Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Potentiel thérapeutique des lymphocytes T régulateurs dans la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Charcot, elles développent une paralysie progressive et sont suivies jusqu'au point limite, fixé à l'incapacité de se retourner en quinze secondes ou une perte de poids dépassant 15 %. Certaines reçoivent un transfert de lymphocytes T régulateurs par voie intraveineuse, d'autres un prélèvement intracardiaque après injection létale. Le porteur revendique une approche de thérapie cellulaire à amener "au plus proche de la clinique".
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie du motoneurone adulte qui se caractérise pas une paralysie progressive. Bien que les neurones moteurs soient sélectivement atteints dans la maladie, le système immunitaire se retrouvent également impliqué dans cette maladie. En effet, des lymphocytes T dits régulateurs (Treg), une population de globules blancs dont la fonction est de supprimer les réponses immunitaires potentiellement dangereuses, voient leur nombre et leur propriétés régulatrices fortement diminuées chez les patients et les souris. L’hypothèse de départ est que les altérations métaboliques présentes dans la maladie de Charcot contribuent au dysfonctionnement des lymphocytes T régulateurs dont la fonction est directement gouvernée par l’environnement métabolique. Notre projet consiste donc à étudier le métabolisme des lymphocytes T régulateurs dans la maladie et d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une correction métabolique de ces cellules dans un modèle de maladie de Charcot.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour vocation d'explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. En ciblant l'interaction entre système nerveux et système immunitaire, notre objectif est d'amener le plus proche possible de la clinique une approche de thérapie cellulaire compatible avec les contraintes cliniques.
Procédures
L’étude du métabolisme implique des prélèvements intra-cardiaques suite à une injection léthale d’un mélange anesthésique/analgésique chimique sur des animaux modèles de la maladie de Charcot avec un phénotype dommageable. Un total de 54 animaux avec phénotype dommageable seront soumis à ce prélèvement sanguin. Le prélèvement prend moins de 5 min par animal. L’étude de l’effet thérapeutique d’un transfert de lymphocytes régulateurs d’origine différente dans des souris modèles de la maladie de Charcot comprend une injection de cellulaire en intra-veineuse sur un total de 192 souris à phénotype dommageable. 4 souris à phénotype dommageables serviront de souris donneuses de lymphocytes qui seront modifiés in vitro avant réimplantation. 72 souris qui ont été transfusées seront incluses dans une étude comportementale qui débute à l’âge de 60 j jusqu’à son incapacité à effectuer le test moteur, et qui atteint donc le point limite. Chaque test moteur est non-invasif et non-contraignant prend entre 20 sec et 5 min par souris. Un total de 168 souris seront utilisées pour une étude de cytométrie et d’histologie. Ces souris recevront une injection terminal d’un mélange anesthésique/analgésique chimique pour ensuite être soumis à un prélèvement sanguin ou une perfusion intra-cardiaque pour préparation à l’histologie. L’anesthésie profonde et très rapide, la manipulation prend moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Le modèle de maladie de Charcot que nous utilisons a été généré chez la souris. Les premières souris transgéniques récapitulant la maladie de Charcot ont fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique, électrophysiologique et histopathologique. Un manuel d’utilisation standardisé respectant les bonnes règles relatives à l’expérimentation animale est d’ailleurs publié. L’évolution de la maladie chez ces souris se fait par le suivi du poids la souris (comme témoin d’une amyotrophie qui signe la dégénérescence des neurones moteurs) et le test de la grille. La paralysie affecte systématiquement les membres postérieurs en premier. Afin d’estimer l’espérance de vie des souris dans les différents groupes, la mortalité sera fixée à l'âge auquel l’animal est incapable de se retourner dans les 15 secondes lorsqu'il est placé sur son dos (ou bien lorsque sa perte de poids excède 15% du poids maximum.
Devenir
Les souris porteuses de la mutation causant la SLA ont une espérance de vie limitée. L'ensembles animaux seront euthanasiés selon les critères d'interuption définis préalablement
Remplacement
Le modèle murin de la maladie de Charcot que nous utilisons mime l’ensemble des traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques de la maladie humaine. Un effort est réalisé pour minimiser et optimiser le nombre d’animaux. Cependant, la validation fonctionnelle et le protocole thérapeutique pré-clinique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles animaux de la maladie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèle de la maladie.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèle de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. L’enrichissement du milieu avec des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à fournir un environnement enrichi. Cet environnement permet d’améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une grille de suivi est scrupuleusement suivie avec une définition claire des points limites. Les souris sont euthanasiées par injection d’une dose léthale d’anesthésique chimique (kétamine) en combinaison avec un analgésique (xylazine).
Choix des espèces
Le modèle de la maladie de Charcot que nous utilisons a été généré chez la souris. Les premières souris transgéniques récapitulant la maladie ont fait l’objet de nombreuses études nous permettant de connaître très précisément leur tableau clinique, électrophysiologique et histopathologique. Un manuel d’utilisation standardisé respectant les bonnes règles relatives à l’expérimentation animale est d’ailleurs publié. L’évolution de la maladie chez ces souris se fait par le suivi du poids la souris (comme témoin d’une amyotrophie qui signe la dégénérescence des neurones moteurs) et le test de la grille. La paralysie affecte systématiquement les membres postérieurs en premier. Afin d’estimer l’espérance de vie des souris dans les différents groupes, la mortalité sera fixée à l'âge auquel l’animal est incapable de se retourner dans les 15 secondes lorsqu'il est placé sur son dos (ou bien lorsque sa perte de poids excède 15% du poids maximum.
Impact du jeûne intermittent sur les épilepsies de type absence chez la souris: modèles génétiquement modifiés
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire des épilepsies-absence, elles subissent la pose chirurgicale d'un implant crânien d'enregistrement (EEG) de 45 minutes et des prélèvements sanguins, pour tester si un jeûne intermittent réduit les crises. Le porteur indique que ces crises ne sont ni douloureuses ni convulsives et classe la procédure en modéré à cause de la chirurgie et des prélèvements. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour évaluer un modèle épileptique.
Objectifs
Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime cétogène riche en protéines et gras, et faible en carbohydrates, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 2 modèles d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique (ex. ethosuximide, valproate), en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications métaboliques, physiologiques et transcriptomiques qui accompagnent le régime IF.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que des prélèvements sanguins à un mois minimum d'interval (voir chronogramme en annexe). L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement.
Impact sur les animaux
Le régime IF a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que les modèles d'épilepsie que nous utilisons n'induisent pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui provoquent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant EEG, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.
Choix des espèces
L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Nous utilisons les animaux à partir de 6 semaines car c'est l'âge à laquelle les crises d'absence commencent à se manifester. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur nos modèles génétiquement modifiés.
Etude des effets de la caféine sur le connectome cérébral dans un modèle de maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
126 souris génétiquement modifiées pour développer une pathologie de type Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont exposées à la caféine in utero ou à l'âge adulte, puis suivies pendant douze mois par IRM sous anesthésie, tests comportementaux (labyrinthe surélevé, reconnaissance d'objets), frottis vaginaux et prélèvements sanguins, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur nomme des atteintes possibles comme des blessures entre mâles après rasage du flanc et une défaillance cardio-respiratoire sous anesthésie. Il affirme le recours à l'animal "incontournable" et sans "alternative", et renvoie l'application chez l'humain au long terme.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer, plus fréquente cause de démence est responsable d’une morbidité et mortalité importante avec un impact économique majeur sur le système de santé. Les patients ayant la maladie présentent une altération du connectome cérébral qui est la cartographie de l’ensemble des connexions existant entre les différentes aires du cerveau, et généralement établie à partir de méthodes d’IRM. A ce jour, il n’existe pas de traitement préventif. De récents travaux chez la souris suggèrent qu’une exposition anténatale à la caféine constituerait un facteur de risque dans l’apparition précoce des déficits cognitifs. En revanche, administrée quotidiennement à de faibles doses à l’âge adulte, la caféine pourrait retarder ou réduire le risque d’apparition des déficits cognitifs. Notre objectif est d’étudier les effets de la caféine sur la connectivité cérébrale dans la maladie d’Alzheimer et de vérifier si les éventuels changements de connectivité sont corrélés aux performances cognitives. Afin de comprendre l’impact de la caféine sur le cerveau dans la maladie d’Alzheimer, nous caractériserons pendant 12 mois l’évolution des connectomes structural et fonctionnel chez des souris mâles et femelles génétiquement modiées de type Alzheimer. Les souris seront exposées à la caféine soit in utero, soit à l’âge adulte (dès 3 mois). Elles seront suivies par IRM fonctionnelle à l’état de repos et imagerie du tenseur de diffusion sous anesthésie générale légère et sédation. Nous comparerons les connectomes de ces souris à ceux de souris contrôles grâce à une approche classique de traitement des données d’IRM fonctionnelle de repos. Des études comportementales précéderont les explorations IRM. Elles permettront d’établir d’éventuelles corrélations entre modifications du connectome et performance cognitive sous les effets de la maladie et de la caféine. Une approche personnalisée se fera grâce à la plateforme neuroinformatique « The Virtual Mouse Brain ». Le connectome fonctionnel de chaque souris sera prédit à partir du connectome structural acquis en imagerie du tenseur de diffusion et comparé au connectome fonctionnel obtenu expérimentalement par IRM fonctionnelle de repos. Cela permettra, si les prédictions sont avérées, de prédire l’évolution de la maladie d’Alzheimer et l’efficacité des thérapies. L’approche par virtualisation permettra d’optimiser la plateforme sur le modèle étudié et de réduire le nombre d’animaux nécessaires dans des études futures.
Bénéfices attendus
Cette étude repose sur un modèle animal d’Alzheimer. Elle s’appuie aussi sur des méthodes avancées de neuroimagerie (IRM) transposables à l’homme qui permettent l’exploration non-invasive du cerveau. Ce travail investigue l’effet de la caféine sur la connectivité cérébrale et fournira des informations détaillées sur le développement de la pathologie dans le modèle expérimental étudié et éventuellement sa régression avec le traitement à la caféine. Nous nous attendons à identifier des biomarqueurs prédictifs de la détérioration, régression ou amélioration de la maladie d’Alzheimer. L’approche par virtualisation du cerveau de chaque souris grâce à la plateforme neuroinformatique nous permettra d’effectuer des prédictions du connectome fonctionnel pour chaque temps donné, ce qui sera vérifié expérimentalement au travers des acquisitions d'IRM fonctionnelle à l'état de repos qui seront effectuées et de l’évaluation cognitive de chaque animal. Ceci pourra à long terme être utilisé chez l’homme étant donné que la plateforme a été initialement développée chez l’homme. On pourra alors prédire en fonction du stade de prise en charge de la maladie d’Alzheimer, son évolution ainsi que l’impact des thérapies mises en œuvre.
Procédures
Exposition à la caféine des reproducteurs, des embryons, des fœtus via le cordon ombilical et des petits de la portée via le lait maternel : les parents reproducteurs seront exposés à la caféine par l’eau de boisson deux semaines avant l’accouplement. Les reproductrices seront exposées à la caféine durant toute la gestation et par conséquent, les embryons et les fœtus in utero. Après la mise-bas, les petits seront exposés jusqu’au 15ème jour postnatal par la prise du lait maternel. Exposition à la caféine à l’âge adulte : Un groupe de souris sera exposé à la caféine par l’eau de boisson après 3 mois de vie et de manière chronique jusqu’à 12 mois. Tests comportementaux : Le comportement sera étudié sur des animaux contrôles, exposés à la caféine soit in utero, soit à l’âge adulte. Chaque animal sera soumis à 2 tests différents avec des intervalles de récupération entre les tests. Le test du labyrinthe en croix surélevé dure en moyenne 5 min. Le test de substitution et de reconnaissance d’objets dure 35 minutes en moyenne par animal. Chaque test sera réalisé 4 fois sur un même animal (3, 6, 9 et 12 mois). Prélèvement vaginal : Le frottis vaginal sera réalisé sur des souris vigiles. Chaque femelle de l’étude aura 4 frottis au total sur une durée de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois). Les cellules seront prélevées en quelques secondes par lavage vaginal dans l’eau stérile contenue dans une fine pipette. Prélèvement sanguin : Il sera réalisé en quelques secondes sur des souris anesthésiées en vue de l’IRM. Chaque souris de l’étude aura 4 prélèvements sanguins au total au niveau de la veine saphène latérale ou de la veine submandibulaire sur une durée de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois). IRM : Les animaux seront explorés sous anesthésie générale légère et sédation. La durée de l’examen sera d’environ 1h30. Les animaux contrôles et les animaux exposés à la caféine in utero ou à l’âge adulte (dès 3mois) subiront 4 examens au total sur une période de 9 mois (3, 6, 9 et 12 mois).
Impact sur les animaux
Les souris traitées à la caféine peuvent présenter une baisse de la consommation de l’eau de boisson les deux premiers jours d’exposition. Les souris exposées à la caféine in utero par le biais de leurs mères peuvent avoir un poids plus faible à la naissance que les contrôles. Cependant, à l’âge adulte, leur poids n’est plus différent de celui des souris naïves. L’exposition in utero à la caféine a un effet délétère sur le cerveau. Les animaux seront soumis à 2 tests comportementaux différents et pourraient être plus anxieux lors du second test réalisé le lendemain du premier. L’effet indésirable lors des frottis vaginaux est de provoquer une stimulation induisant une pseudo-gestation. Bien que ce risque soit mineur chez les souris à l’inverse des rates, nous avons envisagé les dispositions permettant de minimiser cette éventualité (utilisation d’une micropipette et espacement des prélèvements de 3 mois). Les animaux seront aussi examinés par IRM tous les 3 mois (m3 à m12). A chaque IRM, ils seront rasés au niveau du flanc droit sur les faces dorsale et ventrale afin de faciliter le monitoring de la saturation en oxygène pendant l’examen. Ce geste est indispensable pour avoir des valeurs fiables sur les souris de notre étude car l’oxymètre étant associé à un capteur infrarouge, son pouvoir absorbant est atténué par leur pelage noir. Cependant, du fait du dos rasé, les souris mâles peuvent se blesser plus facilement lors des luttes entre congénères. Ils seront alors surveillés et nettoyés avec de la vétédine au besoin. La seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque le vetflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.
Devenir
Après la dernière IRM, les descendants des triades seront soumis à une perfusion intracardiaque en vue de prélèvements destinés à des analyses neuroanatomiques et immunihistochimiques. Les reproducteurs seront mis à mort à 12 mois du fait de leur âge et parce qu’ils ne seront plus réutilisés pour générer des colonies à la fin de l’étude.
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. L’étude de la connectivité cérébrale au cours de la vie nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative. De nombreuses études montrent que les dynamiques cérébrales globales sont analogues chez les mammifères, et le modèle de souris Alzheimer qui sera utilisé est très pertinent pour apporter de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux et mieux appréhender cette maladie.
Réduction
Le recours à l’animal étant incontournable, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum grâce à l’utilisation de méthodes non-invasives en IRM permettant le suivi longitudinal d’un même animal. Nous ne disposons pas de données préliminaires sur l’effet de la caféine sur les métriques IRM dans notre modèle de souris Alzheimer. Il ne nous est donc pas possible d’utiliser de tests statistiques pour évaluer la taille des groupes. En tenant compte des aléas possibles dans la mise en œuvre du projet et sur la base de notre expérience en IRM préclinique, nous avons donc réduit le nombre d’animaux au minimum permettant de répondre à la question scientifique.
Raffinement
Le raffinement concernera la diminution du stress par l’utilisation d’une anesthésie légère lors de l’IRM. Un délai d'acclimatation minimum de 10 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés lors de l’arrivée des animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés en vue de l’IRM. Pendant les sessions d’imagerie, les animaux seront plongés sous anesthésie légère avec sédation afin d’éviter tout stress. Ils bénéficieront d’un monitoring physiologique continu avec un système dédié au rongeur permettant d’adapter immédiatement l’anesthésie afin d’éviter toute situation de détresse cardio-respiratoire. Les études comportementales seront effectuées sous la conduite d’un opérateur expérimenté et les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en plexiglas, cartons à ronger, fast-track, balançoires). Des points limites adaptés et précoces seront mis en place pour la procédure. Des critères d’arrêt anticipé de l’expérimentation en cas de survenue d’une complication seront appliqués.
Choix des espèces
Ce projet utilise des souris génétiquement modifiées comme modèle animal de la maladie d’Alzheimer. Ce modèle est considéré comme pertinent car il reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine (lésions de type plaques amyloïdes, neuroinflammation, propagation de protéines tau et déficits cognitifs). Nous utiliserons des reproducteurs âgés de 6 à 8 semaines, exposés ou non à la caféine. Les descendants seront soit : exposés à la caféine in utero et pendant les 15 premiers jours de vie par le lait maternel ; soit non exposés pendant la gestation mais exposés de manière chronique à la caféine à l’âge adulte (de 3 à 12 mois) ; soit, jamais exposés à la caféine au cours de leur vie. Les différentes interventions se feront tous les 3 mois sur les souris adultes (à partir de 3 mois jusqu’à 12 mois). Cette étude permettra d’étudier les modifications induites par la maladie, la caféine et le vieillissement sur le connectome cérébral.
Projet pilote : Modèle de mouvements anormaux après privation en oxygène chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont privés d'oxygène pendant 1 à 30 minutes, dont 40 sans anesthésie et maintenus par contention, pour mettre au point un modèle de myoclonies reproduisant le syndrome de Lance-Adams humain. Le porteur décrit une possible détresse respiratoire, des secousses musculaires gênant déplacement et alimentation, et reconnaît que la mort pendant l'anoxie est une "possibilité expérimentale". Il s'agit d'une étude "pilote" visant à caler les paramètres d'un futur modèle, et il revendique la "nécessité" d'expériences animales au motif qu'on ne peut provoquer ces atteintes chez l'humain.
Objectifs
Chez l’homme, l’arrêt de l'oxygénation du cerveau (ou anoxie cérébrale) peut être liée à des causes variées : arrêt cardiaque, crise d’asthme ou infection des poumons très sévère, noyade, pendaison, etc. Elle entraîne chez les survivants des maladies neurologiques chroniques comme le syndrome de Lance-Adams (LAS). Le LAS apparait dans les jours ou semaines suivant le manque d'oxygène, après retour des patients à un état de conscience normal. Le LAS est caractérisé par des secousses musculaires involontaires (appelées myoclonies) très importantes. Ces secousses musculaires, non qualifiées comme douloureuses par les patients, apparaissent spontanément ou sont induites par les mouvements ou des sons par exemple. Elles rendent impossible la réalisation de nombreux gestes de la vie quotidienne : marcher, s’alimenter, se laver ou aller aux toilettes. Les patients sont le plus souvent traités par de multiples médicaments qui exposent à de nombreux effets secondaires et aux risques d’interactions entre médicaments. Dans le LAS, l'efficacité de ces médicaments est souvent insuffisante. Les mécanismes à l'origine du LAS restent peu connus. A ce jour, deux modèles de LAS ont été développés chez le rat, soit par arrêt des contractions cardiaques après une injection de toxiques dans le coeur, soit par arrêt de la circulation sanguine par compression des gros vaisseaux sanguins situés dans le thorax à la sortie du coeur. Cependant, ces deux modèles présentent plusieurs limites, notamment une approche expérimentale lourde, un taux de mortalité élevé et l’induction de lésions cérébrales par ischémie (interruption brutale du flux sanguin) et non pas par anoxie (manque pur d'oxygène). L’objectif de notre projet pilote est donc de mettre au point un nouveau modèle animal de myoclonies après un manque d'oxygène reproduisant le phénotype de LAS chez l’humain. Avec une procédure expérimentale plus simple, moins invasive et plus représentative du mécanisme de LAS chez l’humain, nous souhaitons identifier les divers paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un modèle fiable et reproductible tout en limitant la mortalité et la douleur chez l’animal, indispensable pour vérifier nos hypothèses concernant les mécanismes à l'origine du LAS.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints de LAS est aujourd’hui limitée avec des traitements à l’efficacité assez faible dans cette pathologie. L’amélioration de la prise en charge des patients passe avant tout par une meilleure compréhension des mécanismes aboutissant aux secousses involontaires (appelées myoclonies) du LAS. Cela repose donc notamment par l’exploitation des modèles animaux qui reproduisent cette pathologie. Comme évoqué précédemment, les modèles déjà publiés de LAS ont des points faibles. Nous souhaitons donc développer ce nouveau modèle de LAS chez le rongeur pour ensuite l’explorer finement afin d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes pathologiques du LAS. Les études animales déjà réalisées donnent des résultats assez hétérogènes. Chez l’homme, les études cliniques semblent indiquer que les secousses des patients avec un LAS pourraient provenir de l'écorce du cerveau appelée cortex. Dans notre groupe de patients atteints de LAS, les premiers résultats sont très en faveur d’une atteinte du cortex pouvant être à l'origine des secousses. Par ailleurs, certains neurones spécifiques du cortex sont très consommateurs d'oxygène. Le manque d'oxygène pourrait donc en priorité affecter le fonctionnement de ces neurones-là. Nous faisons donc l’hypothèse que les secousses musculaires du LAS sont, au moins en partie, dues à un souffrance de ces neurones au sein du cortex responsable des mouvements. A court terme, cette étude pilote permettra d’établir les différents paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un nouveau modèle animal de LAS. A long terme, le bénéfice de la mise en place de ce nouveau modèle sera d’approfondir, dans un projet ultérieur, les connaissances déjà acquises sur le LAS, en particulier par des méthodes électrophysiologiques et immunohistochimiques afin de tester notre hypothèse.
Procédures
Le protocole d'anoxie transitoire sera réalisé à une seule reprise sur les 50 rats. Sur un premier groupe de 10 rats (groupe 1), cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale. Pour les 4 autres groupes de rats (de 10 rats chacun), cette procédure sera réalisée sans anesthésie. Le protocole d’anoxie durera entre 1 et 30 minutes. Pour chacun des rats, des électrodes sous-cutanées de surveillance ECG et une pince oxymètre de pouls de surveillance de la saturation en oxygène seront placées avant la procédure d’anoxie et seront retirées ensuite. De plus, une voie veineuse sera posée dans la veine caudale. Pendant cette procédure d’anoxie transitoire sur le groupe 1, le risque anesthésique est à prendre en compte. Par ailleurs, pour les animaux non anesthésiés (groupes 2, 3, 4 et 5) pour la procédure d’anoxie transitoire, le système de contention pourra représenter une nuisance pour l’animal car cela va nettement restreindre sa mobilité. Au cours de la procédure d’évaluation de la survenue des myoclonies, des injections de molécules anti-épileptiques (durée d’injection et temps de maintien : 1 minute) seront réalisées une fois pour chaque animal par voie intra-péritonéale. Pour tous les animaux, le phénotype induit sera surveillé très attentivement du fait de la possibilité de perte de motricité et d’apparition de myoclonies et de crises d’épilepsie. Enfin, les animaux seront euthanasiés par une méthode de mise à mort réglementaire.
Impact sur les animaux
Ce projet pilote va permettre d’évaluer les différents effets indésirables possibles de ce protocole expérimental. La phase de manque d'oxygène pourra être à l’origine d’un stress pour les animaux du fait de potentielles difficultés à respirer. Cette privation d'oxygène sera réalisée dans une cage contenant un système de contention permettant d’immobiliser l’animal, pendant 1 à 30 minutes. Certains animaux seront endormis pour la réalisation de cette procédure par l'utilisation de médicaments anethésiques, donc le risque de l'anesthésie est également à prendre en considération. La mort des animaux au cours du manque d'oxygène est une possibilité expérimentale. Les secousses musculaires involontaires engendrées par le manque d'oxygène pourront entrainer des difficultés de déplacement pour les animaux ainsi que des difficultés d’alimentation. Il nous semble également important de rappeler que, chez l’humain, les secousses musculaires ne sont pas considérées comme étant douloureuses.
Devenir
Les mêmes animaux sont impliqués dans les manipulations d’anoxie et d’évaluation des myoclonies/suivi du phénotype dommageable. A l’issue de ces manipulations, les animaux seront euthanasiés par une méthode de mise à mort réglementaire, l’euthanasie étant requise pour réaliser des prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Certaines questions d’intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que de nombreuses procédures alternatives existent, ni les processus aboutissant à la mort des neurones ni les processus favorisant l'apparition de crises d'épilepsie ou de secousses musculaires involontaires (appelées myoclonies) ne peuvent être légitimement bien étudiés chez l’homme ou dans d’autres modèles non animaux. De plus, il n’est pas légitime de provoquer une crise d’épilepsie ou des myoclonies chez un patient pour des études scientifiques. Enfin, lors des expériences sur les animaux, l’environnement est mieux contrôlé et la qualité des données est nettement supérieure.
Réduction
Nous sommes sensibles au besoin d’utiliser le moins d’animaux possible et de diminuer la souffrance animale tout en respectant la rigueur scientifique. C’est dans cette objectif que nous conduisons cette étude pilote afin d’établir les paramètres du protocole permettant de réduire au maximum la mortalité du protocole donc le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire (50) pour produire une conclusion scientifique et statistique tenable. Afin de réduire ce nombre d’animaux, nous réaliserons la procédure d’anoxie sur un premier groupe d’animaux qui seront anesthésiés afin de bien définir les paramètres techniques (design intérieur des cages d’induction, paramètres physiologiques limites, temps d’exposition critique à de faibles % en oxygène, débit de gaz nécessaire).
Raffinement
Une période d’acclimatation, d’une semaine minimum, à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. De façon à réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront maintenus au sein de groupes sociaux de plusieurs individus. Les conditions d’hébergement, incluant température, éclairage, bruit et espace ainsi que les conditions d’enrichissement de l’environnement, d’alimentation et soins si nécessaire, seront adaptées aux animaux et à leur âge. Un soin particulier sera apporté à la réduction de l’inconfort, de la douleur ou du stress des animaux. Un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). Une période, d’une semaine minimum, d’habituation à la manipulation humaine et à tous les outils utilisés pendant nos procédures expérimentales est respectée avant la réalisation de nos procédures. Avant le début de chaque expérience, une période d’acclimatation de 30 minutes sera observée au cours de laquelle les animaux, laissés dans leur cage, ne seront pas manipulés. Cela leur permettra de s’habituer à leur nouvel environnement et éviter toute forme de stress. Les animaux bénéficieront alors de nourriture et d’eau à volonté ainsi que d’un environnement enrichi à l’aide de tunnels. Pendant la procédure d’anoxie, les paramètres physiologiques (électrocardiogramme et saturation en oxygène) seront surveillés constamment.
Choix des espèces
Notre projet s’intègre dans la thématique du laboratoire qui s’intéresse aux processus physiopathologiques d’épileptogenèse et d’ictogénèse. Le rat est l’espèce choisie pour ce projet. Les méthodes d’investigations électrophysiologiques et immunohistochimiques (qui seront utilisées dans un deuxième temps au cours d’un projet ultérieur) sont maîtrisées au laboratoire et ont déjà permis la publication d’études sur d’autres modèles d’anoxie et d'épilepsie réalisées sur des rats adultes. Par ailleurs, les études déjà publiées sur les modèles animaux de LAS précédemment citées ont été faites chez le rat. Nous allons utiliser des rats adultes à 8 semaines de vie. Le LAS chez l’humain est en effet décrit uniquement chez des adultes. Par ailleurs, les études électrophysiologiques d’anoxie cérébrale et d’épilepsie réalisées dans l’équipe dans d’autres projets ont été faites chez des rats adultes. Ces mêmes techniques seront utilisées dans un deuxième temps sur un projet ultérieur.
Etude de la signalisation insulinique cérébrale dans un modèle animal diabétique : le rat Goto Kakizaki
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Diabétiques de la lignée Goto-Kakizaki ou témoins Wistar, ils subissent une chirurgie stéréotaxique unique pour injecter de l'insuline ou son véhicule dans un ventricule cérébral, restent quinze minutes sous isoflurane puis sont mis à mort aussitôt. Le porteur décrit une craniotomie sous anesthésie locale et analgésie, et affirme n'attendre "pas" de souffrance liée à la procédure. Il présente le rat GK comme un modèle de diabète de type 2 "impossible" à remplacer par des systèmes in vitro ou in silico pour étudier la réponse à l'insuline.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une pathologie due à l'altération du métabolisme glucidique et dont la prévalence mondiale augmente de façon alarmante. Il est caractérisé par une hyperglycémie chronique due à un défaut de sécrétion d'insuline par les cellule beta du pancréas et à une résistance à l'action de cette hormone au niveau de ses tissus cibles périphériques : le muscle, le foie et le tissu adipeux. L'objectif de notre projet est d'élucider, dans un modèle animal de diabète de type 2 le rat GK , si la résistance à l’insuline est aussi présente dans le cerveau. Pour cela nous allons étudier dans cet organe les mécanismes moléculaires de la signalisation de l'insuline suite à une administration d'insuline ou de sérum physiologique ( véhicule) par injection stéreotaxique dans le ventricule latéral du cerveau. Pour cette étude, qui portera sur les animaux des deux sexes, 40 rats diabétiques GK et 40 rats Wistar sains seront nécessaires.
Bénéfices attendus
Le diabète est associé à de nombreuses comorbidités, dont des troubles neurocognitifs tels que la maladie d’Alzheimer. Dans la littérature, une altération de la signalisation insulinique dans le cerveau est proposée comme un mécanisme participant au développement des maladies neurodégénératives. Ainsi, en recherchant dans ce projet si le rat diabétique GK possède une insulinorésistance en central comme en périphérie, il serait intéressant d’agir sur ce mécanisme en thérapeutique d’autant plus qu’il n’existe toujours pas de traitement curatif pour le diabète et les maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux vont subir une chirurgie unique par stéréotaxie afin d' injecter dans le ventricule latéral une solution d'insuline ou de son véhicule . Cette opération dure 20 minutes. A la fin de l'injection, une petite goutte de sang de 10 microL, obtenue à l'extrémité de la queue en piquant avec une petite aiguille 26G, est prélevée pour contrôler la glycémie.
Impact sur les animaux
Les animaux sont anesthésiés à l'isoflurane, la tête est fixée sur un cadre stéréotaxique, le crâne est desinfecté et rasé , une incision longitudinale de la peau du crâne est effectuée à l’aide d’un ciseau fin. L’os du crâne est perforé à l’aide d’une fraise. Le volume injecté grâce à une seringue hamilton munie d'une aiguille 26G est de 5 μL à un débit de 1 μL/minute pendant 5 minutes. Il n'est pas attendu de souffrance dans le cadre de la procédure chirurgicale, nous procédons à une injection en sous cutané d'anesthésique local composée de lidocaïne (2%) diluée à 0.5% (à la dose de 7mg/kg) associée à un analgésique la Buprénorphine à la dose de 0,01mg/kg 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la procédure, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Nous surveillons les paramètres vitaux, la respiration, le pouls et la température corporelle.
Devenir
Il n'y a qu'une seule procédure dans ce projet. Après l'injection stéréotaxique dans le cerveau, les 80 rats restent sous anesthésie à l'isoflurane pendant les 15 minutes nécessaires à l'action de l'insuline puis sont immédiatement mis à mort.
Remplacement
L’étude de la réponse à l’administration de l'insuline ne peut être réalisée que sur animaux vivants et l’avantage du rat GK réside dans le fait que c’est un modèle de DT2 sans manipulation génétique et mimant la chronologie d’évolution du diabète humain. Ainsi, sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant au mieux la différence entre les groupes .En fonction de la procédure expérimentale, des variables étudiées et du nombre d’effectifs, nous utiliserons principalement des tests paramétriques, et si nécessaire des tests non paramétriques.
Raffinement
Pendant la procédure la respiration, l'obstruction des voies respiratoires, le pouls et la température corporelle seront surveillés. Afin de raffiner la procédure et réduire au mieux l’apparition éventuelle de douleur, nous prendrons toutes les précautions nécessaires (Une injection en sous cutané d'anesthésique local composée de lidocaïne (2%) diluée à 0.5% (à la dose de 7mg/kg) associée à un analgésique la Buprénorphine à la dose de 0,01mg/kg, sera effectuée 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la procédure, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Le choix du protocole expérimental impliquant les 8 groupes d'animaux, nous permet d'assurer une fiabilité à cette étude.
Choix des espèces
Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète dans l'équipe est le rat. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes mâles et femelles de 4 mois, ce qui nous garantit aussi une stabilisation du diabète chez les GK.
Etude de traçage des voies neuronales chez les cichlidés Amatitlania nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 260 cichlidés de trois espèces vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Ils subissent une craniotomie d'environ une heure pour un traçage neuronal, puis sont maintenus un à cinq jours avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur décrit une étude d'anatomie cérébrale visant à comprendre comment des cerveaux de poissons produisent des comportements complexes, et écarte le poisson zèbre et le médaka dont le cerveau est trop petit pour la chirurgie. Il affirme que ces trois espèces de cichlidés, aux comportements et cerveaux différents, sont "indispensables".
Objectifs
Certains poissons téléostéens comme les Labres et les Cichlidés présentent des comportements semblables à ceux de l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la pensée logique telle que l’inférence transitive, la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau des cichlidés, en particulier les espèces Amatitlania nigrofasciata (A. nigrofasciata), Neolamprologus brichardi (N. brichardi), et Pseudotropheus zebra (P. zebra). Ces trois espèces ont des origines géographiques, une taille et des comportements différents. Les cerveaux des poissons téléostéens sont organisés de façon très différente par rapport aux cerveaux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. Pour mieux comprendre leur organisation cérébrale, nous réaliserons un traçage neuronal sur le cerveau de cichlidé afin de visualiser les connexions neuronales entre les différentes structures. Mieux connaître la connectivité neuronale du cerveau de poisson téléostéen permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux aussi différents que ceux des téléostéens ont pu permettre l’émergence de comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Bénéfices attendus
Les cichlidés présentent des comportements assez complexes incluant certaines capacités cognitives dites de « haut niveau ». Cependant, les réseaux neuronaux des cerveaux de poissons téléostéens demeurent méconnus. Afin d’expliquer comment les cerveaux des poissons traitent l'information, des études de traçage des voies neuronales sont nécessaires, afin d’établir la connectivité du cerveau de téléostéen. Nos études précédentes montrent que l'organisation globale du cerveau de poissons téléostéens est très différente de celle des tétrapodes. Cette étude permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Procédures
Procédures chirurgicales durant environ une heure. Les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement du cerveau 1-5 jours après la chirurgie. Le nombre des animaux utilisés au cours des 5 ans du projet est de 1260 au total.
Impact sur les animaux
En plus de l'intervention chirurgicale, deux nuisances post opératoires potentielles sont attendues, soit dues à l'effet de l’anesthésie, soit dues à l’effet de la chirurgie elle-même. Chaque poisson sera isolé dans un aquarium "hôpital" où la température restera stable à 25°C et où l’eau sera bien oxygénée par un bulleur d'air. Nous allons surveiller si le poisson se déplace normalement le jour même de la chirurgie, et vérifier s'il s’alimente le lendemain. Si un quelconque effet de mal-être est observé, une grille de points limites déterminera la marche à suivre concernant le devenir du poisson (soins vétérinaires, ou euthanasie).
Devenir
L'euthanasie des individus est nécessaire au prélèvement de leur cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces qui ont un grand cerveau avec des capacités cognitives de haut niveau. Le but à long terme est d'associer les données anatomiques avec des tests comportementaux qui ne peuvent pas être réalisé chez les modèles téléostéens conventionnels comme le poisson zèbre ou le médaka et nécessitent donc l’utilisation de cichlidés. Les trois espèces que nous souhaitons utiliser, A. nigrofasciata, N. brichardi, P.zebra, ont des comportements très différents et des cerveaux organisés de façon différentes. De ce fait, il est pertinent et nécessaire d'utiliser ces trois espèces de cichlidés.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques non-paramétriques (Mann Whitney U test, Kruskal Wallis, Wilcoxon) qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études précédemment publiées chez les téléostéens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. La température de la pièce ainsi que son taux d’humidité seront surveillés. Lors de la chirurgie, après l'induction de l'anesthésie, une injection de lidocaïne (à 1mg/kg) est pratiquée dans les muscles entourant la boite crânienne, afin d'analgésier localement la zone avant la craniotomie (attendre 2 minutes avant incision). Après la chirurgie cérébrale, le bien-être des animaux est plus attentivement surveillé par des expérimentateurs compétents jusqu'à l’euthanasie des animaux (1-5 jours après la chirurgie). Aussi, une communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs permettra un suivi adéquat des animaux. Pour surveiller la santé des animaux, des points limites (voir grille de points limites jointe) seront utilisés, prenant en compte des comportements ou signes visibles. Dans le cas où des animaux montreraient des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Selon la gravité de ces signes, les animaux pourront être soignés via une analgésie par balnéation (5mg de lidocaïne par litre d’eau), ou si ce n'est pas possible de soigner, ils seront euthanasiés dans les délais les plus brefs. L’analgésie par balnéation plutôt que par injection en post opératoire a été choisi pour réduire le stress de l’animal, puisqu’une injection demanderait la manipulation du poisson (sortie de son aquarium, anesthésie, puis injection), ce qui produirait un stress trop important pour un poisson déjà en souffrance. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement avant l'opération chirurgicale pour fournir de l'enrichissement. En revanche, aucun enrichissement n'est prévu au niveau de l'hébergement pour des raisons de sécurité lors de la récupération post-opératoire. En effet, les enrichissements traditionnels (tubes, cachettes), pourraient être utilisés par les poissons après leur chirurgie pour se frotter ou essayer de "gratter" le site de la chirurgie. Dans ce cas, le risque serait présent d'une réouverture de la plaie.
Choix des espèces
Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types comportements ont déjà été observé chez A. nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude neuroanatomique de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser les chirurgies nécessaires à ce projet. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet la chirurgie, semble donc toute indiquée. Nous travaillerons sur des jeunes adultes (taille du corps à partir de 3 cm) car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.
Exploration de stratégies thérapeutiques pour restaurer la fonction synaptique et les comportements cognitifs dans un modèle de souris du syndrome de l’X fragile
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant le syndrome de l'X fragile, elles reçoivent un traitement pharmacologique quotidien par gavage ou injection intrapéritonéale, et pour certaines une chirurgie d'implantation cérébrale suivie de cinq semaines en cage individuelle. Le porteur indique que les injections, la contention, les tests comportementaux, la chirurgie et l'isolement social provoquent douleurs et stress, et mentionne deux tests d'évaluation des déficits cognitifs sans préciser lesquels. Il affirme qu'aucune alternative in silico ou en culture cellulaire ne convient et que l'animal doit rester "intact" pour étudier la mémoire.
Objectifs
Le syndrome de l'X fragile (SXF) est la forme la plus fréquente de déficience intellectuelle héréditaire (Prévalence 1:4000 chez les hommes et 1:7000 chez les femmes) et cette maladie reste malheureusement sans traitement efficace à ce jour. La majorité des patients atteints présentent une déficience intellectuelle associée à des troubles de l'apprentissage, de l'attention, et dans un quart des cas à des troubles du spectre autistique. Ce syndrome résulte de mutations du gène FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) qui entraine soit l’absence d’expression de la protéine correspondante, FMRP, ou bien l’expression d’une forme non fonctionnelle de celle-ci. La modification de cette protéine chez la souris conduit à des effets similaires à ceux observés dans les cerveaux de patients atteints de SXF. Deux mécanismes ont déjà été montrés comme dérégulés chez ces souris génétiquement modifiés et comme étant à l’origine des anomalies de communication entre neurones observées chez ces animaux. Ces mécanismes représentent donc des cibles très intéressantes pouvant être utilisées à des fins thérapeutiques. Les travaux que nous souhaitons mener sur ce model vise à cibler ces mécanismes dans la perspective de développer des solutions thérapeutiques innovantes pour les patients atteints du syndrome de l'X fragile. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées et des agents pharmacologiques actifs sur les mécanismes d’intérêt. Nous évaluerons leurs efficacités pour restaurer la communication neuronale par des taches comportementales et des mesures d’activité neuronale in vitro et in vivo.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d’évaluer l'efficacité de traitements pharmacologiques afin de corriger les défauts physiologiques et les comportements identifiés sur le modèle murin de syndrome de l’X Fragile. La validation d’un ou plusieurs de ces traitements permettra de proposer des pistes de traitements pour les patients atteints du syndrome de l'X fragile (SXF) .
Procédures
Dans ce projet, les 540 animaux recevront un traitement pharmacologique quotidien soit par voie orale pour une durée variable en fonction de la molécule, soit par injection dans le péritoine pour une durée de 8 jours maximum - 140 de ces animaux recevront juste un traitement pharmaceutique -260 animaux recevront un traitement pharmaceutique et subiront deux tests comportementaux afin d’évaluer les défauts cognitifs. Ces 2 tests nécessitent que les animaux soient isolés respectivement 15 et 8 jours afin de limiter les interactions stressantes pouvant influencer sur les performances de mémoire. -140 animaux recevront un traitement pharmaceutique et subiront une chirurgie implantatoire afin d’enregistrer l’activité neuronale lors d’un test comportemental de mémoire. Les animaux seront hébergés en cage individuel pour une durée de 5 semaines suite à la chirurgie pour éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères. L’ensemble des animaux seront sacrifiés en présence d’analgésique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont : Des douleurs avec les piqûres en injection dans le péritoine Du stress physique lié à des contentions et aux tests de comportement Des douleurs, et stress liés aux lésions des chirurgies, Du stress lié au restriction de comportement social suite à l'isolement des animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux est sacrifié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des expériences d'electrophysiologie in vitro ou des études histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonction cérébrale complexe étant à la base du codage de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques et de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitifs et sensoriels sont traités exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de limiter le nombre d’animaux, il sera réalisé différents tests comportementaux successifs et de gravité croissante sur les mêmes cohortes. Pour les expériences comportements, nous utiliserons 20 souris / traitement. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient être le résultat d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux. Pour les enregistrements d’activité neuronale in vitro et in vivo au cours du comportement, le nombre de 10 souris / traitement nous permettra d’enregistrer un nombre de neurones conséquent afin de pouvoir collecter un ensemble important de données.
Raffinement
Pour les expériences in vitro, les souris seront maintenues en groupes sociaux tout le long de la procédure. Pour les expériences in vivo, les animaux seront placés en cage individuelle pour des périodes de 8 à 10 jours lors de chaque tache comportementale. Les animaux subissant une chirurgie implantatoire seront placés en cage individuelles pour une période de 4 à 5 semaines. Lorsque l’animal est placé en cage individuelle, la cage est enrichie avec un tunnel et une maison en papier mâché pour favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée (2/jours) dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues aux congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin », qui renseigne les soins prodigués et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. La chirurgie implantatoire est réalisée sous anesthésie gazeuse avec un contrôle de la respiration et de l’absence de reflex tout le long du protocole. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutané d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique, en sous cutané en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une seconde injection est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 4-6 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, nous réalisons une injection d'une double dose d'analgésique, et d'un euthanasiant. L'absence de reflexe est vérifié afin de contrôler la profondeur de l'anesthésie.
Choix des espèces
Les modèles murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions normale et pathologique, la souris partage environ 99% de ses gènes avec l'homme. L’homologue murin du gène FMR1 humain a été manipulé pour générer des modèles animaux présentant des phénotypes similaires à ceux observés chez les patients X-fragiles notamment au niveau de la morphologie neuronale et de l’apprentissage, ce qui en font des modèles de choix pour l’étude de la pathologie. Les données de la littérature démontrent clairement que les mutations du gène FMR1 sont responsables du syndrome de l’X fragile chez l’homme et que ces mêmes mutations chez la souris ont des effets moléculaires, morpho-fonctionnels et comportementaux similaires à ceux observés chez les patients X fragiles. Nos modèles souris X fragiles sont donc d’excellents modèles précliniques pour évaluer le potentiel thérapeutique de traitements pharmacologiques ciblant les défauts relevés chez nos souris. Les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines et jusqu’à 4 mois d’âge.
Etude de l’engramme d’une mémoire de type post-traumatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 480 individus étant classés en sévère. Elles subissent un conditionnement par deux chocs électriques aux pattes censé induire une mémoire de type post-traumatique, complété par des injections intrapéritonéales, avant analyse du cerveau. Le porteur décrit un modèle comportemental de mémoire traumatique développé par l'équipe, sans détailler les autres tests employés au-delà de ce conditionnement. Il affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier la mémorisation et qu'une espèce "suffisamment proche" de l'humain est requise pour extrapoler les résultats.
Objectifs
Si les caractéristiques cliniques de l’état de stress post-traumatique (ESPT) sont bien décrites, les bases neurobiologiques de cette pathologie sont encore méconnues. L’un des trait cardinaux de cette pathologie, se développant à la suite d’un stress intense, est une altération de la mémoire associant à la fois une amnésie et une hypermnésie. Cette mémoire est définie comme maladaptative, en opposition à une mémoire émotionnelle normale qui est considérée comme adaptative. Le but de ce projet est de définir en quoi ces deux types de mémoire diffèrent. Pour ce faire, nous étudierons le réseau cérébral recruté dans ces deux types de mémoires à la fois lors de l’encodage de l’événement et lors de son rappel.
Bénéfices attendus
En identifiant les bases neurobiologiques spécifiques de la mémoire traumatique, ce projet doit ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement de ce trouble lié au stress.
Procédures
Les animaux sont soumis à des procédures comportementales entainant un stress chez l'animal permettant de mimer une mémoire de type post-traumatique ainsi qu'à des injections intra-péritonéales.
Impact sur les animaux
Une telle investigation implique l’utilisation d’un modèle permettant de distinguer et de comparer après un épisode de stress le développement d’une forme de mémoire émotionnelle normale et d’une mémoire de type traumatique. Le modèle de mémoire traumatique développé au sein de l’équipe permet précisément une telle comparaison. Ce modèle de conditionnement implique des effets stressants chez les animaux liés l'application de deux chocs élèctriques légers au niveau des pattes. Cette nuisance entraine une classe de sévérité sévère.
Devenir
Toutes les souris des procédures 1 et 2 seront mises à mort après les procédures comportementales afin d'analyser l'activité du cerveau.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine. 3) Le modèle comportemental a été établi chez la souris et l’ensemble des appareils comportementaux que nous utiliserons sont dimensionnés pour cette espèce.
Réduction
Concernant la réduction, l’effectif de 528 souris se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Nous avons en effet déterminé ce nombre suites aux expériences précédentes utilisant les mêmes tests comportementaux.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit, en cage collective, sauf dans la semaine qui précède l'étude comportementale où elles seront placées en cage individuelle . Dans toutes les cages l'environnement sera enrichi ( bio-tunel et carrés de cellulose) . Elles recevront de l’eau et de la nourriture à volonté, elles seront changées régulièrement et elles seront observées tous les jours de la semaine et pesées 1 fois par semaine par un personnel qualifié . Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et surveillé deux fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être (perte de poids, poils hérissés, prostration…), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera euthanasié dans les 48h.
Choix des espèces
La souris adulte (8 à 12 semaines): -est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. L’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris adulte : pour une comparaison des résultats, l’étude des mécanismes neurobiologiques responsables du passage d’une mémoire normale à une mémoire traumatique implique l’utilisation de cette espèce -permet d'accéder au niveau cellulaire grace à des procédures histologiques simples et d'immunohistochimie
Etude comportemental d’une lignée de rat modèle trisomique après traitement par une molècule candidate
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue et le cerveau prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus d'une lignée trisomique dont le porteur reconnaît le phénotype "dommageable", petite taille dans 80 % des cas et dermites à staphylocoque exigeant des antibiotiques chez la moitié d'entre eux, ils reçoivent pendant seize jours une molécule par voie intrapéritonéale puis passent le test de la piscine de Morris. Ce test d'apprentissage impose des séances de nage répétées, les animaux en difficulté ou épuisés étant retirés de l'étude. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour étudier les déficits cognitifs et propose comme candidat un médicament déjà utilisé contre l'alcoolisme.
Objectifs
Le Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 est la première cause de retard mental d’origine génétique. Le SD est lié à la présence d’une copie supplémentaire du chromosome 21 et touche 1 naissance sur 700. Il se caractérise par des déficiences intellectuelles : les personnes atteintes de SD ont des difficultés d’apprentissage et de mémorisation qui sont liées à des défauts dans le développement et le fonctionnement du cerveau. Cette anomalie chromosomique conduit à une surexpression des gènes du chromosome 21 humain, perturbant de nombreux systèmes physiologiques, morphologiques et biochimiques. Ces dérégulations se font de manière directe via l’augmentation de la production de protéines, ou indirecte à travers une multitude d’interactions de ces protéines sur l’ensemble du génome. Nous avons démontré le rôle du surdosage d'une protéine dans le modèle de rat SD, comme l'un des principaux moteurs du dysfonctionnement cognitif. Afin de mieux comprendre la conséquence du surdosage de cette protéine sur le fonctionnement cérébral dans notre modèle de rat SD et de développer une stratégie thérapeutique, notre projet est de tester une molécule qui est un médicament utilisé en clinique dans le traitement de l'alcoolisme, qui peut inhiber cette protéine dans un environnement cellulaire, et d’évaluer les capacités cognitives de notre modèle de rat SD.
Bénéfices attendus
La création et la caractérisation d’un modèle de rat portant la même mutation que l'humain, a permis de comprendre que la conséquence du surdosage d'une protéine est l'un des principaux moteurs du dysfonctionnement cognitif chez les patients trisomiques. Il n’existe à ce jour aucun traitement qui permet de restaurer les performances cognitives chez les patients. Toute molécule capable d’inhiber ou de réduire le surdosage de cette protéine sera potentiellement donc d’un grand bénéfice pour les patients.
Procédures
Nous allons réaliser les interventions suivantes : -Administration de composés par voie intra-péritonéale (moins d'une minute par rat) une fois par jour pendant 16 jours -test d'apprentissage dans la piscine de Morris : La durée du test est sur 7 jours : les 2 premiers jours 4 essais de 90s espacés d'1h sont réalisés chaque jour. Les 4 jours suivants, 2 essais de 90s, espacés de 2h, par jour. Le dernier jour, un seul essai de 90s. -Un prélèvement sanguin à la veine temporale superficielle (2 minutes par rat).
Impact sur les animaux
Le phénotype du notre modèle animal utilisé est considéré comme dommageable. En effet, les anomalies suivantes ont été observées : -Animaux de petite taille (80% des cas) -Dermites à Staphylococcus aureus nécessitant des traitements antibiotiques locaux (50%) voire des traitements antibiotiques généraux (20%). Concernant le SD, aucun phénotype délétère n’est observé chez ces rats dans leur environnement. Lors de l’injection par voie intrapéritonéale, une surveillance du site d'injection sera effectuée et un soin local pourra être appliqué en cas de lésion ou d'infection du site. Lors du test d'apprentissage (Piscine de Morris), les animaux présentant des problèmes de nage ou d'épuisement seront retirés de l'étude. Après les prélèvements sanguins, une surveillance de l'état des animaux, en s'assurant notamment qu'il n'y a pas de saignement au niveau de la zone de prélèvement.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés puis les cerveaux seront prélevés en vue d'analyses post-mortem (structures cérébrales).
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle pas d’alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. En effet, l’étude de déficits cognitifs nécessite un modèle vivant et suffisamment proche de l’Homme pour pouvoir être transposé à l’espèce humaine. Par ailleurs, il n’existe pas encore de modèle de cerveau in vitro ou autre permettant de réaliser de la recherche fondamentale dans ce domaine.
Réduction
Dans cette étude, nous comparerons trois groupes de rats: un groupe de rats contrôle négatif (sauvages + véhicule) ; un groupe de rats contrôle positif (mutant trisomique + véhicule) et le groupe d’intérêt (mutant trisomique + molécule à tester). Chaque groupe sera composé de 20 rats. En ce qui concerne le sexe, comme nous n’attendons pas à avoir un effet sexe, les 2 sexes seront utilisés (on veillera à avoir des groupes de mêmes proportions). Nous avons évalué le nombre de rats nécessaire pour pouvoir valider de façon statistique (test de Mann et Whitney) l’hypothèse que l’effet du traitement entre les groupes n’est pas nul. En fonction de ces paramètres, 20 rats par groupe seront nécessaires pour notre étude.
Raffinement
Du fait de leurs phénotypes dommageables, ces animaux font l’objet d’une attention particulière afin de pouvoir détecter le plus précocement possible tous problèmes pouvant altérer leur bien-être. Les animaux seront ainsi suivis quotidiennement tout au long de leur vie. Si un animal présente des signes de douleur ou de mal être, il sera présenté au vétérinaire puis, si un traitement est envisageable, il sera mis en place (on utilisera des anti-inflammatoires). A noter que le traitement utilisé devra être adapté au cas par cas en fonction des symptômes rencontrés. Si aucun traitement n’est envisageable, l’animal sera mis à mort. Par ailleurs, tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par 2 et disposeront d’un bâton à ronger comme enrichissement.
Choix des espèces
Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez cette espèce. De plus, les régions homologues du chromosome 21 humain sont retrouvées sur 2 chromosomes chez le rat contre 3 chez la souris. L’obtention d’un modèle de trisomie complète est donc plus simple à obtenir chez le rat. Le rat constitue ainsi un modèle de choix pour générer des modèles de maladies humaines pour le syndrome de down. Les rats seront adultes, agés de 15 à 16 semaines environ au début des tests. l'ensemble des tests sera réalisé sur une période de 3 semaines.
Validation d’un nouvel outil diagnostic et thérapeutique pour le traitement des microthromboses dans l’accident vasculaire cérébral ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque, dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère. Elles subissent trois modèles d'accident vasculaire cérébral ischémique puis un suivi par IRM, pour tester un agent de contraste censé diagnostiquer et traiter les microcaillots. Le porteur indique que ces modèles peuvent provoquer des douleurs postopératoires, des déficits moteurs et cognitifs et une perte de poids, les souris perdant plus de 20 % de leur poids ou dépassant un score de douleur défini étant alors tuées. Il répète que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.
Objectifs
L’enjeu de ce projet est d’améliorer la prise en charge des microthrombi (petits caillots sanguins) résiduels dans les accidents vasculaires cérébraux (AVC) de type ischémique. Pour cela, nous avons développé un nouvel agent de contraste (PHySIOMICS). Ce dernier, peut être combiné à différentes molécules et semble doté de propriétés anti-inflammatoires. Ainsi, dans un premier temps, nous combinerons cet agent de contraste à des molécules favorisant la thrombolyse des thrombi (par exemple l’activateur tissulaire du plasminogène). Ensuite, nous évaluerons l’effet des PHySIOMICS sur la réponse inflammatoire associée dans le parenchyme cérébral. Nous développerons ainsi un outil théranostique qui vectorisera un traitement thérapeutique spécifiquement au niveau des microthrombi tout en assurant leur diagnostic. L’IRM moléculaire permettra de suivre l’apport thérapeutique des PHySIOMICS couplés ou non sur le traitement des microthrombi chez la souris.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic et le traitement des AVC chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un potentiel traitement ischémique et inflammatoire ainsi que la caractérisation de l'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 modèles d'AVC ischémique différents, le modèle thrombine d'une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 1); le modèle chlorure de fer (application d'une compresse imbibée de chlorure de fer sur l'artère cérébrale moyenne permettant la formation d'un caillot) d'une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 2); le modèle sténoses en tandem : c'est à dire la formation de plaques d'athérome au niveau de l'artère carotide commune puis les faire migrer au niveau du parenchyme pour une durée moyenne de 30 minutes et 1 fois par animal (cf procédure 3) et 1 modèle de neuro-inflammation d'une durée moyenne de 20 minutes (cf procédure 4). Tous les animaux auront un suivi à l'IRM d'une durée moyenne de 45 minutes à J0 (après avoir induit un AVC ischémique (procédure 1 à 3) ou une neuroinflammation (procédure 4)) et un second suivi allant de 6h à 7 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : *Pour le modèle thrombine (cf procédure 1): - perte de poids - douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Pour le modèle chlorure de fer (cf procédure 2): - perte de poids - douleurs post opératoires - stress – déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le modèle de sténose en tandem (cf procédure 3): - diabète – douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le modèle de neuroinflammation (cf procédure 4) : - diabète - douleurs post opératoires - stress - déficits fonctionnels et/ou cognitifs. *Pour le suivi à l'IRM : -stress. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observations des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (grimace scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
Les animaux issus des procédures d'AVC ishcémique et de neuroinflammation seront mis à mort par perfusion intra-cardiaque afin de prélever les organes.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine grave touchant une part importante de la population. De plus, les méthodes in vitro de ce projet aident à la réduction du nombre d’animaux. La technique des microfluidiques nous permettra l’étude de la fixation des PHySIOMICS couplés au TPA et/ou la NAC aux caillots et de visualiser leur dégradation. Ainsi l’efficacité de ce couplage sera déjà évaluée et validée avant d’avoir recours aux animaux limitant ainsi leurs nombres.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquations avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir d’une analyse de puissance et de nos données sur le modèle.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permet de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveillance du poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée par rapport au poids initial et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel utilisé dans cette procédure expérimentale est neuf (pour les consommables, comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyé et désinfecté pour les réutilisables (pinces métalliques).
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l'inflammation cérébrale. Le stade de développement des animaux est de 8 semaines pour les souris des procédures 1; 2 et 4 pour un poids compris entre 35 et 40g. Ce choix a été fait fait suivant les données de la litérrature employant les mêmes modèles expérimentaux. Enfin, pour la procédure 3, le modèle d'AVC ischémique sténose en tandem sera réalisé sur des souris de 12 semaines car il est nécessaire d'induire un régime de "high-fat diet" pendant 6 semaines (après sevrage qui est à 6 seamines) afin d'obtenir des animaux diabétiques.
Comprendre le rôle de MKP1 dans les troubles de l’humeur induits par le stress et la douleur chronique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Elles subissent une chirurgie ou des séances de stress répété allant jusqu'à une heure par jour pendant 21 jours, suivies de tests comportementaux dont le porteur ne précise pas la nature, pour évaluer le rôle d'une protéine dans la dépression. Le porteur indique que les symptômes anxiodépressifs et la sensibilité mécanique induits ne seront pas soulagés parce qu'ils sont l'objet de l'étude. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut reproduire ce modèle intégré et conclut au recours à la souris.
Objectifs
Affectant approximativement entre 8% et 20% de la population mondiale, la dépression est l’un des plus grands enjeux de ce siècle en matière de santé publique. Récemment, plusieurs études chez l’Homme et chez l’animal ont suggéré que la protéine MKP1 pourrait jouer un rôle dans la dépression. Grâce à ce projet, nous pourrons évaluer l’implication de cette protéine dans le développement de la dépression dans les deux sexes dans différents modèles de dépression et déterminer si cette protéine pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour de futurs traitements personnalisés des troubles dépressifs.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est double : 1) étudier l’implication de la protéine MKP1 dans l’établissement de la dépression dans 3 modèles de dépression d’étiologies différentes et 2) comparer le rôle de cette protéine chez les mâles et les femelles, qui ne sont pas égaux face au développement de symptômes dépressifs. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de déterminer si MKP1 est impliqué dans le développement de la dépression quel que soit les facteurs conduisant à cette pathologie. De plus, nous pourrons déterminer si MKP1 est un mécanisme commun dans le développement de la dépression à la fois chez les mâles et les femelles. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques de la dépression, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle et selon l’origine des symptômes dépressifs.
Procédures
Les animaux seront uniquement soumis à l'induction du modèle et aux différents tests comportementaux. Un groupe d'animaux subira une procédure chirurgicale de 15min + 4 tests comportementaux (répartis sur 2 semaines), un autre groupe subira 1h de stress par jour sur 21 jours + 5 tests comportementaux (3 de 5 min, 1 de 6 min et 1 de 24h) et un dernier groupe subira 10 min de stress par jour sur 5 jours + 3 tests comportementaux ( 2 de 5 min chacun, 1 de 10 min).
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent développer des symptômes anxiodépressifs que nous ne pouvons pas soulager puisqu’il s’agit de l’objet de l’étude. À la suite de la procédure chirurgicale, les animaux présenteront une sensibilité mécanique qui ne peut être soulagée puisqu'il s'agit de l'objet de l'étude, ainsi qu'une légère difficulté de déplacement qui disparaitra en 48-72h.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, afin de prélever leur cerveau pour effectuer les analyses moléculaires d'intérêt.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress et la douleur chronique chez l’animal, comme modèles de pathologie psychiatrique humaine, est un processus intégré et repose sur l’observation du comportement de l’animal vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par modèle et condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Pour cela, nous réalisons plusieurs types d’études sur la même cohorte d’animaux. Les expériences seront également réalisées par petit groupes d’animaux afin qu’elles puissent être stoppées dès l’obtention de résultats statistiquement fiables et robustes. Ainsi, le nombre d'animaux indiqué par groupe ne correspond pas au nombre total d’animaux réellement utilisés mais à un nombre maximum.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cage collective afin de respecter leurs besoins sociaux. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et analgésie (sans que l'animal ne ressente de la douleur). En post-chirurgie, les animaux seront quotidiennement surveillés afin de contrôler leur bien-être et de mettre en place une analgésie si besoin. A chaque étape de l'étude, nous avons établi des points limites nous permettant de soustraire l'animal à la souffrance. Si de nouvelles approches bénéfiques pour le bien-être de l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la Structure chargée du bien-être animal de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Les modèles utilisés ne sont caractérisés que chez la souris, c'est pourquoi nous utilisons cette espèce. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (critères: début des procédures à au moins 7 semaines, poids supérieur à 20g pour les mâles et 15g pour les femelles). En se référant aux précédentes expériences réalisées au laboratoire, nous ne réaliserons pas ces modèles sur des souris âgées de plus de 6 mois.
Etude de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans le modèle d’ischémie thrombotique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque un AVC par application de chlorure de fer sur une artère cérébrale, suivi d'une IRM sous anesthésie, de tests comportementaux non détaillés et d'une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que le modèle entraîne un déficit sensorimoteur et des lésions cérébrales, avec pertes d'équilibre et faiblesse musculaire possibles. Il juge "indispensable" de développer de nouvelles stratégies face à un traitement actuel inefficace sur les caillots riches en plaquettes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester quatre stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos quatre stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC thrombotique chez la souris par administration intrapéritonéale (i.p), par administration intra veineuse ou bien par voie orale (per-os), pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 3 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit moteur ainsi que du volume lésionnel.
Bénéfices attendus
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Cependant, le tPA n’a aucune efficacité sur un caillot riche en plaquettes. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes visant à traiter efficacement cette pathologie. L’objectif de ce projet est de tester quatre stratégies thérapeutiques par 3 voies d’administrations différentes afin d’étudier la diminution des volumes lésionnels ainsi que l’augmentation de la récupération fonctionnelle après un AVC. Ces stratégies thérapeutiques sons susceptibles d’agir sur la lyse d’un caillot riche en plaquettes. Nous utiliserons donc un modèle d’infarctus cérébral thrombotique qui reproduit au mieux la physiopathologie de l’AVC permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir appliquer une solution de chlorure de fer (FeCl3 ; 20 %), provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM). Cet acte chirugical durera 20 minutes. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire pour l’infusion des traitements. Une moyenne de 5 minutes est à prévoir pour cette pose. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suiveront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Un total de 56 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme : l’animal peut continuer à s’alimenter, s’abreuver ou encore se fabriquer un nid.Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés. Aucune nuisances n'est attendues concernant l'administration des traitements, les test comportementaux ainsi que pour l'examen IRM.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 12. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Chaque site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, à une désinfection et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil,de l'oxygène sera administré pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 5. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Il pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC thrombotique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS et de 25g pour les C57BL6J. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.