Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
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- Système gastrointestinal
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- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Influence des récepteurs 5-HT4 corticaux sur le potentiel d’antidépresseurs à action rapide des agonistes des récepteurs 5-HT4.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
129 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Chacun subit une ablation des bulbes olfactifs par chirurgie intracérébrale d'environ trente minutes, puis une seconde opération onze jours plus tard pour poser un dispositif d'administration continue, avant deux séances d'observation de dix minutes de son activité motrice. Cette ablation sert à reproduire chez le rat un état dépressif, afin de mesurer la vitesse d'action de molécules agissant sur un récepteur de la sérotonine. Le porteur affirme que les rats opérés ne présentent aucune altération comportementale caractéristique d'un stress, d'une souffrance ou d'un inconfort, dans un modèle dont l'intérêt repose précisément sur l'état dépressif que cette ablation installe.
Objectifs
Les molécules actuellement disponibles pour le traitement de la dépression et des troubles de l'humeur sont loin d'être optimales. En effet, seuls 1/3 des patients répondent pleinement aux médicaments, et même dans ce cas, on n'observe une amélioration thérapeutique qu'après plusieurs semaines d'administration continue, un problème qui peut s'avérer crucial dans les cas de crise suicidaire. Il a été montré que des composés capables d'agir en activant un type particulier de récepteur à la sérotonine (un neurotransmetteur présent dans le cerveau des mammifères) présentaient un potentiel d'antidépresseur rapide dans des modèles expérimentaux, se montrant efficaces après seulement 3 jours de traitement. D’autres travaux menés sur le fonctionnement des neurones du cerveau de rat ont clairement indiqué que la capacité de ces composés à agir sur les zones cérébrales qui contrôlent l'humeur sont "freinées" en raison de l'existence d’autres récepteurs qui ressemblent aux premiers cités, mais ayant une autre fonction dans le cerveau. Très récemment, nous avons développé un outil génétique qui permet d'éliminer sélectivement ces récepteurs responsables de l’effet «parasite ». Ainsi, nous allons pouvoir disséquer les mécanismes intimes par lesquels nos composés améliorent l'humeur de façon très rapide. Pour cela, nous procèderons à un test comportemental connu et validé pour modéliser chez le rongeur la vitesse d'un traitement antidépresseur. Ce test nécessite une chirurgie, appelée « OBX » dans la nomenclature.
Bénéfices attendus
Cette étude devrait permettre de comprendre comment les composés à action antidépressive rapide agissent spécifiquement sur le fonctionnement des régions du cerveau concernées. Il deviendra alors possible de proposer la conception de nouveaux traitements contre la dépression, en concevant des molécules qui agiront directement sur les mécanismes mis à jour, sans mettre en jeu le "signal parasite" mentionné ci- dessus.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux chirurgies: la première durant laquelle sera réalisée l'OBX (environ 30 min par animal), la seconde 11 jours plus tard pour permettre d’administrer nos composés en continu (3-5 min par animal). Puis, 3 et 14 jours après cette dernière, les animaux seront soumis à deux séances de test comportemental d’une durée de 10 min, où on ne fera qu’observer leur activité motrice. Cela revient donc à 4 interventions sur la durée de vie à la mort de l'animal.
Impact sur les animaux
Le test OBX est connu et validé comme un modèle de test pour traitement antidépresseur depuis plus de 30 ans. Il repose sur la nécessité d’effectuer une chirurgie au préalable, avant de passer aux expériences comportementales proprement dites. Cette chirurgie provoque des douleurs modérées. Il a été montré que les rats opérés ne présentent aucune altération comportementale caractéristique d’un stress, d’une souffrance ou d’un inconfort particulier. La surveillance des animaux sera donc celle qui est classiquement mise en œuvre après une chirurgie intracérébrale, les risques de nuisance étant de type post-opératoire : infections, douleurs inflammatoires, réouverture de plaie. Nous suivrons les rats quotidiennement durant la semaine qui suivra l’opération, ainsi que les trois premiers jours de la semaine suivante. Le jour suivant, 11ème jour, aura lieu le début des traitements en continu. Il s’agit d’une chirurgie extrêmement minime, qui ne nécessite d’anesthésier l’animal que durant quelques minutes : aucune nuisance n’a été rapportée suite à l’utilisation de cette technique.
Devenir
A l'issue des procédures 1 et 2, tous les animaux seront mis à mort. Il sera nécessaire de prélever les cerveaux pour valider les chirurgies effectuées au préalable et analyser les effets des traitements pharmacologiques.
Remplacement
Dans ce projet, nous souhaitons valider, à l'aide d'une sortie comportementale, nos hypothèses issues de travaux menés sur le fonctionnement des circuits cérébraux impliqués dans l'efficacité des antidépresseurs. Par définition, un modèle comportemental ne peut pas s'effectuer autrement que sur le système intégré que représente un animal entier, et vivant.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d'animaux permettant l'obtention de résultats statistiquement fiables et robustes. Pour cela, nous avons procédé à l'estimation du minimum requis pour chaque groupe expérimental, en nous basant sur les acquis de nos précédents travaux, et sur des calculs statistiques. Sur cette base, nous avons déterminé qu'il sera nécessaire d'utiliser un effectif compris entre 12 et 15 animaux par groupe, en fonction de la variabilité propre à l’expérimentation. Nous avons ainsi établi un grand total de 129 rats nécessaires pour réaliser l’ensemble du projet.
Raffinement
En ce qui concerne le suivi des animaux, notre priorité sera de viser à favoriser au maximum leur bien être durant la totalité de l’étude. Un minimum de 10 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal dès leur arrivée à l‘animalerie. Ils seront placés en cages collectives par groupe de 2 individus, une pesée et une observation quotidienne durant la période post- opératoire seront réalisées afin de s’assurer du bon état des plaies chirurgicales, des sutures et du bien-être général. Les manipulations seront effectuées ou encadrées par du personnel formé et habitué à ce genre de gestes. Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux recevront un anti inflammatoire afin de lutter contre l’apparition de toute douleur éventuelle. En outre, nous utiliserons des anesthésiants locaux autour des zones opérées.
Choix des espèces
Toutes les expériences précédentes, ayant mené aux hypothèses qui sont à la base de ce projet, ont été réalisées chez le rat; il apparaît donc naturel d'utiliser cette même espèce pour en établir la validation comportementale. En outre, le modèle d'OBX, qui nous permet d'évaluer la cinétique d'effet d'un traitement antidépresseur potentiel, a été validé chez le rat et ne semble pas être transposable à la souris. Les rats seront utilisés au stade de jeune adulte (entre 7 et 9 semaines), correspondant à ce qui est classiquement choisi pour le test d'OBX.
Caractérisation d’une nouvelle lignée de souris transgénique porteuse d’une mutation responsable d’une maladie rare liée à la vitamine B12 (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
Porteuses de deux exemplaires d'une mutation qui provoque un déficit congénital en vitamine B12, une partie des souris de ce projet naît avec des malformations cardiaques, des retards de développement neurologique et une espérance de vie inférieure à six mois. 140 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 20 femelles reproductrices. Les souriceaux subissent à huit jours un tatouage et le prélèvement d'un fragment de queue, puis huit tests comportementaux enchaînés jusqu'à l'âge de trente jours. Le porteur annonce que 60 souris au génotype sans intérêt pour l'étude seront proposées à d'autres chercheurs et enseignants, toutes les autres étant tuées dans l'établissement.
Objectifs
Une nouvelle maladie liée à la vitamine B12 a été découverte en Europe et aux États-Unis. Elle s’appelle la « pathologie épicobalamine C ». Elle peut causer des problèmes graves chez les nouveau-nés, comme des troubles du cœur, une anémie (manque de globules rouges) et des problèmes neurologiques (liés au cerveau et aux nerfs). Cette maladie est due à un problème causé par un gène voisin de celui impliqué dans l’utilisation de la vitamine B12, c’est donc un effet indirect. Les scientifiques ne savent pas encore exactement pourquoi cela arrive chez l’humain, mais ils pensent que cela pourrait être lié au stress (comme le stress oxydatif). En 2024, des souris génétiquement modifiées ont été créées pour reproduire cette maladie. En 2025, des scientifiques en France ont commencé à élever ces souris pour observer leurs symptômes (comportement, cœur, sang, cerveau, etc.). Les souris porteuses de la maladie sont croisées entre elles pour obtenir des petits avec ou sans la maladie. Certaines souris recevront un traitement pour « réparer » le gène défectueux et voir si leurs symptômes disparaissent. Cette étude, menée en collaboration entre deux établissements utilisateurs situés sur le même campus, aidera à mieux comprendre la maladie et à trouver des solutions pour les humains touchés.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont la compréhension du dysfonctionnement provoquée par la mutation et la découverte de cibles thérapeutiques qui permettraient d'améliorer la prise en charge des patients. Les animaux porteurs des 2 exemplaires de la mutation traités avec le médicament devraient retrouver un aspect et un comportement normal, sans altération du métabolisme de la vitamine B12.
Procédures
Une partie des femelles gestantes (5 souris) sera traitée avec un médicament à faible dose administré par ingestion volontaire grâce à un mélange alimentaire avec du lait concentré sucré, très appétissant pour les souris, afin d’induire la recombinaison génique chez les embryons. Cette prise alimentaire du médicament ne durera quelques secondes. Le tatouage et le prélèvement d'un petit bout de queue chez les souris âgées de 8 jours (120 souris) sont réalisés en moins de 2 minutes afin de procéder à l'identification des souris. L’enchainement des 8 tests comportementaux sera réalisé tout au long de la vie des souriceaux dès l’âge de 8 jours et jusqu’à 30 jours, et chaque test ne dure que de 2 à 5 minutes maximum. Ces tests sont basés sur une observation des animaux (66 souris) libres de leur déplacement afin de tester leurs capacités d'apprentissage, de mémorisation, de coordination locomotrice et d'interactions sociales.
Impact sur les animaux
Les souris homozygotes mutants portant l’épimutation étudiée du gène Prdx1 ont un phénotype proche de celles déficientes pour le gène MMACHC, une souche que nous avons déjà étudiée par ailleurs. La conséquence est un déficit congénital en vitamine B12 qui induit des troubles cognitifs, des retards de développement neurologique et des malformations cardiaques, donc une fragilité physique chez les animaux d’intérêt et une espérance de vie à la baisse, inférieure à 6 mois. Par ailleurs, les souris subiront un geste invasif au moment du prélèvement tissulaire d’un fragment distal de queue (
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront utilisés afin de générer un effectif suffisant pour permettre de réaliser l'étude expérimentale qui sera basée sur l'utilisation d'animaux porteurs des deux exemplaires de la mutation. Les souris dites hétérozygotes (un seul exemplaire de la forme mutante et non mutante) issus des différents croisements et présentant un génotype sans intérêt pour l'étude, seront proposées à d'autres chercheurs et enseignants pour un replacement éventuel. Toutes les autres souris (femelles génitrices, descendants présentant les 2 exemplaires mutants ou non mutants) seront étudiées et mises à mort dans l'établissement utilisateur.
Remplacement
Les études humaines in vitro sur cultures cellulaires ont donné des informations sur les mécanismes moléculaires liant les mutations entre les 2 gènes d'intérêt mais ne permettent d’établir un lien clair entre stress cellulaire et déclenchement ou maintien de ces mutations, ni d’en comprendre les conséquences physiopathologiques. Ainsi, les études nécessitent un modèle in vivo intégrant les dimensions métaboliques, comportementales, inflammatoires et hormonales. A ce jour, aucune approche in vitro ou in silico ne permet de reproduire ces interactions de manière fonctionnelle et intégrée. Une approche sur animal entier est donc indispensable pour étudier ces mécanismes dans leur globalité
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire aux phases expérimentales suivantes est déterminé à l’aide d'un logiciel spécialisé en tenant compte de différents facteurs afin de déterminer les effectifs nécessaires et suffisants pour obtenir des données statistiques fiables. Les souris mutantes auront un comportement et un métabolisme bien différent des autres, ce qui nous indique qu'un effectif de 11 animaux par groupe d'étude sera nécessaire. Ainsi, en se basant sur des portées de 6 souris, 5 femelles gestantes traitées avec du tamoxifène devraient suffire pour générer 11 mâles et 11 femelles qui ne devraient plus avoir la mutation grâce au traitement tamoxifène (100% de la portée), tandis que 15 femelles gestantes sans traitement tamoxifène généreront 11 mâles et 11 femelles mutants et 11 mâles et 11 femelles non mutants. Ce protocole expérimental impliquera donc 20 génitrices (5+15) et 120 descendants (30+90).
Raffinement
Les souris sont élevées et manipulées dans un établissement utilisateur d’animaux à des fins scientifique ayant un statut sanitaire bien contrôlé. Le transport des animaux entre les deux EU se fait à pied car les établissements sont situés sur le même campus, à quelques dizaines de mètres de distance. Les cages sont placées dans des sacs noirs isothermes, et en période de froid (température inférieure à 15°C), deux blocs chauffants sont placés dans le sac afin de maintenir une chaleur suffisante pendant la durée du transport (moins de 5 minutes). Le traitement au tamoxifène sera réalisé grâce à une prise volontaire des souris en diluant ce produit dans du lait concentré. Pendant la gestation les souris seront pesées 2 fois par semaine pour suivre l’augmentation du poids corporel et la bonne santé de l’animal. Chez les descendants, la biopsie d’un fragment de queue sera réalisée selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables stress/douleurs, couplée à une anesthésie locale au moment du prélèvement. Les animaux seront ensuite surveillés quelques minutes pour vérifier la reprise d’une activité motrice normale. A l’issue de chaque test comportemental, les souris retournent dans leur cage d’élevage en présence de leurs congénères et sont laissées quelques minutes sous la surveillance de l’expérimentateur afin de contrôler leur bon état de santé (motricité, exploration, interactions). Des points limites ont été fixés en accord avec la structure chargée du bien-être animal afin de garantir la préservation du bien-être animal tout au long du protocole.
Choix des espèces
Ce projet nécessite la génération et la gestion d’un modèle murin génétiquement modifié porteur d’une séquence humaine qui n’existe pas chez la souris. La souris constitue l’espèce modèle de référence pour ce type d’approche, en raison de sa facilité de reproduction, de la disponibilité d’outils génétiques adaptés et à la validation internationale des protocoles métaboliques et comportementaux. L’utilisation d’un modèle portant la séquence mutante est indispensable pour reproduire le contexte génétique observé chez l’humain et évaluer ses conséquences physiopathologiques. La lignée utilisée ici a été spécifiquement développée pour reproduire le contexte génétique humain de façon ciblée. Les adultes reproducteurs seront utilisés à maturité sexuelle (8 semaines d’âge) pour réaliser les accouplements nécessaires à la production des portées expérimentales tout au long du projet. Les mutations seront recherchées à l'âge de 8 jours, à partir d’un prélèvement de queue , puis sevrés à J21, avec un suivi du comportement à l'âge de 3 jours jusqu'à 30 jours, puis finalement mis à mort à l'issue de ces tests.
Etude préclinique des déficits fonctionnels et de l’inflammation cérébrale dans différents modèles de traumatismes crâniens et dans une pathologie neurovasculaire associée : l’accident vasculaire cérébral (EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier l'inflammation cérébrale après un traumatisme crânien et un accident vasculaire, 760 souris vont être utilisées, dont 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un traumatisme crânien de quarante-cinq minutes leur est infligé, suivi pour une partie d'entre elles d'une ischémie cérébrale d'une heure trente, de quatre tests comportementaux que le RNT ne nomme pas et d'IRM sous anesthésie jusqu'à trois mois après le choc. Toutes sont ensuite ouvertes sans réveil pour le prélèvement de leurs organes. Le porteur écrit que les souris se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et n'émettent aucun son audible à l'oreille humaine, dans un projet où 520 d'entre elles subissent des procédures classées sévères.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) est un trouble neurologique majeur à l’échelle mondiale, encore mal pris en charge sur le plan clinique. Ils sont divisés en trois catégories selon leur gravité : léger, modéré et grave. Le TC induit une lésion émise par le choc initial qui peut provoquer ischémies et hémorragies, un dysfonctionnement immunitaire, une rupture de la barrière hémato-encéphalique ou encore une coagulopathie. Suite à un TC, une coagulation anormale est fréquemment observée chez les personnes touchées, menant à une aggravation des symptômes et du pronostic lors de la survenue de coagulopathies et pathologies neurovasculaires tel que l’accident vasculaire cérébral (AVC). Ce projet permettra d’étudier les déficits fonctionnels et inflammatoires dans différents modèles de TC chez un modèle murin et d’explorer a posteriori les modulations physiologiques potentielles qu’ils entraînent. Dans un second temps, cette étude se focalisera sur la caractérisation de l’inflammation cérébrale et des déficits fonctionnels chroniques sur des souris touchées par un AVC ischémique après un TC afin d'en analyser les mécanismes sous-jacents. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU).
Bénéfices attendus
Cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et des accidents vasculaires cérébraux qui peuvent en découler, et présentent un potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de possibles cibles thérapeutiques.
Procédures
- Traumatisme crânien (45 minutes), tests comportementaux (4 tests : 5 fois 30 secondes ; 5 fois 15 minutes (deux tests joints) ; 3 fois 5+5 minutes), pose de cathéter intraveineux pour injection d’agent de contraste (15 minutes), IRM anatomique et moléculaire (7 jours, 21 jours, 2 mois, 3 mois post-TC ; 35 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet. - Traumatisme crânien (45 minutes), modèle d’ischémie cérébrale (1h30), tests comportementaux (4 tests : 5 fois 30 secondes, 5 fois 90 minutes, 3 fois 15 minutes, 3 fois 5+5 minutes), pose de cathéter intraveineux pour injection d’un traitement et/ou agent de contraste (15 minutes), IRM anatomique (24h pré-AVC ; 8 minutes) et moléculaire (24h, 7 jours post-AVC ; 35 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet. L'ensemble des procédures chirurgicales, d'anesthésie et d'imagerie seront effectuées dans l'EU 1/2, et les tests comportementaux dans l'EU 2/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, une hypothermie (lors des phases d’anesthésies), des douleurs post-opératoires, du stress (notamment lors des phases de tests comportementaux), des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéique.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage et n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine. Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et des points limites ont été établis pour permettre un arrêt de protocole si nécessaire. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable comme les pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie, où la température corporelle centrale sera surveillée en continu à l'aide d'une sonde rectale et maintenue à 37°C à l'aide d'un coussin chauffant contrôlé placé sous les animaux. Les animaux recevront également une anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante de la respiration, alimentation, réactivité et comportement de l'animal pendant 24h, puis jaune de 24h à 48h après l’intervention, les 48h après chirurgie étant les plus critiques pour l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles.
Etude pilote technique : marquage de l’activité neuronale dans une tâche d’apprentissage rapide
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la moitié d'entre elles et modéré pour l'autre. Chacune reçoit une injection d'un marqueur génétique, soit par une chirurgie intracérébrale d'environ quarante-cinq minutes, soit dans une veine, puis passe un test d'apprentissage moteur sur cylindre en rotation ou un test d'exploration. Le projet ne cherche aucun résultat sur l'apprentissage lui-même, il sert à mettre au point la technique de marquage avant une étude ultérieure. Sur le remplacement, le porteur indique qu'aucune simulation informatique ne permet d'évaluer l'activité du cerveau pendant le comportement et que les structures étudiées sont absentes chez les invertébrés.
Objectifs
Pour comprendre comment le cerveau capture les expériences transitoires et les convertit en changements durables dans les circuits neuronaux, il faut identifier les ensembles spécifiques de neurones responsables du codage de chaque expérience. Cette étude pilote vise à tester une nouvelle méthode d'identification de population neuronales activées lors d'un test d'apprentissage rapide chez la souris, grâce l'injection d'un marqueur de l'activation encodé génétiquement.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote nous permettra de tester et mettre au point une technique de marquage d'activité neuronale efficace dans une tâche d'apprentissage rapide. Ces résultats serviront de base à une étude des mécanismes neuronaux de l'apprentissage rapide, en identifiant les neurones impliqués et manipulant les neurones identifiés, et permettront une réduction du nombre d’animaux nécessaires pour cette étude. De plus, ce travail servira également à tous nos autres projets : en effet, l'identification des ensembles neuronaux activés dans des situations contrôlées est fondamental pour l'étude de la physiologie et pathologies cérébrales
Procédures
Tous les animaux seront soumis à l'injection du marqueur d'activation, sous anesthésie générale. L'injection sera soit intra-cérébrale (chirurgie d'environ 45 minutes), soit intra-veineuse (moins d'une minute). Tous les animaux seront ensuite soumis à un test comportemental non douloureux, soit d'apprentissage moteur (cylindre en rotation, 5 essais de 5 minutes maximum par jour pendant 5 jours), soit d'aprentissage rapide (exploration pendant 10 min par jour pendant 3 jours)
Impact sur les animaux
La chirurgie d'injection intracérébrale sous anesthésie peut engendrer une douleur post-opératoire modérée de courte durée. L'injection intra-veineuse peut causer un saignement léger de courte durée peu douloureux. Les tests de comportements peuvent entrainer un stress léger de courte durée pour l'animal.
Devenir
La mort des animaux est nécessaire pour le prélèvement des cerveaux et l’identification des neurones qui ont été activés pendant la tache comportementale.
Remplacement
Aucune méthode de simulation informatique n'est suffisante pour permettre d'évaluer l'activité du cerveau lors du comportement. Les cultures cellulaires ne permettent pas d'étudier des mécanismes d'apprentissage observés chez l'animal in vivo. Les structures cérébrales étudiées ne sont pas présentes chez les invertébrés.
Réduction
Cette étude pilote technique vise à diminuer le nombre d'animaux utilisés dans notre projet scientifique en testant et optimisant une nouvelle méthode en amont avant de l'appliquer dans un projet comprenant de multiples groupes et conditions. De plus, ce travail servira également à tous nos autres projets : en effet, l'identification des ensembles neuronaux activés dans des situations contrôlées est fondamental pour l'étude des réseaux neuronaux, que ce soit dans des conditions physiologiques ou pathologiques. Nous utilisons le nombre minimal d'animaux par groupe pour obtenir des résultats exploitables. De plus, la stratégie expérimentale est choisie de manière à minimiser le nombre de groupes, chaque condition supplémentaire étant testée, ou abandonnée, à la lumière des résultats précédents. Le nombre d'animaux indiqué est donc un maximum qui ne sera probablement pas atteint.
Raffinement
Ce projet teste un moyen de raffiner le protocole d'injection pour nos projets futurs en remplaçant une chirurgie cérébrale par une injection intra-veineuse. Les souris sont hébergées dans une animalerie agréée et disposent de matériel d'enrichissement (coton pour faire des nids, petites maisons ou tubes pour se cacher). Toutes les mesures sont prises pour minimiser les nuisances subies par les souris: période d'acclimatation, anesthésie et analgésie appropriée lors des chirurgies, suivi post-opératoire quotidien pendant tout le temps nécessaire à la stabilisation. Le bien-être des animaux est contrôlé tout au long de leur utilisation et des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. L'animal est habitué à la manipulation par l'expérimentateur en amont des expériences pour réduire son stress.
Choix des espèces
Il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère pour obtenir des résultats potentiellement transposables à l'Homme, car les structures étudiées ne sont pas présentes, ou sont organisées différemment chez les autres vertébrés (et absentes chez les invertébrés). Parmi les modèles animaux mammifères, nous utilisons le modèle souris qui permet l'utilisation de lignées transgéniques nécessaires à la suite du projet. Les animaux sont utilisés à l'âge jeune adulte pour les tests comportementaux. Pour cela, l'injection du système de marquage est effectuée 2 à 4 semaines en amont (à partir de 4 semaines d'âge minimum)
Évaluation des effets comportementaux, physiologiques et neurobiologiques de l’obésité induite par un régime hyperlipidique et évaluation des leurres lipidiques comme stratégie thérapeutique.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Rendues obèses par un régime riche en graisses, 400 souris subissent des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements sanguins et tissulaires. L'objet est de mesurer l'anxiété, la dépression et les comportements compulsifs provoqués par ce régime, puis de tester une molécule qui stimule les récepteurs de la langue sensibles aux graisses sans apport calorique. Le porteur écrit avoir dimensionné son effectif avec un outil en ligne gratuit. Il annonce des tests comportementaux qu'il qualifie de non invasifs et conçus pour minimiser la souffrance, sans en nommer un seul, et décrit la mise à mort comme rapide et indolore.
Objectifs
L'obésité est une maladie complexe, souvent associée à des troubles comme la dépression ou l'anxiété. Parmi ses causes, on retrouve notamment une alimentation trop riche en graisses. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes biologiques reliant l’obésité et ces troubles du comportement, en utilisant une molécule qui agit sur les récepteurs de la langue sensibles aux graisses, sans apport calorique. Pour cela, nous étudierons les effets de cette molécule sur les comportements liés à l’anxiété, la dépression et les troubles compulsifs, induits par un régime riche en graisses. Le projet permettra d’explorer les liens entre obésité et santé lentale, déjà observés chez l’humain et confirmés par des modèles animaux, mais encore mal compris au niveau des mécanismes cérébraux, notamment ceux liés à l’inflammation du système nreveux. Cette étude vise aussi à identifier des marqueurs biologiques spécifiques de l’obésité et évaluer le potentiel thérapeutique de cette nouvelle approche. Ce projet pourrait ouvrir la voie à des solutions innovantes pour traiter à la fois l’obésité et ses conséquences psychologiques.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet devraient permettre de (1) mieux comprendre les liens entre le système digestif, le cerveau et les troubles du comportement (comme l’anxiété ou la dépression) provoqués par une alimentation trop riche en graisses. Cela inclut l’étude de la communication entre la langue, l’intestin et le cerveau, un axe encore peu exploré ; et (2) d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement contre l’obésité et ses conséquences sur la prise de poids, la santé métabolique (comme la régulation de la glycémie) et le comportement (réduction de l’anxiété, de la dépression ou des troubles compulsifs). Ce traitement pourrait être utilisé à la fois en prévention (pour éviter l’obésité) et en cure (pour traiter ses effets).
Procédures
Pour étudier les effets de l’obésité et des traitements, le comportement des animaux sera évalué à l’aide de tests non invasifs, conçus pour minimiser toute souffrance. Ces tests, bien que pouvant causer un stress léger et temporaire, seront précédés d’une période d’habituation afin de familiariser les animaux avec leur environnement et les manipulations. Les animaux subiront également des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, qui incluent des prélèvements sanguins. Ces procédures seront réalisées sous analgésie pour garantir leur bien-être. Enfin, à la fin de l’étude, les animaux seront mis à mort de manière rapide et indolore (en moins d’une minute), sous anesthésie et analgésie, conformément aux normes éthiques strictes en vigueur.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux permettent d’étudier les aspects émotionnels, cognitifs et sociaux des animaux. Bien qu’ils puissent causer un stress léger (lié à une restriction alimentaire temporaire ou à un isolement ponctuel pendant les tests), toutes les précautions sont prises pour limiter cet impact : habituation progressive des animaux aux manipulations, environnement contrôlé (température, luminosité, bruit réduit). Les tests physiologiques (tolérance au glucose et à l’insuline), essentiels pour évaluer les effets de l’obésité (comme l’insulinorésistance chez les souris), peuvent entraîner une légère douleur ou fatigue. Pour y remédier, une analgésie est utilisée avant et pendant les tests, les prélèvements sanguins sont minimisés, et une surveillance continue est mise en place pour détecter tout signe de détresse. De plus, les animaux sous régime riche en graisses (pouvant entraîner un surpoids) bénéficieront d’un accès facilité à la nourriture et à l’eau pour limiter les inconforts, et l’ajout d’enrichissement dans les cages permettra d’améliorer leur qualité de vie. En fin de l’étude, les animaux seront mis à mort de manière indolore (en moins d’une minute), sous anesthésie et analgésie, conformément aux normes éthiques européennes.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.
Remplacement
Ce projet combine une approche en culture cellulaire (méthode in vitro sans recours aux animaux) pour étudier finement le mécanisme d’action de notre molécule thérapeutique au niveau cérébral et ses effets sur différents types cellulaires, ainsi qu’une approche sur modèle souris, indispensable pour analyser des processus physiologiques complexes impliquant plusieurs organes (cerveau, langue, intestin, tissu adipeux, foie et pancréas). Bien que la culture cellulaire permette de réduire l’utilisation d’animaux, le modèle souris reste nécessaire pour une approche intégrée, notamment pour évaluer les interactions entre ces organes et valider l’efficacité globale de la molécule.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict nécessaire, tout en permettant d’obtenir des résultats fiables et scientifiquement valables. Pour définir cet effectif, un outil en ligne gratuit a été utilisé afin d’aider à concevoir l’étude de manière rigoureuse. Par ailleurs, des travaux antérieurs ont montré qu’un groupe de 15 animaux permettait d’obtenir des résultats statistiquement pertinents. Les données seront analysées au fur et à mesure de l’étude, afin de pouvoir arrêter les expérimentations dès que le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables sera atteint, limitant ainsi l’utilisation d’animaux au minimum indispensable.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes afin de préserver les interactions sociales naturelles, dans des cages transparentes adaptées et enrichies pour favoriser leur bien-être. Leur état général sera contrôlé quotidiennement. Dans le respect de la règle des 3R et des principes éthiques de l’expérimentation animale, des méthodes non invasives et des tests comportementaux seront privilégiés chaque fois que possible. Lorsque des gestes susceptibles de provoquer une douleur sont nécessaires, ils seront réalisés avec une prise en charge adaptée de la douleur. Les animaux seront habitués progressivement à une manipulation douce afin de limiter le stress, et les contentions seront réduites au strict nécessaire. Lors des tests de tolérance au glucose ou à l’insuline, des techniques permettant une manipulation plus douce seront utilisées. Après ces procédures, une période de repos d’une semaine, sans manipulation autre que la pesée hebdomadaire, permettra aux animaux de récupérer du stress et de la fatigue éventuels. En cas de signes de détresse ou de dégradation de l’état général, les animaux seront immédiatement retirés de l’étude, replacés dans leur cage de vie avec un accès libre à l’eau et à la nourriture, et surveillés quotidiennement. Si leur état venait à se détériorer de manière irréversible et à atteindre un seuil limite prédéfini, ils seraient retirés définitivement des expérimentations et mis à mort afin d’éviter toute souffrance inutile. Toutes les interventions seront réalisées par un personnel formé et qualifié, en nombre limité, garantissant un suivi attentif et individualisé des animaux.
Choix des espèces
De nombreuses études portant sur la thématique du projet ont déjà été réalisées chez la souris, qui constitue un modèle de référence largement utilisé pour l’étude de l’obésité et des organes associés. Ce modèle permet de comparer les résultats obtenus avec ceux déjà disponibles dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, car les systèmes biologiques étudiés doivent être pleinement développés. Cet âge permet d’éviter à la fois la période de puberté et les altérations physiologiques liées au vieillissement. Ce choix est adapté aux objectifs du projet, qui s’inscrivent dans une approche à la fois préventive et curative de l’obésité.
Effets de vésicules extracellulaires provenant de bactéries à propriétés anti-inflammatoires sur le développement normal et pathologique de l’intestin chez des rongeurs
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Rats : 320
Des rates sont mises en gestation pour fournir des ratons utilisés dès la naissance, puis renvoyées à l'animalerie pour y servir de nouveau : ce sont les 80 seuls animaux du projet à ne pas être tués. 1 580 animaux non-humains sont utilisés en tout, 1 280 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger. Les souris reçoivent un gavage deux fois par semaine pendant seize semaines, une bague posée dans l'oreille au sevrage, des prises de sang à la queue et des mesures de motricité intestinale sous anesthésie pouvant durer trois heures, à l'endoscope ou à la bille. Le porteur numérote quatre tests comportementaux sans en nommer aucun, et affirme qu'aucun effet indésirable des vésicules bactériennes n'est rapporté dans la littérature chez les rongeurs.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) touche plus de 40 millions de personnes dans le monde et a pour cause principale le vieillissement. Aucun traitement efficace n’existe pour prévenir, ralentir ou guérir la maladie. Elle est invalidante et entraîne une perte progressive des neurones au niveau du cerveau. Un des signes physiopathologiques majeurs de la MA est l’accumulation dans le cerveau d’un peptide appelé Abeta qui à la longue altère la connectivité des neurones. Plusieurs études montrent que les patients atteints de la MA ont également des altérations digestives pouvant se manifester de façon très précoce, avant qu’apparaissent les premiers signes cérébraux. De plus, les atteintes intestinales augmentent le risque de développer une forme sévère de la maladie. Enfin, il a été mis en évidence que les patients atteints de la MA souffrent de manière fréquente d’une altération du microbiote intestinal ainsi que de la quantité de métabolites produits par ce microbiote. L’inflammation est aussi une composante majeure de la pathologie et a été montrée comme stimulant la production de l’Abeta. Ce projet vise à apporter la preuve de concept qu’une approche thérapeutique utilisant des vésicules extracellulaires (VEs) bactériennes : 1) favorise le développement fonctionnel de l’intestin ; 2) prévient les altérations intestinales et/ou cérébrales chez un modèle murin de vieillissement accéléré évoluant vers une MA, ce qui pourrait ouvrir la voie à des traitements innovants ciblant le système nerveux entérique dans la MA. Les VEs seront produites à partir de bactéries à Gram+ ayant des propriétés anti-inflammatoires connues telles que Propionibacterium freudenreichii, une bactérie propionique laitière utilisée dans l’industrie agroalimentaire, et Faecalibacterium prausnitzii, une bactérie présente naturellement dans le microbiote intestinal. Du fait de leurs rôles ubiquitaires et leur biodisponibilité, les VEs sont perçues comme des acteurs et outils majeurs dans des approches thérapeutiques visant la santé humaine. De plus, des travaux récents montrent des effets bénéfiques de ces VEs dans des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Ce qui nous a permis d’émettre l’hypothèse que ces VES pourraient améliorer les fonctions et communications des neurones entériques et de la barrière épithéliale intestinale, baisser ou bloquer la neuro-inflammation intestinale et prévenir de ce fait les altérations des fonctions intestinales observées dans la MA.
Bénéfices attendus
Le déclin cognitif et digestif lié à l’âge représente un véritable enjeu pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées. De plus, améliorer les capacités cognitives est reconnu comme une stratégie visant à réduire le risque de développer des pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (MA). Le vieillissement du cerveau est aussi associé à des altérations au niveau intestinal dont la cause pourrait être le vieillissement/ altération des neurones et/ou de la paroi intestinale. Dans ce contexte, améliorer les mécanismes de communication neuronale au niveau intestinal pourrait aussi positivement impacter ceux du cerveau. C’est ainsi qu’une étude récente montre qu’une approche de supplémentation en probiotique montre des effets bénéfiques sur l’intestin et le cerveau dans un modèle murin de MA. Il apparait donc pertinent de penser qu’une approche utilisant des probiotiques non vivants comme les VEs provenant de bactéries ayant des propriétés anti-inflammatoires, aurait des effets bénéfiques sur le développement fonctionnel de l’intestin, mais aussi pourrait contrecarrer les effets délétères de la protéine responsable de la MA. Ainsi, la capacité de VEs d’intérêt à prévenir les altérations au niveau intestinal et leur mode d’action dans le développement fonctionnel normal et pathologique de l’intestin reste inconnu à ce jour et fait l’objet de cette étude.
Procédures
1. Elevage des souris transgéniques - pose de la bague d’identification au moment du sevrage bague avec crème analgésique, sur l’oreille de l’animal (20 sec/pose de bague) 2. Étude du développement intestinal - pesée quotidienne (10 sec sur la balance pendant 21/22 jours) - - administration quotidienne de VEs à la pipette (20 sec pendant 21/22 jours)- mesure du temps de transit total (apparition crotte rouge, 4h maximum) - mesure du temps de transit colique (8 prélèvements maximum de selles toutes les 15 min, 2h au total) - mesure de la perméabilité intestinale in vivo : - contention + gavage 2 fois/semaine avec les VEs (30 sec, pendant 16 semaines) - mesure de motricité in vivo (3h max de l’anesthésie au réveil) 3. Étude de vieillissement pathologique évoluant vers des pertes de mémoire caractéristiques de la MA - pesée 2 fois/semaine (10 sec sur la balance, pendant 16 semaines) - contention + gavage 2 fois/semaine (30 sec, pendant 16 semaines) - mesure du temps de transit total (apparition crotte rouge, 2h maximum) - mesure du temps de transit colique (8 prélèvements maximum de selles toutes les 15 min, 2h au total) - mesure de la perméabilité intestinale in vivo : contention + gavage (30 sec) + prélèvement de sang à la queue sur animal vigile (1*30 sec) - test comportemental 1 (5 min à 2 mois et à 6 mois) - test comportemental 2 (10 min à 2 mois et à 6 mois) -- test comportemental 3 (30 min + 10 min + 10 min à 2 mois et à 6 mois) - - test comportemental 4 (10 min + 5 min à 2 mois et à 6 mois) - mesure de motricité in vivo avec un endoscope (3h max de l’anesthésie au réveil à 2 mois et à 6 mois) - mesure de motricité in vivo avec une bille (30min max de l’anesthésie au réveil à 2, 3, 4, 5 et 6 mois)
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effets indésirables n’est reporté dans la littérature concernant l’administration de VEs bactériennes chez les murins. La technique du micropipette-guided drug administration devrait permettre de limiter le stress lié à l’administration de vésicules exracellulaires. Le gavage des souris est limité à 2 fois par semaine pour limiter le stress et la douleur liés à au gavage, bien que cet acte soit pratiqué par un personnel entraîné.
Devenir
Mise à mort de tous les ratons et toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour analyser les protéines, l’expression des gènes et les tissus. Les rates gestantes utilisées pour produire les ratons seront réutilisées à l’animalerie.
Remplacement
L’étude des effets bénéfiques de postbiotiques comme les vésicules extracellulaires sur l’intestin dans un contexte physiopathologique nécessite une étude in vivo non seulement des fonctions intestinales, mais aussi des capacités comportementales qui ne peuvent, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, le vieillissement et le développement de la maladie d’Alzheimer mettent en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinal, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.
Réduction
Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin nous ont permis d’identifier les vésicules extracellulaires d’intérêt parmi plusieurs types de vésicules extracellulaires bactériennes, réduisant de manière significative le nombre d’animaux nécessaire. Parallèlement, des expérimentations similaires menées chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et de réduire le nombre minimum d’animaux par groupe. Pour étudier l’effet des vésicules extracellulaires bactériennes sur le développement intestinal, nous avons réduit au nombre minimum le nombre d’animaux nécessaires pour nous permettre d’obtenir des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Les rates gestantes seront seules dans leur cage avec de l’enrichissement (frisottis, tubes) leur permettant de déchiqueter, de jouer, se cacher et préparer leur nid. Les ratons seront gardés avec leur mère jusqu’à la fin de l’expérience. Les souris seront au maximum 5 par cages et de l’enrichissement (frisottis, tubes) sera placé dans les cages leur permettant de déchiqueter, de jouer et de se cacher. L’ensemble des animaux sera également surveillé quotidiennement à l’animalerie avant et pendant la procédure expérimentale, y compris le week-end. Les animaux seront habitués à la présence de l’utilisateur grâce à une manipulation régulière pour limiter le stress lors des expérimentations. Nous avons également défini des points limites à nos expérimentations pour évaluer le bien-être de nos animaux et prendre en charge la douleur si elle a lieu.
Choix des espèces
Pour l’étude des effets de vésicules extracellulaires sur le développement fonctionnel de l’intestin en condition physiologique, le raton nouveau-né constitue un bon modèle adapté du fait de la facilité d’administration de composés par la technique d’administration à la pipette à partir de la naissance et la possibilité d’effectuer des études fonctionnelles après le sevrage. Le modèle de souris choisi est un bon modèle de la maladie d’Alzheimer car c’est un modèle de vieillissement spontané puisqu’il ne présente aucune introduction de nouveaux gènes pour induire des signes de la maladie. De plus, il se prête bien à des expériences de traitement à but thérapeutique comme la supplémentation avec des vésicules extracellulaires envisagée dans ce projet. Les travaux menés au sein du laboratoire in vitro ont également montré que ce modèle est pertinent pour l’étude du rôle de l’intestin dans la maladie d’Alzheimer. Les souris seront utilisées dès l’âge de 3 semaines et supplémentées de façon chronique par gavage jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus au vu de la littérature scientifique concernant la cinétique d’apparition des altérations au niveau de l’intestin ou du cerveau. Les rats seront utilisés dès la naissance pour pouvoir évaluer les effets bénéfiques sur le développement fonctionnel de l'intestin et sur la barrière épithéliale intestinale. En effet, la mise en place des mécanismes fonctionnelles de l’intestin telle que la motricité se fait très tôt et une intervention au-delà de cette fenêtre de temps risque de ne pas être efficace.
Etude de la régulation du pH cérébral par le flux sanguin dans un contexte sain et pathologique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à quinze séances d'imagerie de trois heures par animal, précédées pour une partie d'entre eux de deux chirurgies de quarante-cinq minutes et d'une heure : 548 souris vont être utilisées, dont 404 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur inclut dans son calcul d'effectif environ 20 % de mortalité par groupe. L'objet est de comprendre comment le flux sanguin cérébral évacue le CO2 et régule le pH du cerveau, chez des souris saines, vieillissantes, puis porteuses d'une angiopathie amyloïde, avec un prolongement vers la rétine pour tester si l'œil pourrait servir de fenêtre de diagnostic. Les souris du modèle pathologique sont utilisées entre six et dix-huit mois, âge auquel les plaques amyloïdes sont installées, et leur état en fin de procédure, avec une implantation crânienne lourde, exclut selon le porteur tout replacement.
Objectifs
L’objectif général du projet est de mieux comprendre le rôle du flux sanguin dans la régulation du pH et du CO2 cérébral dans un contexte sain et pathologique. Le CO2 est un déchet métabolique produit par l’activité cellulaire. Il doit être éliminé du cerveau via la circulation sanguine pour préserver l’homéostasie du pH tissulaire, car une accumulation de CO2 conduit à une acidose, qui perturbe le fonctionnement neuronal. Le CO2 est donc un régulateur majeur du débit sanguin cérébral. Toutefois, la façon dont le CO2 est échangé à travers la paroi des différents types de vaisseaux du cerveau et le rôle des cellules de l’unité neurovasculaire dans cette régulation demeurent non élucidé car les techniques pour étudier ces phénomènes manquaient jusqu’à présent. De récents travaux ont permis de développer des biosenseurs ou colorants fluorescents sensibles au pH ainsi que des approches méthodologiques pour étudier le rôle de la vascularisation cérébrale dans l’élimination du CO2. Ce phénomène sera étudié chez des souris saines, au cours du vieillissement, et dans un modèle murin d’angiopathie amyloïde cérébrale (AAC), une pathologie cérébrovasculaire fréquemment observée chez les individus atteints de la maladie d’Alzheimer, qui se caractérise par une accumulation de plaques amyloïdes au niveau des vaisseaux du cerveau. En effet, il semblerait que la régulation du pH cérébral soit altérée dans la maladie d’Alzheimer et l’AAC pourrait en être une des causes en perturbant l’intégrité et la fonction vasculaire. Les astrocytes sont des cellules de l’unité neurovasculaire impliquées dans la régulation du pH cérébral. Nous étudierons leur rôle dans la régulation des échanges de CO2 et de pH à travers la barrière hémato-encéphalique en modulant de manière génétique (souris transgéniques spécifiques) ou pharmacologique des transporteurs ou canaux de ces cellules impliqués dans le transport d’ions. Finalement, les résultats obtenus dans le cerveau seront également étendus à la rétine afin de vérifier si l’imagerie de l’œil pourrait être utilisé comme biomarqueur des pathologies cérébrovasculaires.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet pourraient avoir un impact majeur sur la compréhension de la neurophysiologie et la neuropathologie. Il est en effet fondamental de caractériser comment le cerveau régule son pH tissulaire, élimine le CO2 et réagit aux changements de pH et de CO2, et quelle est la contribution du flux sanguin cérébral et des astrocytes dans ce phénomène d’homéostasie. Cette caractérisation permettra ensuite de mieux comprendre les processus neuropathologiques des maladies cérébrovasculaires, plus particulièrement de l’angiopathie amyloïde vasculaire qui touchent les petites artères cérébrales par l’accumulation de dépôts de protéines. Enfin, les résultats sont concluants, ils pourraient mettre en lumière un nouveau biomarqueur pour ces pathologies qui pourraient être évaluées de manière non invasive avec l’imagerie rétinienne.
Procédures
Une partie des animaux recevra un traitement par injection (sans anesthésie) durant 3 jours consécutifs durant moins d’une minute. Une partie des animaux sera soumis à deux interventions chirurgicales (d’environ 45 minutes et 1 heure) à 5 jours d’intervalle minimum, sous anesthésiesie générale et analgésie. Tous les animaux seront observés au microscope biphotonique ou en imagerie ultrasonore sous anesthésiesie ou sous sédation durant 3 heures maximum ou éveillé durant 1 heure maximum et ce, au total 15 fois maximum durant le projet, toute imagerie et tout état confondu. Une partie des animaux recevra une injection de colorant (sans anesthésie) la veille de l’expérience d’imagerie durant moins d’une minute (une fois toutes les deux semaines maximum). Une partie des animaux pourra recevoir une injection de colorant juste avant l’imagerie, sous anesthésie durant moins de 10 minutes, maximum 4 fois, avec un intervalle de minimum 1 mois entre chaque injection. Durant les expériences d’imagerie, les animaux pourront recevoir une injection unique (durant moins d’une minute) ou une perfusion lente de colorants ou agent de contraste (durant le temps de l’expérience soit au maximum 3 heures), sous anesthésie. Les animaux observés éveillés suivront au préalable une habituation de deux semaines au poste d’imagerie.
Impact sur les animaux
Les animaux seront régulièrement manipulés par les expérimentateurs, ce qui pourra provoquer un stress. Les animaux recevront des injections pouvant provoquer un stress et une légère douleur chez l'animal éveillé au moment de l’introduction de l’aiguille. Les expériences d’imagerie de la rétine peuvent dans des cas très rares causer une lésion oculaire. Certaines injections pourront provoquer une douleur locale et transitoire au site d’injection et dans de rares cas des lésions locales. Les animaux sont exposés à un risque cardio-respiratoire, d’hypothermie ou d’hypoventilation durant les expérimentations sous anesthésie ou sédation. Une partie des animaux subiront des procédures chirurgicales, sous anesthésie générale, qui peuvent provoquer une douleur transitoire et une perte de poids les 3 jours suivants. Les animaux pourront être observés éveillés sous le microscope après une période d’habituation qui peut être stressante au début de l’apprentissage. Une partie des animaux recevra une perfusion de colorant (sous anesthésie ou sous sédation), durant l’expérience d’imagerie, ce qui peut provoquer parfois provoquer une douleur et un saignement transitoire.
Devenir
La condition des animaux en fin de procédure (âgés et avec une implantation chirurgicale importante) ne nous permettant pas de procéder à un replacement, ces derniers seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire. Le cerveau sera prélevé post-mortem sur 100 animaux pour des analyses histochimiques complémentaires.
Remplacement
Notre étude porte sur l’étude du cerveau, un organe très complexe, composé de nombreux types cellulaires, encore mal connu, et dont il n’existe pour le moment aucun modèle de remplacement fiable et pertinent pour répondre à notre question précise, qui est la régulation du pH cérébral. Par ailleurs nous étudions le flux sanguin cérébral, qui est absent dans tous les modèles in vitro et ex vivo. Finalement, notre étude de neurophysiologie nécessite de travailler à l’échelle d’un organisme entier afin de préserver la communication entre les différents organes et le système cardio-respiratoire (cerveau, cœur, poumons, …).
Réduction
Pour ce projet, nous utiliserons 548 animaux. Nous avons réduit le nombre d'animaux au maximum tout en s’assurant de l’obtention de données statistiques robustes d'après nos expériences passées sur ces modèles et en prenant en compte une certaine marge d’erreur inhérente aux aléas expérimentaux, dont environ 20% de mortalité par groupe Notre expertise d’imagerie fonctionnelle in vivo a un avantage considérable : elle permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans nos études car nous réalisons nos expériences d’imagerie sur des animaux vivants et en bonne condition physiologique. Nous pouvons ainsi réutiliser le même animal plusieurs fois au cours de l’étude. Aussi, nous pouvons étudier le cerveau et la rétine au sein du même animal, ce qui permet non seulement de réduire le nombre d’animaux, mais aussi d’augmenter considérablement la puissance statistique (analyses pairées) de nos observations et de nos corrélations en analysant des données de ces deux organes différents au sein du même animal.
Raffinement
Les animaux importés observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant le début des expérimentations ainsi que des temps de repos établis entre les différents actes expérimentaux. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec divers enrichissements (bâtons en bois à ronger, cotons pour nidation, et igloo et roue), avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous éviterons tant que possible l’hébergement individuel des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Des points limites ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure du bien-être animal (SBEA) pouvant mener à l’administration d’un traitement, à décaler dans le temps les actes prévus ou à euthanasier l’animal si cela est nécessaire. Durant les procédures, les animaux bénéficieront d’anesthésie ou sédation et d’analgésie adaptée à chaque acte réalisé. Durant l’anesthésie et la sédation, un gel ophtalmique est déposé sur les yeux, un suivi de température est réalisé et l’animal reçoit un apport d’air oxygéné. La chirurgie sera effectuée en condition stérile, sous anesthésie générale, analgésie et anti-inflammatoire ainsi que des anesthésies locales adaptés. Après la chirurgie et l’imagerie, les animaux recevront un antidote de l’anesthésique pour leur permettre de retrouver rapidement leurs capacités physiologiques et seront placés dans une cage de réveil chauffée et oxygénée jusqu’à leur réveil complet. Ils recevront une gelée nutritive après la chirurgie et un suivi postopératoire méticuleux de 3 jours avec pesée quotidienne sera mis en place. Les animaux observés éveillés suivront avant toute expérience un protocole d’habituation au poste d’imagerie et à l’expérimentateur pour diminuer le stress lié à cette procédure.
Choix des espèces
La souris est une espèce de mammifère dont la génétique et la physiologie est relativement proche de l’Homme, et chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques. Pour étudier l’impact de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser des animaux âgés, chez lesquels la pathologie amyloïde est bien installée. Aussi, pour la lignée transgénique pathologique et les contrôles, nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 18 mois afin de suivre l’évolution de la maladie dans le cerveau et la rétine et d’analyser les paramètres physiologiques à différents stades de la maladie (stade précoce, modéré et avancé). Pour les autres lignées, les souris seront utilisées à l’âge adulte, soit entre 2 mois et 12 mois maximum, car il est nécessaire d’observer des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures.
Validation d’implants neuronaux, neurophysiologie, comportement et neuroanatomie fonctionnelle cérébrale de la vocalisation chez le mini-porc
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Vingt-cinq des 60 mini-porcs de ce projet sont destinés à l'adoption, parfois avec des morceaux d'implants laissés au contact de leur cortex parce que les retirer mettrait leur vie en danger. Vingt-sept autres sont tués pour que soit examinée la réaction de leur cerveau aux électrodes, et huit sont opérés puis stimulés sous anesthésie sans être réveillés. Les animaux gardés vivants subissent jusqu'à dix anesthésies en vingt-quatre mois, des séances d'IRM d'une à deux heures, une chirurgie d'implantation crânienne suivie d'un isolement d'au moins vingt-quatre heures, et portent un capot fixé sur la tête, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente le mini-porc comme une "alternative éthique aux Primates Non Humains" et retient son cerveau parce qu'il bouge beaucoup, ce qui permet de tester la stabilité d'implants destinés à des personnes privées de parole.
Objectifs
Cinq millions de personnes dans le monde ont un déficit sévère de la parole suite à des traumatismes, lésions vasculaires, ou des maladies neurodégénératives. L’objectif des interfaces cerveau-machine pour la parole (BCI parole), est de permettre à certaines personnes de communiquer à nouveau grâce au contrôle d’une synthèse vocal à partir de leur activité cérébrale enregistrée à l’aide d’implants cérébraux. Afin d'optimiser les BCIs parole, ce projet vise à comprendre la dynamique cérébrale de la production de vocalisations et à valider de nouveaux implants corticaux capables d’enregistrer et de stimuler de façon stable et précise l’activité cérébrale sur le long terme avant leur utilisation chez l’homme. Le premier objectif est l’étude des bases corticales de la vocalisation chez le miniporc. Les BCIs parole chez l’homme utilisent des algorithmes nécessitant l’identification de caractéristiques pertinentes des signaux cérébraux liés à la production vocale et des zones cérébrales impliquées. Des implants à haute densité couvrant de manière extensive le cortex permettront de préciser finement la dynamique spatio-temporelles corticale spécifique du contrôle volontaire de vocalisations chez le miniporc libre de ses mouvements et en interaction avec ses congénères. Ces données serviront de références pour le décodage de la parole chez l’homme. Des méthodes d’imagerie préciseront les voies anatomo-fonctionnelles impliquées. Le second objectif est de valider sur plusieurs mois la performance d’enregistrement/stimulation et la biocompatibilité de nouveaux implants cérébraux. Après validation in-vitro et chez le rat, des tests chez le miniporc viseront à déterminer leur performance et leur acceptabilité par le tissu cérébral dans une situation proche de l’homme. Contrairement au rat, le porc est très sensible aux infections, permettant de valider l’efficacité et la compatibilité des protocoles de stérilisation. De plus, la taille du cerveau permet de valider des dispositifs similaires à ceux qui seront utilisés chez l’humain. Enfin, les mouvements importants du cerveau de miniporc permettront de valider la stabilité des implants.
Bénéfices attendus
À court terme, cette étude servira à vérifier que les nouveaux types d’électrodes implantées dans le cerveau n’occasionnent pas de lésions ou d’effets indésirables, garantissant ainsi la sécurité et la tolérance des dispositifs implantés chez l’homme. Elle apportera également des connaissances nouvelles sur le cerveau du miniporc, dont la structure reste encore mal connue. Elle permettra enfin d’observer comment ces animaux communiquent et interagissent entre eux à travers leurs vocalisations et comportements sociaux. À long terme, ce projet de recherche s’inscrit dans un projet plus vaste destinés à développer des interfaces cerveau-machine pour redonner la capacité de communication à des personnes présentant un déficit sévère de la parole. Pour y parvenir, il est essentiel de mieux comprendre comment le cerveau produit la parole et d’identifier les zones précises impliquées dans ce processus. Cela permettra de savoir où placer les électrodes afin d’enregistrer les signaux électriques liés à la production de sons et de mots. Des premiers résultats préliminaires ont déjà montré que certaines régions du cerveau activées lors de vocalisations chez le miniporc sont similaires à celles activées lors de la production de la parole chez l’humain, ce qui rend le miniporc particulièrement intéressant comme modèle d’étude.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Avant la chirurgie, des séances d’imagerie IRM (environ 1 à 2h) et scanner (environ 30 minutes en plus du transport) seront réalisées sous anesthésie après injection. Pour le transport entre la zone d’hébergement (stabulation) et le service d’imagerie, les animaux seront anesthésiés par injection. La chirurgie d’implantation sera effectuée sous anesthésie gazeuse ou fixe. L’induction sera réalisée par 2 injections préalables d’anesthésiques, les animaux seront ensuite intubés ou maintenus au masque. Une perfusion sera également mise en place. Des traitements antalgiques et analgésiques seront administrés pendant la chirurgie ainsi qu’en période post-opératoire pendant une semaine. Après l’opération, si certains soins nécessitent une immobilité totale, des anesthésies de courte durée (2 heures) pourront être réalisées par injection. Les animaux subiront au maximum 10 anesthésies pour l’ensemble des procédures sur 24 mois. Des substances fluorescentes seront également injectées chez 4 mini-porcs. Pendant les anesthésie, des stimulations pourront être délivrées au niveau du cortex pour localiser les zones impliquées dans le contrôle des muscles impliqués lors des vocalisations.
Impact sur les animaux
Nuisances associées : - au transport : les animaux seront transportés dans des véhicules réglementaires pour les IRM et scanner. La durée de chaque transport n’excèdera pas 30 minutes. - à la chirurgie d’implantation : o hypothermie, douleurs si l’anesthésie et l’analgésie sont mal dosées pendant la chirurgie et les stimulations électriques o des douleurs, un inconfort du fait de la présence d’un capot sur leur tête, un risque d’infection au niveau de la zone d’implantation pendant quelques jours après la chirurgie. o l’isolement physique de l’animal durant environ 24h pourra également générer un stress après l’intervention chirurgicale - Au rejet ou un mauvais positionnement des implants
Devenir
Nous ferons en sorte que le maximum d’animaux puisse bénéficier d’une adoption (notamment lorsqu’un animal sera utilisé seulement pour évaluer la performance et la longévité des implants et non leur biocompatibilité). En pratique nous estimons que cela concernera au maxium 25 animaux sur les 60 prévus dans l’étude. Avant adoption, les connecteurs des implants seront retirés, ainsi que la chambre de protection et le ciment de fixation. Il est possible que certaines parties des implants (zones des électrodes au contact du cortex) ne puissent pas être retirées sans mettre en danger la vie de l’animal ou nécessiter une chirurgie lourde. Dans ce cas, nous chercherons à faire adopter l’animal avec les résidus d’implants non retirés si ceux-ci ne risquent pas de mettre en danger sa santé, et ce une fois que la peau recouvrant le crâne aura cicatrisé (environ 3 semaines). En général les animaux seront adoptés à un âge allant de 12 à 24 mois. Une partie importante de l’étude concerne la biocompatibilité des implants. Afin d’étudier la structure du cerveau de cochons qui ont été implantés de façon chronique ainsi que le comportement des implants, ces animaux devront donc être mis à mort (soit 27 animaux). 8 animaux serviront à des études de stimulation électrique sous anesthésie. Ces animaux ne seront pas réveillés après la chirurgie.
Remplacement
Avant tout test chez l’animal, les performances des implants seront d’abord évaluées in vitro dans des solutions tampon. Cela permettra de vérifier les propriétés électriques et électrochimiques des électrodes afin d’en optimiser le mode de fabrication. Une fois leur fabrication optimisée, des dispositifs seront alors testés chez l’animal pour évaluer leur performance in vivo dans le temps. Ce projet trouve 3 justifications à l’utilisation d’animaux : 1) Tester de nouveaux types d’implants avant leur utilisation chez l’homme nécessite une validation préclinique in-vivo. 2) L’étude des bases corticales de la vocalisation chez le miniporc est un sujet complètement inexploré et présente donc par lui-même un intérêt de recherche fondamentale important. 3) Les « BCIs parole » chez l’homme utilisent des algorithmes décodant les signaux corticaux afin de prédire la parole produite. Analyser ces signaux directement chez l’homme est possible chez des patients implantés pour des raisons médicales (épilepsie) mais le nombre et l’étendue de la couverture corticale des implants n’est pas contrôlable. Ici nous préciserons finement cette dynamique en couvrant de manière extensive le cortex avec plusieurs implants dans des zones spécifiques afin d’identifier les meilleurs signaux pertinents au décodage des vocalisations, ce qui pourra s’étendre au décodage de la parole chez l’homme.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux utilisés à chaque étape permettra d’obtenir des résultats utiles et reproductibles. Afin de réduire le nombre d’animaux, le même animal sera utilisé pour plusieurs protocoles à chaque fois que ce sera possible.
Raffinement
Durant leur séjour à l’animalerie, tout sera mis en œuvre pour que les animaux préservent au maximum une interaction sociale afin de diminuer leur stress. Pour tous les mini-porcs, une période d’acclimatation, essentielle pour réduire le stress lié au transport et à l’introduction dans un nouvel environnement, et ainsi améliorer leur bien-être durera au minimum 2 semaines. Au cours de cette période, les animaux seront habitués au personnel et aux routines et préparés aux procédures expérimentales en utilisant des jeux et un renforcement positif. Toutefois, après la chirurgie d’implantation, les animaux devront être isolés au moins 24h. Pour améliorer leur bien-être, ils cohabiteront dans la même pièce que leurs congénères mais dans un box différent avec des séparations transparentes ; cela leur permettra quand même d’interagir visuellement et auditivement quand ils sont séparés. Des jeux et/ou animations seront mis à disposition des animaux afin de leur créer un milieu enrichi (ballons, sons, etc.). Pour le bien-être des animaux, un traitement post-opératoire (antibiothérapie et antalgiques / analgésiques) sera administré systématiquement. Les animaux seront observés quotidiennement ou plus fréquemment si apparition de signes cliniques. Des points limites spécifiques découlant de l’utilisation d’une grille de scoring et d’un arbre décisionnel ont été définis afin d’éviter toute souffrance inutile. Pour la réalisation des examens d’imagerie, les animaux seront anesthésiés. Ils seront transportés dans un véhicule climatisé, à l’intérieur de cages de transport adaptées et conformes aux autorisations sanitaires en vigueur. L’anesthésie sera maintenue en continu depuis le départ de l’animalerie jusqu’au retour.
Choix des espèces
Outre son alternative éthique aux Primates Non Humains, le modèle porcin est beaucoup plus pertinent que le rat pour plusieurs raisons 1) Le mini-porc produit un nombre important de vocalisations différentes de manière spontanée, ce qui permettra de faciliter l’étude des zones corticales de la vocalisation. Par ailleurs, le porc est un animal social permettant d’étudier ces activités lorsque plusieurs animaux interagissent. 2) Le mini-porc est pertinent pour évaluer la biocompatibilité des implants et leur capacité à enregistrer l’activité neuronale et la stimuler électriquement de manière stable sur le long terme. Le miniporc est plus pertinent que le modèle rat car son cerveau est plus grand permettant de valider des dispositifs semblables à ceux qui seront ensuite utilisés chez l’homme. Par ailleurs, le cerveau de miniporc produit des mouvements importants, sources principales de l’instabilité des signaux chez l’homme et des contraintes d’implantation. Enfin, il présente les mêmes contraintes en termes d’asepsie, de stérilité et de chirurgie que pour l’homme. La chirurgie sera effectuée préférentiellement sur des animaux âgés de 3 à 6 mois à cause de contraintes anatomiques empêchant une implantation à des stades plus tardifs.
Étude d’un gène, facteur de protection de la maladie d’Alzheimer, chez la souris EU2/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
226 souris vont être utilisées, dont 202 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, les reproductrices et reproducteurs âgés étant réformés et tués eux aussi. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue, puis une injection dans le cerveau sous anesthésie, dont le porteur écrit qu'elle provoque une douleur aiguë "modérée à sévère" liée à l'incision, au forage et à l'inflammation locale, alors qu'aucune procédure du projet n'est déclarée sévère. À sept et dix mois, les animaux passent un test de reconnaissance d'objet et un test de mémoire en labyrinthe, les mâles le matin pour que la présence des femelles ne biaise pas les résultats. L'objet est de tester si une protéine du recyclage cellulaire limite l'accumulation de la protéine Tau, et le porteur compte parmi ses mesures de réduction le fait que la lignée soit déjà disponible sur place.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.
Procédures
Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.
Remplacement
Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau
Réduction
Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.
Choix des espèces
Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.
Etude préclinique des déficits fonctionnels et de l’inflammation cérébrale dans différents modèles de traumatismes crâniens et dans une pathologie neurovasculaire associée : l’accident vasculaire cérébral (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un traumatisme crânien de quarante-cinq minutes, pour une partie des animaux suivi d'une ischémie cérébrale d'une heure trente, puis des séances d'IRM à sept jours, vingt et un jours, deux mois et trois mois : 760 souris vont être utilisées, dont 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées par une chirurgie sans réveil qui permet le prélèvement des organes. Le porteur affirme que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et n'émettent aucun son audible à l'oreille humaine. Il annonce quatre tests comportementaux, en donne les durées à la seconde près, et ne dit pas lesquels.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) est un trouble neurologique majeur à l’échelle mondiale, encore mal pris en charge sur le plan clinique. Ils sont divisés en trois catégories selon leur gravité : léger, modéré et grave. Le TC induit une lésion émise par le choc initial qui peut provoquer ischémies et hémorragies, un dysfonctionnement immunitaire, une rupture de la barrière hémato-encéphalique ou encore une coagulopathie. Suite à un TC, une coagulation anormale est fréquemment observée chez les personnes touchées, menant à une aggravation des symptômes et du pronostic lors de la survenue de coagulopathies et pathologies neurovasculaires tel que l’accident vasculaire cérébral (AVC). Ce projet permettra d’étudier les déficits fonctionnels et inflammatoires dans différents modèles de TC chez un modèle murin et d’explorer a posteriori les modulations physiologiques potentielles qu’ils entraînent. Dans un second temps, cette étude se focalisera sur la caractérisation de l’inflammation cérébrale et des déficits fonctionnels chroniques sur des souris touchées par un AVC ischémique après un TC afin d'en analyser les mécanismes sous-jacents. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU).
Bénéfices attendus
Cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et des accidents vasculaires cérébraux qui peuvent en découler, et présentent un potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de possibles cibles thérapeutiques.
Procédures
- Traumatisme crânien (45 minutes), tests comportementaux (4 tests : 5 fois 30 secondes ; 5 fois 15 minutes (deux tests joints) ; 3 fois 5+5 minutes), pose de cathéter intraveineux pour injection d’agent de contraste (15 minutes), IRM anatomique et moléculaire (7 jours, 21 jours, 2 mois, 3 mois post-TC ; 35 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet. - Traumatisme crânien (45 minutes), modèle d’ischémie cérébrale (1h30), tests comportementaux (4 tests : 5 fois 30 secondes, 5 fois 90 minutes, 3 fois 15 minutes, 3 fois 5+5 minutes), pose de cathéter intraveineux pour injection d’un traitement et/ou agent de contraste (15 minutes), IRM anatomique (24h pré-AVC ; 8 minutes) et moléculaire (24h, 7 jours post-AVC ; 35 minutes). Une chirurgie sans réveil sera effectuée pour le prélèvement d’organes à la fin du projet. L'ensemble des procédures chirurgicales, d'anesthésie et d'imagerie seront effectuées dans l'EU 1/2, et les tests comportementaux dans l'EU 2/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, une hypothermie (lors des phases d’anesthésies), des douleurs post-opératoires, du stress (notamment lors des phases de tests comportementaux), des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéique.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage et n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine. Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et des points limites ont été établis pour permettre un arrêt de protocole si nécessaire. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable comme les pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie, où la température corporelle centrale sera surveillée en continu à l'aide d'une sonde rectale et maintenue à 37°C à l'aide d'un coussin chauffant contrôlé placé sous les animaux. Les animaux recevront également une anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante de la respiration, alimentation, réactivité et comportement de l'animal pendant 24h, puis jaune de 24h à 48h après l’intervention, les 48h après chirurgie étant les plus critiques pour l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles.
1.2. Titre du Projet : Effets de nouveaux inihbiteurs de la voie SPAK sur la cognition, le sommeil et les crises d’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Environ 400 souris reçoivent une injection de PTZ pour déclencher des crises d'épilepsie, une partie devant atteindre un état de crise prolongée. 2 040 souris vont être utilisées en tout, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 240 un niveau modéré, avec des implantations d'électrodes de cinq heures et des injections quotidiennes pendant sept jours. Le porteur écrit que l'injection de PTZ "ne provoque pas de douleur particulière" et qualifie les crises qui suivent de stressantes et fatigantes, sans autre précision sur ce que subit l'animal pendant le status epilepticus. Après chaque procédure, le cerveau est prélevé, ce qui suppose la mise à mort de tous les animaux.
Objectifs
Dans le cerveau, l’inhibition agit comme un frein qui empêche les signaux nerveux de s’emballer. Quand ce frein fonctionne mal, cela peut contribuer à des maladies comme l’épilepsie ou certains troubles psychiatriques. Pour mieux comprendre ces problèmes et imaginer de nouveaux traitements, nous avons étudié une voie de communication entre neurones, appelée SPAK, qui est anormalement activée dans certaines de ces maladies. Nous avons découvert un nouveau mécanisme qui contrôle cette voie et, grâce à des modèles informatiques, nous avons conçu des molécules capables de la réguler. En les testant sur des neurones cultivés en laboratoire et observés avec des techniques de microscopie avancée, nous avons vu que certaines molécules parviennent à bien contrôler cette voie, aussi bien dans des conditions normales que pathologiques. Cependant, leurs effets ne sont pas identiques selon qu’elles agissent sur des neurones « freins » (inhibiteurs) ou des neurones « accélérateurs » (excitateur), ce qui rend difficile de prédire précisément leur impact dans un vrai cerveau. La prochaine étape sera de tester ces molécules dans l’organisme pour comprendre comment le blocage de la voie SPAK influence l’activité des connexions entre neurones, le fonctionnement global du cerveau et différents comportements comme la mémoire, l’anxiété, le sommeil, les interactions sociales ou encore la sensibilité aux crises d’épilepsie chez la souris. Enfin, nous chercherons à comprendre plus en détail le rôle de cette voie dans les deux grands types de neurones.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment fonctionne une voie de communication encore peu étudiée dans le cerveau, appelée voie SPAK, et à tester l’efficacité de nouvelles molécules que nous avons développées (une invention déjà déposée et en cours de brevet). Nous espérons montrer que bloquer cette voie grâce à nos molécules pourrait protéger contre les crises d’épilepsie et améliorer des fonctions comme la mémoire, l’attention et les interactions sociales, tout en préservant un sommeil de bonne qualité. En étudiant des versions modifiées de cette voie dans différents types de cellules nerveuses, nous pourrons identifier plus précisément celles qui sont impliquées. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements contre certaines formes d’épilepsie, y compris celles associées à des troubles cognitifs ou du sommeil.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, plusieurs types de procédures seront réalisées sur les animaux expérimentaux. 1. Chirurgies sous anesthésie générale (1 à 2 fois par animal) o Injections cérébrales : administration de vecteurs viraux, d’une durée d’environ 1 heure par animal. Nombre total prévu : ~624 animaux. o Implantations d’électrodes : chaque intervention dure environ 5 heures. Nombre total prévu : ~800 animaux. 2. Évaluations comportementales (animaux vigiles) Des séances d’observation et d’évaluation comportementale sont planifiées, pour un total d’environ 260 souris. 3. Induction de crises d’épilepsie aiguës (animaux vigiles, 1 fois par animal) o Les crises seront induites par administration de PTZ. o Durée de chaque session : environ 1 heure. o Nombre total prévu : 400 souris. 4. Injections répétées (animaux vigiles) o Injections intrapéritonéales (IP) : 1 injection par jour pendant 7 jours, pour ~312 souris. o Injections intraveineuses (IV) : même protocole et durée que les injections IP, pour ~312 souris. o Injections IV ou IP (expériences principales) : 1 injection par jour pendant 7 jours, pour un total d’environ 792 souris, après détermination du mode d’injection le plus adapté sur la base des expériences de contrôle.
Impact sur les animaux
Les injections (sous la peau, dans l’abdomen ou dans une veine) ainsi que les différents tests comportementaux réalisés sur les souris adultes peuvent provoquer un léger stress. Celui-ci est lié à la manipulation nécessaire pour l’injection ou au fait de se retrouver dans un environnement nouveau. Pour l’induction de crises d’épilepsie, les souris reçoivent une seule injection sous la peau d’une molécule appelée PTZ. Cette injection ne provoque pas de douleur particulière, mais les crises qui suivent sont stressantes et fatigantes pour l’animal. Dans le cadre de certaines expériences, il est nécessaire que l’animal atteigne un état de crise prolongée (status epilepticus). L’implantation d’électrodes pour mesurer l’activité musculaire, cardiaque ou cérébrale, ainsi que les injections cérébrales de virus pour cibler certains types de cellules, nécessitent des chirurgies sous anesthésie générale. L’implantation d’électrodes pour l’enregistrement de l’électromyogramme (EMG) et de l’électrocardiogramme (ECG) et du potentiel de champ (LFP), ainsi que l’injection stéréotaxique de vecteurs viraux dans des types cellulaires spécifiques, impliquent une intervention chirurgicale susceptible d’induire une douleur résiduelle, considérée comme modérée après application des mesures de raffinement.
Devenir
Après chaque procédure, le cerveau des animaux est prélevé pour permettre des analyses scientifiques.
Remplacement
Nous avons réalisé des expériences en laboratoire sur des cellules de l’hippocampe, une région du cerveau, et ces tests montrent que nos molécules pourraient agir sur la voie de signalisation SPAK. Pour vérifier leur potentiel thérapeutique, nous devons maintenant les tester chez l’animal éveillé. Cela nous permettra de mieux comprendre comment ces molécules agissent sur les cellules du cerveau, sur les circuits impliqués dans l’épilepsie et sur les comportements qui sont affectés par cette maladie. L’utilisation d’un modèle animal est essentielle, car elle permet de conserver les interactions naturelles entre les différents organes, ce qui n’est pas possible dans des études uniquement sur des cellules en laboratoire.
Réduction
Nous avons conçu ce projet pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en gardant un nombre suffisant pour obtenir des résultats fiables. Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été déterminé à partir des données de nos études précédentes et de calculs statistiques précis. En pratique, nous utiliserons 10 animaux par groupe. Les deux sexes, mâles et femelles, seront inclus dans nos expériences. De plus, les mêmes animaux seront utilisés pour tous les tests comportementaux, en commençant toujours par les tests les moins stressants afin de limiter leur inconfort. Enfin, les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques adaptées pour garantir la fiabilité des conclusions.
Raffinement
Toutes les procédures chirurgicales de ce projet seront réalisées sous anesthésie générale ou locale, sur un tapis chauffant, et avec l’utilisation d’antalgiques pour limiter la douleur. Les injections et prélèvements seront faits en suivant les bonnes pratiques vétérinaires. Les souris seront hébergées par petits groupes, avec un maximum de 5 animaux par cage, et observées régulièrement pour vérifier leur état de santé. Avant chaque intervention, le poids et l’état général de chaque animal seront contrôlés. Si un signe de douleur ou de malaise est détecté, l’animal sera retiré immédiatement du protocole. Nous faisons tout pour réduire au maximum le stress et la douleur, en mettant en place des périodes d’habituation et en utilisant des anesthésiants et antalgiques adaptés. Le suivi quotidien de l’état des animaux (attitude, aspect du pelage, poids) permettra d’administrer un traitement supplémentaire si nécessaire ou, si un seuil critique est atteint, de retirer l’animal de l’étude. Enfin, lorsque l’euthanasie est nécessaire, elle sera réalisée dans une pièce séparée, pour éviter tout stress aux autres animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé en recherche en neurosciences. Elle permet d’étudier le comportement, de modifier certaines cellules du cerveau grâce à des techniques génétiques, et de reproduire des modèles d’épilepsie qui sont bien établis pour comprendre cette maladie chez l’humain. Nos expériences seront réalisées sur des souris adultes, car les changements dans le fonctionnement des molécules que nous étudions apparaissent après la naissance, dans des maladies comme l’épilepsie, certains troubles psychiatriques ou encore des troubles du sommeil.
étude de l’activité électrique de l’hippocampe chez le rat dans des environnements complexes
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 rats vont être utilisés, cinquante d'entre eux portant sur le crâne un implant d'enregistrement de 10 à 25 grammes et vivant seuls en cage pendant toute l'étude, jusqu'à six mois. Une chirurgie d'une heure trente à trois heures ouvre le crâne pour implanter les électrodes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour ces cinquante animaux et léger pour les dix autres. Tous sont soumis à un contrôle alimentaire continu pour être motivés à explorer une arène circulaire, une arène à quatre compartiments et à passer un test d'appariement différé, une à deux fois par jour, cinq jours par semaine. Les cinquante rats opérés sont tués pour vérifier la position des électrodes dans le tissu cérébral, les dix autres pouvant être affectés à d'autres projets ou proposés à l'adoption.
Objectifs
L’objectif principal de ces expériences est de comprendre comment les neurones de l’hippocampe du rat s'activent lorsque le sujet s'oriente dans un espace complexe, constitué de plusieurs compartiments connectés par des portes. L’hippocampe est une structure cérébrale fortement impliquée dans l’orientation spatiale et la mémoire. De plus, la dégénérescence de cette structure a lieu dans les phases précoces de la maladie d’Alzheimer, caractérisée dans ses premiers stades par des déficits d’orientation spatiale et de mémoire. L’hippocampe possède des neurones appelés cellules de lieu, qui s’activent spécifiquement lorsque le rat se trouve à un endroit précis de l’espace. L’ensemble de ces neurones fournit une représentation de l’espace, dite aussi carte cognitive, qui permet à l’animal de s’orienter et de mémoriser des lieux. Ces cellules de lieu, initialement découvertes chez le rongeur, existent aussi chez d’autres espèces de mammifères, comme la chauve-souris et l’humain, ce qui suggère que les mécanismes cérébraux à la base de l’orientation et de la mémoire spatiale sont très conservés au cours de l’évolution. Toutefois, la grande majorité des travaux déjà effectués ont étudié les propriétés de ces neurones dans des espaces très simples et uniformes, tels que des pièces uniques et vides. Or, la plupart des espaces dans lesquels les animaux (mais aussi les humains) se déplacent sont généralement plus complexes, puisqu’ils sont constitués de plusieurs lieux connectés entre eux. Comprendre comment l’hippocampe représente ce type d’espace est essentiel pour identifier la véritable nature de cette représentation neuronale. Cela pourrait également contribuer à mieux caractériser les déficits des personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer dans ses phases précoces, et fournir ainsi des pistes pour un diagnostic plus précoce de la pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la nature de la représentation spatiale des cellules de lieu hippocampiques, grâce à l’utilisation d’environnements complexes et connectés, plus proches des espaces naturels. La compréhension fine des mécanismes neuronaux sous-tendant cette représentation est essentielle pour appréhender non seulement son fonctionnement, mais aussi son dysfonctionnement dans le cadre de pathologies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Un total de 60 rats est utilisé dans cette étude. 10 rats réalisent une procédure comportementale seule (Procédure 1). Ils sont d'abord habitués à l'expérimentateur par une manipulation quotidienne pendant 10 jours, afin de diminuer leur stress. Après cette période, ils sont testés dans une tâche comportementale dans une arène. Chaque session a une durée de 20 minutes et est effectuée 1-2 fois par jour, à raison de 5 jours par semaine. Afin de motiver les animaux à effectuer cette tâche, ils sont soumis à un contrôle alimentaire durant toute la procédure. Le but de ce contrôle alimentaire est que l’animal puisse consommer une ration alimentaire journalière qui couvre l’ensemble de ses besoins (donc sans déprivation alimentaire), mais que cette ration se répartisse entre des croquettes standard (celles-ci sont fournies en quantité limitée dans la cage de vie) et des récompenses alimentaires (granulés sucrés) obtenues lors des tâches comportementales. Le poids corporel des animaux est mesuré régulièrement (1 à 3 pesées hebdomadaires) pour s’assurer que les animaux consomment assez de nourriture pour couvrir leurs besoins. Une consommation insuffisante se traduit par un poids inférieur à celui attendu pour l’animal compte tenu de son âge, son sexe et de sa souche. Si nécessaire, un supplément de croquettes et/ou granulés sucrés est fourni à l’animal. Les 50 animaux restants sont soumis à deux interventions (Procédure 2) : une procédure chirurgicale et la même procédure comportementale que pour la procédure 1, couplée cette fois-ci à l'enregistrement de cellules nerveuses. La procédure chirurgicale, d’une durée comprise entre 1h30 et 3h environ, permet l'implantation du plot d'enregistrement. Pour la procédure comportementale couplée à l'enregistrement des cellules nerveuses, les animaux sont également soumis à un contrôle alimentaire durant toute la période. Lors des enregistrements des cellules nerveuses, les animaux sont d'abord maintenus doucement par l’expérimentateur pour permettre le branchement du câble d'enregistrement sur le plot. Cette étape a une durée de 30-60 secondes. Afin de minimiser le stress des animaux, ils sont habitués à cette légère contention avant et après la chirurgie, au cours de séances quotidiennes de manipulation. Puis ils sont introduits dans le dispositif comportemental. La durée totale de l'étude est de 6 mois au maximum.
Impact sur les animaux
- Chirurgie : réalisée sous anesthésie générale profonde, d’une durée comprise entre 1h30 et 3h, elle entraîne une lésion au niveau du crâne, ainsi qu’un certain stress. Cette intervention comporte des risques de détresse respiratoire, d’infection et de douleur post-opératoire. Elle permet l’implantation d’électrodes dans l’hippocampe du rat. - Enregistrements neuronaux et tests comportementaux : - Le plot d’enregistrement auquel sont connectées les électrodes intracérébrales est implanté de manière chronique et entraîne une gêne modérée, liée à son encombrement et à son poids (10-25 g). Il nécessite un hébergement individuel afin d’éviter toute détérioration du matériel d’enregistrement par un congénère. Cet hébergement isolé entraîne une restriction des interactions sociales pendant toute la durée de l’étude. - Manipulations expérimentales : le branchement du câble d’enregistrement requiert une légère contention de l’animal afin d’assurer la stabilité du dispositif et la sécurité de la manipulation. Afin de motiver les animaux à l'apprentissage des tâches comportementales, un contrôle alimentaire est imposé en continu à l'animal et des récompenses alimentaires sont délivrées durant les tâches comportementales. Les animaux subissent donc un stress et un inconfort causé par ce contrôle alimentaire tout au long de l’étude. Les tests comportementaux utilisés sont : le test d’exploration libre dans une arène circulaire, effectué 2 à 3 fois par semaine (durée : 10 à 15 minutes) ; le test d’exploration libre dans une arène à quatre compartiments, effectué 1 à 2 fois par jour (durée : 20-30 minutes) à raison de 5 fois par semaine ; le test d’appariement différé, effectué 1 à 2 fois par jour (durée : environ 20 minutes), 5 jours par semaine. Les animaux subissent également une douleur liée à l’injection d’anesthésique lors de la mise à mort.
Devenir
A la fin des expériences les 50 animaux ayant subi une chirurgie seront mis à mort. Cette décision découle des objectifs de l'expérimentation, à savoir la vérification du bon placement des électrodes d’enregistrement intracérébral, qui requiert une analyse du tissu cérébral. Les 10 animaux restants n’ayant subi que des tests comportementaux (procédure de degré de sévérité légère), il n’est pas nécessaire de les mettre à mort en fin de procédure. Après avis du vétérinaire désigné, ces animaux peuvent éventuellement être affectés à d’autres projets, ou bien mis à l’adoption.
Remplacement
La nature même des expériences ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, les méthodes alternatives existantes, comme les études sur des réseaux de neurones artificiels, ne permettent pas de répondre à l'ensemble de questions posées puisque ces dernières nécessitent l'analyse de la relation entre les activités neuronales et le comportement.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux utilisés reflète la recherche d’un juste équilibre entre la nécessité de répliquer les observations afin d’obtenir des résultats statistiquement valables, et celle de réduire au minimum la taille des effectifs. Le nombre d’animaux ici présenté a été estimé sur la base de nos expériences antérieures à la fois sur le comportement et l'enregistrement de l'activité neuronale, et sur un test de puissance statistique permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux tout en ayant suffisamment de données pour une inférence statistique valide. Nous mettrons en place deux stratégies pour réduire le plus possible le nombre d'animaux utilisés. D'une part, nous allons tout d’abord caractériser l’activité neuronale des rats dans une tâche d’exploration libre dans une arène simple, ce qui nous permet de mieux idéntifier les cellules d'intêret selon des critères standard. Puis, nous commencerons à utiliser des systèmes d’enregistrement à haute densité (probes en silicone), qui permettent d’augmenter le nombre de contacts d’enregistrement et, par conséquent, le nombre de neurones enregistrés. Cette approche contribue ainsi à réduire le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont habitués à la manipulation et à la salle d’expérimentation pendant 10 jours avant le début du protocole afin de diminuer leur stress. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique puissant à action prolongée est administré en préopératoire, permettant ainsi de couvrir la phase postopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire et de la solution physiologique sont administrés en début d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal. Des points limites spécifiques ont été définis et seront appliqués tout le long de l'expérience. Leurs conditions de stabulation sont conçues pour attenuer le stress du aux procédures. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier. Ils sont hébergés dans des cages rehausées afin de permettre aux animaux de bouger aisément dans leur cage et de se rehausser sur les pattes arrières sans qu'ils soient gênés par le plot d'enregistrement.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude qui se situe dans le prolongement des travaux effectués précédemment dans l’équipe. Il est donc impératif de maintenir les mêmes conditions expérimentales, ce qui inclus l’utilisation de la même espèce. De plus, la majorité des études portant sur la caractérisation des cellules de lieux ont été réalisés chez le rat. On pourra se baser des connaissances bien établies pour poursuivre ce projet et ainsi éviter de multiplier les expériences et l'utilisation d'un grand nombre d'animaux. Les animaux seront testés à l'âge adulte. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour caractériser l'activité de l'hippocampe chez des animaux en comportement. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et celle de la littérature.