Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Photopharmacologie en lumière infra-rouge proche.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
853 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie dans des procédures terminales sous anesthésie, les autres à un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie du cerveau de quarante minutes pour injecter des nanoparticules ou des virus, avec selon les cas l'implantation de canules, de fibres optiques ou d'électrodes, et des enregistrements de cinq heures. Le projet vise à piloter par lumière infrarouge les récepteurs de la dopamine et de l'acétylcholine pour étudier les interactions sociales entre souris. Le porteur signale des douleurs crâniennes, des saignements, des pertes de poids et des bagarres entre animaux, et affirme que cette recherche n'est réalisable que sur l'animal.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer des technologies permettant de contrôler par la lumière infra-rouge proche les récepteurs des neurotransmetteurs chez la souris, pour des études de circuits neuronaux et des comportements. Pour cela, nous utiliserons des outils photochimiques synthétiques nouvellement développés, qui permettent la libération rapide de drogues et d’autres neurotransmetteurs par la lumière, ou bien qui modulent de manière bidirectionnelle l’activité d’un récepteur neuronal avec de la lumière. Leur utilisation chez la souris en comportement est très restreinte, notamment parce que ces sondes sont normalement stimulées par la lumière UV ou visible, qui pénètre très mal dans les tissus, et donc nécessitent d’un apport local de lumière qui est invasif. Pour surmonter ce problème, nous proposons d'utiliser des nanoparticules de conversion ascendante, des chromophores (dans notre cas, substance qui possède des électrons capables d’absorber l’énergie et d’être excités, à des longueurs d’onde spécifiques, et qui va en retour en transmettre d'autres) inorganiques qui ont la propriété physique de convertir la lumière infrarouge proche (qui peut pénétrer assez profondément au sein des tissus biologiques) en lumière visible. Ces particules sont déjà utilisées dans des études en cancérologie ou en neuroscience, mais leur utilisation avec des drogues dans le cerveau n’est pas encore démontrée. Ces nanoparticules seront couplées à l’utilisation de drogues photosensible, permettant un contrôle non invasif des récepteurs endogènes du cerveau chez les souris en comportement. Les stratégies développées ici seront applicables à la plupart des récepteurs, circuits neuronaux et modèles animaux, ainsi notre projet a un potentiel pour changer le paysage de notre compréhension de la neuromodulation, à la fois dans le domaine de la santé et de la maladie.
Bénéfices attendus
Cette étude et les technologies développées ici présentent un fort potentiel non seulement à des fins de recherche sur des modèles animaux, mais aussi pour des applications thérapeutiques chez l'homme. Le ciblage des médicaments sur des populations neuronales particulières pourrait améliorer l'efficacité thérapeutique, tout en diminuant les effets secondaires associés à une sélectivité insuffisante dans les approches conventionnelles. Les stratégies développées ici devraient être applicables à la plupart des récepteurs, cellules, circuits et modèles animaux. Nous nous concentrerons principalement sur les interactions sociales entre des souris vivant en groupe, en manipulant de manière non invasive les voies dopaminergiques et cholinergiques sur des souris vigiles, à l'aide de molécules pharmacologiques spécifiques au type cellulaire et contrôlable par la lumière infrarouge proche. Cela permettra de déterminer comment les récepteurs de la dopamine et de l’acétylcholine contribuent à conduire ou à inhiber les interactions sociales. La réalisation du projet pourrait aider à améliorer notre compréhension de la physiologie normale et à mieux comprendre l'étiologie et le traitement des maladies neuropsychiatriques, en offrant une occasion unique de tester les avantages des médicaments ciblant les cellules pour les troubles neurologiques et neuropsychiatriques.
Procédures
Injections de nanoparticules ou de particules virales dans le cerveau : procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale (durée 40 min), une fois par animal, sur l'ensemble des animaux, soit 800 animaux. 2) Prélèvement du cerveau: procédure terminale, réalisée sous anesthésie profonde, sur 100 souris. 3) Enregistrements électrophysiologiques in vivo (durée 5h) : procédure terminale, procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie profonde, sur 352 souris. 4) Implantation de canule : procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale (durée 40 min), une fois par animal, sur 77 animaux. 5) Implantation de fibres optiques ou de diodes électroluminescentes: procédure réalisée sous anesthésie générale (durée 40 min), une fois par animal, sur 231 animaux. 6) Implantation de puces pour radio-identification: procédure réalisée sous anesthésie générale (durée 5 min), une fois par animal, sur 154 animaux. 7) Prélèvement de liquide cérébro-spinal : procédure terminale, réalisée sous anesthésie générale (durée 20 min), sur 53 animaux.
Impact sur les animaux
Les chirurgies au niveau du crane peuvent engendrer d’éventuelles douleurs au niveau des canaux auditifs, ou bien au niveau du crane. L’ouverture de la peau au niveau du crane, ainsi que les craniotomies, peuvent produire des saignements locaux. L’anesthésie peut faire baisser la température de l’animal, ainsi que sa respiration. Après une chirurgie, on peut s’attendre à une perte de poids drastique et continue, une perte/instabilité des implants, des signes d'infection grave autour de la zone de l'implant, une perte d'appétit et/ou une consommation atténuée de liquides, des anomalies comportementales et/ou morphologiques incurables. Les bagarres entre animaux dans une même cage peuvent aussi arriver, blessant superficiellement ou gravement certaines souris. Finalement, certains effets indésirables liés à la stimulation optique peuvent survenir et troubler l'activité locomotrice.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés, afin de récupérer les cerveaux pour analyses histologiques et moléculaires, ou bien pour vérifier le site d’enregistrement electrophysiologique.
Remplacement
Notre objectif est de tester de nouvelles technologies optiques et chimiques (nanoparticules, composés cagés…) pour manipuler les récepteurs des neurotransmetteurs situés dans les régions profondes du cerveau, de manière non invasive, et d’étudier l’impact de cette manipulation sur l’activité cérébrale et sur les comportements, notamment sociaux. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux. Il y a plusieurs avantages à utiliser la souris comme modèle pour notre recherche : Un nombre croissant de recherches a révélé des homologies génétiques, anatomiques et fonctionnelles chez les rongeurs et les primates, notamment au niveau neuronal et au niveau des récepteurs. Par exemple, les fonctions dopaminergiques, cholinergiques et glutamatergiques sont similaires chez les rongeurs et les primates. En outre, plusieurs comportements cognitifs ont été conceptualisés sur la base des découvertes chez les primates et répliqués avec succès chez les rongeurs. De plus, l'existence de nombreuses souris génétiquement modifiées permet l'utilisation de techniques permettant une visualisation, une manipulation et un enregistrement restreints dans l'espace et dans le temps de l'activité cérébrale spécifique à un type de cellule. Par exemple, afin de réaliser des expériences d'optopharmacologie, nous utiliserons des lignées de souris transgéniques dans lesquelles des récepteurs manipulables pourront être ciblés sélectivement sur une population neuronale spécifique. En manipulant ces récepteurs neuronaux avec des drogues sélectives et photosensibles, nous pourrons, espérons-le, révéler des cibles sélectives pour de nouveaux traitements plus ciblés.
Réduction
Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une littérature vaste et robuste dans des domaines similaires (etudes employant de l’optogénétique par exemple) mais aussi sur notre expertise personnelle en photopharmacologie. Afin de réduire l'utilisation de souris au minimum, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. Nous utiliserons dans la mesure du possible tant les souris mâles que femelles, afin d’utiliser toutes les souris issues d’une même portée.
Raffinement
Les animaux seront placés dans une animalerie aux conditions d’hébergement standard (température de 22°C et avec une photopériode de 12h jour et 12h nuit). Du nid végétal sera déposé dans les cages de manière à enrichir l’environnement des animaux et leur permettre de fabriquer un nid. Lors des etudes en environnements sociaux, l'espace alloué pour chaque souris ainsi que l'enrichissement sont supérieurs aux cages conventionnelles de stabulation. Les souris sont pesées tous les jours et suivies en temps réel via des caméras infra-rouge nous permettant de mesurer à distance le comportement des souris. Il nous est donc possible d'intervenir rapidement en cas de quelconque soucis. De plus, le bien-être des souris est conditionné par la mise en place de protocoles visant à réduire les éventuelles souffrances animales (administration d'analgésique lors de chirurgies ou après agression entre congénères).
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle de la souris car d’un point de vue anatomique et fonctionnel, les systèmes dopaminergiques méso-cortico-limbiques sont bien conservés, chez l'ensemble des mammifères et en particulier chez les rongeurs. Plus particulièrement, la distribution des récepteurs nicotiniques et les afférences cholinergiques sont organisées de manières similaires que chez l'homme. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, les poissons ou les oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulation des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles animaux. Si les modèles d’invertébrés et poisson peuvent être utilisés pour étudier certains mécanismes dopaminergiques, l’organisation anatomique est trop différente pour qu'ils puissent être utilisés pour comprendre la modulation nicotinique du système dopaminergique. Finalement la souris étant un mammifère social qui vit en groupe, c’est un modèle pratique pour pouvoir étudier le comportement social en groupe chez les animaux sociaux. Des modèles d’autres mammifères sociaux (rat, singe) ne se justifient pas car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents sont peu nombreux chez ces espèces. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (> 8 semaines). Pour les études nécessitant une transduction virale, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7-8 semaines le jour de l’injection virale, afin d'observer un temps de transduction nécessaire par le virus concerné (entre 2 et 4 semaines). Les expériences d’électrophysiologie ou de comportement seront réalisées à partir de 4 semaines après l’injection virale, temps nécessaire à l’expression du transgène. L’implantation des fibres optiques ou des électrodes d'enregistrement se fera à partir de 8 semaines d’âge.
Marqueurs prédictifs de la variabilité cognitive et sociale individuelle chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées dans des procédures pouvant atteindre un niveau de souffrance sévère, environ deux cent quarante tuées à l'issue pour des analyses du cerveau et cent vingt souris 'visiteuses' gardées pour d'autres projets. Les souris expérimentales subissent une chirurgie d'implantation, une série de tests comportementaux de l'adolescence à l'âge adulte, puis un isolement de trois semaines avec restriction alimentaire, que le porteur désigne comme la principale nuisance. Le projet cherche des marqueurs de la variabilité cognitive et sociale entre individus, avec une visée à terme sur la psychiatrie humaine. Le porteur affirme qu'il ne peut être mené ni par des modélisations informatiques ni sur une espèce autre que les mammifères.
Objectifs
Notre objectif est d'établir les interactions, et potentiellement, les origines, de la variabilité cognitive & sociale inter-individuelle, d'en comprendre les mécanismes de mise en place et de déterminer si nous pouvons l'orienter. Nous étudierons pour cela comment les interactions entre profils sociaux et cognitifs émergent.
Bénéfices attendus
Ce projet qui repose sur l’établissement de profils comportementaux individuels et sur leur évolution au cours de la vie possède une dimension translationnelle importante car il entend identifier les profils « extrêmes » pouvant évoluer vers un état pathologique et identifier les marqueurs neurobiologiques de ces facteurs de vulnérabilité. Si cette approche s’avère fructueuse, nos résultats pourraient en outre apporter des éléments en faveur de la réduction du nombre d’animaux dans les expériences comportementales et favoriser les études dimensionnelles et personnalisées comme cela commence à se faire chez l’humain en psychiatrie.
Procédures
Les animaux expérimentaux (120 mâles et 120 femelles) seront soumis à une procédure chirurgicale de 5 minutes. Des tests comportementaux nécessaires pour définir des profils sociaux et cognitif sont réalisés à l’adolescence et l’âge adulte grâce à quatre tâches ( deux tâches de 3 jours et deux durant 5 min et 1h). Uniquement à l'âge adulte, un isolement de 3 semaines sera réalisé.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet la majeure nuisance sera un isolement à l'âge adulte . Lors de cette procédure, les animaux subissent une restriction alimentaire
Devenir
Dans les trois procédures, les animaux expérimentaux seront euthanasiés pour nous permettre de determiner des paramètres neurorbiologiques en lien avec les profils sociaux et cognitifs. Toutes les souris visiteurs mâles et femelles seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets.
Remplacement
Les objectifs de ce projet étant d'étudier le développement de la cognition sociale et de l’organisation d’interaction sociale dans un groupe chez des animaux sains et conspécifiques, d'en comprendre les bases neurales et biologiques, il ne peut donc pas être remplacé par des modélisations informatiques, ni être conduit chez des espèces autres que les mammifères.
Réduction
La réduction des animaux est faite par le suivit des mêmes animaux de l'adolescence à l'âge adulte pour eviter d'avoir deux groupe indépendants.
Raffinement
Le raffinement de nos mesures est dans la mise en place d'un environement semi-naturel avec mesure semi-automatique des comportements. Nous avons également un enrichissement minimum des animaux standard (cabane, sizzle, cotton).Pour ces chirurgies d’implantation de puces, les animaux sont anesthésiés grâce à un gaz . Nous rasons les poils, mettons un antiseptique et procédons également à une anesthésie locale de la peau avant ouverture. Afin de réduire les effets anxiogènes de l'isolement social, des objets permettant de faire un nid seront disposés dans les cages de vie. A l’âge adulte, Après ces deux tâches qui nécessitent une mise temporaire en cage individuelle à l’âge adulte, les souris sont replacées en cages collectives pour les manipulations suivantes. Nous avons déjà réalisé ces regroupements qui se passent généralement sans problème. Les animaux seront évalués dans les 3 premiers jours après le regroupement grâce à une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.. Durant les procédures de restriction alimentaire ou de changement de régime alimentaire, afin de s’assurer de la bonne adaptation des animaux à cette procédure, ils seront suivis chaque jour selon une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que ces animaux ont des capacités cognitives et sociales adaptées aux questions posées dans le projet. Notre projet consistant à étudier le comportement des animaux à différents stades de développement, nous utiliserons donc les animaux à l’adolescence puis à l’âge adulte.
Etude de l’ARN non codant Cyrano au cours de la neurogenèse
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La plupart subissent, nouveau-nées, une électroporation du cerveau sous anesthésie, d'autres des injections, avant d'être tuées entre deux et vingt et un jours de vie pour prélever leur cerveau. Le projet vise à comprendre le rôle d'un ARN non codant dans la formation des neurones après la naissance, comme base d'un futur travail sur les tumeurs cérébrales. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit la différenciation complète des cellules souches neurales du cerveau.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent la balance entre renouvellement des cellules souches neurales et leur engagement dans la différenciation en neurone, dans le cerveau des souris juste après la naissance. Nous étudierons plus précisément la fonction de certaines molécules d’ARNs non codantes. Pour cela des animaux non altérés génétiquement seront utilisés pour étudier l’impact de la surexpression ou de l’inhibition de ces molécules en utilisant une technique permettant d’intégrer des petites molécules d’ADN dans les cellules souches neurales, directement dans le cerveau des nouveau-nés. En parallèle, nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés de façon non dommageable permettant d’éliminer la fonction des molécules d’ARN non codantes qui nous intéressent de façon ciblée dans les cellules souches neurales du cerveau postnatal par la même technique. Nous étudierons dans le cerveau de ces souris, la division cellulaire des cellules souches ainsi que leur devenir en neurones. Ces expériences permettront de déterminer le rôle de ces molécules d’ARN au cours de la neurogenèse postnatale.
Bénéfices attendus
Des centaines de milliers d'ARN non codants ont été identifiés chez les mammifères en particulier chez l’homme. Ces ARN forment un groupe de molécules impliquées dans une variété de mécanismes essentiels pour la cellule. Compte tenu de ces caractéristiques il a été montré que l'expression aberrante de certains ARN non codants est fortement liée à l’apparition et à la progression des tumeurs cancéreuses. Chez l’homme et la souris, les molécules d’ARN qui nous intéressent dans ce projet sont associées à des tumeurs du cerveau, les gliomes, qui constituent la tumeur primaire la plus fréquente et la plus meurtrière du système nerveux central. Il a été montré récemment que des gliomes apparaissent suite à des anomalies génétiques qui surviennent dans certaines cellules souches neurales, en particulier des anomalies concernant les molécules d’ARN non codantes que nous étudions dans ce projet. L’étude menée dans ce projet permettra à court terme de connaitre le rôle de ces ARN non codants dans la physiologie normale de ces cellules souches. Ces connaissances constitueront la base d’un projet futur pour évaluer à plus long terme le rôle de ces molécules dans l’induction et la progression tumorale dans un modèle de gliome chez la souris. Nous pensons donc que l’étude de la fonction physiologique de ces ARN dans les cellules souches neurales sera bénéfique pour la compréhension future du développement de certains types de gliomes chez l’homme
Procédures
Intervention: 1) electroporation du cerveau: geste réalisé sous anesthésie générale. Durée de l'acte: 1 minute maximum, effectué sur 864 animaux nouveau-nés, 1 seule fois par animal. 2) Injection intrapéritonéale, durée moins de 1minute, effectuée 1 fois sur 192 animaux nouveau-nés et 2 fois sur 60 animaux nouveau-nés. 3) Toracotomie dans le cadre d'une euthanasie par perfusion intracardiaque. Geste réalisé sous anesthésie générale sub-létale (surdosée) après une pré-médication avec un analgésique morphinique. Durée: 5 minutes, 1 seule fois car conduit à la mort de l'animal, sur 556 animaux.
Impact sur les animaux
Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 21 jours après. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’année et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur l'état de santé et le bien être des animaux. Concernant l’injection par voie intrapéritonéale, l’acte entraine probablement un stress des animaux au moment de la contention et de l’introduction de l’aiguille dans l’abdomen mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits par l'introduction de l’aiguille sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux. La lignée transgénique que nous utilisons dans ce projet est une lignée conditionnelle qui induit la mutation de l’ARN Cyrano seulement dans quelques cellules du cerveau après la naissance, ce qui n’entraine aucun effet dommageable sur l’animal
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever leur cerveau en vue de leur analyse
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour ce projet. En effet nous étudions l’impact physiologique des ARN non codant sur la biologie des cellules souches neurales. Il n’existe pas de système cellulaire in vitro qui reproduisent l’intégralité de la différenciation des cellules souches neurales en différents sous-types neuronaux qu’elles produisent in vivo dans le cerveau. De plus la prolifération et la différenciation de ces cellules souches sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux présents au niveau de niches cellulaires qui entourent ces cellules. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. La seule alternative in vitro consiste à cultiver des cellules souches fraichement prélevées sur des animaux. Mais même dans ce cas, les méthodes de culture existantes ne reproduisent pas exactement le devenir des cellules souches en termes de type de types cellulaires. Peu de neurones sont générés dans ces conditions au profit des cellules gliales, et le système ne permet pas non plus d’obtenir les différentes sous-populations neuronales produites en condition physiologique dans le cerveau antérieur.
Réduction
Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des cellules souches directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques, en particulier pour des approches de gain de fonction. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routione depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et nous pouvons estimer au plus juste le nombre d’animaux suffisants à utiliser pour avoir des résultats reproductibles et tenant compte du taux d’échec des expériences réalisées par la suite sur les échantillons biologiques. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir de mêmes portées, sans distinction de sexe, afin d’optimiser le nombre de nouveaux-nés utilisés par portée et donc de réduire le nombre de portée par expérience. Pour les analyses histochimiques, le nombre d’animaux nécessaires à l’étude a été réduit grâce au fait que chaque cerveau prélevé servira à l’analyse de plusieurs marqueurs. Grâce aux formations suivies en biostatistique sur des petits échantillons et à l’expérience acquise de l’analyse statistique de résultats obtenus en utilisant ces méthodes dans d’autres projets qui ont déjà obtenu une autorisation, le nombre d’animaux pour ce projet a pu être réduit au strict nécessaire.
Raffinement
Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. 6 personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation post-expérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises.
Choix des espèces
La souris est le modèle mammifère utilisé par la communauté scientifique pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la neurogenèse postnatale et adulte et qui sont conservés chez l’homme. De plus il permet des manipulations génétiques, soit par l’utilisation d’animaux transgéniques soit par modification ciblée de l’information génique des cellules souches neurales in vivo dans le cerveau. Les animaux seront utilisés au stade post-natal P0/P1 pour 2 raisons : -le projet concerne l’étude de la neurogenèse postnatale qui est la période la plus active en termes de renouvellement des neurones -les cellules souches ne sont accessibles par électroporation qu’aux stades P0-P1 Les animaux seront sacrifiés à différents temps après électroporation, du jour 1 (P1) au jour 21 (P21) après la naissance parce qu'ils correspondent aux différentes étapes du processus de neurogenèse par lesquelles une cellule souche doit passer avant de devenir un neurone mature .
Intérêt d’une thérapie matricielle pour contrer les dommages cérébraux et les déficits cognitifs induits par la radiothérapie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
220 rats sains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Leur cerveau entier est irradié, puis pendant six mois ils reçoivent chaque semaine une injection intraveineuse d'une molécule dite RGTA, avec quatre IRM et quatre batteries de tests comportementaux mesurant la fatigue, la locomotion, l'anxiété et la mémoire. Le porteur indique que l'irradiation provoque fatigue, perte de poids, sécrétions oculaires et érythèmes, qu'il présente comme transitoires. Il affirme qu'il est 'indispensable' de recourir à l'animal pour analyser ces phénomènes, en vue d'un éventuel passage chez l'humain.
Objectifs
Bien que la radiothérapie soit un traitement de référence pour traiter les tumeurs cérébrales, celle-ci peut induire des déficits cognitifs sévères qui altèrent grandement la qualité de vie des patients. L'irradiation cérébrale permet de contrôler la tumeur mais conduit également à des lésions du tissu cérébral sain qui aboutissent à un déclin cognitif, notamment des atteintes mnésiques. Actuellement,, il n’existe aucune prise en charge thérapeutique pour prévenir et/ou réparer les lésions cérébrales induites par la radiothérapie. Ainsi, ce projet vise à évaluer dans un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat adulte, l’intérêt d’une thérapie matricielle utilisant une molécule dénommée RGTA® (ReGeneraTing Agent). Les effets neuroprotecteurs et pro-cognitifs de cette molécule ont déjà été montrés dans différents modèles animaux de pathologies cérébrales. L’objectif de ce projet est double : 1/ mieux comprendre les mécanismes-clés des déficits cognitifs induits par la radiothérapie cérébrale et 2/ les limiter par une nouvelle thérapie matricielle. L’intérêt de la thérapie RGTA® pour contrer les lésions cérébrales et les déficits cognitifs induits par la RT cérébrale sera évalué dans un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat sain (non porteur de tumeurs cérébrales). Ce modèle animal a été développé au laboratoire et est bien caractérisé que ce soit en termes de décours temporel des altérations comportementales (fatigue/locomotion/cognition) ou des atteintes du tissu cérébral.
Bénéfices attendus
Cette étude préclinique doit permettre de 1/ de mieux comprendre les mécanismes responsables des troubles cognitifs observés après l'irradiation cérébrale et 2/ d’apporter des preuves expérimentales robustes pour évaluer l'intérêt du RGTA® en tant qu'agent neuroprotecteur, régénérateur et pro-cognitif dans le contexte des lésions cérébrales induites par la RT. A la fin du projet, les résultats seront accessibles sous la forme d’articles scientifiques. De plus, des biobanques de tissus cérébraux et de sang seront établies lors de ce projet et seront mises à disposition de la communauté scientifique. A long terme, une transposition à la clinique pourrait être envisagée pour atténuer le déclin cognitif des patients traités par RT et améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes procédures comme une irradiation de l’ensemble du cerveau qui durera 10 minutes. Les rats seront ensuite traités chaque semaine, pendant une durée de 6 mois, par la thérapie matricielle ou par son excipent (sérum physiologique), administrés par voie intraveineuse et durera au maximum 5 minutes par animal. Pour évaluer les effets du traitement, des IRM cérébrales d'une durée maximale de 45 minutes par animal seront réalisées et répétées 4 fois pendant l'étude. L'ensemble des animaux réaliseront également plusieurs tests comportementaux pour évaluer la fatigue, l'activité locomotrice, l'anxiété, la mémoire à court-terme et la mémoire à long-terme. Chaque animal réalisera 4 fois cette batterie de tests comportementaux (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois après irradiation cérébrale). L’ensemble des tests comportementaux seront échelonnés sur 2 semaines avec 1 seul test par jour et la durée de chaque test comportemental sera comprise entre 10 et 20 minutes.
Impact sur les animaux
A la suite de l'irradiation cérébrale, les animaux seront fatigués, présenteront une perte de poids et pourront présenter des signes de dégradation de leur état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, érythèmes cutanés sur la tête). Il est important de noter que ces effets indésirables sont transitoires et réversibles. De plus, l’ensemble de ces effets indésirables sont également retrouvés chez les patients traités par radiothérapie et le but de ce projet est d'évaluer l'intérêt du traitement RGTA® pour atténuer et réduire ces effets secondaires.
Devenir
A la fin de l'étude (6 mois après irradiation cérébrale), les animaux des différentes procédures seront mis à mort afin de mener des études post mortem sur le sang et le tissu cérébral.
Remplacement
Bien que des alternatives non-animales seront utilisées dans ce projet, il est indispensable d’avoir recours à l’expérimentation sur des animaux pour permettre une analyse intégrée des phénomènes complexes induits par l’irradiation cérébrale et d’évaluer l’intérêt de la thérapie matricielle utilisée dans ce projet. Ce projet permettra d'obtenir des preuves expérimentales suffisamment robustes pour in fine tester ce traitement chez l’Homme.
Réduction
Grâce à l'utilisation au préalable de tests statistiques appropriés et à l'utilisation de techniques d'investigation non invasives (imagerie IRM et tests comportementaux), le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une puissance des résultats sera réduit au minimum. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est estimé à 220 rats répartis en 4 groupes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en animalerie conventionnelle aux normes requises. Le personnel participant au projet est formé aux procédures en expérimentation animale. Des inspections du bien-être des animaux seront réalisées quotidiennement. De plus, toutes les mesures visant à réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux seront entreprises, notamment en appliquant une anesthésie et une analgésie appropriées. Concernant les effets indésirables liés à l’irradiation cérébrale qui peuvent affecter de façon transitoire l’état général des animaux, des mesures sont déjà mises en place dans l’équipe et connues par les personnes impliquées dans ce projet. De plus, une échelle d’évaluation de l’état général des animaux (score défini par plusieurs items visuels) a été mise en place dans l’équipe sur ce modèle animal pour surveiller finement l’état général des animaux. Enfin, des points limites spécifiques et de critères d'arrêt de souffrance seront utilisés afin de réduire toute souffrance ou douleur chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat possède un cerveau dont la taille est supérieure à la souris et qui est compatible avec les appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée ainsi qu’une imagerie IRM de haute résolution. D’autre part, plusieurs tests comportementaux visant à évaluer les déficits moteurs et cognitifs sont bien décrits chez le rat. Enfin, le modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat utilisé dans ce projet a été developpé par le laboratoire de recherche qui l'a d'ailleurs déjà très bien caractérisé en termes de dommages cérébraux et de modifications comportementales jusqu’à 6 mois après irradiation encéphalique. Ainsi, le laboratoire de recherche maîtise très bien ce modèle animal que ce soit dans le décours temporel de sa physiopathologie mais aussi en termes de prise en charge du bien-être animal. Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 5 mois (poids d’environ 350 g) lors de leur arrivée à l’animalerie. L’irradiation cérébrale sera réalisée sur des animaux âgés de 6 mois mais les rats arriveront à l’animalerie 1 mois avant afin de les acclimater dans leur nouvel environnement, de les habituer aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux. L’âge de 6 mois a été retenu puisqu’il correspond à l’âge adulte mature chez le rat et est équivalent à l’âge de 18 ans chez l’Homme. A ce stade de développement chez le rat, la substance blanche est complètement mature, ce qui représente un critère très important pour modéliser les atteintes cérébrales observées chez le patient adulte traité par radiothérapie.
Etude des mécanismes cellulaires de l’impulsivité
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis à une restriction alimentaire pendant une évaluation comportementale de l'impulsivité de trois mois, à une neurochirurgie, puis à des injections quotidiennes d'un traitement dopaminergique pendant vingt jours qui provoque une forte impulsivité, avant leur mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur justifie la mise à mort par le 'besoin' d'obtenir les tissus cérébraux, et rattache l'impulsivité à la vulnérabilité aux addictions. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne permet d'évaluer un comportement impulsif.
Objectifs
La perte de contrôle sur les comportements motivés qui se reflètent au travers d'une forte impulsivité, est à la base de la vulnérabilité à developper des addictions, qu'elles soient liées aux drogues ou à des comportements (jeu pathologique, boulimie, ...). Il n'existe pas à ce jour de traitements réellement spécifiques et efficaces contre ces troubles, et ce notamment car les mécanismes cérébraux qui sous-tendent ces comportements pathologiques sont encore peu connus. L'objectif de ce projet est donc d'identifier certains des mécanismes neuronaux qui conduisent au développement d'une forte impulsivité.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes neuronaux qui sous-tendent les comportements impulsifs est une première étape essentielle pour pouvoir ensuire développer des stratégies thérapeutiques pertinentes et efficaces contre les troubles psychiatriques associés, comme les addictions.
Procédures
Les animaux seront soumis à quatre types d'interventions différentes : une évaluation comportementale de l'impulsivité (3 mois), une procédure de neurochirurgie (une heure maximum par animal), une procédure d'injection intrapéritonéale d'un traitement dopaminergique (une fois par jour pendant 20 jours) et mise à mort par dose létale d’anesthésique pour perfusion intracardiaque et prélèvement de tissus cérébraux afin d'étudier les mécanismes neuronaux pouvant expliquer les comportements observés (injection intrapéritonéale de pentobarbital après anesthésie à l'isoflurane, durée de la procédure : 5 minutes pour l'anesthésie profonde).
Impact sur les animaux
Nous attendons des nuisances d'ordre modérée dûes à la restriction alimentaire contrôlée, nécessaire à la réalisation de la tâche comportementale, et à la procédure chirurgicale. Le traitement pharmacologique induit une forte impulsivité, mais nous n'attendons pas de part nos connaissances du produit, à des effets physiologiques indésirables, à la dose modérée utilisée et largement documentée.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux afin de mieux comprendre les mécanismes de ces comportements et du traitement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation d'un comportement impulsif.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une d'approche statistique.
Raffinement
Pour la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et analgésiés. Un anesthésique local sera également injecté au niveau du site opératoire en sous-cutanée, afin de prévenir le développement d'une potentielle douleur. Si nécessaire les heures ou jours suivant la chirurgie, un analgésique ou antalgique pourra être administré. En cas de signe d'alerte, l'alimentation sera supplémentée par une solution de Blédine, ainsi qu'une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l'animalerie. Des injections d'eau glucosée pourront également être réalisées. Afin de réduire les potentielles gênes induites par les injections répétées des aiguilles très fines seront utilisées. Les animaux seront habitués en amont à l'experimentateur ainsi qu'à la manipulation, et les aiguilles seront changées entre chaque injection, ainsi que le site d'injection chaque jour. Les animaux seront également stabulés selon la procédure mise en place par l'animalerie, afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Nous serons cependant obligés de les isolés par rapport à la procédure comportementale. Cependant, l'isolement sera limité par le fait que nous utilisons des cages avec grilles en portoir ouvert, proches les unes des autres. Ainsi, un certain nombre d'interactions sociales persistent, notamment par l'olfaction (essentielles) et l'audition.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des structures que nous allons étudier. De plus, le rat est couramment utilisé pour les études sur les comportements impulsifs. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes, ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois. Nous travaillerons également à la fois sur les mâles et les femelles pour prendre un compte un effet potentiel du sexe.
Effet d’anticorps ciblant différentes protéines du cerveau dans des modèles de schizophrénie chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 764 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent une chirurgie crânienne de deux heures puis une injection d'anticorps dans le cerveau, d'autres reçoivent des injections répétées de psychotrope pour reproduire des symptômes de schizophrénie, à l'âge adulte ou dès la naissance, avant des tests comportementaux d'exploration et de réaction à des sons. Le porteur teste des anticorps issus de lamas censés cibler une protéine liée au glutamate, et renvoie les retombées pour les patients au conditionnel. Il affirme que le volet comportemental force le recours à la souris et conclut que le remplacement n'est pas possible.
Objectifs
La schizophrénie est une maladie psychiatrique hautement invalidante touchant environ 1% de la population. La recherche actuelle suggère que le glutamate, messager majeur dans le cerveau, est lié à la maladie quand il est trop concentré, mais les essais jusque là ont échoué à cause d'actions mal ciblées à l'origine d'effets secondaires. Une famille de protéines permet cependant de réduire les quantités de glutamate localement, ce qui diminue les risques d’effets secondaires. Nous avons montré que des petits anticorps provenant des lamas pouvaient réduire les symptômes de la maladie chez la souris en ciblant un type de protéine de cette famille. Dans cette étude, nous cherchons à observer les effets de nouveaux anticorps ciblant un autre type de protéines de cette famille, pour potentiellement trouver des résultats similaires par une autre voie. Pour ce faire, nous les testerons chez des souris modèles reproduisant différent symptômes puis enfin sur des souris modèles ne possédant plus la cible de nos anticorps, en contrôle.
Bénéfices attendus
L'utilisation des petites molécules thérapeutiques a historiquement été limitée à cause de leur manque de précision. Nos anticorps, eux, ciblent exclusivement leur cible, ce qui en fait des agents thérapeutiques prometteurs. De plus, cibler le système du glutamate permet de s’attaquer directement à la source de la maladie, plutôt que de se limiter au traitement supericiel de certains symptômes d’hallucinations et de délires tel que le font les traitements actuels. Adresser de manière complète le problème permettrait de réduire tous les symptômes, en particulier cognitifs et/ou de l’humeur, ce qui serait un immense pas en avant pour les patients et limiterait les interruptions de traitement.
Procédures
Dans un premier temps, l’activité de nos anticorps sera évaluée après injection dans le cerveau, ce qui nécessite d'une part une chirurgie crânienne d'une durée de deux heures par animal, et d'autre part une injection unique sur vingt minutes. Si nos anticorps parviennent à passer directement dans le cerveau depuis le sang, cette procédure pourra être remplacée par une injection simple en périphérie (moins de cinq minutes). En ce qui concerne nos modèles, ils se basent sur l’injection régulière (moins de cinq minutes) de psychotrope soit sur deux semaines (une fois par jour) à l’âge adulte soit sur une semaine (un jour sur deux) chez le nouveau-né. Les tests comportementaux seront non invasifs et non douloureux avec de l'exploration d'arène et des réactions aux stimuli sonores sur deux ou trois jours, pour un total de deux heures pour chaque test, soit six heures par animal pour réaliser tous les tests. Tous les animaux à la fin des expériences seront mis à mort par injection d’anesthésique suivie d’une perfusion pour fixer les tissus et récupérer le cerveau.
Impact sur les animaux
Cette étude utilisera des animaux non mutés ou ne possédant plus les protéines cibles. Ces déficiences n'induisent pas de douleurs chez l'animal. La chirurgie présente des risques de mort lors de l’anesthésie, ainsi que de gêne et de douleur suite à l’opération. Les modèles murins de schizophrénie seront mis en place par des injections répétées de psychotrope au stade adulte ou au stade nouveau-né. Outre la douleur des injections, ces modèles impliquent des difficultées de mobilité, de mémoire, et de sociabilisation (sans agressivité). D’après les données chez l'animal obtenues par nos collaborateurs, aucun signe de souffrance n’est attendu après unique injection d’un anticorps. Les anticorps qui seront évalués dans cette étude n'ont pas d'effets indésirables attendus après injection unique.
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau pour des analyses sur les tissus.
Remplacement
Le remplacement de l’animal n’est pas possible pour cette étude. Les anticorps développés jusque-là ont une cible murine et, bien que leurs caractéristiques aient été décrites en laboratoire, les aspects les plus complexes (circulation dans le système, délai d’action, durée de l’effet) ne peuvent être reproduits. L'étude se concentre de plus sur un trouble psychique dont les mécanismes ne sont pas bien décrits, mais pour lesquels la littérature présente plusieurs modèles murins représentant bien différents symptômes de la maladie. L'aspect comportemental de ce projet, à l'heure actuelle, force l'utilisation de l'animal.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude a été déterminé afin de minimiser l'utilisation de l'animal tout en assurant la pertinence statistique des études réalisées par la suite, en prenant en compte des variabilités attendues car observées dans des travaux similaires et les risques de pertes liés à la chirurgie. Si, au cours du projet, les variabilités observées sont plus faibles, les groupes seront réduits en conséquence. Mâles et femelles seront utilisés, car les modèles murins de schizophrénie utilisés ne présentent pas de variabilité en fonction du sexe. Les nanobodies injectés auront déjà été sélectionnés pour leurs caractéristiques in vitro. Pour chaque étape, les nouveaux résultats permettront de réduire la sélection. Les mêmes animaux seront observés à travers différents tests comportementaux.
Raffinement
Cette étude utilisera des animaux non mutés ou ne possédant plus les protéines cibles. Ces déficiences n'induisent pas de douleurs chez l'animal. Tous les animaux suivront une période de cinq jours d’habituation à la manipulation et aux tests afin de réduire au maximum le stress lié au contact humain et à l’environnement d’étude. Des groupes d’animaux subiront des chirurgies et seront donc endormis profondément par l'utilisation d'anesthésiques appropriés et leur douleur sera traitée avec des anti-douleurs afin de minimiser la souffrance et la mortalité des animaux. Des mesures préventives aux impacts secondaires de la chirurgie (baisse de température, déshydratation, sécheresse des yeux) seront mises en place, avec une semaine de récupération sous surveillance quotidienne. Les résultats actuels ne permettent pas d’affirmer que nos anticorps entrent dans le cerveau d’eux même, mais une étude parallèle est prévue, et si l’injection directe est possible elle sera alors favorisée pour limiter la souffrance animale. Les injections de psychotropes, outre la douleur de la piqûre, induisent des déficits de mobilité et de mémoire qui seront surveillés en fonction de l'âge de l'animal pour identifier aussi tôt que possible toute souffrance non prévue par l'étude. Les données obtenues par nos précédents collaborateurs suite à un traitement aigu avec ces anticorps ne montrent pas de signe de souffrance supplémentaire à l’introduction de l’aiguille chez l’animal. Le comportement des animaux sera évalué via une grille de score de douleur à chaque étape pour intervenir au plus tôt en cas de signes de souffrance plus importants que prévus dans le cadre des manipulations. Un score élevé nous amènera a contacter la structure de bien être animal pour prendre la décision d'utiliser des anti-douleurs ou euthanasier l'animal.
Choix des espèces
Les anticorps produits jusque-là visent des cibles murines avec une forte spécificité et les modèles d'intérêt pour la schizophrénie sont particulièrement bien documentés chez la souris. Afin d’identifier rapidement les composés ayant un potentiel thérapeutique, nous avons décidé d’utiliser d'abord un modèle rapide pour évaluer un symptôme simple de la maladie. Les composés ayant montré une capacité à atténuer ce symptôme seront ensuite caractérisés plus en profondeur dans un modèle d’exposition précoce à un psychotrope. Ce modèle, impliquant une période d’expérimentation plus longue, se veut plus proche de la maladie. Les souches déficientes pour les cibles visées sont des contrôles essentiels pour confirmer que l’activité des anticorps est propre à leur action sur la cible. Ces souris ont déjà été étudiées, et ne montrent pas de souffrance par rapport aux souris non mutées.
Nouvelles molécules pour promouvoir la régénération de la moelle épinière chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 162 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent des neurochirurgies et une lésion de la moelle épinière provoquant une paralysie des membres inférieurs, avec un risque de douleurs de type allodynie et d'infection urinaire, ainsi que des injections répétées dans l'œil. La mise à mort permet de récupérer les structures nerveuses. Le porteur affirme que le modèle murin est "non remplaçable" et présente la souris comme le standard international de la recherche sur la régénération du système nerveux.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière représentent entre 250 000 et 500 000 patients par an dans le monde. Ce sont souvent de jeunes patients puisque d’après les données de l’Organisation Mondial pour la santé, ces atteintes surviennent chez des personnes âgées entre 20 et 29 ans. Plus de 90 pour 100 de cas sont dus à des blessures traumatiques comme les accidents de la route, la violence ou les chutes. Cependant la proportion des lésions non traumatiques comme les cancers progresse d’année en année. Les patients souffrant de lésions de la moelle restent handicapés de façon permanente puisque les neurones du système nerveux central (SNC- cerveau, moelle épinière) n’ont pas la capacité de repousse. A ce jour il n’y a pas de traitement afin de réparer le SNC. La compréhension des mécanismes moléculaires des lésions du système nerveux représente donc un défi majeur en biologie dans le but de développer des stratégies thérapeutiques innovantes. Le but de ce projet d’identifier l’effet de nouvelles molécules sur la repousse axonale dans le SNC afin de permettre la reconstruction des circuits neuronales et le retour fonctionnel. Ces molécules ont été sélectionnées suite à des tests dans les cultures de neurones. Le but de ce projet est de tester les molécules les plus prometteuses in vivo chez la souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont extrêmement importants d’un point de vue aussi bien fondamentale qu’appliqué. En effet, nos travaux vont définir des molécules clés pour permettre la neuroprotection et la régénération du système nerveux centrale. Notre projet caractérisera en détail des molécules importantes pour la régénération du système nerveux central. Non seulement nous allons identifier et valider de nouvelles cibles qui permettront de faire régénérer les nerfs, mais nous allons aussi mettre en évidence la formation de nouveaux circuits après une lésion. Ces données seront essentielles dans une optique translationnelle. En effet, nos résultats permettront de mettre en évidence de nouvelles cibles qui peuvent être exploités pour le développement de thérapies innovantes dans le domaine des lésions de la moelle mais aussi en cas d’atteintes traumatiques du cerveau.
Procédures
Les souris subissent des neurochirurgies pour une durée de 40minutes, anesthésie inclue. Les souris peuvent subir une ou plusieurs neurochirurgies. Les souris sont soumises à un traitement pharmacologique pendant 2 à 6 semaines, tous les 2 jours. Le geste dure 1 minute. Les animaux subiront des désagréments liés à l’anesthésie et à la plaie d’implique les injections ou les neurochirurgies qui se caractérisent essentiellement par une douleur modérée. Les souris participeront également à des tests de comportement pour évaluer le retour moteur et sensitif. Ces tests ne sont pas douloureux. Elles seront testées sur une durée de 6 semaines à une fréquence d'une à deux fois par semaine. Les souris seront acclimatées à la salle de comportement pour 1h avant de commencer le test qui dure au maximum 15min.
Impact sur les animaux
Ce projet implique des injections répétitives dans l’oeil. Le risque de ces expériences est d’induire une inflammation de l’oeil. Les animaux vont subir plusieurs injections en intra-péritonéales pour induire une anesthésie et pour les traitements pharmacologiques. Les animaux subissent une lésion de la moelle épinière induisant la paralysie des membres inférieurs chez la souris pouvant éventuellement induire à un risque d’infection urinaire. Cette lésion peut également induire un risque de douleurs (type allodynie).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer les structures d'intérêt. De ce fait, les animaux ne peuvent pas être réutiliser.
Remplacement
Pour atteindre nos objectifs, les modèles murins sont essentiels et non remplaçables car i) les paradigmes de lésion chez la souris sont les mêmes que chez l’humain, ii) un très grand nombre de lignées de souris transgéniques sont déjà disponibles pour nos recherches, iii) les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents acteurs (neurones, cellules gliales, environnement de la lésion…) et ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Le modèle murin est le standard international reconnu pour la recherche sur la régénération du système nerveux central. iv) les moélcules testés in vivo chez la souris ont été préalablement caracterisées dans des cultures de neurones.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : -les études préliminaires des molécules sur des cultures primaires de neurones -La validation systématique de toutes nos préparations de virus pour s’assurer de leur efficacité avant les expériences -L’entrainement de toutes les personnes qui pratiquent les expériences pour ne pas perdre d’animaux dû à de mauvaises chirurgies. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Seules les molécules montrant un effet seront utilisées chez les animaux.
Raffinement
L’ensemble des animaux qui auront subi une intervention chirurgicale seront observés quotidiennement et seront pesés aux moins deux fois par semaine. Une échelle de cotation de souffrance basée sur les signes indicatifs de gêne ou de douleur sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir le point limite permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. Pour l’ensemble des procédures, le poids des souris sera vérifié quotidiennement pendant une semaine à la suite des chirurgies. Les animaux auront de l’eau gélifiée dans leur cage ainsi que leur nourriture. Nous serons attentifs à leur comportement : pour l’entretien du poil en cas de doutes, nous en discuterons avec le vétérinaire réfèrent. Néanmoins, nous serons particulièrement vigilants au bien être des souris : elles recevront un analgésique 24h avant les interventions chirurgicales et ce pendant 48h.
Choix des espèces
La régénération du système nerveux est un phénomène multifactoriel qui s’intègre dans la formation d’un circuit neuronal. La modélisation de ce processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les voies moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in-vivo standard dans la communauté scientifique grâce à une grande similitude avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles telles que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les paradigmes scientifiques que nous utilisons. La souris permet aussi l’utilisation de tests de comportement pour analyser le retour fonctionnel. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris dont le système nerveux est considéré comme mature (plus de 4 semaines). En effet le système nerveux en cours de développement présente de grande capacité de régénérescence, ce qui est perdu dans le système nerveux mature. Nous voulons étudier les mécanismes de régénérescence et de plasticité axonale dans le système nerveux central adulte pour être le plus proche possible des lésions traumatiques chez l’homme.
Essai d’une thérapie cellulaire chez le rat avec des précurseurs de photorécepteurs édités génétiquement
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
295 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent sous anesthésie une injection sous-rétinienne de photorécepteurs issus de cellules souches humaines, puis des examens d'imagerie, des électrorétinogrammes et des tests comportementaux de la vision. La mise à mort permet des analyses de la rétine. Le porteur affirme que l'évaluation d'une récupération visuelle ne peut se faire qu'in vivo et décrit une piste thérapeutique pour des cécités aujourd'hui irréversibles.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de valider le potentiel de restauration visuelle de cellules rétiniennes appelées photorécepteurs rendues artificiellement sensibles à la lumière grâce à la présence d’un canal ionique. Ces photorécepteurs sont obtenus in vitro à partir de cellules souches humaines, appelées cellules iPS. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer dans un modèle de rats présentant une perte visuelle provoquée par une dégénération de la rétine similaire à celle observée chez l’homme et immunodéficient, le potentiel thérapeutique de ces cellules modifiées après transplantation. L’utilisation de cellules rendus artificiellement sensible à la lumière vise à contourner les difficultés rencontrées par différents groupes, et rapportées dans différentes études, d’obtenir une restauration fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Les travaux de thérapie cellulaire humaine de ces dernières années utilisant des photorécepteurs dérivés de cellules souches pluripotentes ont obtenu un certain succès en termes de survie et d’intégration dans le tissus-hôte des cellules transplantées. En revanche, la plupart des études témoignent d’une absence ou d’une faible récupération fonctionnelle, liée notamment à un défaut de maturation des cellules transplantées. L’approche proposée ici vise à contourner cet obstacle à l’aide de cellules rendues photosensibles artificiellement par une approche d’édition du génome qui devrait permettre d’observer une récupération fonctionnelle beaucoup plus importante. Les bénéfices attendus sont donc une restauration au moins partielle de la vue chez les animaux modèles aveugles. Ces résultats pourraient permettre à terme de proposer à des patients souffrant de cécité irréversible une thérapie visant à rendre au moins partiellement la vue ; les seuls traitement disponibles à l’heure actuelle permettent au mieux un ralentissement de la perte visuelle avant la cécité complète.
Procédures
Trois groupes d’animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste en l’injection intraoculaire (sous la rétine) de cellules en suspension (2 groupes pour deux types de cellules différentes), ou de solution tampon (1 groupe) ; cette opération dure 15 à 20 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permette l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisé une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière. ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 6 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables possibles de l’étape chirurgicale consistant en la transplantation cellulaire dans l’espace sous-rétinien sont une douleur oculaire et péri-oculaire dans une courte période post-opératoire. Les procédures post-opératoire (tests visuels, imagerie) n’ont pas d’effets indésirables avérés. Dans de rares cas, une inflammation anormale de l’œil peut être observée en post-opératoire.
Devenir
A la suite de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (survie cellulaire ; différenciation et intégration aux tissus de l’hôte ; réponse à la lumière des cellules transplantées ; reconnexion avec les autres types cellulaire ).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une récupération fonctionnelle visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d’animaux pour cette étude est de 295 réparti en trois groupes distincts. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30% (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Cet effectif a été déterminé à l’aide d’un calcul de puissance permettant une analyse statistiquement robuste et ainsi l’interprétation fiable des données obtenues.
Raffinement
Les animaux sont élevés en cages de stabulation avec éléments d’enrichissement pour toute la durée du protocole ; nourriture et abreuvement à volonté. Les procédures prévoient une surveillance de leur état physique général (et particulièrement du système oculaire). Les procédures utilisées comportent plusieurs tests comportementaux qui n’ont pas d’effets indésirables avérés ou documentés et ne génèrent pas de douleur avérée. Le risque d’une légère irritation de la surface oculaire ne pouvant pas être totalement exclue pour certains examens (imagerie, ERG) les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant les 24h suivant ces différents actes. Le geste chirurgical, qui peut générer une nuisance ou une douleur temporaire est géré en pré et post-opératoire par un traitement analgésique puis un anti-inflammatoire non stéroïdien à durée d’action longue. Les signes de comportement anormal, signe de possible souffrance, seront également surveillés. Les points limites adaptés sont définis de manière adaptée aux procédures mises en œuvres et inclus une surveillance de l’état physique et comportemental de l’animal. L’observation d'un de ces points limites entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal selon les méthodes adaptées et réglementaires.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études précliniques. Ce choix permettra une comparaison des résultats obtenus avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Nous utiliserons une lignée particulière, chez laquelle le système immunitaire est altéré, Ce modèle permet l’étude de xénogreffes (greffe entre donneur et hôte d'espèces différentes) sur le long-terme en réduisant drastiquement le rejet des cellules transplantées normalement provoqué par une forte réponse immunitaire (xénogreffe). Il permet également d’éviter les traitements anti-rejets potentiellement toxiques à long terme ; Les animaux sont inclus dans l’étude à l’âge de 3 mois, stade auquel la dégénérescence de la rétine est effective et l’ensemble des procédures s’étalera sur une durée de 6 mois (étude jusqu'à 6 mois post-transplantation) donc jusqu’à un âge maximal de 9 mois.
Exploration fonctionnelle de la contribution des fibres CLTMRs dans la modulation de la douleur post lésionnelle-Etude pilote par neuroimagerie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris triples mutantes, elles reçoivent du tamoxifène par injection puis par trois gavages, avant une séance d'IRM sous anesthésie légère, pour tester si l'on peut suivre l'activation de certains neurones sensoriels. Le porteur présente une étude pilote censée conditionner un projet plus large sur la douleur, les animaux étant tués faute de pouvoir être relâchés. Il affirme que la détection des variations cérébrales ne peut se faire que sur animal vivant.
Objectifs
Il s'agit ici d'une étude pilote dont les objectifs sont les suivants : Le but de ce projet est d'étudier la biologie d'une classe particulière de neurones somato-sensoriels non myélinisés capables de transduire des stimulation mécaniques à bas seuil, détectées au niveau de la peau poilue. Typiquement, chez l'homme, ces neurones interviennent dans la détection et transduction du toucher social ou affectif. De manière intéressante, des études récentes, y compris certaines réalisées au sein de notre équipe, suggèrent que ces neurones sont aussi capables de moduler la douleur postlésionnelle ainsi que la réponse immunitaire cutanée. Cependant, ces conclusions ont toutes été formulées de manière indirecte et à l'heure actuelle, aucune étude n'apporte la démonstration directe de leur fonction in vivo, à l'état basal et dans la modulation de la douleur post-lésionnelle. C'est précisément le but de notre projet. Il repose sur l'utilisation d'une série de lignées de souris génétiquement modifiées de manière à générer des souris triple mutantes permettant d'activer, inhiber ou bien éliminer séléctivement ces neurones in vivo, et ce, de manière inductible. Le but de cette étude pilote est de vérifier qu’il est possible de suivre par IRM la réponse cérébrale induite par l'activation de ces neurones. Les résultats de cette étude préliminaire conditionneront la mise en œuvre d’un projet s’appuyant sur des méthodes d’IRM fonctionnelle pour l’étude des réseaux cérébraux de la nociception impliquant ces neurones.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude pilote sont les suivants : La prise en charge de la douleur est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une classe particulière de neurones somatosensoriels, qui semblent avoir des propriétés de modulation de la douleur post-lésionnelle. Par conséquent, nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par des lésions tissulaires. De plus, notre projet est conçu de sorte à permettre la découverte de nouvelle pistes thérapeutiques, qui pourraient avoir une application chez les patients humains. A noter que les neurones étudiés ont été également décrits chez l'homme.
Procédures
L'ensemble des animaux recevra une série administrations de tamoxifen : une injection intra-péritonéale à P42 suivie de 3 gavages espacés de 3 jours, 3jours après l’injection I.P. Une session d'imagerie (d'une durée inférieure à 1h30) sera ensuite réalisée de façon non invasive sur chaque souris (sous anesthésie et sédation légères) à l’état basal (avant injection) et après injection.
Impact sur les animaux
Les animaux seront examinés une seule fois par IRM avant et après administration du véhicule ou d’une solution d'un composé appelé Clozapine-N-Oxyde (CNO. Nos données préliminaires nous permettent d’affirmer que les doses de tamoxifen et CNO utilisées ici n’ont aucun effet délétère sur nos souris triples mutantes. L’examen IRM sera conduit sous anesthésie gazeuse. La seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque l’isoflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.
Devenir
Les animaux seront tous euthansiés à l'issue de la procédure d'imagerie. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées et sur des souris dégénérées, leur mise en liberté est inconcevable.
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. Le recours à l’animal est incontournable car la détection de variations hémodynamiques cérébrales résultant d’une stimulation pharmacologique ne peut être réalisés que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation d’une technique d’imagerie non invasive permettra de réduire le nombre d’animaux, grâce au suivi longitudinal de chaque individu. En l’absence de données préliminaires permettant de connaître la taille d’effet attendu (l’objectif de ce projet exploratoire étant justement d’apporter des informations sur la réponse cérébrale au CNO) nous avons estimé la taille des groupes nécessaires à l'obtention de données fiables sur la base de notre expérience en IRM préclinique. Les animaux seront leur propre contrôle. Les données seront analysées au moyen d’une analyse statistique non paramétrique pour mesures répétées adaptée aux petits échantillons.
Raffinement
Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress et l’angoisse. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec monitoring physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge en plastique, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels.
Choix des espèces
Chez la souris, la population des C-LTMRs est similaire à celle décrite chez l'homme sous le nom de C-Tactile. Cette étude pilote sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux adultes.
Analyse de la fonction musculaire : étude pré-clinique des effets de composés pharmacologiques sur le modèle du rat DMDmdx.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une mutation reproduisant la dystrophie musculaire de Duchenne, ils subissent des tests répétés de force et de locomotion sur animal vigile, puis un prélèvement sanguin à la jugulaire sous anesthésie, avant d'être tués pour l'analyse musculaire. Le projet teste des composés pharmacologiques et vise à remplacer le modèle chien, jugé plus lourd et coûteux. Le porteur affirme qu'aucun modèle non animal ne permet cette évaluation préclinique.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la plus fréquente des maladies musculaires (environ 1/3500 naissances males). Elle est causée par un défaut dans le gène de la dystrophine (sur chromosome X) à l’origine d’une dégénérescence progressive du tissu musculaire. La maladie touche tous les muscles de l’organisme, y compris le muscle cardiaque et le diaphragme. Chez les patients DMD, la marche est définitivement perdue avant l’âge de 15 ans et le décès survient généralement avant 30 ans. Il n’existe pas de traitement curatif à ce jour sur le marché. En attendant la validation et mise en place de thérapies curatives visant à ré-exprimer la dystrophine, la thérapie pharmacologique est une des approches envisageables pour pallier les processus physiopathologiques liés à l’absence de dystrophine. Avant le passage chez l’homme, l’efficacité thérapeutique des approches de thérapie est validée en préclinique sur des modèles animaux de la pathologie. Deux modèles animaux DMD, la souris mdx et le chien GRMD, sont couramment utilisés pour l’évaluation d’approches thérapeutiques mais présentent des limites : - La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD et présente un phénotype peu marqué. - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle de gros animal qui est coûteux et lourd à manipuler. Le modèle de rat DMDmdx, générée par un consortium de laboratoires en 2014, est un modèle intermédiaire : c’est un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations d’utilisation que le modèle canin., cette lignée de rat DMDmdx peut donc être utilisée pour réaliser les 1ères phases d’évaluation de l’efficacité de nouveaux produits thérapeutiques. Notre équipe développe un ensemble d’approches expérimentales afin d’évaluer l’efficacité de produits pharmacologiques pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. Ainsi, sur ce modèle de rat DMDmdx, nous envisageons de tester 10 produits en 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence au niveau pré-clinique les effets musculaires de composés d’intérêt sur le modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne. Aussi, ce projet conduit chez le rat DMDmdx permettra également de valider l'évaluation préclinique d'approches thérapeutiques de la DMD dans un modèle animal adapté. Ainsi, l'objectif est de réduire voire remplacer le chien GRMD, autre modèle de la pathologie humaine également utilisé, plus lourd et plus couteux à manipuler, pour cette évaluation préclinique.
Procédures
Au cours de la période de traitement les animaux seront soumis à des tests d'exploration fonctionnelle (force, locomotion, anxiété) non invasifs via la réalisation de différents exercices. Chacun de ces exercices durent entre 5 et 10 minutes maximum. Ces tests seront effectués 3 fois au cours de ce projet : avant la mise en place du traitement, (soit 4 semaines d'âge), au milieux (soit 3.5 mois d'âge) et à la fin de la période de traitement (soit 6 mois d'âge). En fin de période de traitement un prélèvement sanguin à la jugulaire sera effectué sur des animaux anesthésiés (durée: environ 30 min, de l'induction à la sédation à la remise de l'animal dans sa cage d'hébergement).
Impact sur les animaux
L'évolution de la maladie en elle-même peut entrainer un déclin de l'état de santé (difficultés locomotrices, d'alimentation voire respiratoires). Aussi, l’ensemble des tests d’évaluation de la fonction neuromotrice sera effectué sur animal vigile. Bien que validés, non invasifs, et précédés d'une période d'habituation, ces tests peuvent induire un stress chez les animaux.
Devenir
Ce projet vise à évaluer les effets de composés pharmacologiques sur la fonction musculaire de rats DMDmdx, modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne, via la réalisation de tests moteurs sur des animaux vigiles associés à des tests in vitro visant spécifiquement l'étude du tissu musculaire. A la fin de la procédure d'analyse des composés sur la fonction neuromotrice, réalisée à différents stades de développement des animaux et du traitement, l'ensemble des rats sera donc euthanasié afin de conduire cette analyse de la masse et fonction musculaire, afin de corréler les effets physiologiques et cellulaires (identification du lien entre effet et cible d’action)
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle alternatif non animal modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne pour évaluer au niveau pré-clinique les effets de traitement pharmacologiques sur la progression de la pathologie.
Réduction
Le nombre d’animaux estimés dans ce protocole est suffisant pour justifier d’une pertinence scientifique, et est réduit au maximum tout en tenant compte de la validité statistique, des contraintes du modèles et des approches expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. L'évolution de la maladie en elle-même pouvant entrainer un déclin de l'état de santé (difficultés locomotrices, d'alimentation voire respiratoires), l'état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne par le personnel animalier et responsable du projet pour estimer une éventuelle gêne ou douleur liées à l'expression clinique de la maladie. Si un seul signe clinique spécifique ou 3 signes notables sont détectés, alors le responsable du la structure chargée du bien être des animaux et le responsable de l’étude seront prévenus et l'animal sera sacrifié sans délais. Un prélèvement sanguin sera réalisé en fin de traitement. L’ensemble des tests d’évaluation, validés et non invasifs, sera effectué sur animal vigile. Afin de limiter au maximum le stress engendré par la manipulation, les mesures seront précédées par une période d’habituation à la salle d’expérimentation, aux dispositifs expérimentaux ainsi qu’à l’expérimentateur et un renforcement positif (récompense des animaux suite réalisation des essais) sera mise en place.
Choix des espèces
La lignée de rats DMDmdx possède, comme chez les patients atteints de dystophie musculaire de Duchenne (DMD) une mutation à l'origine d'une déficience en une protéine, la Dystrophine. Le phénotype sévère implique une atteinte des muscles squelettiques et cardiaque. Deux modèles animaux de la Dystrophie musculaire de Duchenne , la souris mdx et le chien GRMD, sont couramment utilisés pour l’évaluation d’approches thérapeutiques mais présentent des limites : - La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD et présente un phénotype peu marqué. - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle de gros animal qui est coûteux et lourd à manipuler. Le modèle de rat DMDmdx est un modèle intermédiaire : c’est un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations d’utilisation que le modèle canin. Rats d’âge compris entre 1 et 6 mois afin : - d’évaluer l’efficacité du traitement à différents stades de l’évolution de la maladie dont les premiers symptômes sont visibles chez le rat dès l’âge de 4 semaines. L'exploration des fonctions motrices sera effectuée à 3 stades : avant le traitement (environ 4 semaine d'âge), au milieux (environ 3.5 mois d'âge) et à la fin de la période de traitement (environ 6 mois d'âge). La procédure d'analayse des composés sur la masse et fonction musculaire in vitro des rats DMDmdx sera réaliser en fin de traitement soit à 6 mois d'age.
Etude des capacités mnésiques et des mécanismes cérébraux sous-jacents chez la souris en condition d’hypergravité
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont placées jusqu'à quinze jours dans une centrifugeuse reproduisant une hypergravité de 2G, ce qui les plaque au sol et augmente leur stress, puis passent le test de la croix surélevée et le test du labyrinthe en Y avant d'être tuées pour l'étude de leur hippocampe. Le projet vise à comprendre l'effet de la gravité sur la mémoire, en vue d'aider les astronautes lors des vols spatiaux. Le porteur affirme que l'effet de l'hypergravité sur un "organisme entier" ne peut pas être modélisé in vitro.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer les effets de l’hypergravité (à court ou à long terme) sur la potentialisation à long terme (LTP) dans l’hippocampe des animaux, l’un des mécanismes essentiels de la mémoire. Nous allons aussi déterminer si l’exposition à l’hypergravité (2G) va mener à des difficultés dans des tests comportementaux évaluant la mémoire, la cognition et le stress des animaux. Après une période d’habituation, en groupe sociaux, dans des cages de l’animalerie, la totalité des animaux, soit 80 animaux, seront soumis soit à l’hypergravité (2G) pendant 24h (n=20), 48h (n=20) ou 15 jours (n=20) dans une centrifugeuse in vivo, prévue à cet effet soit à 1G (condition normogravitaire, n=20). Pour reproduire un champ gravitaire de 2G, et donc placer les animaux en hypergravité, nous utilisons une centrifugeuse in vivo (programme spatial du CNES). A la fin de ces différentes périodes, la première moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort pour une étude electrophysiologique approfondie sur tranches d’hippocampe. L’autre moitié des animaux effectura des tests comportementaux pour étudier si des modifications sont concommittantes au niveau comportemental (mémoire) et au niveau cérébral (propriétés électrophysiologiques de l’hippocampe). Après 15 jours d’adaptation, durant lesquels ces tests seront effectués à nouveau 4 fois (2 fois par semaine), les souris seront mises à mort pour effectuer des enregistrements electrophysiologiques et voir si les propriétés électrophysiologiques sont modifées.
Bénéfices attendus
Les données qui seront recueillies grâce à ce projet apporteront des informations essentielles sur le rôle de la gravité dans le fonctionnement de l’hippocampe. En effet on sait que le système vestibulaire, qui est l’organe sensoriel sensible à la gravité est directement connecté à l’hippocampe et participe ainsi non seulment à l’orientation dans l’espace mais aussi à la mémoire spatiale et aux autres fonctions contrôlées par l’hippocampe. Comprendre comment la gravité modifie le fonctionnement et la plasticité de l’hippocampe, et indirectement comment elle affecte les fonctions cognitives servira de base pour trouver des contre-mesures pour aider les astronautes à éviter la désorientation et l’altération de leurs fonctions cognitives lors de changement de gravité telles qu’ils subissent lors des vols spatiaux.
Procédures
Après une période d’habituation, en groupe sociaux, dans des cages de l’animalerie, la totalité des animaux, soit 80 animaux, seront soumis soit à l’hypergravité pendant 24h (n=20), 48h (n=20) ou 15 jours (n=20) dans une centrifugeuse in vivo, prévue à cet effet soit à 1G (condition normogravitaire, n=20). A la fin de ces différentes périodes, la première moitié des animaux de chaque groupe sera mise à mort pour une étude electrophysiologique approfondie sur tranches d’hippocampe. L’autre moitié des animaux sera soumise à des tests comportementaux non invasifs. Ces tests seront réalisés sur animaux vigiles et sans anesthésie. Concernant les 20 animaux témoins, ils seront placés, en groupe sociaux, dans une nacelle de centrifugeuse qui sera déposée dans la meme pièce que la centrifugeuse mais qui ne sera pas en rotation. Alors que 10 de ces animaux effecturont le protocole « électrophysiologie », les 10 autres effecturont le protocole « comportement + electrophysiologie ». Les nuisances prévues sont au nombre de 3. Tout d’abord l‘exposition à l’hypergravité (pour 60 souris), puis les tests comportementaux (pour 40 souris) puis l’électrophysiologie post-mortem (pour 80 souris). L’exposition à l’hypergravité va consister en une augmentation progressive de l’accélération générée par la mise en rotation de l’appareil. Nous prévoyons une augmentation lente permettant d’atteindre un vecteur d’intensité gravitaire perpendiculaire au sol des cages de 2G en 5 minutes. Lors de cette augmentation les animaux vont ressentir une augmentation de leur poids qui va les plaquer au sol et réduire leurs mouvements puis les animaux vont s’adapter et on observe qu’après quelques heures ils commencent à retrouver un certain niveau d’activité. On observe pendant cette phase d’adaptation une augmentation du niveau de stress, puis une habituation à ce nouvel environnement et une réapparition des comportements normaux. Les tests comportementaux que nous effectuerons dès la sortie de la centrifugeuse puis à deux autres délais pour les souris exposées durant 2 semaines sont le test de la croix surélevée et le test du labyrinthe en Y (alternance spontanée). Ce ne sont pas des tests qui génèrent une nuisance particulière, les animaux sont libres de leurs mouvements et on recueille seulement des paramètres liés à leur exploration.
Impact sur les animaux
La mise en hypergravité des animaux induit une sensation d’alourdissement qui peut potentiellement induire une augmentation du niveau du stress, en perturbant leur perception de la gravité et de leurs déplacements dans l’espace. Par conséquent, et comme cela a été montré dans la littérature, les animaux vont s’immobiliser pendant une periode de quelques heures avant de s’habituer au nouveau référentiel gravitationnel et reprendre une activité normale.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure. En effet la première moitié des animaux est utilisée pour des études electrophysiologiques ex-vivo de tranches d’hippocampe, par conscéquent ils seront mis à mort dès la sortie de la centrifugeuse. L’autre moitié des animaux sera soumise à des tests comportementaux non-invasifs à la sortie de la centrifugeuse, ils seront ensuite réutilisés quelques jours plus tard, pour des mesures électrophysiologiques, pour évaluer des phénomènes de réadaptation plusieurs jours apres la centrifugation. Par conséquent, à la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Des études in vitro ou in sillico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de l’hypergravité sur un organisme entier. En effet, la gravité exerce des effets sur l’intégralité de l’organisme (systèmes sensoriels, système musculo-squelettique, viscères etc.), et les effets de ses modifications et de leurs interactions ne peuvent, à l’heure actuelle, pas être modélisés autrement que sur un organisme dans son intégralité. Par ailleurs, étant donné que nous effectuons des tests comportementaux, nous avons besoin des animaux vivants. Pour les enregistrements életrophysiologiques nous avons besoin de tranches de cerveau qui ne sont pas encore modélisables in vitro ou in sillico. Nous avons choisi le modèle souris afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur ce même modèle, car il est de petite taille et peut etre maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse. De plus, le modèle souris est un mammifère suffisament proche de l’homme pour pouvoir transférer les données obtenues entre ces deux espèces.
Réduction
Nous avons défini le nombre d’animaux dans chaque groupe à n=10 en nous basant sur la littérature disponible sur le sujet et sur les travaux du laboratoire utilisant les mêmes méthodes. De plus, le fait d’utiliser les mêmes animaux pour les études comportementales et pour le suivi de la récupération des animaux après l’exposition à l’hypergravité permet de réduire considérablement leur nombre.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables dans des cages standard, répondant aux normes d’éthique. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, c’est-à-dire dans un environnement stabilisé en température à 21°, hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h). L’eau et la nourriture seront ad libitum, de la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition. Leur milieu est enrichi par des frisures de carton et un igloo en papier mâché. Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, à chaque arrêt de la centrifugeuse un responsable des animaux vérifiera quotidiennement l’état des animaux et particulièrement des éventuelles variations de poids, leur apparence physique externe des animaux (poils hérissés, blessures…), des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et mis à mort.
Choix des espèces
Les données bibliographiques les plus récentes sur ce sujet ont portés sur le modèle souris, il parait donc judicieux de poursuivre avec cette espèce pour pouvoir confronter nos résultats et apporter de nouvelles données. Nous avons également choisi le modèle souris car il est de petite taille et supporte très bien une modification de la gravité jusqu’à 2g. De plus, son génome est connu et suffisament proche de celui de l’homme pour obtenir des premiers résultats concluants. Nous utilisons des souris adultes de 8 semaines car pour étudier la plasticité synaptique hippocampique, nous souhaitons que la croissance et le développement cérébral soit atteint.
Mise en place et caractérisation d’un modèle murin de neuropathie induite par la monométhyl auristatine E
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection quotidienne d'un cytotoxique anticancéreux, la monométhyl auristatine E, pendant sept semaines, et subissent chaque semaine le test de la plaque chaude, le test des filaments de von Frey, le rotarod et le grip-test. Le projet vise à créer un modèle de neuropathie induite par la chimiothérapie, les souris étant tuées pour prélever nerfs, peau et ganglions. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'ensemble des mécanismes de la douleur, une étude in vitro sur neurones humains étant menée en parallèle.
Objectifs
Parmi l’ensemble des thérapies anticancéreuses, de la chimiothérapie « traditionnelle » à la thérapie ciblée en passant par l’immunothérapie, de nombreux agents sont responsables d’une forte neurotoxicité à l’origine de neuropathies. Ces NPIC, pour neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie, dépendent de l’agent utilisé et de la dose. Elles se manifestent par l’apparition de troubles sensitifs telles que des douleurs neuropathiques ou des pertes de sensibilité. Les NPIC sont très fréquentes impactant fortement la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie, pouvant conduire à une diminution des chances de survie des patients. A ce jour, la seule prévention reconnue repose sur le dépistage des neuropathies périphériques préexistantes et/ou la détection précoce de signes de neuropathie chez des sujets soumis à une chimiothérapie neurotoxique. Il apparaît évident que connaitre les mécanismes physiopathologiques des thérapies cancéreuses et les prévenir par une thérapeutique efficace sont une priorité pour améliorer la qualité de vie des patients et leur permettre de suivre leur traitement anti-cancéreux. Les immunoconjugués ou "antibody drug conjugate (ADC)" forment une nouvelle classe d'agents anticancéreux. Les immunoconjugués résultent d'un couplage entre un anticorps dirigé contre une cible spécifique d'un type de cancer et d'un cytotoxique. La monométhyl auristatine E (MMAE) est un puissant cytostatique anti-tubules, utilisé pour la synthèse de nombreux immunoconjugués. Un des effets indésirables imputés aux ADC-MMAE, et figurant parmi les plus fréquent, est l'apparition de neuropathies périphériques et des douleurs associées. Les douleurs neuropathiques secondaires à l'administration d'ADC-MMAE sont indépendante de la cible de l'anticorps et donc du type de cancer. Le relargage de la MMAE dans la circualation systémique serait fort probablement à l'origine de cette neurotoxicité. Aucun modèle animal de neuropathie périphérique induite par la MMAE n’a encore été développé. Un tel modèle serait l’outil idéal pour l’évaluation de potentielles thérapeutiques pour la prévention des neuropathies induites par des ADC-MMAE. L’objectif de ce travail est donc de développer et caractériser un modèle murin de neuropathie induite par la MMAE afin d’utiliser cet outil pour la mise en évidence future de molécules neuroprotectrices.
Bénéfices attendus
De plus en plus d'études montrent que les mécanismes pathophysiologiques inhérents au développment de neuropathie périphérique induite par la chimiothérapie sont spécifique à chaque agent anticancéreux. Ainsi, par exemple, une stratégie thérapeutique efficace dans la prévention de la neuropathie périphérique induite par l'oxaliplatine (un agent anticancéreux alkylant indiqué principalement dans la prise en charge des cancers colorectaux), pourrait s'avérer infructeuse dans le cadre d'une neuropathie induite par la vincristine (un agent anticancéreux stabilisateur des microtubulues, principalement indiqué dans la prise en charge des leucémie lymphobloïde aiguë). Les "antibody drug conjugate" (ADC) associés à la monométhyle auristatine E sont de plus en plus nombreux sur le marché. Bien que la plupart des effets indésirables sytémiques associés aux chimiothérapies soient moindre avec les ADC-MMAE, ceux-ci induisent très fréquemment des neuropathies périphériques. Ce nouveau modèle de neuropathie induite par la MMAE serait un outil pertinent pour comprendre les mécanismes pathophysiologiques de ces neuropathies et pour la mise en évidence future de molécules neuroprotectrices. La découverte d'un stratégie thérapeutique efficace à l'aide de ce modèle, permettrait une translation chez l'Homme plus rapide et pour la prise en charge de neuropathies induites par plusieurs ADC (example: le polatuzumab-vedotin (lymphome diffus à grandes cellules B), le brentuximab-vedotin (lymphome de Hodgkin), le tisotumab-vedotin (cancer du col de l'utérus), le sofituzumab-vedotin (cancer urothélial) ).
Procédures
Chaque animal (soit 40 animaux) recevra une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 semaines, et sera également soumis une fois par semaine pendant 7 semaines aux tests comportementaux suivants; le test de la plaque chaude pour évaluer la réponse à la chaleur, le test des filaments de von Frey pour évaluer la sensibilité tactile, le test du rotarod pour évaluer la coordination motrice et le grip-test pour évaluer la force musculaire. L'injection intrapéritonéale a été privilégiée par rapport à l'injection sous-cutanée et l'injection intra-veineuse. En sous-cutané, la MMAE peut comme de nombreux agents de chimiothérapie créer des lésions cutanées. Les injections seront répétées tous les deux jours pendant 7 semaines, ainsi la répétition des injections sera plus aisée en intrapéritonéal qu'en intraveineux. La pose d'un cathéter a été exclu afin de garantir une liberté de mouvement totale à l'animal nécessaire pour les tests comportementaux.
Impact sur les animaux
Les neuropathies périphériques induites par les ADC-MMAE se traduisent chez l'Homme par des troubles de la sensibilité, des douleurs neuropathiques ou des faiblesses. La MMAE est un agent ciblant les microtubules, tout comme la vincristine et le paclitaxel, deux agents anticancéreux "traditionnel". Nous avons dévellopé et caractérisé deux modèles de neuropathie induite par la vincristine et le paclitaxel. Dans ces modèles, nous observons l’apparition d’une allodynie mécanique suite à l’administration de vincristine. Cette allodynie se traduit par une hypersensibilité en réponse à un stimulus focalisé qui est l’application d’un filament de von Frey sur la voute plantaire. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluée). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu de la vincristine et du paclitaxel présentent un comportement tout à fait similaire aux animaux témoins. Ils ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. Ainsi, nous nous attendons à ce que les animaux recevant la MMAE présentent des symptômes similaires; ie. un hypersensibilité en réponse à un stimulus tactile provoqué, sans troubles moteurs associés.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, les éventuelles altérations morphologiques associées à la MMAE seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique des ganglions spinaux, du nerf sciatique et de l’innervation de la peau. Les prélèvements de GS, de nerfs sciatiques et de peau seront réalisés juste après la mise à mort. La mort sera donnée par dislocation cervicale après une anesthésie par inhalation d'isoflurane. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus du système nerveux sensitif seront prélèvés sur chaque animal (nerf sciatique, peau es pattes, ganglion rachidien dorsaux)
Remplacement
Il n'existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l'expérimentation animale disponible qui reproduit l'ensemble des mécanismes mis en jeu à la génération d'une douleur induite par des cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle dont la séquence d'injection des agents anti-cancéreux est la plus conforme aux protocoles de chimiothérapies neurotoxiques utilisés chez l'Homme. En parallèle de cette étude chez la souris, une étude in vitro évaluant l'effet de la MMAE seule ou conjuguée (brentuximab-vedotin) sur des neurones sensoriels humains dérivés d'iPSc (induced-pluripotents stem cells) est en cours. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, ...) mise en jeu en niveau du neurone sensitif humain, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation inhérents aux neuropathies induites par la chimiothérapie, ainsi que toute la complexité des phénomènes aboutissant à la sensation douloureuse.
Réduction
Le nombre de 10 animaux par groupe a été calculé à partir de résultats (moyenne et écart-type) obtenus au cours d'une étude sur le modèle de neuropathie induite par la vincristine (un agent ciblant les microtubules, comme la MMAE) (Bessaguet, et al., 2018). Les résultats générés par les animaux du groupe MMAE de l'étude pilote (n = 5) pourront être utilisés pour l'analyse statistique de l'étude principale et ainsi permettre de réduire le nombre d'animaux du groupe MMAE de l'étude principale (de n = 10 à n= 5). Si les valeurs obtenues suivent la loi normale, nous utiliserons des tests statistiques paramétriques (ANOVA à deux facteurs, ANOVA, test t de Student). A l'inverse, si les valeurs ne sont pas distribuées normalement, nous utiliserons des tests non-paramétriques (Scheirer-Ray-Hare, Kruskal-Wallis et Mann et Whitney). L'analyse statistique sera réalisée à l'aide de deux logiciels; les logiciels R studio et Graph Pad Prism. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements (peau, nerf et ganglions rachidiens dorsaux) seront effectués sur chaque animal mort (dislocation cervicale après anesthésie par inhalation d’isoflurane 3 %) avant qu'il soit placé dans le congélateur des cadavres.
Raffinement
Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet de la MMAE à différentes doses (20, 50 et 100 µg/kg) sur l’état général des animaux et le développment d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide de tests comportementaux. En fonction des résultats, cette étude pilote sera renouvelée avec des doses deux fois inférieures. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de cette étude pilote, alors nous procèderons à l’étude principale. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seuls des test d'évitements seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la MMAE doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux Ctrl pour pouvoir particper à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.
Choix des espèces
Des modèles murins de NPICs ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique. Ces conditions sont les mieux réunies avec des adultes jeunes (7-8 semaines, poids 25-30g).