Système nerveux
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Analyse immunohistochimique de l’activation cellulaire dans le système trigéminal dans un modèle de migraine chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
112 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'un composé déclenchant la migraine, puis des stimulations cutanées mécaniques ou électriques sous anesthésie générale irréversible, pour mesurer l'activité de protéines dans le système trigéminal. Le porteur indique que la douleur provoquée constitue l'objet même du projet et qu'aucun antalgique ne peut donc être administré. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et juge l'étude in vivo "nécessaire" parce que l'intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux.
Objectifs
Le but de ce travail est de mesurer sur tissu (coupe d'encéphale), via une approche immunohistochimique, les variations d'expression des différentes protéines, notamment des marqueurs d'activité neuronale/cellulaire, induites par l'injection unique ou répétée d’ISDN, avec ou sans traitement préventif (SNC80), afin de mettre en evidence le rôle du recepteur delta opioide dans le traitement de la migraine. Nous profiterons de cette éxpérience pour valider un nouvel appareil de stimulation électrique, acquis très récemment, et qui doit remplacer la procédure de stimulation manuelle. L’avantage de cet appareil est l’automatisation ce qui nous permets de raffiner notre procédure (moins d’erreur humaine, meilleure reproductibilité, réduction des animaux)
Bénéfices attendus
Nous validons le paramettrage du nouveau stimulateur et nous connaitrons l’effet de la condition de migraine aigu et chronique sur l’activité au niveau du système trigeminal et la possible prevention de cet effet par d’un agoniste DOP
Procédures
Les interventions prévus dans ce projet sont des injections s.c. et i.p sur des animaux vigiles. Chaque animal reçoit au maximum 1 injection s.c. (durée d'intervention: 1min) et entre 2 à 6 injections i.p. (durée d'intervention: 1min, 1 injection / jour). Réalisation des stimulations cutanées sous anesthésie générale irréversible.
Impact sur les animaux
La douleur provoquée constitue la mesure et l'objet de ce projet, aucun antalgique ne peut donc être utilisé. L'allodynie ne se traduit pas par une fuite ou une agressivité lors de la manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort .
Remplacement
Il n’y a pas de méthode alternative permettant de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique.
Réduction
Le nombre de groupes de rats et le nombre de rats par groupe sera réduit au maximum tout en préservant une puissance statistique significative. Le nombre de rats par groupe a été fixé à 6/8 en tenant compte du fait, qu’en moyenne et d'après les études précédentes, le groupe ISDN est un peu plus variable par rapport au groupe saline. Les résultats obtenus chez les groupes saline permettront d’une part de valider l’utilisation du stimulateur électrique au sein du laboratoire et d’autre part serviront de contrôles négatifs (témoin) pour comparer aux résultats obtenus avec le groupe ISDN. Nous avons choisis comme groupe temoin de l'effet de l'agoniste SNC810 le worst-case (injections repetée de saline).
Raffinement
Dans le respect du "R "de Raffiner, il est à noter que nos animaux sont sous anesthésie générale lors des stimulations mécanique ou électrique. Concernant la période avant anesthésie, les animaux sont hébergés dans des cages standards bénéficiant d'un enrichissement social et environnemental adapté avec visites quotidiennes. L'expérience du présent modèle de migraine montre que les animaux ne présentent jamais de problème liés aux injections et au développement de l'allodynie mécanique qui pourraient altérer leurs besoins physiologiques et bien être (motricité, postures, reactions aux stimuli lors de la manipulation...). Les manipulateurs sont experimentés pour executer les procedures decrits dans le present projet.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. Rats adultes (6-8 semaines) par raport à la prevalence de pathologie en étude (la migraine).
Rôle du transporteur PMAT (Plasma membrane MonoAmine Transporter) dans le cerveau dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection d'un virus et implantation d'une fibre optique, puis des enregistrements en champ ouvert après administration de cocaïne pendant cinq jours, avant leur mise à mort pour analyses post-mortem, pour étudier le rôle du transporteur PMAT dans les effets de la cocaïne. Le porteur indique que la chirurgie peut causer un œdème et une douleur post-opératoire, prises en charge sous anesthésie et analgésie. Il affirme que les effets des drogues d'abus se produisent à l'échelle de l'"organisme entier" et ne peuvent être évalués que sur l'animal entier.
Objectifs
Les transporteurs de recapture des neurotransmetteurs exercent un contrôle étroit de la transmission synaptique dans le cerveau en assurant l'élimination des transmetteurs libérés dans la fente synaptique et leur recyclage dans les terminaisons des neurones. A ce titre, ils interviennent dans des processus importants pour les comportements liés à l’humeur et certaines maladies psychiatriques, comme la dépression et l’addiction. PMAT (Plasma Membrane monoAmine Transporter) est un transporteur atypique, dont le rôle dans le cerveau est encore mal connu. In vitro, il transporte préférentiellement la dopamine et la sérotonine. Il est exprimé dans le cerveau des humains et des rongeurs dans diverses régions et divers catégories de neurones, tels que des neurones glutamatergiques, GABAergiques et cholinergiques. Il module des comportements reflétant le niveau d'anxiété, l'activité locomotrice et les effets des drogues d'abus. Des anomalies importantes des taux des neurotransmetteurs aminergiques dans le cerveau ont été mises en évidence dans plusieurs régions cérébrales chez les souris mutantes pour le gène correspondant. Le projet présenté ici vise à préciser le rôle de ce transporteur dans l'activité de certains circuits cérébraux à l'aide d'une technique de photométrie par fibre.
Bénéfices attendus
Les addictions sont des désordres psychiatriques caractérisés par la dépendance physique et/ou psychologique à une substance ou une activité, avec des répercussions délétères sur l’individu. Les informations récoltées par ces expériences précliniques devraient clarifier le rôle d’un transporteur peu connu, PMAT (Plasma membrane monoAmine Transporter), dans les effets d’une drogue d'abus, la cocaïne. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour décrypter les conséquences fonctionnelles de cette drogue sur des circuits neuronaux intacts. Les modèles de souris invalidées pour certains gènes (tels que PMAT ici) permettent également d’étudier la fonction de ceux-ci in vivo chez l’animal, une approche irremplaçable pour aborder des comportements complexes. Les approches utilisées dans le projet permettent d’étudier les mécanismes et circuits cérébraux dans un contexte intégré, et rester le plus proche possible des conditions d’administration de ces drogues chez l’homme. Ces résultats obtenus grâce aux animaux sont complémentaires de ceux obtenus chez les humains, auxquels ils sont confrontés et comparés. Ces connaissances pourront permettront d’approfondir les mécanismes qui sous-tendent les processus addictifs, afin d’élaborer à terme des thérapies plus efficaces pour traiter ces troubles psychiatriques. Ces travaux sont originaux et les expériences ne sont pas réalisées par d'autres laboratoires.
Procédures
Toutes les souris subiront 3 étapes séquentielles: 1- Une chirurgie stéréotaxique (classe modérée; durée 30-40 min). 2- Des enregistrements par fibre optique dans un champ ouvert, à l'état basal ou après administration de cocaine (classe légère; durée 1h30 min par session sur 5 jours consécutifs). 3- Une euthanasie, afin de valider les expériences (classe sans réveil; durée 20 min). La chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. L'administration par injection intra-péritonéale de cocaïne ou de saline n'engendre pas d'effets secondaires et n'altère pas les poids des animaux. Les souris sont surveillées pendant toute la procédure. L’effet hyperlocomoteur de la cocaïne est très rapide et dure 20 min. La cocaïne n’est pas associée à des effets secondaires indésirables notables. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Nous n'envisageons pas d'autres nuisances possibles lors des expériences proposées.
Devenir
A la fin de la procédure tous les 80 animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements et analyses post-mortem nécessaires au projet (immunofluorescence et analyse anatomique).
Remplacement
De manière générale, les effets à court ou long terme des drogues d’abus se produisent à l’échelle de l’organisme entier et donc ne peuvent être évalués de manière définitive qu’in vivo, sur l’animal entier. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour décrypter les conséquences fonctionnelles de ces drogues sur des circuits neuronaux intacts. Les modèles de souris mutées pour des transporteurs de neurotransmetteurs permettent également d’étudier la fonction de ceux-ci in vivo chez l’animal, une approche irremplaçable pour aborder des comportements complexes. Cette approche permet d’étudier les mécanismes et circuits cérébraux dans un contexte intégré, et rester le plus proche possible des conditions d’administration de ces drogues chez l’homme. Ces aspects intégrés ne sont pas reproduits dans des modèles de substitution, comme des cellules en culture, et il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. Ces résultats obtenus grâce aux animaux sont complémentaires de ceux obtenus chez les humains, auxquels ils sont confrontés et comparés.
Réduction
Afin d’en limiter le nombre, tous les animaux (80 en tout) sont soumis aux enregistrements en photométrie par fibre, puis ces mêmes animaux en bonne santé sont euthanasiés en vue des études anatomiques ou immunohistochimiques. Des groupes de 10 minimum doivent être utilisés afin d’obtenir des résultats statistiquement concluants sur les effets biologiques. La taille de ces effectifs est déterminée sur la base des études antérieures et de calculs de sensibilité.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les procédures sont optimisées pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique et l’implantation de la fibre optique sont réalisées simultanément sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris (4 par cage) sont hébergées dans une animalerie de stabulation ventilée (température 19-21 degrés C, cycle jour-nuit 12h-12h) avec accès à l’eau et croquettes ad libitum, et la litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Les animaux d’origine extérieure sont acclimatés pendant au moins une semaine avant le début des procédures. Nous travaillons en étroit lien avec l’équipe vétérinaire pour s’assurer que l’animal ne souffre pas face à une gêne, une détresse, une douleur ou une blessure. Si un animal est en souffrance, il est rapidement euthanasié.
Choix des espèces
L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine, et son système nerveux présente de multiples analogies avec celui des humains. Ceci nous permet d’identifier des processus transposables en physiologie humaine et médecine, y compris en ce qui concerne les mécanismes qui sous-tendent l'addiction. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé, avec une histoire fournie d’études pharmacologiques et comportementales en rapport avec l’addiction, ce qui permet de construire des hypothèses valides et pertinentes. Enfin, l'utilisation de la souris comme modèle autorise l'application de techniques moléculaires sophistiquées très informatives, telles celles mises en oeuvre dans ce projet (recombinaison homologue, transfert de gènes au moyen de virus), permettant d’aborder la fonction des gènes de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (âge entre 10 et 20 semaines). Il s’agit du stade pertinent pour évaluer l'effet des drogues addictives, les études chez les juvéniles sortant du cadre de ce projet de recherche.
Etude des bases cellulaires de l‘oubli adaptatif chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
54 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils subissent une craniotomie avec implantation d'électrodes intracérébrales sous anesthésie, puis une restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pendant toute une tâche de mémoire spatiale dans un labyrinthe radial, pour étudier les bases cellulaires de l'oubli adaptatif. Le porteur indique que tous les animaux sont mis à mort afin de vérifier l'emplacement des électrodes et de réaliser des marquages histologiques. Sur le remplacement, il affirme que cette tâche d'apprentissage exige l'"animal entier" et conclut qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut s'y substituer.
Objectifs
L’oubli adaptatif est un processus nécessaire à la vie quotidienne permettant d’oublier des informations non pertinente à un moment donné afin qu’elles n’interfèrent pas avec d’autres informations utiles. Cet oubli adaptatif est notamment indispensable au bon fonctionnement d’une mémoire à court terme appelée mémoire de travail que nous utilisons dans la vie quotidienne. Le principal objectif du projet est d’avoir une meilleure compréhension des bases cellulaires de l’oubli adaptatif se mettant en place (ou non) au cours de tâches de mémoire spatiale. Plus particulièrement il s’agira de caractériser les modifications individuelles d’activité de différents types de neurones dans différentes structures connues pour être impliquées dans la mémoire et l’oubli adaptatif. Cette caractérisation nous permettra également de mieux connaître les dynamiques (d’un point de vue localisation et temporalité) de réseaux soutenant la mise en mémoire ou l’oubli adaptatif d’informations spatiales. Un objectif annexe sera d’étudier l’effet particulier de ces mêmes tâches sur les cellules de lieux présentes dans l’hippocampe et de caractériser leurs interactions avec les réseaux évoqués précédemment.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux connaître les bases neuronales nécessaires à la mise en place de l’oubli adaptatif mais également comment les modifications supportant cet oubli évoluent dans le temps et l’espace. Notre hypotèse principale est qu’un mécanisme de dépotentialisation de la transmission entre deux neurones déjà connu (LTD pour long-term depression) serai le support de cet oubli adaptatif et permettrai de faire le « tri » entre les informations pertinentes à conserver en mémoire et celles inutiles qui créeraient des interférences. Or, de récentes études montrer qu’une dérégulation des gènes impliqués dans cette LTD pourrait être associée aux troubles du spectre autistique qui, certes, peuvent dans certains cas « booster » les capacités de mémorisation (diminution de l’oubli « normal »), mais aussi profondément perturber le comportement d’un individu. Déterminer les mécanismes moléculaires de cette LTD qui sous-tendrait l’oubli adaptatif et la gestion efficace des interférences en mémoire de travail parait donc aujourd’hui tout aussi essentiel que comprendre ceux régissant la consolidation des informations en mémoire à long terme. L’étude de ces mécanismes pourraient nous permettre à long terme de mieux comprendre et donc éventuellement traiter des pathologies liées à la perturbation de la transmission neuronale.
Procédures
Les principales interventions sur les animaux sont les suivantes : - Une chirurgie d’implantation d’électrodes, impliquant une craniotomie, réalisée sous anesthésie (1 chirurgie/animal, environ 4h prévues pour chaque intervention) - Une restriction alimentaire aboutissant à un maintien des animaux à 90% de leur poids normal au meme age. Cette restriction alimentaire est maintenue tout au long du protocole sauf en pré- et post-chirurgie. - La passation dans une tâche comportementale dans un labyrinthe radial. En phase d’habituation les animaux effectueront 1 session d’environ 1h/jour (le nombre de jours d’habituation varie en fonction de l’animal, entre 12 et 15). En phase de test, les animaux effectueront 1 session de 3h environ/jour x2 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie pour implanter des électrodes au sein des structures visées : gyrus denté, CA1 et cortex pariétal pour l’enregistrement et voie perforante et cortex cingulaire pour les stimulations, ainsi qu’une électrodes d‘electroencephalogramme et une d’electromyogramme en controlatéral. Les autres effets indésirables attendus sur les animaux découlent principalement de la restriction alimentaire qu’ils subiront tout le long de la procédure comportementale : les rats seront maintenus à 90% de leur poids durant la totalité de la procédure. Durant cette même procédure les animaux seront manipulés quotidiennement par l'expérimentateur. Le stress que cela pourrait générer sera toutefois minimisé par une habituation longue et adaptée selon les besoins de chaque animal. Pour des raisons de sécurité dues à la présence des électrodes et la restriction alimentaire, les animaux seront hébergés individuellement.
Devenir
Tous les animaux de cette étude seront mis a mort à l'issue du protocole. En effet des vérifications histologiques d’implantation des électrodes devront être effectuées avant de pouvoir inclure les enregistrements issus d’un animal dans nos données. Des marquages immunohistochimiques seront réalisés pour réaliser une comparaison avec de précédents résultats de l’équipe et pouvoir valider ce nouveau protocole.
Remplacement
La nature même de l’expérience ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elle repose sur une tâche d'apprentissage complexe que les animaux effectuent et ne peut donc pas être réalisée à partir de modèles in vitro ou in silico car nécessitant l’animal entier comme modèle expérimental. Par ailleurs, du fait du caractère invasif de la procédure (implantation d'électrodes intra-cérebrales), cette procédure ne peut pas non plus être conduite chez l'humain. On ne peut donc envisager pour l'instant une méthode alternative de modélisation qui ne nécessiterait pas l'utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum (n = 6 pour chaque groupe, soit 18 animaux). Le protocole utilisé étant nouveau., il sera nécessaire de refaire passer des animaux uniquement en comportement pour vérifier que le changement de paradigme ne modifie pas les résultats comportementaux attendus (n = 10 pour chaque groupe, soit 30 animaux). Ce nombre d’animaux est nécessaire car nous allons étudier différents apprentissages comportementaux ainsi que leur contrôles et de par la nature des tâches, un rat ne peut en effectuer plusieurs (les phénomènes de sur-apprentissage biaisant les performances comportementales). A ce nombre minimum s’ajoutent 6 animaux afin de prendre en compte les risques de mortalité liés aux chirurgies et à la perte des électrodes. Notre étude nécessitera donc 54 animaux au total (3 groupes de 6 animaux par groupe + 6 pour prendre en compte les risques de mortalité (chirurgie, implant, etc) + 3x10 pour un groupe de rats validant notre protocole comportemental). L’utilisation de microdescendeurs à haute densité permet de réduire le nombre d’animaux en permettant d’enregistrer plus de neurones et plus longtemps. Le fait d’étudier différentes structures chez un même animal et le fait que chaque animal sera son propre contrôle par rapport aux effets de l’habituation permet également de réduire le nombre de rats nécessaire à ce projet.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en binômes avant la mise en place de la restriction alimentaire. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés, toujours individuellement dans des cages rehaussées (+13cm) afin qu’ils puissent se déplacer sans que l'implant n’entrave leurs mouvements. Pour pallier au maximum à l’hébergement individuel, une fois l’isolement nécessaire les anciens binômes seront hébergés côte à côte dans des cages transparentes et ouvertes où ils pourront se voir, se sentir et communiquer. Chirurgie : durant la procédure chirurgicale l'anesthésie générale profonde sera assurée par l'association d'un agent volatil (isoflurane) et d'un dérivé morphinique (buprénorphine). La buprénorphine agira également comme un analgésique puissant pendant 6h après l'injection, couvrant donc la totalité de la durée de la chirugie et sera également associée à un AINS longue durée (carprophène, 24h d'action) et un analgésique local (lidocaïne) assurant ainsi une couverture analgésique optimale pendant la chirurgie. Durant la phase post-chirurgicale, l'animal aura accès à un complément alimentaire riche en eau et en nutriments (hydrogel) en plus de sa nourriture standard ad libitum pour faciliter sa rémission. Le suivi de l'état de l'animal dans la phase post-chirurgicale sera fait deux fois par jour durant toute la période de rémission (5 à 10 jours) et visera à évaluer le niveau de douleur et/ou de détresse du rat. Une prise en charge analgésique sera mise en place si nécessaire. Le degré sera adapté à l'état de l'animal pour faire disparaître toute manifestation de douleur ou de détresse. Nous mettons aussi en place des points limites stricts et spécifiques au projet pour evaluer toute détresse et y pallier. Tâches comportementales : la restriction alimentaire nécessaire à l’induction de la motivation dans notre tâche d’apprentissage ainsi que ses conséquences seront hautement contrôlées (de précédentes expériences de l’équipe montrent que la perte de poids modérée (maximum 10% de leur poids initial) est bien supportée par les rats). La procédure comportementale sera précédée d’une période d’habituation à l’expérimentateur, à la pièce et au matériel d’expérimentation, dans le but de faire disparaître tout stress lié à la manipulation des animaux ou l’agencement du labyrinthe. La durée de cette période d’habituation sera adaptée aux besoins de chaque animal.
Choix des espèces
Ce protocole nécessite un apprentissage de paradigmes comportementaux. Le rat est donc préféré à la souris quand cela est possible puisqu’il est moins facilement stressé et possède un répertoire comportemental plus riche. Il existe notamment une large littérature traitant des bonnes performances des rats dans des tâches d’orientation spatiale et de planification. La souche Dark Agouti possède une bonne vision ce qui est nécessaire pour nos tâches d'orientation spatiale dans un labyrinthe. Cette souche est également peu agressive et facilement manipulable. Les rats de souche Dark Agouti sont de plus consanguins ce qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle. Les animaux auront 10 semaines lors de leur réception et de leur intégration dans le protocole, ce qui correspond à de jeunes adultes ayant atteint leur maturité cérébrale et étant à leur pic de capacités cognitives, qui resteront inchangées tout au long de l’expérience.
Effet de l’exposition prénatale de nicotine et de cocaïne sur le développement spinal embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes sont exposées à la nicotine dans l'eau de boisson ou à la cocaïne par injection pendant la gestation, ce qui peut entraîner un défaut d'alimentation ou une anorexie, avant d'être tuées pour prélever les embryons. Le porteur étudie l'effet de ces expositions prénatales sur le développement de la moelle épinière et les troubles moteurs observés chez l'enfant. Il affirme que les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier cette exposition prénatale et qu'un modèle mammifère est "nécessaire".
Objectifs
La consommation de nicotine ou de cocaïne chez la femme enceinte conduit à des troubles moteurs chez l'enfant. La nicotine et la cocaïne traversent la barrière placentaire et engendrent des anomalies du développement du système nerveux, à l’origine des troubles moteurs observés chez l’enfant, mais qui restent encore aujourd'hui très mal connus. De nombreuses études effectuées chez la souris montrent que l'activation des récepteurs nicotiniques (AChR) par l’acétylcholine (ACh) de l’embryon est nécessaire au développement correct des réseaux moteurs de la moelle épinière et plus particulièrement au développement des neurones spinaux (migration, synaptogenèse, développement des propriétés électrophysiologiques). Il a été montré par ailleurs que la cocaïne pouvait agir directement sur les AChR en les inhibant. Nous faisons ici l’hypothèse que la nicotine en activant de façon anormale les AChR et la cocaïne en les inhibant, engendre des erreurs de développement dans les réseaux spinaux qui seraient à l’origine des troubles moteurs observés après la naissance. Pour tester ces hypothèses, nous utiliserons un protocole d'exposition prénatale à la nicotine et à la cocaïne de souris transgéniques gestantes permettant de localiser et étudier le développement de certains neurones spinaux impliqués dans la locomotion. Nous analyserons les effets de l'exposition prénatale de nicotine et de cocaïne à deux stades du développement au 12ème et au 14éme jour embryonnaire. Ces deux périodes de traitement doivent nous permettre d'analyser les effets de l'exposition prénatale aux toxines sur la migration et la synaptogenèse des neurones spinaux. Des enregistrements électrophysiologiques et des techniques d'immunohistochimie seront utilisés pour analyser l'activité et le développement des neurones spinaux chez les embryons exposés, comparés à des groupes contrôles. Notre projet doit permettre de mettre en lumière les mécanismes cellulaires du développement spinal à l'origine des altérations motrices dues à l'exposition à la nicotine et à la cocaïne pendant la grossesse.
Bénéfices attendus
Nos travaux doivent permettre de mieux connaitre et mieux comprendre les effets délétères de la nicotine et de la cocaïne sur le développement du foetus et à terme permettre d'adapter et d'améliorer la prise en charge des enfants exposés à ces drogues.
Procédures
Des groupes de souris gestantes seront exposés à la nicotine. Des groupes seront traités avec la nicotine pendant la gestation jusqu'au 12ème ou jusqu'au 14ème jour embryonnaire. La nicotine sera administrèe par l'eau de boisson (200microgramme/L + 1 pour cent saccharine). La quantité de boisson qui sera bue par chacun des animaux sera monitorée. En parallèle un groupe de souris gestantes "contrôle" n'aura pas de nicotine dans l'eau de boisson (1 pour cent saccharine). Des groupes de souris gestantes seront exposés à la cocaïne. Des groupes seront traités avec de la cocaïne pendant 4 ou 6 jours pendant la gestation entre le 9ème et le 12ème jour ou entre 9ème et le 14ème jour de gestation. La cocaïne sera administrèe par injection sous-cutanée (40 mg/Kg/jour dans un liquide physiologique 0.9 pour cent NaCl). En parallèle un groupe de souris gestantes "contrôle" recevra des injections quotidiennes sans cocaïne (liquide physiologique 0.9 pour cent NaCl). 384 animaux au total suivront l'ensemble de ces procédures.
Impact sur les animaux
L'administration chronique de nicotine dans l'eau de boisson peut entrainer un défaut d'alimentation et de prise d'eau. L'administration chronique de cocaïne peut entrainer des anorexies. Le niveau d'eau dans les biberons sera surveillé afin de détecter un éventuel défaut de prise d'eau. Dans le cas d'un risque de déshydratation, le traitement sera interrompu. La prise de poids des femelles gestantes sera surveillée. En cas de perte de poids anormale, un régime spécifique, déjà utilisé pour d'autres études de ce type, sera donné aux animaux (BioServ #F1258SP).
Devenir
Les femelles gestantes sont euthanasiées avant le prélèvement des embryons.
Remplacement
Des simulations informatiques seront réalisées afin de remplacer/compléter certaines expériences. Cela permet de réduire le nombre d'animaux utilisés pour certaines étapes du projet. Des modèles de culture de neurones spinaux existent et permettent de tester les effets de la nicotine ou de la cocaïne sur les récepteurs nicotiniques. Cependant ces modèles in vitro restent complémentaires aux approchent in vivo car ils ne permettent pas d'étudier l'exposition prénatale de ces molécules sur le développement de l'embryon.
Réduction
Plusieurs expériences seront menées sur une même portée. Notre projet est basé sur des méthodes variées qui permettent d'utiliser au maximum tous les embryons d'une même portée. Cela permettra de réduire le nombre de femelles gestantes utilisées. Des tests statistiques seront réalisés afin de vérifier les effets de la nicotine et de la cocaïne sur l'activité et le développement des neurones des moelles épinières embryonnaires. Nous prévoyons des portées de 8 à 12 embryons en moyenne provenant de 6 portées différentes par condition expérimentale afin que des tests non-paramétriques fiables puissent être effectués (Test Mann et Whitney ou Wilcoxon). Les mâles utilisés comme reproducteurs pourront être proposés pour d’autres études lorsque ceci est possible.
Raffinement
Les souris seront élevées avec un enrichissement et en cages collectives. Les mâles ne seront isolés que pendant la période de reproduction et les femelles isolées uniquement pendant la période de gestation. Seuls des personnels qualifiés contrôleront les points limites généraux et pourront euthanasier les animaux en cas de nécessité. Toute anomalie ou souffrance évidente sera signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites ci-dessous : - perte de poids supérieure à 20 pour cent sur 3 jours - automutilation - développement de plaies ou d'infections - poil mal entretenu ou aspect général anormal - changement de comportement (particulièrement la prostration) - activité cardio-respiratoire ralentie ou accélérée - En cas de blessure, les plaies seront nettoyées et désinfectées au diaseptyl. - En cas de perte de poids, l'animal peut être réhydraté si besoin par injection IP ou sous-cutané de saline (10ml/kg) ou saline-glucose (v/v, 10ml/kg). On peut également déposer des miettes humides issues de la nourriture habituelle directement dans la cage. - En cas de douleur évidente une injection sous-cutanée de Métacam est réalisée (5 à 10 mg/kg), renouvelée 1 fois par jour pendant 3 jours maximum. - En cas de non amélioration, le responsable du projet sera averti et prendra la décision si nécessaire de mise à mort de l'animal par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Ce projet a pour but d'analyser les effets de certaines drogues sur le développement in utéro de la moelle épinière. L'utilisation d'un modèle de mammifère est ainsi nécessaire dans ce projet. Le choix d'un modèle murin a été motivé par la possibilité d'utiliser des lignées transgéniques comme les lignées transgéniques GAD67-eGFP et Hb9-eGFP qui permet de localiser les neurones GABAergiques et les Motoneurones respectivement dans le tissu nerveux.
Choc septique et traitements innovants (B1-bloquants)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 120
1 260 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur provoque un choc septique, avec pour certains une chirurgie avec réveil, puis des enregistrements cardiaques sous anesthésie, les animaux du modèle présentant isolement, faiblesse, perte de poids et baisse de température. Le porteur évalue l'effet de médicaments B1-bloquants sur les fonctions d'organes et la réponse immunitaire pendant le sepsis. Il justifie le recours aux animaux par la complexité d'une pathologie touchant plusieurs organes simultanément.
Objectifs
Le but de ce projet est d’évaluer les effets des B1-bloquants sur les fonctions d'organes et la réponse immunitaire au cours du sepsis à travers l'étude de voies de signalisation ou de mécanismes potentiellement impliqués.
Bénéfices attendus
La septicémie, principale cause d'admission dans les unités de soins intensifs, est caractérisée par une réponse inflammatoire généralisée résultant d’une infection non contrôlée. En dépit de la mise en œuvre des directives internationales, des progrès médicaux constants et des milliards dépensés chaque année, le traitement du sepsis est principalement symptomatique. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité d'un traitement curatif, les B1-bloquants.
Procédures
Tout animaux seront soumis à au moins une injection (Induction du modèle, administration du traitement, ...) ou un prélèvement sanguin. Il est prévu de réaliser une procédure chirurgicale avec réveil sur environ 70 animaux (30 minutes). Les animaux pourront aussi subir des procédures d’enregistrement de paramètres physiologiques sous anesthésie : échocardiographies, électrocardiogrammes et enregistrement de potentiels évoquées moteurs. Tous les prélèvements de tissus seront réalisé sur des animaux préalablement euthanasiés
Impact sur les animaux
Les animaux représentatifs du modèle présentent un changement de comportement (comme l’isolement), un état physique altéré (comme des faiblesses au cours de la marche), des sécrétions (rhinites), ainsi qu’une perte de poids et une diminution de la température.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés dans les 24 heures suivant la création du modèle de sepsis ou son placébo.
Remplacement
L’utilisation d’animaux, dans cette étude, est dictée par la complexité de cette pathologie touchant plusieurs organes simultanément. L’effet ne peut donc être considéré qu’à l’échelle d’un organisme. De plus, il existe une bonne corrélation entre les données obtenues chez les rongeurs (en cas de synergie des résultats des deux modèles étudiés) et l’Homme au cours du sepsis
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, nous nous sommes appuyés sur les travaux antérieurs réalisés au sein du laboratoire, sur une analyse bibliographique poussée de cette pathologie et une optimisation des prélèvements sanguins et des prélèvements tissulaires effectués après euthanasie sur chaque animal
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être animal à travers un suivi régulier des rongeurs et ce afin de déceler tout excès de douleurs. Le bien-être sera mesuré en évaluant les 5 paramètres suivants : i. Comportement; ii. Etat physique; iii. Sécrétions; iv. Poids; v. Température. Tous ces critères sont évalués fréquemment. Si le score dépasse le seuil fixé, les animaux seront euthanasiés. l'admnistration d'analgesique est également prévu.
Choix des espèces
- L’étude du choc septique, à travers l’utilisation de souris comme espèce animale, a fait l’objet de plus de 10 000 publications au cours des 40 dernières années. Une mise en perspective de nos résultats sera donc plus aisée, même si les effets des B1-bloquants, au cours du sepsis, restent, eux, très peu étudiés à ce jour. - Ce modèle a fait l'objet de recherches exhaustives, de sorte que tous les aspects du cycle de vie de l'animal et leurs incidences potentielles sur l'expérimentation sont relativement bien connus. - Un large éventail de techniques sont adaptées aux souris pour étudier différents paramètres et mécanismes, dont celles décrites dans cette saisine. - Une étude analysant les mécanismes physiopathologiques impliqués suite à l’administration de B1 bloquants sera entreprise dans un avenir proche. Cette étude utilisera des souris transgéniques. Une recherche de synergie avec ce projet pourra alors être entreprise. Les souris mâles auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation et seront agés de 6-8 semaines, soit l’âge de leur maturité sexuelle. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois pré pubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu. Les rats mâles auront un poids compris entre 200 et 300g lors de leur utilisation. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois pré pubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu. La grande majorité des animaux (80-90 pourcent) seront des souris. Les rats (10-20 pourcent) ne seront employés que pour les études nécessitant un grand volume de sang et ce afin de réduire le nombre d'animaux total.
Etude des effets d’un anticorps monoclonal bloquant l’interaction de l’activateur tissulaire du plasminogène et du récepteur N-Methyl-D-Aspartate dans un contexte ischémique en synergie avec les traitements thrombolytiques de référence.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par chirurgie, suivi d'une injection intraveineuse, d'une IRM et de plusieurs sessions de tests comportementaux, la chirurgie pouvant entraîner des atteintes motrices et sensorielles comme des tournoiements ou une perte de mouvement. Le porteur teste un anticorps, le Glunomab, et sa forme humanisée pour protéger le cerveau lors de l'ischémie. Il affirme qu'aucun modèle sans animaux ni aucun vertébré moins sensible ou invertébré ne peut remplacer ces procédures.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester l'efficacité d’un anticorps monoclonal murin (Glunomab) dans des modèles d'accidents vasculaires cérébraux. Nous regarderons essentiellement ses effets protecteurs sur les lésions cérébrales, la réponse inflammatoire et la récupération fonctionnelle. Cet anticorps bloque l'interaction de l'activateur tissulaire du plasminogène avec les récepteurs N-Methyl-D-Aspartate. Nous testerons également les formes humanisées (Glunozumab) de cet anticorps.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous allons tester l’efficacité de Glunomab (ainsi que les versions chimérique et humanisée) comme traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques avec ou sans le traitement thrombolytique de référence et sa capacité d’améliorer le devenir fonctionnel. L’AVC, étant la première cause de handicap physique acquis de l’adulte et représente désormais la première cause de mortalité chez la femme dans le monde nécessite une rapide amélioration de l’accessibilité aux traitements de référence en évitant les effets secondaires trop délétères.
Procédures
Les différents types d’interventions sont détaillés par procédure : • Procédure 1 (par animal) : 1 chirurgie + 1 injection intraveineuse (30 minutes) + 1 IRM (10 minutes) • Procédure 2 (par animal) : 1 chirurgie + 1 injection intraveineuse (30 minutes) + IRM (10 minutes) + 4 sessions de tests comportementaux (2 heures) • Procédure 3 (par animal) : 1 chirurgie + 1 injection intraveineuse (30 minutes) + 1 IRM (10 minutes) + 4 sessions de tests comportementaux (2 heures) • Procédure 4 (par animal) : 1 chirurgie + 1 injection intraveineuse (30 minutes) + 1 IRM (10 minutes) + 4 sessions de tests comportementaux (2 heures) • Procédure 5 (par animal) : 1 chirurgie + 1 injection intraveineuse (120 minutes) + 1 IRM (10 minutes) + 4 sessions de tests comportementaux (2 heures) • Procédure 6 (par animal) : 1 mise à mort (5 minutes)
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, les animaux seront surveillés durant deux heures jusqu’à leur réveil complet. Des mesures pré et post-opératoires sont utilisées afin de limiter la douleur directe associée à des injections iv ou ip répétées ou indirecte liée à la conséquence du produit injecté. La chirurgie pourrait avoir comme conséquences de nombreux dommages moteurs et sensoriels sur les animaux de ce protocole (circling, pas de mouvement, peu ou plus de toilettage...). Les injections iv ou ip répétées pourraient, quant à elles, engendrées des inflammations cutanées aux endroits touchés.
Devenir
Tous les animaux (soit 695) seront concernés par la mise à mort en vue de prélévements d'organes et de liquides corporels post-mortem.Tous les échantillons seront répertoriés et stockés à -80C pour une conservation à long terme afin d’optimiser l’utiliser des échantillons prélevés.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'informations. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. En amont de l'expérimentation animale, des méthodes alternatives in vitro existantes répondant au mécanisme d'action de la molécule d'étude ont déjà été employées, nous permettant de justifier le passage de l'in vitro à l'in vivo.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et de la littérature.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. En effet, dès lors que l'animal présentera des plaies externes, de l'Aluspray, un agent cicatrisant, sera appliqué une à deux fois par jour. Egalement, de la Lidocaïne, un agent analgésiant sera appliquée de manière locale dès lors que des signes de douleur physique apparaîtront. Lors des procédures chirurgicales, de la vitamine A sera appliquée sur le globe oculaire de l'animal afin de prévenir de tout asséchement. Si des signes de détresse physique apparaissent, des massages quotidiens seront effectués.
Choix des espèces
Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques et la souris reste l’espèce de choix pour de telles études de plasticité cérébrale. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différente de l’homme. Tous les animaux utilisés de ce projet sont agés de 8 semaines, âge pour equel, les animaux sont considérés comme des "jeunes adultes".
Conséquences des défauts de réparation de l’ADN sur le développement du système immunitaire et système nerveux central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
911 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations dans les voies de réparation de l'ADN, elles subissent des prélèvements sanguins tous les quatre mois pendant un an et développent pour certaines des syndromes tumoraux, celles-ci étant tuées dès l'apparition des tumeurs. Le porteur étudie le rôle de la réparation de l'ADN dans le développement des systèmes immunitaire et nerveux et dans la genèse de cancers comme la leucémie lymphoïde chronique. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative in vitro" pour ces processus de développement.
Objectifs
Les cassures double brin de l’ADN (CDB) sont les lésions génomiques les plus toxiques et font pourtant partie intégrante de processus biologiques au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux. Des mécanismes puissants de réparation de ces lésions ont été conservés au cours de l’évolution afin d’éviter l’instabilité génétique qu’elles peuvent engendrer. La mauvaise réparation des CDB est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme allant de certaines maladies neurodégénératives (Ataxie télangiectasie), aux déficits immunitaires sévères en passant par le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des CDB se traduisent par une létalité embryonnaire tardive consécutive à la mort massive des neurones. Néanmoins, les voies de réparation de l’ADN constituent des cibles thérapeutiques privilégiées pour le développement des traitements anticancer. Notre laboratoire a identifié plusieurs gènes impliqués dans diverses voies de réparation des CDB à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme. Depuis de nombreuses années nous associons ces études issues du patient au développement de modèles animaux d’invalidation génique afin de mieux comprendre la physiopathologie des facteurs identifiés.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet une meilleur compréhension du rôle des mécanismes de réparation de l'ADN au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux central. Ce projet nous aidera également à mieux comprendre comment les défauts de ces mécanismes de réparation participent à la genèse de syndromes tumoraux que l'on rencontre en pathologie humaine, notamment la leucémie lymphoïde chronique.
Procédures
sacrPour évaluer la survenue de leucémie chez les animaux porteurs de mutation dans les voies de réparation de l'ADN, des prélèvements sanguins (une minute sous anesthesie) seront réalisés tous les 4 mois sur une période de 1 an (soit 3 prélèvement par animal) pour l'analyse de l'apparition de cellules pré-leucémiques.
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables que nous anticipons sont le développement de syndromes tumoraux dans certaines situations. Les animaux seront particulièrement suivis pour l'existence de ces tumeurs et euthanasiés dès leur apparition.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures pour prélèvements d'organe et analyse phénotypique
Remplacement
Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont des processus très complexes pour lesquels il n’existe malheureusement pas d’alternative in vitro aux analyses sur animaux entiers pour avoir une vision d’ensemble. Pour certaines études mécanistiques il existe néanmoins la possibilité d’utiliser des lignées cellulaires après immortalisation in vitro des lymphocytes. Nous utiliserons cette approche afin de diminuer le nombre d’animaux dans la mesure du possible.
Réduction
Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité embryonnaire, baisse de viabilité avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Nous calculons le nombre minimal d'animaux nécessaire à l'aide d'outils statistiques.
Raffinement
Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone protégée afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement sacrifiés. Les animaux sont par ailleurs maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social.
Choix des espèces
Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont particulièrement bien étudiés depuis de nombreuses années chez la souris. De nombreuses lignées mutantes existent déjà et peuvent être croisées sur de nouveaux modèles. Le développement de nouvelles technologies permet l’ingénierie de mutations « fines » calquées sur les mutations observées en pathologie humaine. De nombreux réactifs existent pour l’analyse phénotypique des modèles murins. - Pour évaluer le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines) - Pour confirmer un éventuel phénotype dommageable embryonnaire, les embryons seront récupérés à E18, date à partir de laquelle il est possible de réaliser un immunophénotypage - Pour évaluer le phénotype dommageable sur le système immunitaire, les animaux seront sacrifiés à 6-8 semaines, période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel
Les hallucinogènes sérotoninergiques : un nouvel espoir pour traiter la dépression?
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
6 162 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont soumises pendant une à trois semaines à des protocoles de stress destinés à les rendre "anxio-dépressives", puis reçoivent des injections d'hallucinogènes comme le LSD ou la psilocybine, certaines subissant une chirurgie dans le cerveau, avant des tests comportementaux. Le porteur veut déterminer si ces molécules agissent comme antidépresseurs et en comprendre le mécanisme, bénéfice renvoyé à une future application clinique. Il affirme que les méthodes in vitro ne reproduisent pas les réseaux de communication entre cellules et conclut à l'utilité du modèle animal.
Objectifs
L’objectif est de déterminer si les molécules hallucinonèges peuvent être considérés comme des antidepresseurs efficaces après une prise unique administrée à l’âge adulte et de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires de leur mode d’action. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la dépression est la première cause d’incapacité dans le monde. Le nombre de cas a augmenté de 18% en 10 ans dans le monde et les prévisions sur les 10 prochaines années sont inquiétantes. En France, on estime que près d’une personne sur cinq a souffert ou souffrira d’une dépression au cours de sa vie. Les traitements actuellement disponibles pour traiter la dépression (antidépresseurs) présentent de nombreux désavantages : leurs effets ne sont pas immédiats et il faut le plus souvent attendre 3 à 4 semaines avant de ressentir leurs effets bénéfiques, ils induisent des effets secondaires importants et chez 30% des patients ils sont totalement inéfficaces. D’après les récentes études cliniques menées en Angleterre sur de petites cohortes de patients (20 à 30 patients), les hallucinogènes ont un effet rapide, semblent avoir une action prolongée sur plusieurs semaines et sont efficaces pour traiter les patients résistants aux traitements classiques. Ces molécules représentent donc un réel espoir pour traiter toutes les formes de dépressions. Cependant leur mécanisme d’action est à ce jour méconnu. Le projet ci-joint vise à caractériser et comprendre leur mode de fonctionnement mais également à proposer de nouveaux outils moléculaires ayant les mêmes propriétés antidépressives.
Bénéfices attendus
L’objectif est de déterminer si les hallucinogènes comme le LSD ou la psilocybine peuvent être considérés comme des antidepresseurs efficaces après une prise unique administrée à l’âge adulte et de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires de leur mode d’action dans un modèle préclinique de dépression afin d’en promouvoir l’accès en clinique. Ces molécules ont montré des effets trés prometteurs sur une petite cohorte de patients en Angleterre. Les Etats-Unis commencent à mener des études cliniques afin de confirmer ces résultats. Il est essentiel de comprendre les mécanismes d'action des hallucinogènes avant de les utiliser en clinique et permettre le développement de nouveaux outils pharmacologiques présentant une meilleure affinité et spécificité.
Procédures
1) Conditionnement des animaux pour induire un comportemennt anxio-dépressif - durée: 1 à 3 semaines en fonction du protocole qui sera choisi; 2) Injection intrapéritonéale : de 0 à 2 injections aigues juste avant les expérimentations; 3) Chirurgie stéréotaxique: une seule fois sur certains animaux - durée: 20min; 4) Tests comportementaux - durée: plusieurs jours, étalés sur 1 à 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les protocoles de conditionnement utilisés sont des protocoles qui vont stresser les souris afin d’obtenir des souris anxio-dépressives cependant, malgré le caractère stressant des protocoles utilisés, environ 30% des animaux seront résistants et ne développeront pas de comportements anxio-dépressifs suite au conditionnement. Il n'y a pas d'autres alternatives pour obtenir un modèle préclinique de dépression qui reproduise le plus fidèlement possible la pathologie humaine. L’injection du traitement ne nécessitera qu’une seule injection intrapéritonéale, mis à part la gêne occasionnée par la piqure, aucun effet indésirable n’est attendu.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort soit pour des analyses biochimiques, soit pour des analyses immunohistochimiques, soit pour des analyses électrophysiologiques.
Remplacement
Une recherche bibliographique approfondie a été réalisée afin de nous assurer qu’il n’existait aucune approche alternative in vitro qui aurait pu être utilisée pour reproduire les altérations de développement ou de maturation corticale provoquées dans notre modèle d’étude. En effet, les méthodes in vitro essentiellement basées sur les cultures cellulaires, ne permettent pas de maintenir l’intégrité des réseaux cellulaires et ne présentent donc pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour la réalisation de ce projet.
Réduction
La réalisation de différents tests comportementaux sur la même cohorte d’animaux permettra une optimisation de l'utilisation des animaux. Après les analyses comportementales, le projet prévoit diverses analyses post mortem sur un même animal, analyse immunohistochimique et/ou analyse biochimique. Des précautions seront également prises pour éviter les biais expérimentaux comme travailler en aveugle. Un plan d'analyses statistiques sera réalisé afin de vérifier différents paramètres et les résultats expérimentaux obtenus.
Raffinement
Les méthodologies utilisées lors des expérimentations seront adaptées afin de réduire la douleur et la détresse des animaux (après le conditionnement). Ainsi, pendant et après la phase de conditionnement, qui durera 1 à 3 semaines, les animaux seront observés quotidiennement et en cas de suspicion de douleur, une observation plus précise avec une grille d’évaluation de l’état général de chaque animal sera remplie avec identification de points limites et prise en charge adaptée. En fonction de l’état de l’animal, la prise en charge consistera en soit un traitement analgésique, soit une sortie de protocole jusqu’à la mise à mort si nécessaire.
Choix des espèces
Notre projet nécessite l'utilisation de différentes lignées transgéniques afin de comprendre les mécanismes d'action des hallucinogènes en tant qu'antidépresseur. Ces lignées ont toutes étaient générées chez la souris nous utiliserons donc ce modèle animal pour réaliser cette étude. Dans la littérature, le phénotype anxio-dépressif est induit chez des animaux adultes. Les animaux seront donc conditionnés à l'âge adulte soit à partir de J60 puis les expériences seront réalisées 2-3 jours à 4 semaines après la fin du conditionnement en fonction du protocole choisi.
Evaluation de l’effet de la neurostimulation transcrânienne par ultrasons focalisés chez le singe Cynomolgus mâle et femelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
18 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 12 tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau et 6 gardés en vie pour un usage ultérieur. Chaque animal est habitué à la contention, passe une IRM et un scanner sous anesthésie, un test de seuil moteur et de l'imagerie fonctionnelle en état vigile, puis reçoit une neurostimulation cérébrale par ultrasons. Le porteur veut évaluer cette technique chez le singe dans la perspective d'un essai chez l'humain contre des troubles neuropsychiatriques, les résultats obtenus chez les rongeurs étant jugés insuffisants. Il justifie le recours au macaque par sa proximité phylogénétique et l'analogie de ses zones cérébrales avec celles de l'humain.
Objectifs
Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore chez les rongeurs. Dans la continuité de ce projet et en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme. Ce projet permettra de progresser dans la possibilité de transposer cette technique en clinique humaine. Nous aurons ainsi une avancée supplémentaire pour espérer avoir une alternative non-invasive et résolutive pour le traitement des troubles neuropsychiatriques.
Procédures
Habituation à la manipulation et au positionnement à la neurostimulation : 30 min par jour, 2 à 5 fois /semaine. IRM sous anesthésie générale : 1 fois par animal, durée 1h. Scanner X sous anesthésie générale: 1 fois par animal, durée acquisition 10 min. Détermination du seuil moteur sur animal vigile: 1 fois par animal, durée 1h. Imagerie fonctionnelle sous anesthésie générale: 2 fois pour le groupe 1 et 4 fois pour le groupe 2 d'une durée de 80min par imagerie. Neurostimulation sur animal vigile: 1 fois par animal , durée 30 min.
Impact sur les animaux
Les sources de stress sont occasionnées par l’induction anesthésique, l’injection intraveineuse du radiotraceur et le réveil. Le singe est facilement stressé, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage et aux manipulations. D’après nos précèdentes manipulations sur rongeurs, la neurostimulation ne semble pas avoir d’effet indésirable.
Devenir
A l'issue des procédures, 12 animaux seront euthanasiés pour des études histologiques et métabolomiques sur les prélèvements cérébraux, afin d'appréhender les effets cellulaires de la neurostimulation ultrasonore. Les 6 animaux restant seront gardés en vie pour un futur replacement.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé des séquences ultrasonores et un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore chez les rongeurs. Dans la continuité de ce projet et en raison des limitations physiologiques des rongeurs et des contraintes physiologiques liés au crâne et au cerveau humain, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore chez le singe dans la perspective d’un essai clinique chez l’Homme.
Réduction
D’après les groupes expérimentaux que nous souhaitons faire, nous travaillerons sur 9 macaques mâles et 9 macaques femelles. Nous travaillerons sur 7 macaques mâles et 11 macaques femelles. Ces animaux seront répartis en 2 groupes expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en volière avec les congénères pour garder les liens sociaux et en présence d’objets d’enrichissement. Les animaux disposent de plateformes surélevées . l'alimentation couvre les besoins journaliers et est complétée par une distribution de friandises deux fois par jour. Un programme d'enrichissement hébdomadaire est mis en place dans le cadre de leur hébergement ( recherche et diversité de l'alimentation, manipulation d'objets, échelle, musique, tv...) ceci donnant un environnement favorable aux procédures expérimentales. Les animaux seront observés tous les jours. Les procédures expérimentales seront réalisées dans une salle correctement chauffée. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant, un monitoring cardio-pulmonaire sera effectué pendant toute la durée de la manipulation. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Nous avons défini des points limites permettant d’apprécier la douleur, l’inconfort des animaux. Ces points limites seront principalement des signes observables et évaluables par le personnel de zootechnie habilité sur les singes. Nous considérons donc comme point limite toute manifestation de douleur : perte de poids et locomotion réduite, prostration du PNH, déshydradation, état des muqueuses et des selles et l'apparence générale du pelage. Chaque jour, le personnel de zootechnie veillera à l’apparence physique des animaux et aux interactions sociales. Les animaux seront pesés à réception puis avant chaque procédure. En présence de l'un de ces signes, des mesures préventives seront prises, médication en concertation avec le vétérinaire référent et/ou apports alimentaires alternatifs. Pour limiter le stress des animaux, nous ferons une habituation à la manipulation. Dans un premier temps, nous habituerons les animaux à recevoir des récompenses (friandises) après avoir effectué des tâches simples, toucher un objet sans bouger pour coopérer avec l'animal et instaurer une relation de confiance entre l'animal et l'expérimentateur. Puis dans un deuxième temps, ils seront habitués à être installé en salle de manipulation pour éviter tout stress lié à l'environnement de la salle. Les macaques recevront des friandises à la suite.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce se justifie (1) par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et (2) par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques pubères seront utilisés pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubère ayant un âge supérieur à 3 ans et un poids inférieur à 5 kg.
Evaluation de l’imagerie multiparamétrique et spectroscopique pour localiser la zone épileptogène
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
325 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans l'hippocampe pour déclencher une épilepsie, l'implantation d'une pompe sous anesthésie, jusqu'à quatre séances d'IRM et huit jours de médicaments, avant l'analyse de leur cerveau et de leur sang. Le porteur cherche à mieux localiser par imagerie la zone du cerveau à retirer chez les patients épileptiques opérés, les retombées cliniques étant renvoyées à une évaluation en préparation. Il indique qu'une recherche bibliographique n'a révélé aucune alternative in vitro et que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la communication entre cellules.
Objectifs
Un tiers des patients épileptiques ne répondent pas correctement aux médicaments antiépileptiques et, parmi eux, 1/4 peuvent bénéficier d'une chirurgie résective. L'identification des zones du cerveau à enlever par chirurgie (la zone épileptogène (ZE)) est un processus difficile. Il nécessite un ensemble d'outils complexes comprenant des examens cliniques, d'imagerie et neurophysiologiques, y compris des enregistrements électroencéphalographiques intracrâniens. Cependant, même en combinant toutes les informations actuellement disponibles, la chirurgie de l'épilepsie ne fonctionne pas correctement chez 20 à 60% des patients. Il est donc nécessaire développer de nouvelles méthodes pour délimiter la ZE. La neuro-imagerie, non invasive et largement disponible dans le contexte clinique, apparaît comme un candidat naturel pour aborder cette question. A terme, l'objectif est d'améliorer la chirurgie chez les patients.
Bénéfices attendus
Les données recueillies dans cette étude nous permettrons de caractériser l'impact de différents médicaments anti-épeliptique sur les mesures IRM (mqMRI et GABA-MRS). Ces informations seront utilisées pour modéliser l'impact attendus des médicaments chez l'homme lors de l'évaluaton clinique qui est en cours de préparation.
Procédures
- Procédures chirurgicales sous anesthésie : i) Injection intra-hipppocampique (induction de l'épilepsie) : durée maximum 1h30. ii) Implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée maximum 30min). Maximum deux procédures / animal. - IRM sous anesthésie : maximum 2h30/session IRM, maximum 4 sessions IRM / animal. - Administration de médicaments : durée de quelques minutes / jours pendant 8 jours.
Impact sur les animaux
i) Douleur modérée au moment de l'induction de l'épilepsie, procédure conduite sous anesthésie, ii) Crises épileptiques pendant la phase d'épileptogenèse iii) Douleur modérée au moment du traitement pharmarcologique iv) Douleur légère au moment de l'examen IRM, procédure conduite sous anesthésie
Devenir
Le tissu cérébral et le sang des animaux utilisés dans ce projet est analysé en fin de projet (sauf pour les animaux utilisés pour l'optimisation des protocoles IRM). Tous les animaux sont mis à mort au court du projet.
Remplacement
Nous avons effectué une recherche approfondie sur Pubmed et Google Scholar afin de nous assurer de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre malformations du développement corticale, crises épileptiques et fonction de la barrière hémato-encéphalique. Nous avons utilisé des combinaisons de mots-clés tels que épilepsie, crise, électroencéphalographie, dysplasie, cerveau, neurone, modèles animaux, in vitro et tests animaux alternatifs. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 15 animaux par groupe sont prévus ainsi que deux groupes pour l'optimisation du modèle animal et de l'imagerie, pour un total de 325 souris sur 5 ans. De plus, nous commencerons ce projet par un groupe préliminaire qui permettra la mise au point du protocole : si cette étude préliminaire révèle que le nombre de rats par groupe est surévalué, nous le réduirons de façon à atteindre un nombre d'animaux nécessaire et suffisant.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Les animaux utilisés pour ce projet sont nés et élevés en Europe. Leur nombre a été réduit au minimum nécessaire afin d’obtenir des données suffisantes pour évaluer l’efficacité de cette stratégie d’imagerie pour définir la zone épileptique en cas de prise de médicaments anti-épileptiques.
Choix des espèces
Notre projet propose l'utilisation de petits animaux in vivo (souris). Les souris ont été choisies à cause de leurs caractéristiques neuro-vasculaires et profils électroencéphalographiques bien étudiés. Ils expriment les mêmes marqueurs neuronaux, gliaux et péricytaires que l'Homme. Ils constituent donc un modèle adapté pour les expériences proposées par notre étude, où l'entité neuro-vasculaire complètement fonctionnelle est requise pour investiguer les effets des malformations corticales et des crises. La littérature fournit des preuves de la fiabilité du monitoring électroencéphalographique in vivo et IRM in vivo pour l'évaluation des modifications pathophysiologiques des tissus. De plus, un fort taux de survie est observé lorsque les rongeurs sont utilisés dans ce type d'étude par rapport à d'autres espèces.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique de la Leriglitazone dans un modèle murin de leucodystrophie métachromatique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour développer une leucodystrophie métachromatique, elles reçoivent la molécule Leriglitazone dans leur nourriture pendant deux à six mois et donnent jusqu'à six prélèvements de sang sous anesthésie. Le projet évalue si ce traitement freine la démyélinisation d'une maladie neurodégénérative mortelle, les bénéfices pour les patients restant au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe et que la souris est la seule espèce chez qui un modèle de cette maladie a été créé.
Objectifs
Nous avons pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule, la Leriglitazone, dans le traitement des patients symptomatiques souffrant de leucodystrophie métachromatique (MLD), maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (isolation de la gaine nerveuse). L’efficacité de la thérapie sera conduite In vivo dans un modèle de souris préclinique de MLD déjà connu.
Bénéfices attendus
À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de leucodystrophie métachromatique (MLD) ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Les patients MLD présentent des troubles sévères cognitifs et moteurs (perte de l’équilibre, trouble de la marche) qui sont un calvaire au quotidien et, dès l’apparition des premiers symptômes, l’état des patients se dégrade de façon fulgurante avec un décès certain dans les 2 ans au maximum. Le traitement à la Leriglitazone dont nous proposons d’évaluer l’efficacité, pourrait au niveau cellulaire diminuer la neuro-inflammations, diminuer les lésions cérébrales et prévenir la démyélinisation. Ces bénéfices pourraient s’accompagner au niveau clinique d’une amélioration des fonctions motrices et cognitives des patients et de ce fait soulager leur lourd quotidien et augmenter leur espérance de vie. Il est à savoir également que contrairement à d’autres traitements en cours d’études (comme la transplantation cellulaire), le traitement à la Leriglitazone est non invasif et facile d’administration car per os.
Procédures
Pour évaluer l’efficacité thérapeutique de l’administration orale de Leriglitazone sur le modèle murin de leucodystrophie métachromatique (MLD), le traitement à la Leriglitazone est administré en continu à partir de l’âge de 6mois (dans les croquettes ad libitum) pendant 2 mois ou 6 mois (2 temps d’analyse) avant l’euthanasie des animaux. Pour suivre en longitudinal les effets du traitement à la Leriglitazone, des prises de sang mensuelles sont effectuées. Le nombre de prise de sang est de 2 à 6 selon le temps d’analyse et groupe étudié (à 6 et 7 mois ; ou à 6,7,8,9,10 et 11 mois). Ces prises de sang sont réalisées sous anesthésie et ne durent que 2 minutes au maximum par animal. Durant toute la durée de l’anesthésie, la souris est placée sur un tapis chauffant afin d’éviter un éventuel début d’hypothermie, dont le risque reste faible aux vues de la durée de l’anesthésie qui est de 2 minutes au maximum.
Impact sur les animaux
Le principal effet indésirable concerne le stress que pourrait engendrer les prises de sang mensuelles sur l’animal. Le traitement à la Leriglitazone devrait améliorer quant à lui le phénotype des souris.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologiques et biochimiques) sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la leucodystrophie métachromatique (MLD). Nous avons donc besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier cette maladie et surtout évaluer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. La prise par voie orale nécessite aussi de tester la voie digestive comme voie d’administration, il faut donc un organisme pour tester ce type de traitement.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façons à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un nombre de 12 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables et adéquats pour analyser nos résultats. Un nombre total de 144 souris (comprenant 2 répétitions des expériences par groupe) sera nécessaire pour ce projet. Nous avons décidé également de ne pas ajouter un groupe contrôle supplémentaire à notre étude car ces données ont déjà été publiées.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress (anesthésie pour les prises de sang, manipulation en amont de la procédure pour une habituation au manipulateur, prise de poids mensuelle). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et d'un enrichissement du milieu à l’aide de carré de coton, lanières de kraft et de maison de type celldom. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et de soins adaptés.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la leucodystrophie métachromatique (MLD) et surtout évaluer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu de MLD qui est génétiquement modifié, dont le phénotype est très proche de ce que l’on retrouve chez les patients. Notre projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de l’administration de Leriglitazone sur notre modèle murin de MLD lorsque les symptômes sont installés, en vue d’une thérapie pour le traitement de patients MLD symptomatiques. Pour cela, les animaux entreront en procédure à 5mois et 2 semaines (pour une acclimatation et habituation au manipulateur) avant le début du traitement qui sera administré à partir 6 mois, âge auquel débutent des premiers symptômes chez la souris. La fin de la procédure aura lieu lorsque les souris auront 8 ou 12 mois afin de déterminer l’effet thérapeutique de la Leriglitazone sur le court et long terme.
Impact du jeûne intermittent sur les épilepsies de type absence chez la souris: modèle pharmacologique
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle pharmacologique d'épilepsie infantile, elles subissent une chirurgie de 45 minutes pour implanter des électrodes d'électroencéphalogramme, restent isolées en cage individuelle et donnent des prélèvements de sang. Le projet teste si le jeûne intermittent réduit les crises et permet de baisser les doses de médicaments antiépileptiques. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux animaux pour évaluer un modèle épileptique.
Objectifs
Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime riche en protéine et gras, et faible en sucres, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 1 modèle pharmacologique d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Ce modèle présente des crises dites "absence atypiques", retrouvées chez des pathologies infantiles graves telle que le syndrome de Dravet ou Lennox-Gastaut. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique, en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications qui accompagnent le régime IF.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que deux prélèvements sanguins. L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement. Les animaux implantés avec des connecteurs pour enregistrement EEG courent le risque de se les arracher mutuellement. Ils sont donc isolés en cage individuelles pour la durée du protocole et seront surveillé deux fois par jour. Ils auront un enrichissement spécifique (sizzle, nid en carton, coton), ils seront en contact visuel et olfactif avec les congénères et seront manipulés régulièrement.
Impact sur les animaux
Le régime du jêune intermittent ou intermittent fasting (IF) a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que le modèle d'épilepsie que nous utilisons n'induit pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui induisent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant , dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille de carton, igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques afin d'intervenir si besoin.
Choix des espèces
L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur le modèle d'épilepsie utilisé.