Système nerveux

352 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie cérébrale pour injection de molécules ou implantation de fibres optiques et une chirurgie d'implantation d'un cathéter intraveineux, avant une autoadministration de cocaïne couplée à des chocs électriques de 0,5 mA que le porteur décrit comme "indolores". À la fin, le tissu cérébral est prélevé pour vérifier la précision des chirurgies. Le porteur affirme que l'addiction, "trouble du comportement", ne peut être reproduite in vitro ni in silico, le bénéfice annoncé restant une meilleure connaissance des bases neuronales de la prise de décision.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier les circuits neuronaux qui traitent l'information relative aux conséquences négatives de la prise de cocaine. En effet, une hypothèses postule que la perte de contrôle de la prise de cocaine serait due au fait que certains individus ont des difficultés à associer leur prise de drogue aux conséquences néfastes sur la santé, car ces conséquences arrivent de manière retardée. Des études antérieures ont mis en lumière le circuit reliant le pallidum ventral (PV) au thalamus mediodorsal (TMD) dans les comportements de prise de cocaine. Selon les données de la littérature, ce circuit pourrait avoir un rôle clé dans la prise en compte des conséquences d'une action afin d'ajuster ses comportements futurs. L'objectif de ce projet sera donc d'évaluer le role de ce circuit dans la prise en compte des conséquences retardées de la prise de cocaïne.

Bénéfices attendus

Ces expériences fourniront des informations uniques sur les bases neuronales de la prise en compte des conséquences tardives de la prise de cocaine. De plus, elles mettront en lumière les spécificités neuronales et moléculaires présentes chez les individus à risque de perdre le contrôle de leur consommation de cocaine.

Procédures

Certains animaux seront soumis à une chirurgie cérébrale afin d'injecter les différentes molécules d'intérêt (272 sur 352 rats). Parmi eux, certains recevront également l'implantation de fibres optiques permettant l'enregistrements de l'activité neuronale (24 sur 352 rats). Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure entre 45 min et 1h. De plus, la majorité des rats sera soumise à une chirurgie intaveineuse pour l'implantation d'un cathéter intraveineux (328 sur 352 rats). Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 30 min. L'exposition au courant électrique ne dépasse pas le degré modéré. L'intensité choisie de 0,5mA durant 0,5 sec est considérée comme très faible. Il est également important de souligner que dans cette phase, les animaux ont le choix entre 2 leviers et auront donc la possibilité d’éviter le courant électrique.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances pouvant éventuellement être attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie cérébrale, c'est à dire : possible risque d'inflammation ou d'infection, apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée, perte des points de suture avant cicatrisation complète. Dans tous les cas nous veillerons à ce que ces nuisances soient réduites au maximum. Les courants électriques de 0,5mA sont indolores et n'engendreront pas d'effest indésirables.

Devenir

A la fin des expériences, il est nécessaire de vérifier la précision de nos chirurgies cérébrales mais également de prélever du tissu pour mesurer les niveaux de nos molécules d'intérêt. Aussi les animaux seront mis à mort afin de prélever le tissu cérébral.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal se justifie pour plusieurs raisons éthiques : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 2) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Ce projet s'intéresse à la présence d'un sous groupe d'animaux (estimé à 30 pourcents des individus selon les données publiées). De plus, étant donné que le pourcentage d’attrition est estimé à 20 pourcent en fin d’expérience, il faut démarrer l’expérience avec un groupe de 20 rats. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, il faut obtenir un effectif final minimum de 5 à 6 individus dans le sous groupe minoritaire. Enfin, les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques.

Raffinement

Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie et anesthésie chimique ou gazeuse, sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 30min et 1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection intraveineuse d'antibiotique ainsi qu’une injection sous-cutanée de solution saline, pour favoriser la réhydratation. Une période de récupération de 7 à 10 jours est observée durant laquelle les animaux sont sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Avant le début des expériences, les animaux sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs à raison de 2h par jour) afin de limiter le niveau de stress et d’anxiété des animaux. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de procéder à sa mise à mort. Ces manifestations éventuelles sont suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes ; pesée régulière 3 fois par semaine).

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue un modèle établi pour l'étude de l'addiction avec lequel de nombreuses données ont été obtenues par la communauté scientifique. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., age moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.

20 marmousets vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont mis à jeun de 10 à 18 heures, séparés de leur groupe puis anesthésiés pour subir jusqu'à 20 séances d'IRM, avec injection d'un agent de contraste au fer et d'un chélateur, pour comparer le traitement de la voix entre marmousets, macaques et humains. Le porteur indique que l'anesthésie peut entraîner des complications respiratoires ou cardiaques et que l'agent de contraste affecte le foie. Il revendique un bénéfice de connaissance fondamentale sur les bases cérébrales de la perception vocale, sans application médicale annoncée.

Objectifs

Ce projet vise à utiliser des tests comportements en accès libre ainsi que l'IRMf pour mesurer l'activité cérébrale dans des conditions d'écoute passive et la comparer entre des groupes de sujets de taille comparable entre marmousets, macaques et humains. Les marmousets seront testés grâce à un système de test automatisé accroché à leurs cages et accessible à volonté, et ils seront scannés sous anesthésie en IRM 3T. Pour la partie comportement, deux expériences seront réalisées grâce à des boites de tests automatiques : catégorisation vocalisations par rapport à d'autres sons et discrimination du locuteur. En parallèle deux expériences seront menées dans le box expérimental : l'enregistrement des vocalisations et l'interaction vocale avec des 'singes virtuels' . Pour la partie IRMf, deux expériences seront réalisées: la localisation d'un patch vocal (neurones sensibles et spécifiques au traitement des vocalisations des marmousets) et comparaison inter-espèces; puis le codage normalisé de l'identité.

Bénéfices attendus

Nous espérons que cette recherche fournira de nouvelles informations cruciales sur les bases cérébrales et comportementales du traitement de l'information vocale chez les marmousets.

Procédures

Des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie. Lors de la préparation: les animaux vont être mis à jeun la veille de l'intervention (pour une durée minimale de 10 h et maximale de 18 h) et séparés de leur groupe le temps de la session (maximum 4h de séparation). L’imagerie dure environ 4h comprenant la capture de l’animal, le transport jusqu’au scanner, l’acquisition (environ 2h30), le retour à l’animalerie et la réintroduction de l’individu dans son groupe familial. Lors de l'acquisition : les animaux seront anesthésiés et pourront avoir une injection d’agent de contraste mais également être intubés si le protocole d'anesthésie ne nécessite. Après la séance : les animaux ayant eu une injection d'agent de contraste auront une injection d'un chélateur pour capturer le fer libéré dans le foie. L’injection se fait à la sortie de l’IRM quand le singe est pris en contention avant de le remettre dans sa boite de transport, elle dure environ 30 secondes. Au maximum chaque animal subira 20 sessions de scan IRM maximum espacés d’une semaine minimum.

Impact sur les animaux

Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu. Cependant des nuisances sont attendues chez les animaux pour la partie imagerie lors de la préparation (mise à jeun, séparation de l'animal à son groupe, capture), lors de l'acquisition (l'anesthésie et ses potentielles complications respiratoires et/ou cardiaques, l'injection intraveineuse d’agent de contraste et ses potentiels effets secondaires au niveau du foie, l'intubation si l'anesthésie le nécessite) et après la séance (injection d'un chélateur pour limiter l'effet de l'agent de contraste sur l'organisme et le foie en particulier).

Devenir

A la fin du projet les animaux seront gardés en vie. Ils pourront être réutilisés après avis favorable du vétérinaire désigné.

Remplacement

Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes, afin d’inférer des mécanismes potentiellement présents chez un ancêtre commun, ici les mécanismes comportementaux et neuronaux de la perception de l’information vocale. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux.

Réduction

Un but essentiel de cette étude comparative est de comparer les performances comportementales et les activations cérébrales de macaques, de marmousets et d’humains de manière robuste. Or un problème majeur dans la littérature jusqu’ici est que les rares études publiées sur les marmousets, notamment en IRMf, rapportent des résultats chez un petit nombre de sujets, typiquement 2 ou 3) alors que le standard de publication pour l’IRMf humaine est d’étudier des groupes d’humains d’au moins 12 sujets permettant des analyses de groupe pour des inférences robustes au niveau de la population générale. Nous voulons dans ce projet adresser ce problème et étudier des groupes d’humains et de marmousets de taille comparable. C’est pourquoi nous prévoyons d’étudier un groupe d’une vingtaine de marmousets (les trois couples reproducteurs initiaux et leur descendance), espérant obtenir des données comportementales et IRMf chez au moins une douzaine d’entre eux, pour une comparaison statistique robuste avec une puissance comparable dans une analyse incluant humains et marmousets. Cette stratégie devrait notamment permettre une estimation puissante de la variabilité interindividuelle des performances comportementales et patrons d’activité cérébrale, un but important de ce projet, qui n’a pas encore pu être réalisée de manière adéquate chez les marmousets du fait du trop petit nombre de sujets typiquement étudié. Par ailleurs ces tailles de groupe familiaux, similaires à celles observées dans le milieu naturel, favoriseront des interactions sociales complexes qui sont une condition importante du bien-être du groupe et un facteur important pour le succès des systèmes de test automatiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes familiaux, avec de l'enrichissement structurel et alimentaire renouvelé fréquemment. L’ajout d’agent de contraste permettrait d’améliorer la qualité des images tout en diminuant le nombre de sessions de scan par animal. La réduction du temps d’isolement du singe de sa famille permet de réduire le stress de tous les singes et également de réduire la possibilité de tensions lorsque le singe sera replacé dans son groupe familial. La modification de la mise à jeun n’affectera pas les autres animaux puisque la mise à jeun aura lieu pendant la nuit, période durant laquelle les animaux dorment et ne s’alimentent pas. Le fait de donner la nourriture quand le singe retourne dans sa cage permet de s’assurer qu’il n’y a pas de tensions entre les individus et d’augmenter la cohésion grâce au partage de nourriture entre eux.

Choix des espèces

Cette étude comparative comparera les données du marmouset à celles observées chez l’humain et les macaques. Les raisons justifiant le choix du ouistiti sont les suivantes : Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; Les ouistitis utilisent des vocalisations complexes et variées spécifiques à chaque espèce, bien caractérisées acoustiquement. Il s'agit d’un modèle neuroscientifique hautement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires. Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. La boite de test sera en accès libre pour tous les individus de chaque cage, cependant nous n’effectuerons la procédure IRM que chez les individus jeunes adultes ou adultes (fin de la période juvénile environ 10-12 mois après la naissance). Les trois femelles reproductrices ne seront pas incluses dans la partie IRM afin de ne pas stresser les gestations ni séparer les enfants de la mère. Si un contrôle hydrique doit être mis en place pour encourager l’utilisation des systèmes de tests automatiques les femelles reproductrices et les juvéniles (

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticancéreux (oxaliplatine, paclitaxel, bortézomib, vincristine) pour induire une neuropathie douloureuse, puis subissent chaque semaine des tests comportementaux de douleur (test du von Frey électronique, test d'immersion de la patte), avant un prélèvement terminal du système nerveux. Le porteur reconnaît que l'induction de la neuropathie est une nuisance qu'il qualifie d'"indispensable", et que les anticancéreux réduisent le gain de poids des animaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace encore l'animal vivant pour explorer la douleur, la retombée pour les patients restant renvoyée au conditionnel.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limité. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents au sein de notre équipe de recherche ont démontré l’efficacité analgésique du donépézil sur des modèles animaux de CIPN. L’effet analgésique du donépézil (inhibiteur de cholinestérase) implique l’activation des récepteurs muscariniques M2 (m2AChRs) au niveau spinal. Cependant, l’action anticholinestérasique du donépézil pourrait être responsable de l’activation d’autres récepteurs cholinergiques et le mécanisme analgésique des m2AChRs n’est pas totalement connu (à priori inhibition des cellules excitatrices et pronociceptives glutamatergiques). Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’implication du système cholinergique (m2AChRs) au niveau spinal et du système nerveux périphérique (ganglions spinaux - DRG) dans des modèles animaux de CIPN : mesure de l’expression génique et de la localisation des récepteurs cholinergiques au niveau spinal et des DRG, et exploration de l’effet analgésique d’agonistes spécifiques des m2AChRs.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques des CIPN. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). Nos précédents travaux ont démontré l’intérêt analgésiques du donépézil sur ces modèles animaux de CIPN, et ont permis la mise en place d’une étude clinique évaluant l’effet analgésique du donépézil chez des patients souffrant de neuropathie induite par l’oxaliplatine. Le projet proposé vise à préciser l’implication des m2AChRs comme nouvelle cible thérapeutique, et dont l’objectif à terme sera de développer des agonistes de ces m2AChRs pour le traitement des CIPN, et qui pourront être testé chez l’homme à moyen terme.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections d'anticancéreux ou du véhicule. Le nombre d’injection et leur voie d’administration sera fonction du modèle animal : - Oxaliplatine : 2 injections par semaine (lundi et vendredi) pendant 4 semaines, voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) - Paclitaxel : 4 injections (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Bortézomib : 5 injections (J0, J1, J3, J4 et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Vincristine : 5 Injections (J0, J2, J4, J7 et J9), voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaire et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - Test du von Frey électronique : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats) - Test d’immersion de la patte : durée du test pour un animal 5 minutes (max)

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux nécessitent un bon état général des animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera, in fine, de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies d’expression des récepteurs à l’acétylcholine dans une perspective thérapeutique.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais pour le moment ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexicité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est elle même pas encore élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer de nouvelles stratégies pharmacologiques et par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nosu devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche (Ferrier et al. J Neurosci 2015 ; Selvy et al. Biomed Pharmacother. 2022), ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de test comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le tronc cérébral, l'injection étant réalisée au deuxième jour après la naissance, pour valider des modèles de tumeur pédiatrique aujourd'hui incurable. Le porteur ne décrit qu'"un stress physique léger" lié à la manipulation avant anesthésie, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour prélever leurs cerveaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reconstitue la complexité tumorale in vivo et juge cette souche de souris "impossible" à remplacer.

Objectifs

Avec un taux de survie proche de zéro, les tumeurs du tronc cérébral ou DIPG sont les cancers les plus mortels chez l’enfant. L’étude de cette tumeur, toujours fatale en 2022, nécessite la validation de nouveaux modèles tumoraux et l’analyse des mécanismes responsables de son apparition.

Bénéfices attendus

Démontrer qu’une ou plusieurs des trois nouvelles lignées de tumeur du tronc cérébral forment des tumeurs chez la souris et que ces lignées constituent de bons modèles pour étudier le développement de la tumeur et ultérieurement, pour tester des médicaments.

Procédures

Implantation de cellules tumorales en intracrânien dans le tronc cérébral.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues pour les animaux sont un stress physique léger dû à la manipulation de la cage et des animaux avant anesthésie générale.

Devenir

Les 90 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des cerveaux et leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris. Malgré tout, ces modèles pourraient ouvrir la voie au développement ultérieur de nouvelles approches ex vivo, notamment à l’aide d’organoïdes.

Réduction

Les effectifs des animaux utilisés sont déterminés et nos résultats sont analysés selon des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées et suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées aux animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures. En ce qui concerne la manipulation des souris, celle-ci se fera en conditions stériles, sur tapis chauffant et sur des animaux sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

1. La souche de souris est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations d’hébergement. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale et la manipulation. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.

9 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie d'injection d'un composé dans le cerveau, puis des injections quotidiennes de molécules à tester et des tests comportementaux, dont un test d'évitement passif fondé sur un choc électrique aux pattes, pour évaluer des molécules contre la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que les injections génèrent du stress et que la mémoire est évaluée par la perception de ce choc électrique. Il affirme que les modèles murins sont "indispensables", seuls recours in vivo autre que l'humain à présenter les symptômes de la maladie.

Objectifs

Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer (MA) est aujourd’hui une priorité. Cependant la MA étant une maladie complexe, les chercheurs s’accordent à dire qu’un seul traitement ciblant un seul mécanisme pathologique de la MA ne sera pas suffisant. Nous cherchons donc à identifier de nouvelles molécules à fort potentiel neuroprotecteur. Nous développons également des molécules hydrides, composés de deux entités ciblants des combinaisons de cibles. Il est donc primordial de tester ces molécules sur un modèle in vivo de la MA afin de pouvoir un jour procéder au développement clinique d’un traitement innovant. Pour cela un modèle pharmacologique de souris Alzheimer sera utilisé pour injecter pendant 7 jours les molécules seules ou en combinaison, puis le statut mnésique des animaux sera évalué grâce à des tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de découvrir des molécules neuroprotectrices très efficaces sur un modèle aigu prédictif de la MA, avant de plus longue expérimentations sur un modèle transgénique, pour contrer les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et espérer un développement pré-clinique et clinique de molécules de nouvelle génération active seule ou en combinaison pour une action modifiant de façon durable le décours de la maladie.

Procédures

Les animaux auront au cours de leur vie une chirurgie permettant l'injection du composé dans le cerveau. Cette intervention est d'une durée de 7 minutes maximun entre le début de l'anesthésie gazeuse et la fin de l'inoculation du composé. Ensuite durant 1-7 jours les animaux recevront une injection dans l'abdomen des molécules à tester. Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec des tests comportementaux.

Impact sur les animaux

La chirurgie sous anesthésie est peu invasive. Cette procédure sera suivie par une ou plusieurs injections systémiques dans l'abdomen, ce qui pourra engendrer du stress chez l'animal. Par ailleurs, le test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme repose sur la perception d'un choc électrique de très faible intensité au niveau des pattes de la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post-mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Les molécules sont testées sur une gamme de doses réduite . Les animaux sont testés sur différents tests comportementaux de façon à mesurer différents types de mémoire sur chaque animal. Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe. Le nombre d'animaux a été déterminé par un logiciel de statistique.

Raffinement

Les animaux seront reçu une semaine avant le début de l'expérimentation et gardés en groupe de 8-10 individus par grande cage. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.

Choix des espèces

Le modèle souris permet de mimer rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer et le modèle permet d'obtenir des données préliminaires transférables aux modèles transgéniques murins. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines. C'est à cet âge que la toxicité induite par le composé est la plus marquée, que l'injection dans le cerveau est la plus simple à faire et que les déficits comportementaux et altérations biochimiques ont été caractérisés.

185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation de microbiote de patients par gavages répétés ou une induction d'arthrite par injection d'anticorps, l'implantation chirurgicale d'un capteur de télémétrie, puis un test de sensibilité tactile de von Frey, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans la douleur de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que l'induction d'arthrite peut provoquer diarrhée et déshydratation et que les mesures cardiaques imposent un isolement en cage individuelle. Il affirme qu'aucun modèle de substitution ou in silico ne convient, la perception de la douleur étant selon lui propre à "l'organisme conscient".

Objectifs

Il existe actuellement de très nombreux traitements pour les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR). Bien que ces traitements soient très efficaces sur l’inflammation, on observe chez 20 à 30 % des patients la persistance de douleurs chroniques diminuant grandement leur qualité de vie au quotidien. Ces patients présentent une sensation douleureuse déclenchée plus facilement que ches des personnes non atteintes. C'est la sensibilisation des voies nerveuses de la douleur. Ce mécanisme pathologique est responsable de la douleur chronique. De plus en plus de travaux montrent que le microbiote intestinal agit sur le contrôle de la douleur. On parle de l’axe intestin-cerveau. Cet axe repose entre autres sur les voies d'entrée de la douleur via le nerf vague parasympathique. Nous émettons l’hypothèse que le microbiote intestinal des patients atteints de PR est à l’origine de la sensibilisation de la douleur en modulant les neurones parasympathiques. Une fois altérés, ces neurones vont entrainer des douleurs pathologiques chroniques, malgré le contrôle l’inflammation articulaire. Notre objectif est d'évaluer in vivo l’impact du microbiote intestinal sur la sensibilisation à la douleur et sur la fonction du système nerveux parasympathique dans un contexte de polyarthrite rhumatoide. Nous voulons identifier quels facteurs issus du microbiote intestinal est/sont impliqué(s).

Bénéfices attendus

Une fois la preuve de concept apportée, l'analyse et la comparaison des souches bactériennes et métabolites du microbiote des différentes conditions (polyarthrite douloureuse, non douloureuse et de différents groupes contrôles), en fonction du stade clinique et de la sensibilisation obtenue in vivo permettront d’identifier quels facteurs du microbiote pourraient être impliqués dans ce mécanisme allodynique. Ceci ouvrira de nouvelles voies de recherche sur ce phénomène pathologique. De plus, une fois le facteur identifié, nous pourrons continuer d'explorer ce mécanisme in cellulo (neurones de ganglions jugulaires et noueux murins contenant les corps neuronaux des afférences du parasympathiques).

Procédures

Selon le groupe de souris, les animaux auront soit un transfert de microbiote intestinal de patients (4 gavages (durée 2 à 4 minutes) sur 4 semaines, précédés d'une semaine d'antibiotique par voie orale), soit une induction de polyarthrite rhumatoïde (injection d'anticorps anti-collagènes). Tous les animaux auront une implantation de capteurs de télémétrie sous-cutanée pour enregistrement de l'électrocardiogramme (2 mesures). L'implantation chirurgicale en sous cutanée dure environ 20 minutes. D'une manière hebdomadaire, des recueils de selles seront effectués et une pesée sera réalisée. Un test de détermination de la sensibilité tactile sera effectué à 2 temps du protocole (avant/après). La durée du test de Von Frey est d'environ 20 minutes par animal. Plusieurs prélèvements seront effectués en post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés à des fins d'enregistrement de l'electrocardiogramme devront être mis en cage unique. Concernant l'execution du test de sensibilité tactile (Von Frey), ce dernier sera mené de manière éthique et consiste à ne pas faire durer l'inconfort/la douleur d'un animal au cours du test. L’étude de la douleur se fera donc dans la recherche des seuils de douleur avec un cut off pour ne pas faire souffrir en excès les animaux. Concernant l'induction d'arthrite, l’injection de LPS peut entraîner des diarrhées et une déshydratation.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour éffectuer des prélèvements, soit pour récupérer le télétransmettteur de télémétrie.

Remplacement

Ce projet s'interressant aux mécanismes de régulation de la douleur par le microbiote intestinal, il n'existe pas de modèle de substitution ou in silico permettant d'étudier les mécanismes mis en jeu. Par ailleurs, la perception de douleur est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge et du même genre au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, von Frey), permettant le suivi des animaux dans le temps pour réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'information sur chaque animal. AInsi nous étudierons les paramètres avant/après intervention sur le même animal. De plus, nous effectuerons les mesures d'ECG, de pharmacologie, les tests d'allodynie, les analyses de microbiote chez le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et augmenter la puissance statistiques des tests (tests appariés). Les tissus d'intéret (tissu nerveux, cardiaque, digestif) seront prélevés sur tous les animaux en vue de leur étude ultérieure.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans l’EU, régulée à 22-24°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson et un bruit de fond d’ambiance. Les conditions de stabulation sont effectuées en ambiance EOPS (pas de pathogène, pas d'opportuniste, pas de parasite) avec maintien en groupe dans des cages de taille appropriée avant inclusion dans le protocole. Les animaux sont stabulés en condition d'enrichissement intermédiaire (copeaux de différentes origine et texture, cotons et substrat de nichage, aliment accessible sur le substrat au besoin). Une visite quotidienne par un zootechnicien ou investigateur principal des animaux pour le suivi journalier est effectuée. L'ensemble des procédures sera réalisé avec l'objectif de réduire /limiter l'angoisse tout au long du projet, de limiter la douleur au seul besoin du projet (test d'allodynie de von Frey) en utilisant les méthodes appropriées d'analgésie et d'anesthésie lors de l'implantation des capteurs de télémétrie., et dans le respect de l'animal. Une grille d'évaluation clinique et des actions à mener en conséquences est mise en annexe. En particulier, le jour de l’implantation ECG, les animaux sont surveillés une fois par heure. Puis, les animaux sont surveillés une fois par jour. En cas de présence de douleur (échelons décrits dans la grille), un renforcement des visites sera conduit : Echelons 1 & 2 : 2 à 3 visites/jour; Echelon 3 : 4 visites/jour et 1 visite/heure en échelon 4. Si l’animal est inactif, incapable de se déplacer, avec les poils très hérissés, le dos courbé (possibilité de décubitus latéral) et des difficultés respiratoires ou bien avec les yeux fermés, et une perte de poids (>15% du poids initial), la mise à mort de l’animal est décidée.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vivo, permettent d’évaluer les conséquences fonctionnelles intégrées d’un microbiote précis. La régulation autonomique (afférences/éfférences) est largement similaire entra l'Homme et la souris, tout comme les mécanismes de l'allodynie. L'expérience du laboratoire dans le transfert de microbiote chez la souris, dans les investigations cardiaques et autonomique (HRV) permet d'éviter une mise au point/validation du protocole et la consommation d'animaux pour cela. Par ailleurs, un projet connexe sur le modèle murin est déjà en cours sur cette thématique au laboratoire. L’arthrite sera induite chez des animaux de 10 à 12 semaines d'âge comme cela est conseillé dans la littérature. Le protocole d’humanisation nécessitera 4 semaines et donc l’utilisation de souris âgées de 8 semaines pour qu’elles atteignent les 12 semaines au moment de l’induction de l’arthrite.

552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes pour injecter un marqueur fluorescent dans les embryons, et d'autres femelles reçoivent des embryons génétiquement modifiés, afin d'étudier la létalité embryonnaire liée à des défauts de réparation de l'ADN. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer douleur et infection post-chirurgicale, et que certaines lignées mutantes développent un déficit immunitaire menant à l'euthanasie. Il affirme que ces questions ne peuvent être étudiées que chez le mammifère "in toto", aucun modèle in vitro ne reproduisant le développement du cortex cérébral.

Objectifs

Les cassures de l’ADN sont des lésions génomiques très toxiques qui interviennent lors du développement du système nerveux central. La mauvaise réparation de ces lésions est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme comme certaines maladies neurodégénératives, des déficits immunitaires sévères et le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des lésions de l'ADN se traduisent par une létalité embryonnaire. Plusieurs facteurs impliqués dans les voies de réparation des dommages à l'ADN ont été identifiés à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme et analysés dans des modèles animaux d’invalidation génique afin d’en mieux comprendre la fonction. L'objectif du présent projet est d'identifier les raisons de la létalité embryonnaire de certaines lignées de souris déficientes en voie de réparation de l'ADN. Nous projetons de générer une lignée de souris mutantes incapables de générer les lésions de l'ADN dans le cerveau en développement et d'évaluer si ce fonds génétique peut préserver les animaux déficients en réparation de l'ADN de la létalité embryonnaire.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est la détermination de la fonction des lésions programmées de l’ADN dans les phases précoces du développement du cerveau. Cette fonction est jusqu'à présent inconnue. Cette étude nous permettra alors de mieux comprendre la mort cellulaire neuronale et la létalité embryonnaire qui en découle chez les animaux porteurs d'anomalies de la réparation de l'ADN. In fine, cette étude participera à la compréhension de maladies génétiques de l'enfant caractérisées par des anomalie du développement, l'existence de microcéphalies ainsi que le développement de tumeurs cérébrales et les mécanismes de vieillissement accéléré.

Procédures

Pour générer certaines souris mutantes, 30 femelles pseudogestantes seront réimplantées avec des embryons génétiquement modifiés. Pour l'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN, des embryons à E12.5 ou 14.5 recevront par injection in utero (en une seule intervention et sous anesthésie générale) des souris femelles gestantes un marqueurs fluorescent de ces dommages. La chirurgie dure entre 30 et 45 min selon le nombre d’embryons avec 45 min comme durée maximum.

Impact sur les animaux

Les souris avec un défaut de réparation de l'ADN ont un phénotype dommageable connu ; une létalité embryonnaire. Nous n’envisageons pas de phénotype dommageable des deux lignées mutantes faisant l’objet de ce dossier. L’analyse des lésions de l’ADN dans le cerveau par l'introduction intra-embryonnaire d'un marqueur fluorescent ainsi que la réimplantation d'embryons génétiquement modifiés dans des femelles receveuses peuvent présenter quelques nuisances (douleur, infection post-chirurgicale) liées à l'expérimentation.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques

Remplacement

Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du cortex des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.

Réduction

Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité embryonnaire, baisse de viabilité avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Nous calculons le nombre minimal d'animaux nécessaire à l'aide d'outils statistiques.

Raffinement

Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone protégée afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement euthanasiés. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure. Pour certaines procédures la litière utilisée dans la cage est spécifique pour les animaux opérés et permet de diminuer le risque d'infection de la cicatrice. La nourriture ainsi qu’un gel hydrique sont placés directement dans la litière pour une meilleure accessibilité. Lors des actes chirurgicaux, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré́- et post-opératoire. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou le sacrifice de l'animal sont envisagés en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projet. L'analyse des phénotypes dommageables éventuels se fait sur des femelles gestantes pour la létalité embryonnaire et sur des animaux nouveau-nés de la naissance jusqu'au sevrage pour la baisse de viabilité. L'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN est effectuée sur des embryons à E12.5 et E14.5. Les embryons sont ensuite analysés à E16.5 et E18.5 après activation d'un marqueur spécifique fluorescent.