Système nerveux

Soumises à une injection veineuse ou à une chirurgie du cerveau, 1134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cerveau. Le modèle induit la dégénérescence d'environ la moitié de certaines populations de neurones et l'apparition de troubles moteurs, pour reproduire une maladie neurodégénérative rare. Le porteur ajoute qu'un intérêt du projet est de fournir ce modèle à d'autres chercheurs qui n'y ont pas accès. Il annonce des tests de comportement répétés jusqu'à six mois après la chirurgie sans préciser lesquels.

Objectifs

L’atrophie multisystématisée est une maladie neurodégénérative rare et mortelle touchant environ 5000 personnes en France. Cette pathologie se caractérise par une perte progressive de neurones dans plusieurs régions du cerveau. Cette perte neuronale s’accompagne de l’accumulation toxique d’une protéine spécifiquement dans certaines cellules. Cependant les mécanismes liant ces deux évènements restent peu connus. Comme pour de nombreuses autres maladies, les modèles animaux représentent un outil essentiel pour répondre aux limites des modèles informatiques et cellulaires. Ils apportent beaucoup de connaissances sur cette pathologie. Ainsi, il est essentiel de poursuivre leur optimisation. Dans le contexte de l’atrophie multisystématisée, les modèles transgéniques présentent une pathologie tissulaire large mais peu de troubles comportementaux. Il faut donc poursuivre le développement de nouveaux modèles mimant le plus possible la pathologie humaine. L’objectif de cette étude est de tirer avantage de nouveaux outils moléculaires (vecteurs viraux) pour développer un nouveau modèle de souris d’atrophie multisystématisée qui rassemble de nombreux avantages des modèles précédents. En particulier, nous souhaitons générer un modèle plus pertinent et plus accessible à la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Comme pour les autres maladies, les modèles animaux d’atrophie multisystématisée sont des outils essentiels pour mieux comprendre les mécanismes pathologiques et développer des thérapies. Par le développement de ce nouveau modèle, nous espérons apporter de nouvelles connaissances concernant les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la pathologie. En effet, notre approche permettra l’apparition de signes pathologiques dans l’ensemble du système nerveux central adulte qui est plus vulnérable à ces processus toxiques. Tous ces signes permettront une modélisation plus fidèle de cette maladie chez l’animal. Enfin, de nombreux chercheurs n’ont actuellement pas accès à des modèles animaux d’atrophie multisystématisée, souvent par défaut d’expertise ou du matériel nécessaire à la chirurgie du cerveau. Notre nouvelle méthode de modélisation, obtenue par une simple injection intra-veineuse, permettra de fournir un modèle accessible à une grande communauté de chercheurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection dans la veine (5 minutes) ou une chirurgie du cerveau (20 minutes). Dans la semaine avant ces interventions ainsi qu’un, trois et 6 mois plus tard, les animaux réaliseront des tests de comportements répartis sur 2 jours. Chacun de ces tests peut durer entre 3 minutes et environ 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont : 1-L’injection dans la veine ou dans le cerveau qui peut induire un stress attendu. 2-L’induction du modèle qui peut induire une dégénérescence d’environ 50% de certaines populations neuronales et gliales et l’apparition de légers troubles moteurs et non-moteurs. 3-Les tests comportementaux qui peuvent induire des stresses attendus, y compris lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour l’analyse du cerveau.

Remplacement

Ce projet a pour but de mesurer des marqueurs de la maladie, notamment comportementaux, au cours du développement de l’atrophie multisystématisée. De ce fait, il est impossible de reproduire la complexité d’un organisme vivant et de remplacer notre approche chez l’animal par un modèle cellulaire ou une simulation informatique.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux est basée a priori sur nos études antérieures et celles d’autres équipes démontrant des résultats statistiquement significatifs avec une taille d’échantillons de 15 animaux par condition. Ce nombre pourra être corrigé après l’obtention des résultats des expériences pilotes qui nous fourniront une estimation de la taille de l’effet de l’induction du modèle. Celle-ci nous permettra de calculer le nombre minimal théorique d’animaux nécessaires pour détecter une différence statistiquement significative après un test de mesures répétées ou une comparaison directe de 2 groupes expérimentaux. Le nombre d’animaux nécessaire sera calculé à l’aide d'un logiciel danalyse statisitique. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Avant leur utilisation en expérimentation, un contrôle qualité des vecteurs viraux sera réalisé.

Raffinement

Suite à leur arrivée dans l’animalerie, les animaux auront une semaine d’acclimatation. L’injection du vecteur viral sera réalisée sous anesthésie et traitement anti-douleur. Les tests comportementaux ont été répartis sur plusieurs jours et les animaux seront acclimatés à la salle avant de réaliser les tests. La mise à mort des animaux sera réalisée selon un protocole d’anesthésie et de double analgésie adaptées. Des points limites basés sur des signes indicatifs seront utilisés afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des régions affectées dans l’atrophie multisystématisée. Le modèle sera induit chez des animaux jeunes adultes (10 semaines). À ce stade, les systèmes cérébraux sont matures et stables et le resteront tout au long des procédures expérimentales proposées.

Pour étudier comment le cortex visuel se réorganise après une lésion de la rétine, 845 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie subit une chirurgie d'une à deux heures pour poser une fenêtre crânienne et une barre de tête, une autre une lésion de la rétine, puis des observations au microscope sur animal éveillé, répétées jusqu'à vingt fois. L'étude déclare vouloir éclairer des maladies comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge et développer des outils de restauration visuelle. Le cerveau est prélevé en fin de projet pour compléter les données anatomiques.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre les dynamiques de la réorganisation des neurones du cortex visuel après une lésion partielle de la rétine. Après une lésion, une partie du secteur du cortex visuel ne reçoit plus d’informations visuelle. Les neurones de ces secteurs finissent par retrouver une activité visuelle, en étant recruté par des neurones avoisinants dont le champ récepteur spatial est proche. La dynamique exacte de cette réorganisation est inconnue. En particulier, nous cherchons à comprendre si la sélectivité pour certains aspects des stimuli visuels de ces neurones avant et après lésion influe sur leur réorganisation. La réponse des neurones du cortex visuel avant et après lésion sera quantifiée par des techniques d’imageries. Dans un second temps, nous chercherons à mesurer in vivo la force des connexions entre les neurones avant et après lésion. Ces mesures seront faites par des techniques d’imageries spécialisés. Ce projet permettra de mieux comprendre les réorganisations des neurones qui suivent une perte fonctionnelle localisée de la fonction rétinienne, qui se produit dans certaines pathologies comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue un axe de recherche essentiel, dont les bénéfices attendus sont technologiques et biologiques. Au niveau technologique, le développement de mesure de la connectivité in vivo via des méthodes tout-optiques, encore jamais été réalisé, constitue une avancée méthodologique importante. Au niveau biologique, les lésions rétiniennes sont un modèle classique de dégénérescence maculaire liée à l’âge. Ce projet permettra de mieux comprendre les conséquences de cette maladie au niveau du système nerveux central. A un niveau plus fondamental, ce projet permettra de mieux comprendre comment les réseaux corticaux adaptent leurs représentations des stimuli visuels lors de perte sensorielles. Enfin, une perspective de ce projet consiste à développer les outils qui pourront être utilisés dans différentes stratégies de restauration visuelle.

Procédures

Une partie des animaux auront une chirurgie sous anesthésie et sous analgésie consistant à injecter des molécules d'intérêt et à poser une fenêtre et une barre de tête pour étudier l'activité neuronale. Durée de la chirurgie : 1h-2h, une fois par animal. Une partie des animaux observés en microscopie sera éveillée, les animaux seront observés sous un microscope et sur un tapis roulant. Durée : 1-3h, répétée au maximum 20 fois. Une partie des animaux subira une lésion focale de la rétine sous anesthésie et analgésie. Durée de la procédure : 5 minutes, une fois par animal.

Impact sur les animaux

La contention de l'animal pour les injections et pour les expériences sur animaux vigiles peut entrainer un léger stress des animaux. Les injections peuvent induire légère douleur de courte durée au moment de l'introduction de l'aiguille. L’immobilisation des animaux sous le microscope peut occasionner un léger stress. De rares effets pourront se produire pendant les chirurgies : mauvaise réaction à l’anesthésie, saignements pendant la chirurgie. Nous nous attendons à ce que les chirurgies de pose d’implants chroniques puissent causer des douleurs post-opératoires, du stress ou une perte de poids temporaire. Après lésion de la rétine, dans de rares cas des atteintes oculaires inflammatoires peuvent être observées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin du projet. Les cerveaux seront prélevés afin d'obtenir des données anatomiques supplémentaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Les nouvelles molécules de ce projet seront d’abord testées sur des échantillons in vitro (cultures cellulaires, organotypiques). Nous sélectionnerons les plus prometteurs pour nos expérimentations in vivo). Des simulations par ordinateur, préliminaires aux expériences, sont utilisés pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des opsines). Les animaux seront utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux impliqués dans la réponse à une stimulation visuelle ne sont pas observables in vitro.

Réduction

L’utilisation d’animaux avec implants chroniques nous permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à chaque expérience et répéter les stimulations et les acquisitions tout en respectant le bien-être des animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (845) est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé à l'aide d'un test statistique de puissance. L’utilisation de méthodes de protéomique moderne permet de quantifier l’expression de nombreuses protéines (jusqu’à 200) sur les mêmes échantillons, réduisant considérablement le nombre d’animaux nécessaires. Nous utiliserons ensuite des tests statistiques adaptés pour l’analyse de nos résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. La température des cages, l’hygrométrie et le cycle jour nuit sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Selon les procédures, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale et d’une analgésie. L’efficacité de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée tout au long de la procédure par test des réflexes. En cas de signes de réveil, une adaptation du niveau d’anesthésie sera réalisée. Des traitements analgésies/anesthésies locaux seront également mis en place. Les souris seront constamment surveillées et réchauffées pendant la phase d’anesthésie et de réveil à 37 degrés Celsius (dans une boîte ou sur un tapis chauffant). Pendant les procédures d’anesthésie générale les yeux seront protégés contre le dessèchement avec gel oculaire. A la fin de la chirurgie l’animal reçoit une dose de solution saline de réhydratation pour l’aider à récupérer rapidement ses capacités. Les procédures sont affinées au cours du temps pour garantir le bien-être des animaux (par exemple la mise à disposition dans la cage de gel pour l’alimentation en cas de perte de poids en post-opératoire). Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée pour assurer une surveillance adaptée des animaux. L’utilisation d’une grille d’évaluation et scoring permettra de définir les points limites précoces et prédictifs à chaque acte expérimental pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être de l'animal. Les animaux étant observés éveillés, ils seront soumis à un entrainement avant les observations au microscope, pour les habituer à leur environnement et réduire le stress.

Choix des espèces

La souris adulte est un modèle très utilisé par les laboratoires de recherche pour étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques. La souris est un modèle établi et très utilisé du système visuel. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études en microscopie multi-photonique en profondeur avec une résolution cellulaire. Au début des procédures, les souris seront âgées entre 7 et 24 semaines (système visuel mature), puis nous effectuerons des expériences sur les réorganisations post lésions des circuits neuronaux corticaux jusqu’à 6 mois post-lésion. La souris permet également d'obtenir des modèles transgéniques présentant un phénotype non dommageable et ne pas nécessitant l’injection de vecteurs viraux.

Huit injections rétro-orbitales, une irradiation du cerveau, un prélèvement de liquide céphalorachidien et une perfusion intracardiaque terminale : 7 137 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines lignées reproduisent la maladie d'Alzheimer et développent, vers neuf mois, troubles de mémoire, déclin cognitif et convulsions. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle de cellules immunitaires inflammatoires dans le vieillissement, les maladies neurodégénératives et les tumeurs du cerveau. Les cibles thérapeutiques évoquées pour les patients restent une perspective lointaine, quand les atteintes infligées aux souris sont immédiates.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de certaines cellules immunitaires inflammatoires dans le cerveau. Ces cellules peuvent apparaître lors du vieillissement, dans certaines maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer, ou dans les tumeurs cérébrales. Nous voulons comprendre comment ces cellules arrivent dans le cerveau, comment elles interagissent avec les cellules cérébrales et comment elles contribuent à l’inflammation. L’objectif est également d’identifier si certaines stratégies thérapeutiques pourraient limiter cette inflammation et améliorer l’évolution de ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait améliorer notre compréhension du rôle du système immunitaire dans plusieurs maladies du cerveau, notamment la maladie d’Alzheimer et le glioblastome. Les résultats pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques visant à réduire l’inflammation cérébrale et à ralentir la progression de ces maladies. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de maladies neurodégénératives ou de tumeurs cérébrales.

Procédures

Irradiation cérébrale unique sous anesthésie générale (durée 4 minutes), suivie d’injections rétro-orbitales répétées (8, durée 1 minute, vigile), de prélèvements sanguins (jusqu’à 3, durée 1 minute, anesthésie locale), d’un prélèvement terminal de liquide céphalorachidien et d’une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde et analgésie adaptée, durée 5 minutes, n=1.Des biopsies auriculaires seront réalisées à J10 à l’aide d’un emporte-pièce stérile (2–3 mm) pour le génotypage sous anesthésie locale, n=1, durée moins d'une minute anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les biopsies auriculaires unduiront un stress léger et transitoire. Les irradations localisées du cerveau et les phénotypes des modèles Alzheimer induiront une inflammation cérébrale et donc possiblement une fatigue générale liée à la réponse inflammatoire systémique et des modifications comportementales légères (réduction de l’interaction sociale, augmentation des périodes de repos). Les modèles Alzheimer peuvent aussi développer des troubles de la mémoire, apathie et anomalies sociales à partir de ~9 mois, associés à une perte neuronale, un déclin cognitif, troubles moteurs (dont ataxie), altération de l’apprentissage et du comportement social ou un déclin cognitif progressif, avec ataxie légère et risque accru d’épisodes convulsifs. Les prises de sang pourront induire une douleur légère et transitoire au point de ponction, un stress bref lié à la contention et rarement des hématomes localisés ou saignements mineurs, rapidement résolutifs. Le prélèvement de liquide céphalorachidien n'induira aucune nuisance étant fait sous anesthésie générale profonde sans réveil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Des approches alternatives ont été envisagées, comme l’utilisation de cultures cellulaires ou de modèles informatiques. Ces méthodes permettent d’étudier certains mécanismes biologiques mais ne reproduisent pas la complexité d’un organisme entier. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment des cellules immunitaires circulant dans le sang peuvent entrer dans le cerveau et interagir avec les cellules cérébrales. Ces phénomènes impliquent de nombreux organes et systèmes biologiques, notamment la circulation sanguine et la barrière hémato-encéphalique. Ces interactions complexes ne peuvent actuellement être étudiées que dans un organisme vivant, ce qui rend nécessaire l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique afin de garantir une robustesse des résultats tout en limitant l’utilisation d’animaux. Pour une analyse comparative multi-groupes (effet du modèle Alzheimer, sexe, temps d'intérêt), nous avons calculé et optimisé le nombre d'animaux nécessaires avec un calcul de puissance. Ce design expérimental permet d’atteindre une puissance statistique suffisante tout en respectant les principes éthiques de la réduction animale. Le caractère terminal des expérimentations (prélèvement du cerveau) ne permet malheureusement pas de suivre un animal.

Raffinement

Plusieurs mesures de raffinement seront mises en œuvre afin de limiter la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec matériaux de nidification et objets d’exploration afin de favoriser l’expression de comportements naturels. Un suivi clinique quotidien sera réalisé afin de détecter précocement tout signe de détresse ou d’altération de l’état général. Toutes les procédures potentiellement douloureuses ou stressantes seront réalisées sous anesthésie et/ou analgésie adaptées, conformément aux recommandations en vigueur. Des points limites précoces permettront d’interrompre les procédures si nécessaire. Dans les modèles impliquant des animaux âgés ou présentant des signes neurologiques, l’accès à la nourriture et à l’eau sera facilité, et une alimentation ramollie ou un gel nutritif pourra être fourni. Dans les modèles tumoraux, une surveillance renforcée sera mise en place afin de détecter rapidement les signes neurologiques et de mettre en place des mesures palliatives (nourriture adaptée, soins) ou d'arrêter la procédure si nécessaire.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet est pertinente en raison de sa forte similitude biologique avec l’humain, tant sur le plan génétique, anatomique que physiologique. Les modèles transgéniques reproduisent des caractéristiques clés de la maladie d’Alzheimer, telles que la formation de plaques amyloïdes, la dégénérescence neuronale ou les troubles cognitifs, permettant d’étudier leurs mécanismes et d’évaluer l’efficacité de traitements dans un contexte biologiquement pertinent. La souris est également privilégiée pour sa facilité de manipulation génétique : il est possible de créer des lignées ciblant spécifiquement les gènes impliqués dans la maladie. Certains outils indispensables à notre étude, comme le suivi in vivo des monocytes, n’existent actuellement que chez ce modèle. Enfin, la physiologie générale du cerveau murin, et en particulier celle de la barrière hémato-encéphalique, reproduit fidèlement celle de l’humain, renforçant la pertinence de ce modèle. L’utilisation de ces souris s’inscrit également dans la continuité de nos travaux antérieurs, permettant de tirer pleinement parti des outils et lignées disponibles dans notre laboraotire. En fonction des études et suivant l'évolution de la maladie dans les modèles considérés, les animaux adultes seront âgés entre 3 et 12 mois. .

Trois jours avant l'accouplement puis à sept jours de gestation, 120 femelles reçoivent des pompes osmotiques implantées sous la peau pour diffuser un antiépileptique, et leurs 304 descendants sont ensuite soumis à des tests de motricité et de sociabilité entre 45 et 60 jours, 112 subissant en plus une injection dans le cerveau. 484 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de relier l'exposition prénatale à ces médicaments et l'autisme par des mécanismes épigénétiques. Toutes sont tuées à l'issue pour analyse des tissus, y compris les petits qui peuvent naître avec une malformation de la queue.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique sont des troubles du développement qui touchent environ trois fois plus d'hommes que de femmes. Ces troubles se manifestent principalement par des difficultés dans les interactions sociales et des comportements répétitifs. Les facteurs environnementaux, comme l'exposition à certains médicaments pendant la grossesse, jouent un rôle important dans l'apparition de ces troubles. Par exemple, des médicaments utilisés pour traiter l’épilepsie, comme l'acide valproïque, ont été confirmés comme pouvant augmenter le risque d’autisme chez l’enfant à naître. D'autres médicaments, comme le topiramate ou la lamotrigine, sont également utilisés pour traiter l’épilepsie, mais leurs effets sur la descendance n'ont pas été clairement étudiés. Bien que ces médicaments n’affectent pas directement le code génétique, ils peuvent influencer l'expression des gènes à travers des mécanismes appelés épigénétiques. Cela signifie qu'une exposition à ces médicaments à des moments critiques du développement de l'embryon ou du fœtus pourrait changer la façon dont certains gènes fonctionnent, augmentant ainsi le risque d’autisme. Notre étude se concentre sur des modèles animaux pour comprendre le rôle de ces mécanismes épigénétiques et le lien entre la prise de ces médicaments par la mère pendant la grossesse et l'autisme chez l’enfant.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à mieux comprendre les risques liés à l'utilisation de certains médicaments antiépileptiques chez les femmes enceintes, et leur impact sur les descendants. À court terme, nous espérons que cette recherche nous aidera à identifier les régions du génome affectées par ces médicaments chez les animaux, ce qui permettra à moyen terme de les étudier chez des personnes atteintes d’autisme qui ont été exposées à ces médicaments avant leur naissance. Cela pourrait conduire à des tests diagnostiques et à la découverte de nouveaux traitements pour l'autisme.

Procédures

3 jours avant l'accouplement et à nouveau à 7 jours de gestation, des pompes osmotiques seront implantées sous anesthésie générale (10 min par implantation) en sous cutané chez les 120 femelles adultes. LES 304 DESCENDANTS seront soumis à des tests de motricité et d'évaluation de leur sociabilité, en condition vigile ; entre l'âge de 45 et de 60 jours, chaque souris subira 5 tests d'une durée maximale de 10 minutes pour les 4 premiers tests et de 35 minutes pour le cinquième test. Les tests seront réalisés sur 5 jours consécutifs avec 1 test par jour. 112 SOURIS AURONT UNE INJECTION CEREBRALE DE 1 HEURE.

Impact sur les animaux

Traitement prénatal : léger stress des mères lors de la manipulation - Chirurgie pour mise en place de la pompe et CHIRURGIE STEREOTAXIQUE : douleur post-opératoire minorée par des antalgiques traitement et inconfort transitoire au réveil - Pompe osmotique sous cutanée : gène légère pendant la durée de l’expérience -Avec le modèle d'injection unique d'acide valproïque, il a été constaté une taille des portées inférieure à ce qui était attendu. D’après notre expérience, pas de nuisances visibles sur la mère. -Pour les descendants exposés aux antiépileptiques : légère altération de la motricité et de la sociabilité. L’espérance de vie des petits n’est pas affectée après le sevrage. -Les tests comportementaux, Pour chaque souris du projet : L’ensemble des tests comportementaux évaluant le développement et la motricité générale pourront engendrer un stress léger et transitoire lié à la manipulation chez les souris et à la découverte d'un nouvel environnement. - Identification des petits : légère douleur transitoire due à la pose de bague dans le pavillon de l’oreille - Malformation de la queue (malformation congénitale) possible chez les petits issus de mères traitées avec les antiépileptiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses de tissus.

Remplacement

Ce projet inclut une étude du comportement, en particulier des aspects sociaux et moteurs, qui ne peut pas être reproduite en laboratoire sur des cellules ou via des modèles informatiques avec les connaissances actuelles. Il y a des éléments obtenus par des études cliniques, in silico et in vitro, sans animaux, qui indiquent une association entre anti-épileptiques et autisme. A ce stade de l'avancée des connaissances, seul une étude in vivo dans un organisme entier avec un réseau de neurones permet d'apporter la preuve du lien de cause à effet.

Réduction

Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques pour l’interprétation des résultats obtenus. Le nombre d'animaux à utiliser par expérience a été calculé de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs malgré la variabilité interindividuelle. De plus nous mettrons en place une stratégie d’accouplement restreinte au juste nécessaire en réalisant les accouplements par étapes successives jusqu’à obtention du nombre d’animaux nécessaires à nos études.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites stricts et précis et des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, une pesée est réalisée 1 fois par semaine. Après leur naissance, les animaux resteront avec leur mère jusqu’au sevrage (J21-J28), hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fournie par l’animalerie avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum.. La prise de sang terminale pour l’analyse épigénétique sera réalisée sous anesthésie avec une couverture antalgique. Les animaux seront placés en habituation dans la pièce de comportement minimum 30 minutes avant le début des tests. Les cages d’hébergement présentent des capteurs et sont suivis par logiciel permettant d’améliorer le bien-être animal et de surveiller et vérifier les cages 24heures sur 24. Enfin afin de respecter le bien-être animal, nous avons choisi à la place d'injections quotidiennes, l'implantation de pompes sous-cutanées délivrant le traitement en continu.

Choix des espèces

Les rongeurs sont à ce jour les espèces modèles ayant un système nerveux moteur proche de l’Homme. Les souris ont l’avantage d’être un modèle de choix pour les études comportementales. La souche de souris que nous utilisons est consanguine ainsi ces animaux présentent un fond génétique identique entre eux. De plus un environnement contrôlé au sein de notre animalerie nous permetta d’identifier des marques épigénétiques spécifiquement liées à l’exposition à l’agent étudié. Les mères et les pères effectueront les reproductions entre l’âge de 12 et 20 semaines (femelles) et 25 semaines (mâles), âge optimal pour la reproduction. Les souris de la descendance seront incluses dans le projet dès leur naissance et manipulées entre Jour 45 et Jour 60 pour les analyses comportementales, âge de référence pour la mise en évidence de troubles du spectre autistique sur le plan comportemental avec les outils utilisés.

Opérées pour une injection virale dans le cerveau puis soumises à trois sessions d'enregistrement électrophysiologique sous anesthésie, 20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale de prélèvement. L'objectif déclaré est de cartographier un circuit reliant cortex préfrontal, thalamus et hippocampe pour comprendre les mécanismes de la dépression. Les retombées thérapeutiques annoncées restent au conditionnel et à long terme, l'étude visant d'abord à décrire l'activité de ce circuit. Le porteur affirme que la complexité du cerveau des mammifères rend le modèle animal irremplaçable, tout en concluant que ces travaux préparent un remplacement futur.

Objectifs

Des découvertes scientifiques récentes ont identifiées la dysrégulation des circuits neuronaux, en particulier ceux émergeant du cortex préfrontal, comme jouant un role central dans les mécanismes neuropathologiques des troubles psychiatriques tels que la dépression. Ce projet vise à caractériser les mécanismes électrophysiologiques du circuit neural reliant le cortex préfrontal, le noyau réuniens du thalamus et l'hippocampe. L'objectif est de comprendre comment l'activation du cortex préfrontal par des techniques pharmacogénétiques se propage à travers ce circuit pour influencer l'activité neuronale dans les structures cérébrales impliquées dans la régulation de l'humeur.

Bénéfices attendus

Cette recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques sous-tendant les troubles de l'humeur, en particulier la dépression. Les connaissances acquises sur le fonctionnement de ce circuit neural essentiel contribueront au développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant spécifiquement ces voies neuronales. Cette étude fournira également des bases scientifiques importantes pour la recherche translationnelle en psychiatrie.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie pour injection virale réalisée sur animal anesthésié et analgésié ( durée 60-90 minutes). Puis ils subiront 3 injections d’une molécule active réalisée sur animal vigile (durée moins de 1 minute) afin de faire trois sessions d'enregistrements de l’activité électrique des cellules nerveuses du circuit ciblé sur animal anesthésié et analgésié ( 3 sessions de 60 minutes chacune). Des injections intrapéritonéales d'activateur pharmacogénétique seront administrées (20 souris, 3 injections). Les animaux seront soumis in fine à une chirurgie terminale afin de prélever du tissu pour analyse.

Impact sur les animaux

La procédure de chirurgie pour injection virale pourrait induire une douleur modérée ainsi que des réactions inflammatoires locales. La gène occasionnée par le capot collé sur le crâne pour protéger la zone d'enregistrement est mineure, celui-ci pesant moins d’un gramme. L'injection de l'activateur chemogénétique peut induire une douleur aiguë de courte durée liée à l'injection. Ce composé n'a pas d'effets secondaires non spécifiques connus à la dose utilisée. Aucun effet secondaire comportemental n’est attendu suite à l’activation du cortex préfrontal, hormis un effet antidépresseur et un effet anxiolytique léger.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement et analyse des tissus.

Remplacement

La complexité du cerveau des mammifères est unique. Bien qu'il soit maintenant possible d'étudier de nombreux problèmes neurobiologiques sur des cellules isolées ou des cultures de tissus, l'utilisation de modèles animaux ne peut être remplacée dans ce projet. Les connaissances sur les mécanismes électrophysiologiques du circuit préfrontal-réuniens-hippocampe sont bien trop limitées, et de fait aucun modèle in silico (tels que les cérébroïdes) in vitro n'existe pour modéliser l'activité de ce circuit complexe. Il s'agit d'un réseau neuronal faisant intervenir plusieurs types cellulaires spécifiques et régions du cerveau, avec de nombreuses protéines et neurotransmetteurs impliqués. En outre, l'étude de l'activité électrophysiologique in vivo est primordiale pour comprendre les patterns d'activation neuronale dans des conditions physiologiques. De plus, cette étude permettra d'en apprendre plus sur ce circuit et fera avancer les connaissances en vue d'un remplacement futur.

Réduction

La taille des échantillons a été déterminée sur la base d'une vaste expérience de laboratoire et a été vérifiée par une analyse de puissance mathématique. L'approche d'enregistrements séquentiels permet une réduction significative du nombre d'animaux nécessaires, chaque souris servant pour les trois sites d'enregistrement au lieu de nécessiter des groupes séparés pour chaque structure. Cette stratégie optimise l'utilisation des animaux selon les principes des 3R.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages enrichies leur permettant d'exprimer les comportements naturels de l'espèce : matériel de nidification (carrés coton, frisure), tunnel (également utilisé pour le change des animaux) et bâton à ronger. La chirurgie d’injection virale est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Durant toute la procédure l’animal est placé sur un tapis chauffant thermostaté à 37°C et relié à une sonde rectale afin de limiter l’hypothermie induite par l’anesthésie. Une pommade ophtalmique sera appliquée sur les yeux empêchant la déshydratation oculaire. Avant le début de la chirurgie, une couverture antalgique multi-modale sera faite. L’hydratation de l’animal sera assurée pendant et après la chirurgie par injection d’une solution saline stérile. Puis , l'animal sera replacé au sein de sa cage, maintenue sous lampe chauffante infrarouge afin de maintenir sa température corporelle jusqu'à son réveil complet. Puis l’état de santé des animaux sera suivi pendant 3 jours et évalué à l’aide d’une grille de score. Des points limites ont également été pré-définis afin de déterminer quand arrêter chaque procédure expérimentale afin de prévenir la souffrance animale et garantir la qualité des résultats. Les enregistrements électrophysiologiques sont également réalisés sous anesthésie, et avec analgésie post-opératoire En fin de procédure la chirurgie terminale sera réalisée sur l’animal après arrêt respiratoire. Le système de skull cap permet de réduire considérablement le stress lié aux interventions répétées en évitant de nouvelles incisions cutanées. Les animaux seront habitués à être manipulés pour minimiser le stress lors de la procédure.

Choix des espèces

Les cerveaux murins et humains possèdent de nombreuses similitudes, notamment des régions et circuits analogues (système limbique, cortex préfrontal) permettant de modéliser des réactions et phénotypes neurobiologiques comparables à ceux observés chez l'homme. Le circuit d'intérêt pour le projet est bien conservé entre la souris et l'homme, avec des projections anatomiques et des propriétés électrophysiologiques similaires. Les techniques d'enregistrements électrophysiologiques aigus sont largement établies et standardisées chez la souris, permettant une caractérisation précise de l'activité neuronale dans ces structures. L'utilisation de la souris s'inscrit dans la continuité de nos projets de recherche précédents, permettant une comparaison directe des résultats électrophysiologiques avec les données comportementales déjà obtenues dans notre laboratoire. Notre étude sera effectuée chez l'adulte jeune (8-14 semaines). L'étude repose sur l'exploration des enregistrements électrophysiologiques et nécessite que les systèmes neurobiologiques soient totalement matures (développement total des systèmes cognitifs et émotionnels, et des structures cérébrales cibles).