Système nerveux

36 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie stéréotaxique au cerveau sous anesthésie, puis, vigiles et contenus, une stimulation des vibrisses avec perfusion de substrats marqués et prélèvement sanguin. Le porteur indique que l'anesthésie peut entraîner des troubles cardiorespiratoires, une déshydratation et une infection de la plaie. Il écarte les co-cultures de cellules parce qu'elles "s'affranchissent de la physiologie de l'organisme entier", et rattache l'intérêt du projet à des maladies comme Alzheimer au conditionnel.

Objectifs

Au cours des 20 dernières années des preuves se sont accumulées et montrent que le lactate provenant des astrocytes (cellules de soutien du système nerveux central) servirait de carburant énergétique pour les neurones. Les résultats les plus convaincants ont été obtenus par spectroscopie de résonance magnétique du carbone 13, montrant tout le potentiel de cette méthode pour les études métaboliques. Cependant, la majorité de ces études ont été réalisées soit in vitro, sur des cultures primaires, soit ex vivo sur des extraits de tissu cérébraux ; les résultats de ces études ne reflètent donc pas forcément les processus sur l'organisme entier. Il est désormais possible dans notre laboratoire d'éliminer ces inconvénients grâce à l'utilisation soit de la spectroscopie de résonance magnétique à haute résolution, qui permet d'obtenir directement sur un échantillon tissulaire un spectre de très haute résolution soit de la spectroscopie de résonance magnétique sur l'animal vivant, in vivo. La résonance magnétique nucléaire est une technique non invasive qui permet donc un suivi des animaux. L'objectif du projet est d'étudier in vivo le métabolisme énergétique cérébral de rongeurs, éveillés et stimulés, par spectroscopie de résonance magnétique du proton et du carbone 13 et d'obtenir une réponse claire sur l'utilisation préférentielle du glucose ou du lactate par les neurones lors de l'activation cérébrale. Une analyse ex vivo par spectroscopie à haute résolution permettra d'approfondir les voies métaboliques mises en jeu. Par ces techniques, nous pourrons montrer une préférence des neurones pour la consommation directe de glucose ou de lactate provenant des cellules de soutien du système nerveux, en réponse à la demande énergétique liée à l'activation cérébrale. Ainsi la comparaison des résultats obtenus entre zones activées/non activées pour des rats contrôles et également des rats ne pouvant plus métaboliser le glucose permettra de démontrer les voies métaboliques impliquées lors de l'activation cérébrale. Connaître le carburant énergétique (glucose ou lactate) des neurones, à l'échelle de l'organisme, pourrait permettre de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des maladies où le métabolisme énergétique cérébral est dérégulé (ex : maladie d'Alzheimer).

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes impliqués dans le métabolisme énergétique cérébrale et des interactions cellulaires qui en découlent est cruciale d'un point de vue fondamental, mais pourrait aussi avoir une implication dans la compréhension de certains processus pathologiques dans lesquels ce métabolisme énergétique est dérégulé (hypoxie-ischémie néonatale, AVC, Alzheimer, …).

Procédures

- chirurgie stéréotaxique : insertion d'une aiguille sans injection, puis retrait (témoin). Nombre : 1. Durée : 20 min. - contention, stimulation des vibrisses sur animaux vigiles et perfusion de substrats marqués + prélèvement sanguin (200 ml). Nombre : 1. Durée : 1 h.

Impact sur les animaux

Les modèles de KD utilisés dans ce projet sont bien connus des membres de l’équipe. La modification génétique n’entraîne pas de modifications au niveau pondéral, qualité du poil, appétit des animaux, activité et mobilité. Cependant, l'induction du modèle nécessite une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale à l'isoflurane. Durant la chirurgie, des changements du rythme cardiaque (200-400 bpm) ou du rythme respiratoire (30-60 bpm), mesurés grâce à un capteur placé sous l'animal, peuvent subvenir, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. De même, une anesthésie prolongée peut mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération, la plaie suturée peut s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser.

Devenir

A l'issue de la procédure correspondant à la fin de l'étude, les animaux seront mis à mort. Les stucures cérébrales seront rélevées et analysées.

Remplacement

Des modèles de co-culture (lignées de neurones et d'astrocytes, cellulels de soutien du système nerveux) existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure intégrative : décrypter le métabolisme énergétique cérébral. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de définir quelle est la source énergétique qui permet l’activation neuronale (glucose ou lactate). En effet, l'activité cérébrale est modulée par l'ensemble de l'organisme. Les données scientifiques obtenues à partir de cultutes de cellules ne reflètent donc pas forcément la réalité des processus et des mécanismes mis en jeu chez l'organisme. Il n'existe donc pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Nous utiliserons une technique d’analyse de pointe,spectroscopie de résonance magnétique à haute résolution, qui permet de travailler sur des petites quantités de tissu cérébral et permettent donc de limiter le nombre d’animaux.Pour la partie in vivo, l'utilisation de la résonance magnétique nucléaire qui est une technique non invasive est un atout car elle permet de pouvoir tester plusieurs fois les animaux sans que la procédure ne soit délétère. De plus, nos travaux précédant nous permettent de savoir qu'un nombre minimum de 12 rats par groupe permettra de lisser la variabilité interindividuelle et de mettre en évidence des différences significatives entre les individus dont le transporteur au glucose aura été réprimé et les autres groupes (tests statistiques).

Raffinement

Les modèles modifiés génétiquement utilisés dans ce projet sont bien connus des membres de l’équipe. La modification génétique n’entraîne pas de modifications au niveau pondéral, qualité du poil, appétit des animaux, activité et mobilité. Lors de la chirurgie, les rythmes cardiaques et respiratoires seront monitorés. Du gel oculaire sera appliqué pour éviter toute sècheresse oculaire. La récupération post-opératoire sera réalisée sous lampe chauffante jusqu’au réveil complet des animaux et une réhydratation systématique avec sérum physiologique sera réalisée. Après leur retour en cage collective, les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l’animal à s’alimenter, le comportement et sa vivacité et l’état du pelage seront vérifiés. Les animaux seront pesés 1 fois/semaine afin de détecter les pertes de poids . Un échange quotidien entre le zootechnicien et l’expérimentateur permettra une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée.

Choix des espèces

Le rat Wistar sont utilisés depuis plusieurs années pour les études du métabolisme dans notre laboratoire, ainsi nous disposons déjà de nombreux groupes témoins permettant les comparaisons et limitant ainsi le nombre d’animaux témoins à refaire. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, le métabolisme énergétique cérébral étant différent à des stades plus précoces.

5 940 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie sert à créer des lignées génétiquement modifiées, l'autre subit des variations rapides de température, de salinité, de pH ou d'oxygène, ou la destruction de neurones par un antibiotique. Le porteur indique que ces modifications peuvent altérer la croissance ou la reproduction, et que les reproducteurs sont tués à deux ans quand leurs capacités déclinent. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'étudier un "organisme entier", ce système caudal n'ayant selon lui pas d'équivalent chez les mammifères.

Objectifs

Notre projet est d’étudier les fonctions d’un organe neuroendocrinien situé dans la queue du poisson et appelé système neurosécréteur caudal. Ce système est formé de neurones situés à l’extrémité caudale de la moelle épinière des poissons. Ces cellules produisent différentes hormones qui sont libérées dans la circulation sanguine. Sans doute parce que ce système ne semble pas avoir d’équivalent chez les mammifères, ses fonctions restent très peu connues. Les quelques études disponibles suggèrent une implication dans l’adaptation des poissons aux variations de certains paramètres de leur environnement (température de l’eau, salinité, pH, niveau d’oxygène dissous). Pour notre projet, nous allons utiliser l’organisme modèle poisson-zèbre (Danio rerio). Nos objectifs sont de : 1) Décrire précisément comment ce système est organisé et se met en place au cours du développement du poisson. 2) Déterminer précisément les fonctions de ce système. En particulier, nous allons chercher à identifier quelles hormones sont produites par ce système lorsque le poisson fait face à des variations de son environnement. Puis, nous testerons l’importance de ces hormones dans la réponse physiologique du poisson à ces variations de l’environnement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre le développement et les fonctions du système neurosécréteur caudal, un organe peu connu des poissons. Les quelques données disponibles suggèrent que cet organe est impliqué dans l’adaptation physiologique des poissons aux variations de leur environnement. Les poissons représentent non seulement une part importante de la diversité des vertébrés mais aussi un élément essentiel pour la biodiversité des écosystèmes aquatiques ainsi qu’une source de nourriture importante pour l’humanité. Les changements climatiques liés à l’activité humaine vont impacter particulièrement les environnements aquatiques en affectant notamment la salinité, le pH, l’oxygène et la température et vont impacter l’ensemble des composantes de ces écosystèmes, en particulier les poissons. Nous pensons que mieux comprendre la physiologie de ces animaux, notamment leurs mécanismes d’adaptation à des variations environnementales, sera utile pour comprendre et anticiper l’influence de ces bouleversements climatiques sur ces animaux. Ceci devrait avoir des implications pour définir les stratégies pour la préservation de ces animaux et de ces écosystèmes ainsi que pour l’élevage et l’aquaculture.

Procédures

Quatre types d’interventions sont utilisés dans ce projet : 1. Création de lignée d’animaux génétiquement modifiés. Des œufs sont obtenus par accouplement naturel de poisson-zèbre reproducteurs élevés et maintenus au laboratoire dans une animalerie confinée et agrémentée. Ces œufs sont injectés à l’aide d’une micro-aiguille contenant les éléments permettant l’ajout d’un gène ou l’introduction d’une mutation inactivant un gène). Les animaux issus de ces œufs sont élevés et utilisés comme reproducteurs. 2. Production d’animaux dépourvus de certaines hormones ou du récepteur à ces hormones. Des reproducteurs génétiquement modifiés sont utilisés pour produire des poisson-zèbre dont le gène permettant la production d’une hormone d’intérêt, ou son récepteur, est inactivé et qui sont donc incapables de les produire. 3. Des expériences consistant à faire subir à des poissons des variations d’un paramètre de l’eau (température, salinité, pH ou niveau d’oxygène dissous). Ces variations sont contenues dans des gammes que l’animal peut rencontrer dans son environnement naturel et durent de quelques heures à quelques jours. 4. Suppressions neurones du système neurosécréteur caudal. Des poissons génétiquement modifiés, dont les neurones du système neurosécréteur caudal sont sensibles à un antibiotique, sont traités avec cet antibiotique ce qui entraîne la mort de ces cellules.

Impact sur les animaux

- La création de lignée OGM est généralement sans effet car les modifications du génomes obtenues sont maintenu à l’état hétérozygote (un seul des deux chromosomes parentaux est affecté). Néanmoins, elle est susceptible d’entraîner des malformations congénitales non souhaitées. De telles malformations sont détectées dès les stades embryonnaires et seuls des animaux ne présentant pas de malformation sont mis en élevage. - Les expériences de variations rapides des paramètres de l’eau sont susceptibles d’entraîner un stress ponctuel des animaux, mais ces variations étant contenues dans des gammes proches de celles pouvant être rencontrées dans le milieu naturel, les stress induits devraient être modérés. - L’inactivation des gènes codant pour les hormones produites par les neurones du système neurosécréteur caudal ou de leurs récepteurs, et la suppression de ces cellules, pourraient entraîner des modifications de la physiologie des animaux engendrant une modification de leur croissance ou de leur capacité à se reproduire. Cela devrait également impacter leurs capacités à s’adapter à des variations des paramètres de l’eau, et pourrait entraîner des stress plus forts ou prolongés lors des challenges.

Devenir

Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Ces animaux sont euthanasiés à 2 ans, car à cet âge les capacités de reproduction diminuent fortement. Dans le cadre des challenges et de la production d’animaux dépourvus de SNSC ou de certaines hormones et récepteurs, les animaux sont euthanasiés à l’issu du challenge pour pouvoir prélever les différents tissus qui feront l’objet d’analyses histologique et moléculaire.

Remplacement

Les processus développementaux et physiologiques tel que ceux étudiés dans ce projet sont complexes et impliquent des interactions entre différents organes et parties du corps. Pour étudier ces processus, il est nécessaire de recourir à des organismes entiers. Des alternatives ont été envisagées, notamment la culture in vitro des neurones du système neurosécréteur caudal étudiés. Néanmoins, l’objectif de ce projet et de pouvoir étudier les fonctions des hormones produites par ces neurones sur l’organisme ce qui n’est pas possible avec les alternatives envisagées.

Réduction

Une partie des animaux utilisés dans ce projet permettra la création de lignées génétiquement modifiées et l’autre partie subira des challenges (variations rapides des paramètres de l’eau) afin de déterminer le rôle du système neurosécréteur caudal et des hormones qu’il produit. Le nombre d’animaux envisagé pour la création des lignées génétiquement modifiées est basé sur notre expérience de ce type d’approche. L’optimisation des protocoles nous permet d’utiliser le moins d’animaux possible. En particulier l’utilisation d’un marqueur visible nous permet de sélectionner les œufs porteurs d’un transgène d’intérêt. Pour notre projet, 16 lignées génétiquement modifiés seront nécessaires. Pour chacune, 50 animaux seront utilisés. Ce nombre est nécessaire et suffisant pour garantir l’obtention des lignées souhaitées. Pour les expériences de variations des paramètres de l’eau, 10 animaux seront utilisés pour chaque paramètre de l’eau étudié (4 paramètres en tout), à 3 valeurs différentes, pendant 3 durées différentes et à 3 stades différents. Ces expériences seront réalisées sur des animaux sauvages (non génétiquement modifiés) et des animaux génétiquement modifiés. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour pouvoir prélever les tissus d’intérêt afin de réaliser des analyses moléculaire ou histologique. Notre expérience de ce type d’analyse montre qu’un nombre de 10 animaux par condition est nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats qui soient statistiquement significatifs. Pour chaque expérience de variations des paramètres de l’eau, des contrôles adaptés ont été prévus et les données obtenues seront analysées à l’aide de tests statistiques adaptés. De plus, pour chaque animal euthanasié, différents tissus seront prélevés et les échantillons seront conservés afin de pouvoir être utilisés pour différentes analyses sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. D’une façon générale, ce projet a été conçu et organisé de façon à pouvoir, à chaque étape, sélectionner rigoureusement les lignées à produire et les expériences à mettre en œuvre afin de répondre à nos objectifs. Le nombre de lignées et d’expériences prévus, et donc le nombre d’animaux, ont été optimisés afin de répondre au mieux aux objectifs de ce projet, notamment en termes de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans une animalerie confinée et agrémentée, dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés très régulièrement. Les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche pour assurer une croissance optimale ainsi que de la nourriture vivante (larves d’artémia, rotifères) pour permettre un enrichissement du milieu et sont maintenus à une densité adaptée, y compris pendant les expériences de variations des paramètres de l’eau, afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Pour la création des lignées génétiquement modifiées la sélection des embryons concernés se fait sans avoir recours à des biopsies. De plus, l’observation attentive de ces embryons permet de n’élever que des animaux dépourvus de malformation. Dans le cadre des expériences de variations des paramètres de l’eau et de la production d’animaux dépourvus de système neurosécréteur caudal ou de certaines hormones, les animaux font l’objet d’un suivi particulier (horaire ou quotidien) par du personnel formé afin de surveiller l’éventuelle apparition d’un trouble locomoteur ou comportemental. Des points limites, définis à l’avance, permettent d’interrompre l’expérience de variations des paramètres de l’eau si nécessaire.

Choix des espèces

L’étude dynamique des processus développementaux et physiologiques n’a de sens qu’à l’échelle d’un organisme entier. Ces processus ne peuvent être reproduits totalement in vitro et nécessitent de recourir à des organismes modèles animaux. Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude génétique. Sa relative facilitée d’élevage, son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités d’édition du génome (production de lignées génétiquement modifiées porteuses d’un transgène ou d’une mutation d’intérêt) en font un modèle de choix pour la recherche. Les animaux génétiquement modifiés créés sont utilisés comme reproducteurs. Les animaux sont donc utilisés de la fécondation jusqu'à l'âge adulte. Les études physiologiques sur les animaux dépourvus de système neurosécréteur caudal ou de certaines hormones seront réalisées sur de jeunes larves (2 semaines), des juvéniles (8-10 semaines) et des adultes (4-6 mois) afin d’en tester l’impact en fonction de l’âge des animaux.

1 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral est provoqué par occlusion puis reperfusion d'une artère cérébrale au moyen d'un filament, suivi d'une IRM et d'une série de tests comportementaux étalés sur trois semaines. Le porteur indique que le modèle reproduit des déficits sensorimoteurs et une désorientation au réveil, et applique des points limites en cas de perte de poids ou d'inactivité. Il présente le rat comme le modèle préférentiel de l'AVC et juge "indispensable" de tester chez l'animal cinq stratégies thérapeutiques financées par l'industrie.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant l’augmentation de la récupération fonctionnelle et de diminuer la lésion causée par l’occlusion artérielle. L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monofilament dans la carotide interne puis poussé jusqu’à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) provoquant ainsi une occlusion. Cet acte chirurgical durera 15 minutes. 45 minutes plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament et ainsi permettre une reperfusion. Cet acte chirurgical durera 10 minutes. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 8 minutes et suivront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+22 post AVC. Un total de 56 minutes est prévu pour l'ensemble des tests comportementaux. Enfin, à la fin du projet, un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. L’embolisation de l’ACM provoque une désorientation prononcée au moment du réveil post-chirurgical (phénomène de circling). Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l’ischémie-reperfusion. Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse post chirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 10 rats par groupe (+ 30%) sauf pour les SHAM au nombre de 5 par groupe, ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les rats seront 2 par cage avec plusieurs enrichissements, auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée 15 minutes avant incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Le site d’incision de peau fait appel à une tonte préalable du pelage, à une désinfection et enfin l’application d’une analgésie locale. Lors de la phase de réveil, de l'oxygène sera administré pour permettre une meilleure récupération post-opératoire. Les animaux seront placés dans une cage individuelle chauffée à 28°C pendant 2 heures avant d’être remis en cage par 2. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort. Enfin, une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivants l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par une ischémie-reperfusion. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines soit un poids d’environ 300 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

561 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale d'environ une heure pour électroporer le cerveau des embryons in utero, les embryons étant ensuite prélevés et les mères tuées, afin d'étudier le rôle de micro-ARN dans le développement du cortex cérébral. Le porteur indique que la laparotomie peut provoquer douleurs, infection de la plaie ou rupture des sutures, et justifie la mise à mort des mères par des "raisons éthiques" les empêchant de générer d'autres portées. Il affirme que la culture in vitro ne reproduit pas la complexité du cortex et que seule la souris permet cette approche transgénique.

Objectifs

Le cortex cérebral est organisé en 6 couches de neurones qui sont générées successivement entre les stades embryonnaires E12 et E16 (12 et 16 jours de vie fétale). Les neurones des différentes couches présentent une grande variabilité de morphologie, de connectivité et de propriété physiologique, alors qu’ils sont issus du même pool de progéniteurs. Ce projet s’inscrit dans la thématique de recherche générale visant à comprendre les bases génétiques permettant à une même population de progéniteurs de générer des neurones très différents entre eux en fonction du stade de développement de l’embryon. Dans ce projet nous nous intéresserons en particulier au rôle des micro-ARNs. Les micro-ARNs sont de petites molécules d’ARN de 21-24 nucléotides capables de réguler l’expression des gènes. Il est couramment admis qu’un même micro-ARN peut réguler plusieurs centaines de gènes et qu’inversement un gène peut être régulé par de nombreux micro-ARNs. Ainsi nous pensons que, compte tenu de leur mode d’action, des changements subtils dans l’activité des micro-ARNs sont susceptibles de modifier significativement la compétence neurogénique des progéniteurs. Pour confirmer ou infirmer cette hypothèse, nous allons mener cette recherche en 4 objectifs successifs : - 1/ Etudier l’expression des micro-ARNs dans les progéniteurs au cours du temps entre les stades E12 et E16 - 2/ Déterminer parmi le pool des micro-ARNs exprimés, la fraction réellement engagée dans une activité de régulation - 3/ Déterminer les gènes dont l’expression est régulée par ces micro-ARNs actifs - 4/ Valider expérimentalement le rôle fonctionnel de certains micro-ARNs actifs, en manipulant leur expression et en analysant les conséquences de ces manipulations sur la morphologie et la physiologie des neurones générés.

Bénéfices attendus

De nombreux travaux ont montré que l'expression des gènes au sein des progéniteurs des neurones corticaux varie en fonction du stade de développement embryonnaire. Cette variation d'expression des gènes dans les progéniteurs selon le stade de développement induit une grande diversité morphologique et physiologique des neurones corticaux générés à partir de ces progéniteurs. Cette dynamique d'expression génique est encore mal comprise. Nous pensons que les micro-ARNs, parce qu’ils sont capables de réguler simultanément de nombreux gènes et donc de modifier en profondeur l’expression des gènes d’une cellule, peuvent jouer un rôle dans cette dynamique. Le projet présent va permettre de confirmer ou d’infirmer cette hypothèse ce qui présente un intérêt non seulement pour comprendre comment la structure spécifique du cortex cérebral se met en place mais également d’une manière générale pour appréhender comment une cellule souche initiale va évoluer et se renouveler au cours du développement pour générer l’ensemble des tissus qui composent un organisme.

Procédures

Chirurgie abdominale sur 80 souris gestante sous anesthésie générale (environ 1h par souris). Prélèvement de 241 embryons à un stade supérieur ou égal à E14,5 (10 mn par embryon).

Impact sur les animaux

L’électroporation corticale in utero aux stades embryonnaires entre E12,5 et E16,5 est une technique bien établie pratiquée par de nombreux laboratoires. Les nuisances attendues sur les animaux sont les suivantes. Chez la mère : - L'anesthésie, - La laparotomie, - Des injections intra-péritonéale et sous-cutanée, - D’éventuelles problèmes postopératoires comme des douleurs (associées à une perte de poids ou un état de prostration), l’infection de la plaie, ou une rupture des points de suture. Chez le foetus - L'injection d’acide nucléique intra-ventriculaire suivi d’une électroporation

Devenir

Pour les objectifs 1 à 4, les analyses seront réalisées post-mortem sur les cellules de cerveaux d’embryons électroporées. Pour des raisons éthiques, les mères gestantes dont seront issus ces embryons, ne peuvent être réutilisées pour générer de nouvelles portées et seront donc euthanasiées à l’issue de la procédure. Pour l’objectif 5, les analyses seront réalisées post-mortem sur le cerveau d’animaux de 14 jours issus d’embryons électroporés. Les mères de ces animaux seront également euthanasiées à l’issue de la procédure pour les mêmes raisons que précédemment.

Remplacement

L’option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait la culture in vitro de cellules souche de souris. En effet, il a été montré que la différenciation in vitro des cellules souche génère au cours du temps une succession de sous-types de neurones glutamatergiques qui mime la génération des différentes couches du cortex. Cependant, la culture in vitro ne permet pas de récapituler l’ensemble de la complexité du cortex cérebral. Par exemple, il n’est pas possible de recréer la segmentation du cortex en aires fonctionnelles, ni d’aboutir à une maturation totale des neurones en boite de petri. D’autre part, si la culture in vitro de cellules souche semble maintenir l’existence des facteurs intrinsèques impliqués dans la régulation de la dynamique de différenciation des neurones corticaux, d’autres facteurs de régulation extrinsèques, encore mal connus, ne peuvent pas être maintenus in vitro.

Réduction

Les procédures que nous allons mettre en œuvre visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. Elles font appel à certaines techniques délicates à réaliser, c’est pourquoi nous avons recruté pour ce projet un chercheur contractuel ayant une longue expérience dans l'utilisation de ces techniques et de ce fait les maitrisant parfaitement. Le nombre d’animaux par expérience a été estimé au plus juste de façon à répondre aux exigences pratiques et statistiques de chaque expérience. L’objectif final du projet vise à identifier le rôle de micro-ARNs particuliers dans les cellules souche neurales du cerveau d'embryons de souris pour générer de nouveaux neurones. Cette recherche impliquera de manipuler l'expression de ces micro-ARNs et d'observer l'effet de ces manipulations en comparaison avec une condition témoin (sans traitement). Pour chaque micro-ARN étudié les deux conditions « traitement » et « témoin » seront réalisées dans des embryons de la même souris gestante. Ceci permet de limiter le nombre d’animaux utilisés par rapport à des procédures où la même condition seraient appliquées à tous les embryons d’une même portée. De plus, le fait d’avoir les 2 conditions à comparer dans la même souris gestante permet également d’augmenter la solidité des résultats et donc finalement de réduire le nombre d’animaux utilisés. Enfin, l’utilisation de coupes fines de cerveau permet d’étudier tous les paramètres pertinents nécessaires à la caractérisation des conséquences d’un traitement à partir d’un seul individu.

Raffinement

L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. Les cages sont enrichies et les animaux sont hébergés en groupes sociaux. Les animaux ayant subi une procédure sont surveillés et observés régulièrement. Une grille de score a été définie pour chaque procédure pour l’application de points limites précis et adaptés, avec des actions et des prises de décisions définies grâce à un arbre décisionnel. Des soins spécifiques seront apportés à la mère gestante qui subira l’électroporation in utero. En particulier nous aurons pour impératif de réduire au maximum la douleur induite par les procédures, qui seront réalisées par des personnes très expérimentées. Ainsi, des analgésiques seront injectés avant et après la chirurgie qui se déroulera sous anesthésie. De même des actions spécifiques seront entreprises pour contrecarrer les effets induits par l’anesthésie et la chirurgie. Les animaux ayant subi la chirurgie seront hébergés dans une salle de stabulation spécifiquement dédiée.

Choix des espèces

Chez les mammifères, l’espèce souris est la seule pour laquelle nous pouvons réaliser ce projet, et ce pour des raisons techniques et de connaissances théoriques. En effet, notre projet est basé sur l’utilisation d’une lignée transgénique de souris exprimant T6B de façon conditionnelle. Or, la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle la fabrication de lignée transgénique est faisable facilement. D’autre part, l’électroporation in utero est une technique qui n’est réellement bien maitrisée chez les mammifères que chez la souris. Enfin, chez les mammifères non humains, c’est chez la souris que les connaissances génétiques sont les plus développées. Ce projet cherche à comprendre comment la variabilité morphologique et physiologique des neurones du cortex cérebral de souris est codée dans les progéniteurs neuronaux. Comme la différenciation des neurones corticaux s’initie entre 12 et 16 jours de vie fétale, les expériences de ce projet seront réalisées sur des embryons entre E12,5 et E16,5.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Des femelles reçoivent un régime déséquilibré autour de la gestation, puis leur descendance subit un transfert de flore intestinale et des tests comportementaux avant d'être tuée pour prélever des tissus, afin de relier alimentation, microbiote et traits autistiques. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de non invasifs sans préciser lesquels, et déclare peu d'effets indésirables. Il affirme que l'autisme ne peut être modélisé qu'au niveau de l'"animal entier" exprimant tout son répertoire comportemental.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA) sont des maladies neurodeveloppementale de plus en plus fréquentes, avec une incidence moyenne de près de 1% d’après de récentes études à grande échelle. Les causes de ce trouble sont encore mal identifiées. Le développement de l’autisme pourrait être le résultat d'une combinaison de facteurs environnementaux toxiques et d’une susceptibilité génétique. Parmi les causes environnemantales possibles, l’obésité, conséquence d’un régime alimentaire déséquilibré, est un facteur particulièrement intéressant, puisqu’elle est de plus en plus répandue dans les sociétés occidentales et pourrait ainsi expliquer l’augmentation inquitétante des cas d’autisme dans ces pays. Des études cliniques récentes montrent que les mères souffrant d’obésité ont un risque accru d’avoir un enfant souffrant de TSA. Actuellement il n’existe pas de modèle animal mimant ce facteur de risque, qui permettrait d’en comprendre les mécanismes. Nous avons montré que la descendance de souris gestantes exposées à un régime cafétéria présente une trajectoire développementale altérée ainsi que des symptômes d’autisme à l’âge adulte. La composition de la flore intestinale des ces souris est également altérée. Nous voulons maintenant la contribution du mircobiote intestinal aux altéartions comportementales observées chez les souris exposées au régime cafétéria. Le projet comprendra deux étapes : 1)Exposition de femelles au régime cafétéria une semaine avant l’accouplement et pendant la gestation puis la lactation, 2)Etude comportementale de la descendance avant et après un transfert de flore microbienne entre le groupe exposé au régime cafétéria et le groupe exposé au régime contrôle. L’enjeu de ce projet est d’identifier une nouvelle cause potentielle de développement des troubles autistiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l’impact du microbiote intestinal sur le développement du phénotype autistique des animaux exposés de manière précoce à un régime déséquilibré.

Procédures

Les animaux seront soumis à un transfert de flore. Ce type d'intervention est en essai clinique chez l'homme pour soulager les patients atteints d'autisme. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux ethologique non ivasif. L'ensemble de notre protocole expérimental durera 16 semaines. Les tests comportementaux, que réaliseront auront une durée maximale de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental ne présente pas d’effet indésirable notoire. Dans une expérirnce précédente, l’exposition au régime cafétéria a conduit à une augmentation de 10-15% du poids des mères, et de moins de 10% chez leur descendance. L’ensemble des tests comportementaux ne génère pas de stress particulier.

Devenir

En fin d'expérience les animaux seront euthanasié dans le but de prélever des tissus et étudier l'impact du transfert de flore au niveau moléculaire

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de l’autisme et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d’aspect pour la pathologie autistique, et aussi d’évaluer le cas échéant l’efficacité d’une approche thérapeutique. L’évaluation des effets bénéfiques d’un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu’au niveau comportemental : en effet, il n’existe pas de marqueur biologique pour l’autisme, dont le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.9 pour une taille d’effet f de cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.

Raffinement

Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiels subis par les animaux tout au long du protocole expérimental, en logeant les souris par groupe sociaux de 2 à 4 individus, en mettant à disposition le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons les animaux des deux sexes, nous testerons chaque animal dans différentes tâches et nous utiliserons les tests statistiques adéquats. Nous ne pouvons toutefois pas nous passer du modèle animal car l’autisme est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant tout son répertoire comportemental. Pendant les expériences, nous suivront quotidiennement le bien-être de nos animaux en particulier leurs poids, leur posture. Nous mettrons en place des points limites adaptés afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux, chez lesquels des altérations des compétences sociales, symptôme clé de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique . Les déficits comportementaux détectés chez les souris modélisant l’autisme sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité d’aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. La trajectoire développementale des animaux sera étudiée dès la naissance des animaux. Nous suivrons le développement des animaux jusqu’à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de niveau modéré. Elles reçoivent une injection puis des séances d'imagerie par bioluminescence de dix minutes par semaine sous anesthésie répétée, avant d'être tuées pour l'analyse histologique du cerveau, afin de mettre au point un modèle de suivi de la protéine aSynucléine impliquée dans la neurodégénérescence. Le porteur présente l'imagerie comme non invasive et justifie ces 360 animaux par la volonté de suivre la maladie dans le temps et de limiter à terme le nombre d'animaux non-humains utilisés. Il indique valider le matériel en culture cellulaire en amont, l'imagerie in vivo ne pouvant selon lui se faire que sur des animaux vivants.

Objectifs

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Certains sont basés sur l'injection de virus permettant la surexpression d’une protéine mutée qui forme des agrégats et qui serait une des causes de la mort des neurones dopaminergiques et des problèmes moteurs conséquents. L’accumulation de cette protéine n’est étudiée que post-mortem chez l’animal. L'objectif est la création d’un modèle permettant le suivi au cours du temps de l'évolution du modèle par imagerie, permettant une étude longitudinale tout en limitant le nombre d'animaux pour étudier le modèle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est le suivi de la mise en place et de l’évolution de la "pathologie" à différents temps et sans sacrifier les animaux, pour ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés dans nos recherches et travailler avec un modèle bien maitrisé temporellement.

Procédures

Les animaux sont soumis à de l'imagerie in vivo : 10 minutes par semaine pendant toute la durée de l'étude, sous anesthésie générale. C'est une technique non invasive et nécessitant juste une injection qui est non douloureuse et se fait sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par la répétition de l'anesthésie durant l'imagerie, mais celle-ci est de courte durée (10 minutes maximum) et légère car gazeuse. Et par le transfert entre le site d’hébergement et la plateforme d'imagerie, réalisé par les porteurs du projet.

Devenir

Les animaux sont sacrifiés à la fin de chaque étude afin de réaliser une étude histologique et biochimique du tissu cérébral.

Remplacement

Nous souhaitons améliorer un modèle pathologique afin d’être plus en adéquation avec la réalité de la maladie chez l’humain, nécessitant l’utilisation de modèles animaux robustes. En amont de nos expériences in vivo, le matériel biologique est testé en culture cellulaire afin de valider leur efficacité, de déterminer les concentrations nécessaires et de valider un protocole expérimental correct. L'imagerie in vivo ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.

Réduction

Modèle : la souris C57BL6/JR a été choisie car nos études antérieures ont montré une bonne stabilité et reproductivité, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux pour réaliser ces études. Quant à la souche B6RjTyr c/c, elle représente un atout majeur pour l'imagerie in vivo, du fait de sa dépigmentation cutanée. De plus, le statut sanitaire des animaux étant maîtrisé, la stabilité des modèles est éprouvée. Le développement de modèles avec un suivi en bioluminescence qui est non invasif pour les animaux, permet des études longitudinales et ainsi une diminution du nombre d’animaux utilisés. Ainsi pour ces deux études nous utiliserons : étude 1 : 3 expériences indépendantes x 3 groupes de 10 animaux x 2 souches = 180 souris et dans l'étude 2 : 3 expériences x 3 groupes de 10 souris x 2 souches = 180 souris, il n'y aura pas d'étude statistisque de différences entre les groupes, mais ce nombre nous permet de valider la fiabilité des nos modèles en imagerie.

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.

Choix des espèces

Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Ces travaux d'étude des maladies neurodégénératives en utilisant la souris comme modèle sont largement décrits dans la littérature ce qui nous donne une base solide pour valider nos résultats. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte qui est compris entre 8 et 12 semaines, car la pathologie étudiée apparait à l'âge adulte chez l'humain.