Système nerveux

193 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une neurochirurgie pour induire dans l'hypothalamus l'expression d'une protéine, et 16 femelles reçoivent en plus un frottis vaginal quotidien pendant cinq semaines, afin d'étudier l'effet de l'hormone IGF1 sur le contrôle cérébral de l'ovulation. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des hémorragies et une baisse de température, et que les animaux atteignant les points limites sont mis à mort. Il affirme que la reproduction, fonction intégrée, ne peut s'observer que sur un "organisme vivant", ce qui justifierait selon lui le recours au rat.

Objectifs

L'ovulation dépend de l'intégration de facteurs hormonaux, métaboliques, et environnementaux par le cerveau et plus particulièrement par les neurones hypothalamiques à kisspeptine (KP) qui vont orchestrer la sécrétion de la gonadolibérine ou GnRH permettant le pic de l'hormone lutéinisante (LH) à l'origine de l'ovulation. L'objectif est de développer et de mettre en oeuvre une technique permettant d'induire la synthèse d'une proteine dans une région cible du cerveau sur une période de temps étendue (supérieure à 3 semaines) afin d'étudier l'influence de cette proteine sur le contrôle central de l'ovulation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de deux ordres: le premier consiste en une meilleure compréhension des effets de l' Insulin Growth Factor 1 (IGF1), hormone périphérique, sur le fonctionnement dans le noyau arqué des neurones à KP et plus généralement sur la synchronisation du moment de l'ovulation par l'hypothalamus; le second est la mise au point d'une technique innovante, ne nécessitant pas la mise en oeuvre de bâtiments ayant un niveau de biosécurité élevé, pour induire une proteine dans une région délimitée du cerveau et à un âge déterminé de l'animal ce qui permettra de mieux comprendre sa fonction. Cette technique si elle est validée pourra être déployée chez des espèces animales (telles les espèces de rente) chez lesquelles les outils de génie génétique sont peu disponibles.

Procédures

Tous les animaux (n=193) seront soumis à une neurochirurgie d'une durée moyenne de 15 minutes par animal. Pour ce faire, les animaux seront anesthésiés et leur température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant. Parmi ces 193 animaux, 16 femelles auront un suivi de cyclicité par frottis vaginal réalisé pendant cinq semaines à raison d'un frottis quotidien (les femelles vigiles sont maintenues le temps du frottis).

Impact sur les animaux

Effets directs: Toute neurochirurgie peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. L'incision de la peau du crâne peut induire une douleur localisée. Effets indirects: Mobilité et hygiène du pelage éventuellement réduites suite à la neurochirurgie, l'induction de la synthèse d'IGF1 pourrait avoir des effets sur le poids de l'animal (perte ou gain). Les effets directs sont de courte durée (

Devenir

Le projet porte sur le cerveau et sur l'analyse anatomique et fonctionnelle d'un traitement in situ constitué par un transfectant et un plasmide. De ce fait, il est nécessaire d'euthanasier tous les rats de ce projet en fin d'expérimentation afin de confirmer la zone d'injection, de mesurer son étendue et de caractériser d'éventuelles lésions tissulaires.

Remplacement

La fonction de reproduction étant une fonction intégrée sous contrôle de l'hypothalamus, elle ne peut s'observer que sur un organisme vivant. Les expériences s'appuieront néanmoins sur les données de la littérature pour choisir les critères expérimentaux les plus pertinents et réduire le nombre de tests.

Réduction

Le choix du nombre d’individus par lot s'appuie sur les données de la littérature et notre expérience antérieure montrant que des résultats exploitables et statistiquement fiables peuvent être obtenus avec des groupes compris entre 5 et 7 animaux selon les données à exploiter. La réalisation successive des expériences (et non en parallèle) permet de réduire le nombre de lots expérimentaux car chaque critère établi sera réutilisé dans l'expérience suivante. La taille des lots a été déterminée en nous basant sur notre expérience antérieure où selon les données quantifiées, la variabilité inter-animale et le test statistique utilisé il faut au minimum 7 animaux/groupe. Nous avons ajouté 1 animal par lot afin de prévenir tout risque lié à la chirurgie.

Raffinement

Les rats seront hébergés par trois en présence d'objets en carton (boites à oeufs, tube). Une semaine d'habituation à la manipulation par l'expérientateur sera prévue pour chaque lot de chaque série d'expérience. Les rats seront anesthésiés lors des chirurgies et recevront un traitement antalgique consécutivement à la neurochirurgie. Les rats recevront une pommade ophtalmique pour conserver une bonne lubrification de l'oeil pendant la chirurgie. La surveillance post-opératoire s'appuiera sur l'observation quotidienne du comportement, de l'apparence physique et du poids corporel. La molécule étudiée est une hormone endogène qui n'est pas connue pour avoir des effets nocifs sur la santé des animaux, de même l'absence de nocivité du transfectant a été établie. Néanmoins, une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée tout au long de l'expérimentation ainsi qu'un suivi de poids bihebdomaire.

Choix des espèces

C’est une espèce de référence pour l'étude du contrôle central de la reproduction utilisée en routine par de nombreux laboratoires. L'intérêt de cette espèce dans le cadre de notre projet est la durée courte des cycles ovariens (4 jours) et la bonne reproductibilité/fiabilité des coordonnées stéréotaxiques pour les approches de neurochirurgie. Les animaux seront sexuellement matures afin d'avoir un axe gonadotrope activé et, dans le cas des femelles une activité de reproduction régulière facilement observable par la réalisation de frottis vaginaux. De plus, les coordonnées stéréotaxiques de l'atlas de référence s'appliquent pour des animaux dont le poids est proche de 280g.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué par injection puis maintenu huit semaines, avec jusqu'à seize séances d'imagerie de l'œil sous anesthésie, pour étudier l'atteinte des nerfs de la cornée. Le porteur indique que les souris présentent une hyperglycémie et une production d'urine excessive durant tout le projet, et qu'elles sont tuées pour prélever leurs cornées, une glycémie dépassant 500 mg/dl entraînant une euthanasie. Il affirme que la complexité de l'innervation cornéenne rend l'animal "indispensable" et qu'il n'existe pas d'alternative in vitro.

Objectifs

Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'œil sec en passant par la kératite neurotrophique et la perforation cornéenne. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier comment l’innervation cornéenne est affectée par le diabète de type 1. Grâce à des techniques d’imagerie en temps réel combinés à l’utilisation de souris transgéniques, nous sommes capables de suivre l’innervation de la cornée des souris au cours du temps.

Bénéfices attendus

La bonne compréhension des mécanismes de dégénérescence de l’innervation de la cornée ainsi que les interactions se produisant entre les nerfs et les cellules immunitaires pourront servir de base pour développer et tester des traitements contre la dégénérescence de l’innervation cornéenne chez des patients diabétiques.

Procédures

Nous allons induire un diabète de Type-1 chez des souris (par injection IP d'une molécule ou d'une solution contrôle, injection sur animal vigile, réalisée par du personnel qualifié, le geste est rapide et prends moins d'une minute par animal), et les maintenir pour une durée de 8 semaines. Une partie des animaux recevront également une injection IP de tamoxifène (injection sur animal vigile, réalisée par du personnel qualifié, le geste est rapide et prends moins d'une minute par animal). Tout au long du projet (1 à 2 fois par semaine), nous réaliserons des sessions d'imagerie (maximum 16 session par animal, chaque session durera environ 40min) sur les animaux anesthésiés (anesthésie gazeuse, non invasive) afin d'étudier l'évolution de l'innervation cornéenne au cours de la pathologie. Nous pèserons les animaux une fois par semaine pour surveiller leur poids et nous mesurerons également la glycémie une fois par semaine par prélèvement d'une goutte de sang à l'extrémité de la queue.

Impact sur les animaux

Pour réaliser ce projet, nous allons induire un diabète chez les souris et les maintenir pendant 8 semaines pour étudier la dégénérescence de l’innervation cornéenne. Ces animaux présenteront une activité hyperdurièse et une hyperglycémie tout au long du projet, due à la pathologie. Les injections IP qui seront réalisées sur les animaux peuvent être sources de stress mais le geste est rapide et réalisée par du personnel qualifié afin de limiter le stress des animaux.

Devenir

A l'issue de la dernière session d'imagerie 8 semaines après l'induction de la pathologie, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire. Cela se justifie par le fait que les animaux seront diabétiques et ne pourront pas être utilisés par un autre projet. De plus, nous prélèverons les cornées des souris pour réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Du fait de la complexité de la complexité de l’innervation cornéenne et des interactions avec les cellules immunitaires et le tissu épithélial de la cornée, l’utilisation de l’animal nous est indispensable. Il n’y a pas d’alternative par des modèles in vitro.

Réduction

Ce projet impliquera au maximum 90 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Un test de puissance a été réalisé pour determiner le nombre minimal d'animaux requis.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température des cages (20-24°C) et l’hygrométrie (45-55%) sont contrôlées, le cycle jour-nuit est de 12h. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Pour les sessions d'imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) complémenté par une anesthésie locale de la cornée (chlorhydrate d'oxybuprocaïne). Des points limites ont été défini du fait de l'induction du diabète de type 1. Nous mesurerons la glycémie des animaux 1 fois par semaine et les pèserons à chaque session d'imagerie, soit 1 à 2 fois par semaine. De plus, à cause de l’activité hyperdurièse des animaux diabétiques, un change des cages plus régulier sera effectué. La glycémie des animaux sera mesurée une fois par semaine, les animaux présentant une glycémie supérieure à 500mg/dl seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle animal est requis pour ce projet car seule l'utilisation d'animaux transgéniques permet de visualiser les interactions entre les neurones et les cellules immunitaires. L’innervation de la cornée se développe en post-natal jusqu’au 45ème jour de vie des animaux. Nous utiliserons donc des jeunes adultes à partir de 7 semaines, une fois le développement de l'innervation cornéene finie.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises au test de la piscine de Morris, une épreuve de nage forcée pour mesurer la mémoire spatiale, dans le cadre d'une recherche sur la maladie d'Alzheimer. Le porteur reconnaît une composante aversive au premier essai et un stress modéré lié à la nage, et indique que toutes les souris sont tuées dans les 48 à 72 heures suivant le test pour prélever leur hippocampe. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour étudier la mémoire et l'apprentissage et juge le modèle murin le plus "adéquat".

Objectifs

Depuis plus de 30 ans, les études sur la protéine amyloïde (APP) se sont focalisées sur la synaptotoxicité d’un fragment en particulier, le peptide amyloide beta (Aβ) dans la maladie d’Alzheimer. Mais APP qui est une protéine physiologiquement clivée, va produire de nombreux autres peptides comme les peptides Aη-α et Aη-β. Le rôle de ces peptides dans le cerveau est encore très peu connu. L’objectif de ce projet est de comprendre si la modulation de la quantité de peptides dans le cerveau peut entrainer une altération des capacités mnésiques. Plus particulièrement, ce projet va permettre d’analyser l’effet d’une accumulation d’un peptide sécrété de cette voie (Aη-α) à l’aide d’une lignée de souris transgénique ainsi que d’observer l’effet d’une délétion totale de cette voie à l’aide d’une seconde lignée de souris génétiquement modifiée par la méthode CRISPR/Cas9. Ce projet va permettre d’approfondir un projet déjà en cours, en analysant plus particulièrement les capacités de flexibilité de la mémoire spatiale mnésique sur ces animaux.

Bénéfices attendus

Cette voie de découpage de l’APP a été nouvellement découverte et à ce jour cette souris n’a pas encore été caractérisée. Ce modèle est tout à fait pertinent dans l’étude de la pathologie Alzheimer et des troubles mnésiques associés. Ce projet permettra de comprendre le rôle physiopathologique des peptides au sein du cerveau et plus particulièrement dans la mise en place d’une mémoire spatiale.

Procédures

Les animaux effecturont une tache comportementale en piscine de Morris. Si cette tache peut contenir une composante aversive lors de ses premiers essais chez la souris, la température de l'eau à 21°C+/-1°C, de l'air à >25C et l'attente des animaux entre les essais sous une lampe chauffante permet de réduire très fortement le stress associé avec la nage chez la souris (et éviter l'hypothermie). Une fois la procédure terminée, l’ensemble des animaux sera euthanasié (n=192) dans les 48-72h suivantes la fin de la procédure comportementale. Une fois la confirmation de la mort validée par absence de battements cardiaques et de mouvements respiratoires une dissection du cerveau sera effectuée afin de récupérer des structures telles l'hippocampe pour des études de quantification protéique.

Impact sur les animaux

Un stress modéré est généré par la mise dans la piscine lors de leur premier essai car l’animal ne sait pas ce qu’il doit faire puis ensuite il sait qu’il doit rejoindre la plateforme donc le stress s’atténue. Les animaux développent une pathologie amyloide avec l'âge, indépendante des procédures effectuées.

Devenir

Nous devons prélever les hippocampes pour effectuer desdosages protéiques sur ces tissus, c’est pourquoi nous avons besoin que l'ensemble des animaux (n=192) soit euthanasiés par par une méthode réglementaire une fois la procédure terminée.

Remplacement

Notre modèle de souris est le modèle le plus adéquat pour cette étude car les structures impliquées chez l’Homme dans la mémoire sont conservées chez la souris et présentent le même phénotype comportemental associé à un apprentissage. L'absence de méthodes alternatives quant à l'étude de la mémoire et de l'apprentissage au cours du vieillissement pathologique nous oblige à utiliser les modèles murins mentionnés.

Réduction

Le nombre total d’animaux impliqués est 192. Pour ce projet nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à un calcul de puissance. Des tests statistiques seront utilisés pour pemettre une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe de 3 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid vegetal. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure. Une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une mise à mort pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire le stress des souris. La présence de points limites généraux mais également spécifiques à la procédure sont définis pour permettre un meilleure raffinement.

Choix des espèces

Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. La souris possède un éventail génétique vaste, une reproductibilité fiable et rapide, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre projet. La souris constitue un excellent modèle pour l’étude des processus mnésique d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires mnésique ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau de l’hippocampe sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension de la mise en place de la mémoire, et ainsi pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie). Pour toutes ces raisons, ce choix d’espèce constitue un bon modèle pour notre étude. Deux nouveaux modèles murins transgéniques pour la maladie d'Alzheimer seront utilisés. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte, mais selon le modèle murin et l'apparition des dépots amyloides chez ceux-ci, les animaux seront utilisés à des âges plus ou moins avancés.

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour produire deux protéines humaines, elles reçoivent dans le cerveau, à cinq mois, des extraits cérébraux prélevés sur des personnes atteintes de maladies neurodégénératives, afin d'accélérer l'apparition de la maladie. Le porteur indique que les souris développent une démarche saccadée et des troubles de l'équilibre, et qu'elles sont tuées dès ces signes pour éviter la paralysie du train postérieur qui les empêcherait de se nourrir. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de remplacer l'expérimentation animale pour cette étude.

Objectifs

L’objectif du projet est d’induire une maladie accélérée chez des souris (APPxM83) produisant les deux protéines humaines alpha-synucléine et béta amyloïde après inoculation d’extraits cérébraux humains provenant de patients atteints des 3 formes de maladies humaines associées à l’alpha-synculéine (démence à corps de Lewy, maladie de Parkinson et atrophie multisystématisée).

Bénéfices attendus

Le projet vise à apporter des nouvelles connaissances sur la diversité des différentes maladies neuro-dégénératives humaines associées à la protéine alpha-synucléine.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation dans le cerveau à l’âge de 5 mois réalisée sous anesthésie générale et locale. L’ensemble des souris disponibles à cet âge parmi les 176 animaux produits pour l’étude font l’objet de cette procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux font l’objet à l’âge de 5 mois d’une inoculation intra-cérébrale par voie stéréotaxique, sous anesthésie générale et locale. Les injections stéréotaxiques sont réalisées régulièrement au laboratoire et n’induisent pas d’effets indésirables chez les souris. Cette inoculation est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal, qui peut présenter une posture voûtée. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur qui empêcherait l’animal de se nourrir et boire à volonté.

Devenir

Les animaux sont mis à mort dès l’apparition des signes de démarche saccadée ou troubles de l’équilibre, annonciateurs d’une paralysie, et au plus tard à l’âge de 22 mois.

Remplacement

Le projet ne peut être actuellement réalisé que chez la souris, visant à évaluer le délai d’apparition des signes locomoteurs, les lésions du cerveau et les caractéristiques biochimiques de la protéine alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les lots expérimentaux sont constitués chacun de 16 souris adultes, mâles et femelles, pour chaque inoculum. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux analyses fondées sur l’examen de la durée d'incubation de la maladie, de la distribution des lésions cérébrales et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine agrégée. L’analyse statistique de la distribution des lésions cérébrales nécessite en particulier un minimum de 5 à 6 souris au stade clinique de la maladie. La constitution de lots de 16 souris doit ainsi nous permettre de pouvoir disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour l’analyse des lésions cérébrales. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs de la maladie dans les tissus périphériques.

Raffinement

Pour les inoculations dans le cerveau l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé chez un animal sous anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant de limiter la douleur après l’intervention. Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi pendant toute l’expérimentation. Les souris sont observées tous les jours et suivies individuellement lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre, stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la maladie de ces souris permet d’éviter que ces signes évoluent vers une paralysie, avec des difficultés d’alimentation et un mal-être de la souris. Une fiche individuelle est renseignée pour chaque souris, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau de la souris à l’âge de 5 mois. Le choix de cet âge à l’inoculation permet de réaliser l’inoculation par stéréotaxie chez un animal adulte et son observation pendant une durée suffisante avant le possible développement de signes cliniques spontanés lors du viellissement (au-delà de l’âge de 22 mois chez les animaux hémizygotes M83). Ces souris sont entretenues et surveillées jusqu’à l’apparition des premiers troubles d’équilibre ou de démarche, à partir de laquelle les animaux sont mis à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil. Les animaux éventuellement survivants à l’âge de 22 mois, à partir duquel ils deviennent susceptibles de développer spontanément un phénotype dommageable de souris M83 hémizygotes, sont sacrifiés.

75 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections dans le cerveau d'un virus puis de cellules de gliome, avant des enregistrements optiques sous anesthésie sans réveil, pour tester la faisabilité d'une méthode d'imagerie calcique. Le porteur présente cette étude pilote comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux en remplaçant l'électrophysiologie, et indique que les souris sont tuées par perfusion intracardiaque ou décapitation sous anesthésie pour prélever le cerveau. Il précise avoir privilégié, quand c'était possible, des approches ex vivo sur tranches de cerveau.

Objectifs

L'objectif du projet est la mise en place d'une approche expérimentale, l'imagerie calcique par photométrie in vivo pour évaluer les dommages fonctionnels occasionnés au sein de la substance blanche par la présence de cellules de gliome. Ce projet a donc pour objet de valider la faisabilité d’une nouvelle approche expérimentale dans cette thématique. A terme, cette technique devrait donc améliorer nos connaissances sur les interactions neurones-cellules de gliome dans la substance blanche. La photométrie à fibre optique (fiber photometry) désigne une méthode d’imagerie in vivo basée sur l’utilisation de fibres optiques de diamètres modérées (de quelques dizaines à quelques centaines de µm de diamètre), généralement implantées stéréotaxiquement dans des régions cérébrales d’intérêt. c'est une technique qui s'enligne dans la règle des 3R, puisqu'à terme, cette approche permettra de faire de l'imagerie in vivo, sur plusieurs semaines. Cette imagerie permet donc de faire de l’imagerie en profondeur et s’avère être une technique de choix pour beaucoup de chercheurs dans le domaine des neurosciences, en raison de sa simplicité relative comparée à d’autres techniques d’enregistrement in vivo (notamment l’électrophysiologie), de son rapport signal/bruit élevé et de son prix modéré. Les questions de ce projet sont les suivantes : peut-on utiliser cette approche pour monitorer l'activité des axones, dans les faisceaux de substance blanche ? Si c'est le cas, sera-t-il possible de détecter des changements d’activité neuronale dans les zones infiltrées ? L'objectif de ce projet est d'évaluer dans une étude pilote, la faisabilité de cette approche, par une étude in vivo sur souris anesthésiées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de deux ordres. 1 - d'un point de vue scientifique : Ce projet est un projet pilote pour évaluer la faisabilité d'une technique. Une fois validé, il sera possible d'utiliser cette technique pour de monitorer l’activité d'axones dans la substance blanche dans un contexte physiopathologique et de mettre en évidence d'éventuels changements d’activité au sein de la substance blanche dans les zones d’infiltration, sur plusieurs semaines. 2 - d'un point de vue éthique : cette nouvelle approche constituerait une technique alternative à d’autres techniques d’enregistrement in vivo telles que l’électrophysiologie in vivo (plus chères, plus longues à mettre en oeuvre et à maitriser pour les étudiants, nécessitant de fait plus d'animaux) et s'intègre donc ici dans la règle des 3R, puisque nous permettrait à terme de réduire le nombre d’animaux, dans certains aspects du projet.

Procédures

75 souris subiront des procédures chirurgicales sous anesthésie et analgésie (procédure 1, durée : 23-30 min), pour l'injection stéréotaxique d'AAV ou de cellules tumorales. Parmi ces souris, 5 subiront une perfusion intracardiaque de PBS puis PFA 4% pour le prélèvement de cerveau à des fins histologiques (procédure 2, durée 20 min). Parmi ces souris, 10 subiront une euthanasie par décapitation sous anesthésie, à des fins de prélèvements de tissus pour des expériences ex vivo (pas de procédure, durée : 1 min). Parmi ces souris, 60 souris seront soumis à des expériences sous anesthésie/analgésie pour des enregistrements aigus de photométrie in vivo (procédure 3, sans réveil, durée : entre 2 et 6 h)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certaines souris seront soumises à deux procédures chirurgicales stéréotaxiques sous anesthésie et sous analgésie (Procédure décrite dans la procédure numérotée 1, avec l'injection stéréotaxique d’AAV suivie quelques semaines plus tard d’une injection de cellules tumorales), ainsi qu’à deux procédures sous anesthésie et analgésie, sans réveil (Procédure décrite dans la procédure numérotée 2 , pour la mise à mort en vue de prélèvements de tissus fixés au formaldhéhyde, et dans la procédure numérotée 3, pour l'enregistrement par imagerie calcique in vivo). Ainsi, une attention particulière devra être apportée à l'utilisation adéquate des analgésiques et anesthésiques, et à la surveillance post-opératoire en aval des deux chirurgies (voir dans la procédure 1, la section "méthodes pour supprimer la douleur, la souffrance et l'angoisse" , dans le paragraphe "SUIVI DES ANIMAUX").

Devenir

Les animaux étant soumis à la procédure 1 (" Injections stéréotaxiques cérébrales répétées sur souris adultes, sous anesthésie et sous analgésie") seront maintenu en vie, puis apres quelques semaines seront soumis à des procédures sans réveil : soit la procédure 2 ("mise à mort de souris adultes en vue de prélèvement de tissu fixés au formaldéhyde), soit la procédure 3 ("enregistrement calcique sous anesthésie et analgésie), soit seront décapités sous anesthésie (isoflurane 5%) afin de prélever les tissus cérébraux et effectuer des expériences ex vivo.

Remplacement

Quand cela a été possible et justifié, l'utilisation d'approches ex vivo a été privilégiée dans ce projet. Elle permettra de limiter le nombre d'expériences in vivo à son maximum. Il s'agit d'approches sur tranches de cerveau de souris (perfusées avec du liquide de survie, de l'oxygène. Il s'agit de tranches aigues ou organotypiques) pour évaluer ex vivo l'activité calcique dans les soma et axones des neurones, au sein des tissus.

Réduction

La réduction est un objectif final phare de ce projet de recherche. En effet, il s’agit d’une étude pilote (réalisés sur un nombre réduit d’animaux, sur deux ans), pour évaluer la faisabilité d’une approche expérimentale pour le bénéfice d’un plus large projet de recherche sur le glioblastome. Si la photométrie in vivo permettait effectivement d’évaluer l’activité des axones par imagerie calcique, alors elle pourra être utilisée au sein du laboratoire, pour des enregistrements sur plusieurs semaines, chez un même animal - permettant ainsi de cumuler de nombreux résultats avec un seul animal – et servira d’alternatives dans certaines expériences, à d’autres approches in vivo comme l’électrophysiologie. Au sein même du projet, le nombre de souris a été réduite au minimum, et a été conçu pour permettre une recherche « pas à pas ». Si la première partie du projet n’est pas validée (validation sur des souris naÏves) alors la deuxième partie n’aurait pas lieu. De plus, ce projet est un projet pilote, utilisé pour évaluer, par évaluation de la puissance statistique a posteriori, le nombre minimum de souris nécessaire pour évaluer l’excitabilité et les changements d’excitabilité axonales chez la souris, par photométrie in vivo.

Raffinement

HEBERGEMENT AVEC ENRICHISSEMENT : les animaux sont hébergés en groupe dans les conditions réglementaires, nourris et abreuvés ad libitum selon un rythme nycthéméral de 12h/12h, à 22°C, avec un enrichissement dans chaque cage, pour leur permettre de faire des nids. SURVEILLANCE QUOTIDIENNE POUR EVALUER DES POINTS D ARRETS ANTICIPES : Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement afin de déceler des signes précoces de stress ou de douleur. Après toute chirurgie, les animaux seront en plus pesés pour détecter des pertes de poids anormales (révélateurs de douleur et/ou stress éventuels). Les expériences et le suivi des animaux seront réalisés par du personnel expérimenté. UTILISATION D UN ANIMAL POUR PLUSIEURS PROCEDURES : Lors que cela est possible et justifié, un même animal sera utilisé à plusieurs fins. TRAVAIL DE PAIR AVEC LE RESPONSABLE DE L ANIMALERIE : pour optimiser Les doses d’anesthésie et d’analgésie nécessaires.

Choix des espèces

La progression des cellules tumorales dans l'organisme dépend d'une part des propriétés intrinsèques des cellules tumorales mais aussi de l'environnement spécifique dans lequel la tumeur évolue. Il est donc essentiel de pouvoir étudier les cellules tumorales dans leur environnement immédiat, par le biais de greffes orthotopiques. Des souris Nude et/ou C57BL6 seront utilisées respectivement pour la greffe de lignées tumorale humaine (GMB-Hum) et la greffe de lignée tumorale murine (GMB-Murin). L'utilisation de souris Nude permet l'étude de lignées de souris humaines, ce qui constitue un modèle proche de la pathologie observée chez l'homme. D'autre part, parce que l'activation du système immunitaire est inhérante à la progression des cellues tumorales cérébrales, nous procéderons à des expériences sur des souris C57BL6, greffées de lignées de cellules murines de glioblastome. Les expériences sont faites sur des jeunes souris adultes (injection d'AAV et de cellules tumorales à 4-10 semaines). les Expériences de photométrie seront effectués 2 à 4 semaines plus tard. Chez l'homme, le glioblastome est un cancer cérébral malin particulièrement fréquent chez l'adulte.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique, une forme agrégée d'alpha-synucléine qui déclenche une maladie proche de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que cette inoculation conduirait de toute façon à la mort par paralysie progressive, et que les souris sont tuées dès l'apparition d'une démarche saccadée et de troubles de l'équilibre, avant la paralysie du train arrière. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui de remplacer l'expérimentation animale pour décrire l'extension de ces lésions.

Objectifs

Le projet vise à caractériser la maladie chez la souris génétiquement modifiée M83 après injection dans le cerveau d’une forme particulière d’alpha-synucléine agrégée, non détéctable par les méthodes de laboratoire jusqu'à présent utilisées. L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions des maladies humaines assocciées (maladie de Parkinson et démence à corps de Lewy , atrophie multisystématisée), au sein desquelles elle se présente sous une forme agrégée.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et des caractéristiques moléculaires observées chez les souris.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 40 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation d’alpha-synucléine agrégée est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les lots expérimentaux conduits jusqu’au stade clinique sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, homozygotes et hémizygotes. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d'incubation de la maladie, de la distribution des lésions dans les différentes régions du cerveau et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine pathologique. Un lot de 14 souris permet de disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour les analyses des lésions du cerveau, prélevés lorsque la maladie apparaît chez la souris. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs périphériques de la maladie dans ce modèle transgénique.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines, permettant l’inoculation stéréotaxique des fibrilles dans le striatum, qui sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie avant son délai d’apparition normale lors du vieillissement spontané de cette lignée, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.