animaux auront un traitement par un analgésique potentiel (méthadone, gabapentine, morphine ou 2 de ces molécules associées) dans leur eau de boisson 15 jours après l’induction de la douleur neuropathique Certains animaux seront soumis à un syndrome de sevrage modéré par une injection de naloxone.
Impact sur les animaux
Il y a présence de douleur, plus particulièrement une allodynie mécanique qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie, une perte de poids transitoire peut se produire. Le traitement par la méthadone peut produire un syndrome de tolérance, d’hyperalgésie ou de sevrage, normalement peu présents voir pas présents aux doses utilisées dans ce projet. Un effet positif, antidouleur, induit par les traitements est également attendu.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre de souris nécessaire a été calculé mathématiquement et les effets de la combinaison des deux traitements sera évalué par les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton et de la frisure seront placés dans la cage pour favoriser la nidation pour limiter les comportements d’agressivité, et des barreaux de bois à ronger pour favoriser le comportement naturel du rongeur de ronger. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant la chirurgie d’induction de douleur neuropathique des méthodes d’anesthésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites pour limiter la souffrance de l’animal sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, ces nouvelles pratiques pourraient être intégrées au projet.
Choix des espèces
Les modèles d’animaux neuropathiques utilisés dans cette étude ont été caractérisés et validés pharmacologiquement chez la souris (travaux antérieurs de notre équipe) et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Métabolisme et homéostasie du tissu adipeux dans un modèle murin de pathologie de type autisme (EU3/3)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souris génétiquement modifiées portant une mutation liée à un trouble de type autisme subissent des tests métaboliques, gavage de glucose, injections d'insuline et prélèvements de sang répétés, avant l'euthanasie pour prélever leurs organes. Le projet cherche à comprendre pourquoi ces souris perdent leur tissu adipeux, en lien avec la pathologie neurodéveloppementale. Le porteur affirme que seule une étude in vivo permet d'identifier l'effet de la mutation et qu'il n'existe pas d'autre modèle animal mimant la maladie.
Objectifs
L'intégrité des connections entre les neurones (synapses) est indispensable au bon fonctionnement du cerveau. Nous travaillons sur une protéine qui est essentielle pour le bon développement du système nerveux et la mise en place des synapses. Cette protéine est codée par un gène qui vient d'être identifié comme à risque pour l’apparition de troubles neurodéveloppementaux. En effet, les patients ayant une mutation dans ce gène présentent une déficience intellectuelle ainsi que des troubles de type autisme. Nous avons caractérisé une nouvelle mutation de cette protéine par des analyses in vitro. Pour aller plus loin dans la compréhension de l’impact de cette mutation sur le fonctionnement cérébral, seule une étude in vivo pourra permettre d’identifier comment notre variant perturbe la mise en place des circuits neuronaux. Dans ce but, nous avons créé un modèle de souris portant cette mutation, afin d’étudier les effets potentiels sur l’apprentissage et le comportement. De façon inattendue, les animaux mutants perdent leur tissu adipeux. Dans cette étude nous souhaitons comprendre comment le variant affecte le métabolisme des souris en lien avec la pathologie neurodéveloppementale. De telles connaissances pourraient permettre i) de mieux comprendre ce qui se passe chez les patients pour améliorer leur prise en charge médicale, en particulier en s’intéressant à leur métabolisme et à leur alimentation, ce qui n’est pas du tout fait aujourd’hui ; ii) d’ouvrir des pistes de recherches à visée thérapeutique pour ces patients.
Bénéfices attendus
La souris permet l’utilisation d’approches génétiques pour reproduire les mutations trouvées chez l’homme. Les caractéristiques des souris utilisées sont bien connues ce qui permet d’étudier l’effet du variant de notre protéine cible sur le comportement, l’apprentissage, et la physiologie. Le modèle mutant que nous venons de développer n’existe pas et représente un outil très important pour pouvoir mimer la pathologie humaine. C’est le premier modèle de cette pathologie découverte récemment. Grâce à ce projet, nous allons pouvoir déterminer quel est l’impact de ce variant sur le métabolisme et le maintien du tissu adipeux, en lien avec la pathologie neurodévelopementale. Personne ne s’est encore intéressé aux problèmes potentiels de métabolisme et d’alimentation chez ces patients, et ce nouvel aspect peut avoir un réel impact pour une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Les animaux subiront des tests non-invasifs pour caratériser leur croissance, leur composition corporelle et leur métabolisme. Pour caractériser le métabolisme du glucose, tous les animaux vigiles subiront une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 5 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte espacés sur 2 heures (2 secondes par prélèvement. Après une semaine de repos, tous les animaux vigiles subiront une injection intra-péritonéale (volume et aiguille respectant les recommandations / 3 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte de sang à la queue, espacés sur 2 heures (2 secondes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Pour l'étude de la thermorégulation, les animaux subiront un stress léger lié à la manipulation lors des tests de composition corporelle (1min30/semaine), de motricité (3 fois 10 min) et de comportement (2 fois 15 minutes). Lors de la mesure du métabolisme respiratoire (48h) on peut attendre un stress modéré lié à l’individualisation nécessaire pour l’analyse. Pour le test de tolérance au glucose, on peut attendre une perte de poids de 10 à 15% liée au jeun (12h sur la nuit, de 20h à 08h) et les animaux subiront une administration orale de glucose. Pour le test de résistance à l’insuline, le jeun de 4h le matin n’induit pas de perte de poids et les animaux subiront une injection intrapéritonéale d’insuline. Dans ces deux derniers tests, les prélevements sanguins à la queue induisent une douleur légère. Pour l'étude de l'influence d'un régime hypercalorique, qui reprend les mêmes tests mais sur des animaux ayant une nourriture plus riche, on attend les mêmes effets indésirables. L'élevage (accouplements pour production des cohortes) implique l'isolement d'animaux pour accouplement. Seuls les mâles seront isolés, pour une période maximale de 2-4 semaines.
Devenir
A la fin de chaque procédure, nous euthanasierons les animaux afin de réaliser le prélèvement des organes et les analyses moléculaires et biochimiques nécessaires à la compréhension des mécanisme d’action de notre variant.
Remplacement
Le modèle animal ne peut pas être remplacé, car seule une étude in vivo permet d’identifier l’effet du variant de notre protéine neuronale sur le fonctionnement cérébral et le métabolisme. De plus, il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu d’utiliser au maximum 80 souris sur une période de 2 ans. Le nombre nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats a été calculé avec un logiciel de statistique, sur la base de publications précédentes et de notre expérience (niveau de significativité : p=0.05). Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos procédures expérimentales car des différences ont été observées dans le développement des symptômes chez les garçons et les filles porteurs de la mutation. Les deux procéduresexpérimentales étant réalisées à des températures d’élevage différentes (28° vs 22°), nous ne pouvons pas utiliser le même lot contrôle. Pour l'élevage, nous utiliserons 40 animaux mutés, qui est le nombre nécessaire pour produire les lots d'expérimentation.
Raffinement
Les souris seront hébergées à raison de 5 par cage afin de limiter stress et angoisse. Leur environnement sera enrichi par un carré de ouate et un tunnel en plexi rouge. Le tunnel permet aux animaux de s’habituer à l’analyse de composition corporelle qui est pratiquée elle aussi dans un système de tunnel de contention rouge. La nourriture et l’eau sont disponibles ad libitum et ils suivront un cycle naturel jour/nuit (12h/12h). Lors du change qui sera fait de façon hebdomadaire, on conservera le tunnel et une partie du nid pour garder les odeurs des animaux dans la cage propre et limiter le stress. Pour réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement, y compris les weekends, et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité ou au contraire isolement, hérissement des poils, dos voûté) seront recherchés et seront répertoriés avec des grilles de douleur/suivi. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance sont détectés. Enfin, les animaliers s’occuperont toujours des mêmes souris qui seront changées selon un planning hebdomadaire strict afin d’éviter de les stresser. Les administrations seront réalisées avec des solutions à température ambiante (administration orale de glucose) ou tiédie (injection intrapéritonéale d’insuline).
Choix des espèces
Seule une étude in vivo permet d’identifier l’effet du variant de notre protéine neuronale sur le fonctionnement cérébral et le métabolisme. Nous avons choisi le modèle murin car nous avons pu reproduire par modification génétique le modèle de la pathologie humaine. Il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie. Nous commencerons les tests à environ 10 semaines, puisque nous avons observé précédemment une diminution de poids à cet âge. Dans nos deux procédures, les animaux subissent les mesures du métabolisme respiratoire, les analyses du métabolisme du glucose et l’euthanasie aux mêmes âges.
Régulation de l’expression du gène Sez6 par l’ARN non codant miR-3594-5p
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une neurochirurgie d'environ trois quarts d'heure pour injecter un microARN dans le striatum, une région cérébrale liée au comportement compulsif, avant d'être tué le lendemain par perfusion de formaldéhyde dans le cœur sous anesthésie. Le projet cherche à confirmer, chez le rat, un mécanisme de régulation génétique déjà observé en culture cellulaire dans le contexte de l'addiction à l'héroïne. Le porteur affirme que seul le modèle in vivo permet cette vérification, l'étude neurobiologique invasive étant impossible chez l'humain.
Objectifs
Le but de ce projet est d’évaluer si miR-3594-5p est capable d’inhiber l’expression du gène Sez6 dans les neurones du striatum. L’expression d’un gène peut être définie comme l’ensemble des processus par lesquels l’information héréditaire stockée dans un gène est lue pour aboutir à la fabrication de molécules qui auront un rôle dans le fonctionnement de la cellule, comme les protéines ou les ARNs. miR-3594-5p est une petite molécule d’ARN appelé microARN qui ne produit pas de protéine mais qui est capable de réguler l’expression de différents gènes. Le striatum est une région cérébrale clée car elle joue un rôle critique dans le développement de comportement compulsif. Des travaux antérieurs ont démontré que les rats ayant développé une consommation compulsive et excessive d'héroïne, et non les individus ayant développé une consommation contrôlée et limitée de drogue, présentaient un niveau d'expression plus élevé de miR-3594-5p dans le striatum. L’augmentation du taux de cette molécule est associée à une diminution de l'expression du gène Sez6, gène impliqué dans la régulation des connexions entre les neurones, dans cette même région cérébrale. Il a déjà été mis en évidence que cette molécule est capable d’interagir directement avec le gène Sez6 dans un modèle de culture cellulaire. Il nous reste à déterminer la fonction de cette molécule dans le striatum de rat. Pour cela, nous devons démontrer que cette molécule interagit bien avec Sez6 dans les neurones du striatum de rat et inhibe bien son expression dans ces mêmes neurones.
Bénéfices attendus
Cette procédure confirmera les résultats antérieurs obtenus grâce au modèle de culture cellulaire et les étendra à un organisme vivant entier et intégré. Elle confirmera le rôle fonctionnel de régulation du miR-3594-5p dans le striatum de rat. Elle fournira une information unique sur le rôle de cette molécule dans l’inhibition spécifique de l’expression du gène Sez6 dans les neurones striataux. Les résultats issus de cette expérience seront très importants pour conforter les résultats déjà obtenus.
Procédures
Chacun des 48 animaux sera soumis à une neuro-chirurgie afin d'injecter le miR-3594-5p ou les molécules contrôles dans le striatum. Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 45 min. La procédure expérimentale relève de la classe modérée et est très brève puisqu’elle se termine un jour après la neuro-chirurgie.
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à une procédure très brève dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les seules nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la neuro-chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). Les rats ne seront soumis qu’à une seule procédure n’excédant pas une journée. L’étape de réveil de l’animal est cependant nécessaire avant sa mise à mort pour laisser une fenêtre de temps nécessaire à la molécule pour inhiber le gène Sez6.
Devenir
A la fin des expériences, il est nécessaire de vérifier l'emplacement des infusions de la molécule dans le cerveau et de mesurer le degré d’inhibition de l’expression du gène Sez6. Ceci nécessite une fixation du tissu cérébral par perfusion intracardiaque d’un agent fixant (formaldéhyde) de tous les animaux. Cette procédure est réalisée sous analgésie (carprofène, 15 min avant) et anesthésie profonde (mélange de kétamine et de xylazine) afin de supprimer ou de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux.
Remplacement
Des études précédentes ont démontré que miR-3594-5p se fixait sur l’ARNm de Sez6 dans un modèle de culture cellulaire (modèle in vitro). Malheureusement ce modèle ne permet pas de déterminer le rôle fonctionnel et physiologique de cette interaction dans le striatum de rat. Seul le modèle in vivo (rat de laboratoire, Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles) peut nous permettre d’évaluer si miR-3594-5p inhibe bien l’expression du gène Sez6 dans les conditions biologiques et intégrées du striatum. Il est encore impossible in vitro de reproduire la complexité d’un milieu biologique intégré tel que le cerveau. Ce recours à l’animal se justifie car l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme est impossible, rendant inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce. De plus, le phénomène que nous étudions ne peut être récapitulé sur des modèles mathématiques valides et réalistes.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Un effectif final de 14 rats par groupes est un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet scientifique proposé. Nous devons en effet avoir un nombre suffisant d’animaux en fin d’expérience pour détecter des différences significatives entre nos trois groupes expérimentaux à l’aide des tests statistiques appropriés. Le pourcentage d’attrition moyen est estimé à 10 pour cent en fin d’expérience (injection de la molécule mal placée 5 pour cent ; dégradation de santé 5 pour cent), l’effectif initial par groupe devra donc être de 16 rats. Le plan expérimental complet impliquera donc un lot de 48 rats pour le test de 3 conditions différentes (injection de la molécule, injection du contrôle négatif, injection du contrôle positif).
Raffinement
Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages afin d’éviter le stress de l’isolement social. De plus, ces cages sont enrichies grâce à des tunnels de jeu et des os à ronger afin de limiter l’ennui et le manque de stimulation. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie (carprofène, 15min avant le début de la chirurgie) et anesthésie gazeuse (isoflurane), sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 45 min et 1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection sous-cutanée de sérum physiologique, pour favoriser la réhydratation. Il est ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil (c'est à dire remise sur pattes et locomotion) avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal est relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère pendant les 24 heures restantes avant la fin de la procédure expérimentale. Pendant toute la procédure expérimentale, les animaux sont sous surveillance afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Lorsque le point limite est franchi, l’animal est mis à mort dans les plus brefs délais. Nous mettrons à mort l'animal par asphyxie au CO2. Pour s’assurer d’une mort effective, chaque animal restera sous surveillance pendant 1 heure après l'arrêt cardiaque. Les manifestations éventuelles d'inconfort, de stress ou de douleur sont donc suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes, pesée régulière (3 fois par semaine avant la chirurgie)) et évaluées selon une grille d’évaluation des points limites. Si une perte de poids corporel supérieure à 20 pour cent est observée en 48 heures, l'animal sera alors mis à mort, sachant que dans tous les cas, il y a aussi d’autres points limites qui sont atteints. Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis. En effet, cette espèce est suffisamment proche de l’homme (même classe d’animaux vertébrés des Mammifères) pour servir de modèle animal valide des phénomènes de régulation des gènes par les microARNs par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple les invertébrés). En même temps, elle est suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (comme les primates non-humains). Des espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes de régulation génétiques par les microARNs mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.
Evaluation de l’effet de composés thérapeutiques dans les Encéphalomyélites auto-immunes (EAE)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune, modèle de sclérose en plaques, leur est induite par injections, puis des molécules candidates sont injectées jusqu'à cinq semaines, avec un suivi moteur quotidien de la marche et du tonus de la queue. Le porteur indique que la maladie réduit les capacités motrices et qu'aucun anti-douleur ne peut être administré pour ne pas fausser l'effet des composés testés, les souris étant tuées pour prélèvement d'organes. Il affirme que la culture de cellules ne permet pas d'intégrer les mécanismes de compensation de l'animal.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le pouvoir protecteur et thérapeutique de candidats médicaments, dans les maladies démyélinisantes du système nerveux central.
Bénéfices attendus
Cette étude participera directement à la découverte et la mise au points de nouveaux composés thérapeutiques dans le cadre du traitement de la sclérose en plaques.
Procédures
Les souris sont soumises à une induction d'encéphalomyélite allergique une unique fois induite par 4 injections sous-cutanée de 10 secondes chacune. Les molécules testées sont injectées en intrapéritonéal à raison de 3 injections par semaine (5 secondes par injection) jusqu’à 5 semaines. Les tests moteurs réalisés consistent en une observation des capacités motrices des souris dans des conditions non contraintes sorties de leur cage (tonus de la queue, qualité de la marche). A partir du 7ème jour après induction, ces tests sont journaliers, durent 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Les composés testés n'ont dans des études préliminaires jamais démontré d'effet toxique sur les animaux. Cependant, l'induction de l'encéphalopathie allergique expérimentale n'est pas sans conséquences sur le bien-être animal, avec une réduction de ses capacités motrices, qui est cependant transitoire et strictement encadré par le suivi des points limites. Bien que la manipulation des souris se fasse dans l’environnement le plus apaisant possible (limitation du bruit et de la luminosité), la manipulation des souris en dehors de leur cage ainsi que les injections est susceptible de générer un inconfort. Les molécules testées ayant pour but de traiter la pathologie, les plus efficaces amélioreront le bien-être des animaux dans ces conditions expérimentales en réduisant leurs atteintes motrices.
Devenir
A l'issu de la procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement et analyse des organes.
Remplacement
Le projet est basé sur des études in vivo pour permettre de développer des stratégies thérapeutiques dans le cadre des études translationnelles entre la clinique et la recherche. Dans ce cas, la culture de cellules ne permet pas d’appréhender la physiologie pour intégrer les mécanismes de compensation développés par l’animal. Toutefois, dès que possible les mécanismes cellulaires et moléculaires sont étudiés sur culture cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est calculé pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Des points limites prédictifs ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance. Afin de minimiser les souffrances infligées aux animaux, des cupules d'eau gélifiées sont mises à disposition à l'apparition des premiers symptomes. Afin de ne pas fausser les effets des composés thérapeutiques testés, aucun anti-douleur ne peut être ajouté, cependant les souris sont surveillées quotidiennement à partir du jour 7 post induction afin de monitorer les symptomes et les souris sont sacrifiées en cas d'atteinte du point limite.
Choix des espèces
Des points limites prédictifs ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance. Afin de minimiser les souffrances infligées aux animaux, des cupules d'eau gélifiées sont mises à disposition à l'apparition des premiers symptomes. Afin de ne pas fausser les effets des composés thérapeutiques testés, aucun anti-douleur ne peut être ajouté, cependant les souris sont surveillées quotidiennement à partir du jour 7 post induction afin de monitorer les symptomes et les souris sont sacrifiées en cas d'atteinte du point limite.