Système nerveux
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Rôle des récepteurs métabotropiques au glutamate dans le phénotype autistique des souris Fmr1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris porteuses de la mutation Fmr1 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies du cerveau sous anesthésie générale, l'une d'environ une heure pour une injection intracérébrale, l'autre pour implanter une canule et une fibre optique, puis reçoit des injections répétées et passe trois tests d'interaction sociale de dix minutes dans une arène. Le porteur cherche à savoir laquelle de deux voies nerveuses porte l'amélioration du comportement social observée quand une région du cerveau est stimulée. Il écrit que la mise à mort "constitue la solution la plus éthique et la plus conforme aux exigences scientifiques", après avoir précisé que les canules et les modifications cérébrales interdisent toute réutilisation des animaux.
Objectifs
Une petite région du cerveau joue un rôle important dans la régulation des interactions sociales chez la souris. Chez certaines souris qui présentent des difficultés sociales similaires à celles observées dans l’autisme, stimuler cette zone du cerveau améliore nettement leurs interactions. Cette zone reçoit des informations venant de deux endroits différents du cerveau. Nous voulons comprendre lequel de ces deux endroits est responsable de cette amélioration. Pour le savoir, nous allons d’abord empêcher l’un de ces deux chemins de fonctionner. Ensuite, nous activerons très précisément l’autre chemin grâce à une petite molécule qui peut être contrôlée par la lumière. Si l’amélioration disparaît lorsque le premier chemin est bloqué, cela voudra dire que c’est le plus important. Si l’amélioration est toujours là, alors c’est l’autre chemin qui joue le rôle principal. Nous réalisons cette expérience uniquement sur les souris présentant des difficultés sociales, car ce sont les seules qui permettent de répondre clairement à cette question.
Bénéfices attendus
Nous cherchons à comprendre comment le cerveau contrôle les comportements sociaux chez des souris qui présentent des difficultés proches de celles observées dans certains troubles du développement. Deux zones du cerveau pourraient être responsables de ces difficultés, et notre objectif est d’identifier laquelle joue le rôle principal. Pour cela, nous comparerons l’influence de deux chemins différents du cerveau et déterminerons lequel est indispensable pour améliorer le comportement social lorsque nous stimulons une région précise. Les résultats de ce travail permettront de mieux comprendre ce qui, dans le cerveau, contribue aux difficultés sociales observées dans ce modèle de trouble du développement. À long terme, ces connaissances pourraient aider à orienter des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour les personnes présentant des troubles du spectre autistique.
Procédures
Les animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première consiste en une chirurgie (environs 1h) d’injection dans le cerveau. La seconde consiste en une chirurgie d’implantation d’un dispositif permettant des injections et des stimulations ultérieures. Au cours du protocole, les animaux recevront plusieurs injections de médicaments. Certaines injections seront réalisées par voie intrapéritonéale, d’autres seront effectuées localement dans le cerveau à l’aide du dispositif implanté. Les animaux seront également manipulés pour être connectés à un dispositif optique et participer à des tests de comportement social réalisés dans une arène dédiée. Les animaux réaliseront trois tests de comportement de 10 minutes chacun.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont globalement modérés et transitoires. Après les chirurgies, les animaux peuvent présenter une douleur légère, une diminution d’activité ou de l’appétit pendant 3 à 4 jours, ainsi qu’un faible risque d’inflammation locale ou d’infection au niveau de la plaie. La présence de la canule peut entraîner une gêne mécanique durant quelques jours. Les injections intracérébrales peuvent théoriquement provoquer une réaction inflammatoire limitée, bien que jamais observée dans nos travaux précédents. Les manipulations (contention, connexion à la fibre optique, injections) peuvent générer un stress ponctuel, de très courte durée. Les injections intrapéritonéales peuvent causer une petite gêne immédiate au point d’injection. Les anesthésies comportent un risque faible d’hypothermie ou de ralentissement respiratoire, maîtrisé par une surveillance adaptée. L’ensemble de ces effets est généralement réversible en moins d’une semaine.
Devenir
À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés conformément aux méthodes réglementaires en vigueur. Cette étape est indispensable car les analyses finales nécessitent l’examen du cerveau pour vérifier la bonne localisation des injections, l’efficacité du knock-down et l’implantation correcte du matériel. Ces vérifications histologiques sont essentielles pour interpréter correctement les résultats et garantir la validité scientifique du projet. Par ailleurs, la présence des canules et les modifications cérébrales induites ne permettent pas de réutiliser les animaux dans un autre protocole. L’euthanasie constitue donc la solution la plus éthique et la plus conforme aux exigences scientifiques.
Remplacement
Pour mieux comprendre l’autisme et trouver de nouvelles pistes de traitement, les chercheurs ont besoin de modèles qui permettent de reproduire certains aspects de cette condition. Les souris utilisées dans ce type d’étude présentent des difficultés sociales qui ressemblent à celles observées chez certaines personnes autistes. Observer leur comportement est la seule façon de savoir si ces modèles sont fiables et s’ils peuvent réellement aider la recherche. C’est aussi la seule manière de tester si un traitement potentiel fonctionne : pour l’autisme, il n’existe pas de prise de sang, d’analyse ou de mesure biologique permettant d’évaluer l’amélioration. Tout repose sur le comportement. C’est pour cette raison que l’étude doit être faite sur l’animal entier, qui peut montrer toute la palette de ses comportements sociaux, d’exploration et d’interaction. Ces observations sont indispensables pour faire avancer la compréhension de l’autisme et le développement futur de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été choisi pour être le plus faible possible, tout en restant suffisant pour obtenir des résultats fiables, conformément aux recommandations éthiques. De plus, toutes les manipulations seront réalisées exclusivement sur des souris mutantes, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés en évitant l’inclusion de groupes supplémentaires non nécessaires.
Raffinement
«Nous mettrons en œuvre des mesures de raffinement visant à limiter au maximum la douleur, l’inconfort et le stress des animaux tout au long du protocole. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie adaptée, et une analgésie sera mise en place afin de réduire la douleur péri- et post-procédurale. Une surveillance clinique renforcée sera assurée après les interventions et au cours des manipulations, avec l’application de points limites adaptés permettant d’interrompre la procédure ou de mettre en œuvre les mesures appropriées si l’état de l’animal le nécessite. Après la chirurgie stéréotaxique, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (quatre souris par cage) et bénéficieront d’un enrichissement du milieu (matériel de nidification, cabane en carton). Les animaux seront habitués et manipulés quotidiennement par le même expérimentateur afin de réduire le stress lié aux manipulations. Comme l’autisme touche aussi bien les hommes que les femmes, nous utiliserons des animaux des deux sexes. Enfin, l’optopharmacologie constitue un raffinement supplémentaire, car elle permet d’utiliser chaque animal comme son propre contrôle grâce à l’activation et l’inactivation réversibles du composé par la lumière, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaires.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux, ce qui permet d’étudier facilement les difficultés d’interaction, un symptôme important observé dans l’autisme. Elles disposent aussi d’un répertoire de comportements variés, ce qui permet d’évaluer d’autres aspects liés à cette pathologie. Les troubles observés chez les souris utilisées comme modèle d’autisme sont suffisamment marqués pour vérifier que le modèle est pertinent et pour tester si certains traitements peuvent améliorer leur comportement. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), moment où leurs comportements sont pleinement développés et où les difficultés sociales sont bien établies.
Evaluation de l’efficacité de composés antiépileptiques sur un modèle rongeur d’épilepsie EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
165 souris vont être utilisées, chacune manipulée tous les jours pendant dix semaines, injectée environ dix-huit fois, opérée deux fois et transportée huit heures en camion entre deux établissements. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour prélever des tranches de cerveau. Une épilepsie est provoquée chirurgicalement, des électrodes sont implantées au cours d'une intervention d'environ deux heures, et l'activité cérébrale est enregistrée en continu jour et nuit, le porteur indiquant trois à quatre crises par jour. Il situe l'apport du projet dans la sélection et l'orientation de composés candidats, en amont des premières étapes précliniques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mesurer l’efficacité de molécules antiépileptiques dans un modèle d’épilepsie chez la souris. Ce projet sera réalisé dans deux établissement utilisateurs différents pour la création du modèle et la collection de datas. Des données récentes de la littérature scientifique indiquent que certains récepteurs neuronaux de l’hippocampe sont impliqués dans les mécanismes d’épilepsie temporale. L’hypothèse est que ces molécules anti-épileptiques que nous testerons vont alors cibler ces récepteurs afin de diminuer la fréquence et la sévérité des crises.
Bénéfices attendus
Notre projet permet de caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments antiépileptiques dans ce modèle. Nos techniques mise en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation des effets pharmacologiques sur le système nerveux central et sur ces explants de tissus vivants constitue une bonne approche car elle permet : - Dans un modèle de la pathologie une analyse des crises focales partielles ; - D’obtenir des enregistrements sur animal vigile lors des crises et du repos, des crises épileptiques ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons); Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement des composés testés avant de lancer les premières étapes précliniques.
Procédures
Les animaux sont manipulés tous les jours pendant 10 semaines pour les pesées. (EU1/2) Ils sont injectés tous les quatre jours en SC soit environs 18 injections sur 10 semaines (EU1/2) et (EU2/2) Ils subissent deux chirurgies : *Induction d’épilepsies de 15 à 20 min et une heure post opératoire (EU1/2) *Implantation des électrodes d’enregistrement environ deux heures (EU1/2) Une période d’enregistrement de l’activité électrique cérébrale (sans fil) synchronisée à un enregistrement vidéo 24h/24, 7j/7. (EU1/2) Un transport entre les deux sites (camion spécialisé, 8h de trajet en une seule journée) Et enfin une anesthésie gazeuse durant 5 min maximum. (EU2/2)
Impact sur les animaux
Nous avons des procédures qui peuvent amener à des effets indésirables : La procédure peut par : *-l’hébergement individuel des animaux génère du stress ; *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress ; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables de types inflammation induration au site d’injection, *- des conséquences des chirurgies avec des déshydrations, des infections possibles ; *- L’implantation des électrodes peut provoquer de l’inconfort*- l’état épileptique provoques des crises épileptiques à une fréquence de 3 à 4 par jour, de courte durée inférieure à 2 minutes en temps cumulé et par jour.
Devenir
Ce projet nécessitant une analyse fine de l'efficacité des antiépileptiques sur tranche de cerveau, nous devons mettre à mort tous les animaux de ce modèle..
Remplacement
Nos évaluations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons donc utiliser des animaux vivants pour cela. En effet, nos tests, permettent d’évaluer des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car les modèles informatiques actuels ne nous permettent pas d’appréhender la complexité de ces connexions anormales observées lors des crises épileptiques.
Réduction
Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 165 animaux pour la réalisation de ce protocole. Pour la partie ex vivo, nous réalisons des enregistrements multiples sur tranches de cerveau après mise à mort des animaux. Le même tissu étant utilisé pour plusieurs expériences d'électrophysiologie sur tranche, cela réduit le nombre d'animaux total nécessaire.
Raffinement
Les animaux utilisés au cours de la Procédure seront habitués, dès le départ aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Les sites d’injection seront légèrement modifiés pour éviter tout problème d’inflammation lors des traitements répétés. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à ces doubles chirurgies. Des traitements analgésiques permettant une gestion de la douleur post-opératoire seront appliqués. Le système d’enregistrement de l’activité cérébrale utilise un dispositif sans fil permettant à l’animal de se déplacer librement.
Choix des espèces
Les animaux utilisés au cours de la Procédure seront habitués, dès le départ aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Les sites d’injection seront légèrement modifiés pour éviter tout problème d’inflammation lors des traitements répétés. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à ces doubles chirurgies. Des traitements analgésiques permettant une gestion de la douleur post-opératoire seront appliqués. Le système d’enregistrement de l’activité cérébrale utilise un dispositif sans fil permettant à l’animal de se déplacer librement.
Détection et compréhension de la signalisation des rétinoïdes à l’aide de sondes issues de la chimie click
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Un gavage de quelques secondes, une seule fois dans la vie de l'animal, suffit à justifier l'utilisation de 360 souris. Elles sont 900 en tout, toutes tuées pour prélever leurs organes, 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 180 un niveau modéré, ces dernières subissant une chirurgie d'une vingtaine de minutes sous anesthésie générale. L'objet est de cartographier dans les tissus les formes actives de la vitamine A grâce à des sondes chimiques, méthode que l'équipe a déjà validée en culture cellulaire. Le porteur affirme qu'un remplacement est impossible et retient des souris de quatre semaines, âge qui selon lui limite aussi la durée d'élevage en captivité.
Objectifs
La vitamine A est indispensable au développement et à la physiologie des organismes vertébrés. Les données de nombreuses études scientifiques ont révélé des fonctions extrêmement complexes des formes actives de cette vitamine, dans quasiment tous les types de tissus composant notre organisme. Un déséquilibre de sa signalisation est associé à diverses pathologies, y compris des déficits immunitaires, visuels, et des maladies neurodégénératives. On connait encore peu de choses sur les mécanismes sous-tendant le transport, la biodisponibilité et/ou le stockage des formes (molécules) actives de la vitamine A ou rétinoïdes dans les cellules de l’organisme. Il s’agit de petites molécules qui, à la différence des protéines, sont impossibles à détecter par les méthodes classiques d’analyses de cellules et tissus en histologie et microscopie. Notre équipe a consacré plusieurs années à développer une méthode novatrice pouvant permettre une telle détection. Brièvement, elle repose sur une méthode développée dans le domaine de la chimie du vivant, récompensée par un récent Prix Nobel de chimie. Dans notre cas, et en collaboration avec une équipe de pointe en chimie du vivant, nous avons produit par synthèse chimique des formes modifiées de la vitamine A, et avons prouvé que ces formes réagissent avec des molécules sondes détectables, par exemple, par fluorescence. Cette méthode a été validée en particulier dans des systèmes de culture cellulaire. Le projet va maintenant permettre, pour la première fois, de détecter et de cartographier ces molécules rétinoïdes dans l’organisme au niveau cellulaire grâce à l’histologie et à la microscopie à très haute résolution. De plus, il sera possible de déterminer les formes moléculaires précises de rétinoïdes produites in vivo dans les tissus, en analysant ces molécules capturées dans des extraits tissulaires.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'identifier de nouvelles molécules bioactives à fort potentiel pour le traitement ou le diagnostic de diverses maladies neurologiques. Les nouveaux outils validés dans le cadre de ce projet seront essentiels pour déterminer leur localisation avec une résolution au niveau de la cellule. De telles connaissances permettront d'étudier et de faire progresser de manière significative notre compréhension de la physiolopathologie de plusieurs troubles neurologiques dont la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington. En effet, des travaux scientifiques ont indiqué un lien possible entre la voie des rétinoïdes et les causes possibles de ces maladies. L’amélioration des connaissances sur le métabolisme et la distribution des rétinoïdes au sein des tissus de l’organisme pourraient donc aboutir (en agissant sur cette voie biologique) à des stratégies pour la prévention ou le traitement de ces maladies. Au-delà des connaissances spécifiques sur ces maladies, les données obtenues devraient faire progresser les connaissances sur l'absorption et la signalisation des vitamines. Les techniques et outils spécifiques validés dans le cadre de ce projet devraient être applicables à toutes petites molécules biologiques et à leur analyse dans un organisme vivant.
Procédures
Des souris non-génétiquement modifiées âgées de 4 semaines recevront l’administration d’un soluté par gavage oral. Cet acte ne sera réalisé qu’une fois pour chaque animal, et ne durera que quelques secondes. Etant donné le nombre de molécules (solutés) et les temps post-administration à analyser, cet acte concernera 360 souris. D’autres souris seront soumises à des injections intra-péritonéales : 180 souris recevront une seule injection, 360 recevront une injection supplémentaire pour anesthésie générale, entraînant un endormissement rapide pour effectuer chirurgie terminale sans réveil et des prélèvements d'organes sans réveil. Chaque injection (seringue fine de type insulinique) ne durant que quelques secondes. Un acte chirurgical sera réalisé sur 180 animaux sous anesthésie générale. Cette procédure chirurgicale dure une vingtaine de minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les administrations de solutés par voie orale ou intra-péritonéale peuvent générer un stress de courte durée et un inconfort pour les animaux. Les procédures n’ayant qu’une durée totale de 1 heure (minimum) à 24 heures (maximum), les animaux pourront être surveillés pour tout signe d’inconfort. Les solutés injectés ne comportent pas de principe (molécule) directement actif, ils ne sont pas de nature à avoir un effet indésirable dans le laps de temps précédant la mise à mort de l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort, en vue du prélèvement et de l’analyse d’organes par des techniques de pointe.
Remplacement
Il n’est ici pas possible de remplacer le modèle animal, l’essence même du projet étant de pouvoir cartographier par une méthode novatrice, dans l’organisme et en condition de vie réelle - potentiellement jusqu’à l’échelle sub-cellulaire - les molécules et métabolites d’une voie de signalisation impliquée dans divers processus physiologiques ou pathologiques. Les données obtenues seront transposables et amélioreront les connaissances de ces processus dans l’espèce humaine.
Réduction
Dans notre projet nous utilisons un faible effectif d’animaux permettant toutefois d’effectuer des analyses statistiques (n=5). Ces effectifs ont été déterminés en fonction des données de la littérature et des procédures en vigueur dans l'animalerie. De plus, si l’une des deux voies d’administration des molécules rétinoïdes s’avérait plus efficace, elle sera immédiatement privilégiée, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
En vue de raffiner les procédures, les injections seront exercées par un manipulateur expérimenté. Ici, nous ne nous attendons pas à engendrer une douleur aux animaux lors des administrations orales ou injections de solutés. Il s’agira de plus d’actes isolés ou répétés seulement 1 ou 2 fois pour les injections en vue d’anesthésie générale. Les procédures chirurgicales sont ainsi réalisées sous anesthésie générale par injection d’un mélange d’anesthésie et d’analgésique afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. De plus, durant la chirurgie des précautions sont prises pour protéger les yeux des animaux d’un éventuel dessèchement. Les animaux sont préservés du refroidissement généré par l’anesthésie par l’emploi d’isolant durant l’opération et leur réveil se fait dans une enceinte chauffée. Finallement, des points limites ont été définis et seront appliqués. A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort par un personnel expérimenté.
Choix des espèces
La souris est une espèce mammifère dont les processus physiologiques sont dans l’ensemble proches voire comparables à ceux de l’homme. Il s’agit aussi, et ceci est particulièrement important, d’un modèle pour lequel de nombreuses lignées génénétiquement modifiées ont été créées, modèles de mutations et/ou de processus pathologiques affectant les humains. Les résultats de notre étude pourront immédiatement servir de base pour une exploration des voies biologiques impliquant la vitamine A dans n’importe lequel de ces modèles, si les données de la recherche le justifiaient. Les procédures concerneront des animaux âgés de 4 semaines, âge auquel le développement post-natal des organes (particulièrement le cerveau) peut être considéré comme complet. Ceci minimisera la durée d’élevage des animaux en captivité.
Exploration fonctionnelle de la contribution des fibres C-LTMRs dans la modulation de la douleur post lésionnelle – Étude pilote par IRM du manganèse
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
232 souris passent chacune une à cinq séances d'IRM sous anesthésie, de deux heures au maximum, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par gavage puis par injection dans l'abdomen des composés activant certains neurones sensitifs, plus un produit de contraste, et une partie d'entre elles une injection inflammatoire dans la patte qui provoque une hypersensibilité. Cette étude pilote cherche à voir si ces neurones du toucher affectif modulent la douleur, le porteur reconnaissant qu'aucune donnée antérieure ne permet de fixer l'effectif, calculé "en nous basant sur notre expérience passée". Toutes sont tuées à l'issue, leur mise en liberté étant jugée "inconcevable" du fait de leur modification génétique.
Objectifs
Il s'agit ici d'une étude dont l’objectif est d’explorer la biologie d’une classe particulière de neurones capables de convertir la stimulation mécanique du toucher affectif en message nerveux. Typiquement, chez l’humain, ces neurones interviennent dans la détection du toucher social ou affectif. De manière intéressante, des études récentes suggèrent que ces neurones pourraient également moduler la douleur ainsi que la réponse immunitaire cutanée. Toutefois, ces conclusions reposent sur des approches indirectes, et à ce jour, aucune étude ne fournit de démonstration directe de leur fonction chez l’être vivant, tant à l’état basal que dans la modulation de la douleur après une lésion. C’est précisément l’objectif de notre projet. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées chez lesquelles ces neurones peuvent être activés de manière sélective. Nous vérifierons s’il est possible de suivre par IRM fonctionnelle la réponse cérébrale induite par l’activation de ces neurones. Ensuite le projet vise à étudier par IRM fonctionnelle l’effet de la stimulation de ces neurones sur la réponse cérébrale induite par la douleur dans le but de trouver une stratégie thérapeutique de la douleur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude pilote seront la prise en charge de la douleur qui est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une classe particulière de neurones sensitifs, qui semblent avoir des propriétés de modulation de la douleur post-lésionnelle. Par conséquent, nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cérébraux impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par des lésions tissulaires. De plus, notre projet est conçu de sorte à permettre la découverte de nouvelle pistes thérapeutiques visant la modulation de ces fibres, qui pourraient avoir une application chez les patients souffrants de douleur chronique.
Procédures
Administration par gavage, puis par injection intrapéritonéale des composées activant des gènes. Administration d'un composé ciblant l'activation des neurones étudiés et injection d’un produit de contraste IRM chez toutes les souris, injection d'un produit inflammatoire chez une partie des animaux La durée de chaque intervention est 30 secondes. Toutes les souris subiront 1 à 5 sessions IRM sous anesthésie, ne pas dépassant 2 h chacune.
Impact sur les animaux
Nos données préliminaires indiquent que les doses des composés utilisées ici n’ont aucun effet délétère sur nos souris. Toutefois, l’administration par gavage peut induire un stress chez l'animal, tandis que l’injection de ces substances par voie abdominale peut occasionnellement entraîner une réaction inflammatoire locale, et l’utilisation spécifique du composé C21 provoque des mictions fréquentes durant l’heure suivant son administration. Certaines souris recevront une injection localisée d’un agent inflammatoire dans la patte; celle-ci génère une hypersensibilité susceptible d'entraîner une gêne transitoire. Les animaux seront examinés par IRM, l’IRM étant une procédure non invasive et réalisée sous anesthésie. Les effets indésirables possibles chez les animaux au cours de l'IRM sont le risque rare de défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, cet événement étant peu fréquent lorsque l’anesthésie est à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l’IRM permet de détecter rapidement les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie, assurant ainsi un réveil rapide des animaux.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue des procédures. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées, leur mise en liberté est inconcevable.
Remplacement
Notre projet de recherche vise à mieux comprendre le fonctionnement d'un certain type de nerfs responsables des sensations, comme le toucher ou la douleur. Pour cette étude, nous devons avoir recours à des animaux. Le projet respecte scrupuleusement les règles éthiques visant à limiter l'impact sur les animaux (la règle des "3R" : Remplacer, Réduire, Raffiner). L'utilisation d'animaux est indispensable ici, car nous voulons identifier les zones du cerveau qui réagissent à une substance capable d’activer certains neurones. Les méthodes alternatives ne sont pas possibles pour l'instant : Les cultures de cellules en laboratoire (organoïdes), bien qu'utiles, ne peuvent pas reproduire l'infinie complexité des connexions nerveuses, ni la structure du cerveau avec ses différentes régions et leurs spécialisations, ni modéliser les connexions entre les différentes parties du corps et le cerveau. Les simulations par ordinateur ne sont pas encore réalisables, car pour construire un modèle informatique fiable, nous avons besoin des données réelles que cette étude va nous permettre d'obtenir.
Réduction
Nous nous engageons à utiliser le moins d'animaux possible pour cette expérience. Pour cela, nous procéderons par étapes. Par exemple, pour tester la substance nécessaire à l'imagerie (le produit de contraste), nous commencerons par de faibles doses, jusqu’à ce que nous ayons trouvé la plus faible dose qui convienne. Cette stratégie évitera d'utiliser des doses inutilement élevées et de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés. Comme il n’existe pas de données antérieures sur lesquelles nous appuyer, il est difficile de prévoir exactement combien de souris inclure. Nous avons calculé ce nombre en nous basant sur notre expérience passée en imagerie cérébrale (IRM) et sur celle de nos collaborateurs spécialistes de ces souris génétiquement modifiées afin de garantir que nos résultats soient fiables tout en utilisant le minimum de souris.
Raffinement
Nous faisons tout notre possible pour améliorer le bien-être des animaux et minimiser le stress et la douleur à chaque étape du projet. Les animaux bénéficieront d’un temps d'adaptation. À leur arrivée, nous laisserons les souris s'habituer tranquillement à leur nouvel environnement pendant 14 jours. Les chercheurs passeront également du temps avec elles pour qu'elles ne le perçoivent pas comme une menace. Les animaux bénéficieront d’un suivi clinique régulier. Après chaque intervention, nous surveillerons les animaux au minimum une fois par jour. Nous utiliserons une grille d'évaluation permettant de déceler des signes de de souffrance et d’intervenir rapidement. Toutes les séances d'imagerie (IRM) se feront sous anesthésie, ce qui évitera le stress et l’anxiété chez les souris. L'état physiologique de l'animal (respiration, rythme cardiaque) sera surveillé en continu via un monitoring pour garantir sa sécurité et son confort. Enfin, nous avons défini des points limites pour ne jamais laisser un animal souffrir inutilement. Si l'un de ces seuils est atteint, nous procéderons à une euthanasie.
Choix des espèces
Chez la souris, la population de neurones sensitifs ciblée dans ce projet est similaire à celle décrite chez l'homme sous le nom de C-Tactile. Cette étude pilote sera réalisée sur des souris âgées entre 12 et 24 semaines car nous travaillons sur la physiologie d’animaux adultes.
Étude d’un gène, facteur de protection de la maladie d’Alzheimer, chez la souris EU3/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Vérifier si une protéine du recyclage cellulaire limite l'accumulation de protéine Tau dans l'hippocampe : 226 souris sont utilisées pour cela dans le troisième des trois établissements de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souris Tau22 développent des lésions cérébrales et des pertes de mémoire à partir de six à neuf mois, après une injection de vecteur de thérapie génique dans le cerveau et deux tests de mémoire passés à sept et dix mois. La mise à mort passe par une ouverture du thorax sous anesthésie profonde, le porteur écrivant qu'une perfusion réalisée après le décès abîmerait les mitochondries qu'il veut observer. Les reproducteurs âgés sont réformés et tués eux aussi, aucun animal génétiquement modifié ne pouvant être placé ni relâché.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.
Procédures
Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.
Remplacement
Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau
Réduction
Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.
Choix des espèces
Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.
Caractérisation des altérations comportementales et neuronales chez un modèle génétique murin d’encéphalopathie épileptique humaine.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet portent la mutation d'enfants atteints d'une encéphalopathie épileptique et font des crises d'épilepsie, avec hyperactivité et gestes répétés. 336 vont être utilisées, 192 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles passent un test comportemental par jour pendant dix jours, arène éclairée, enfouissement de billes, labyrinthe en Y, reconnaissance d'objets, labyrinthe en croix surélevé, interaction sociale à trois chambres, et une partie subit en plus une chirurgie de quarante à quatre-vingt-dix minutes pour implanter des électrodes dans le cerveau, suivie de quarante jours de logement séparé et de soixante jours d'enregistrement quotidien. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort, le porteur avançant que ces données alimenteront des "cerveaux virtuels" qui pourraient à terme réduire le recours aux animaux non-humains.
Objectifs
Ce projet étudie des souris porteuses d’une mutation génétique dans une composante des cellules du cerveau, essentiel pour transmettre les signaux électriques. Chez certaines personnes, une mutation dans ce gène provoque une maladie du cerveau. Les enfants touchés présentent souvent des crises d’épilepsie ainsi que des difficultés d’apprentissage et de concentration. Les souris étudiées portent la même mutation que ces enfants. Elles permettent donc de mieux comprendre la maladie. Elles montrent déjà certains signes similaires : crises d’épilepsie, hyperactivité, gestes répétés et un niveau de stress plus faible que les souris normales. Les chercheurs veulent maintenant vérifier si ces souris reproduisent bien l’ensemble des symptômes observés chez les patients. Pour cela, ils réaliseront cinq types d’expériences : • D’abord, ils confirmeront quelles souris portent la mutation (génotypage). • Ensuite, chaque souris participera à une seule des quatre autres expériences, qui serviront à : 1. Mieux comprendre comment et quand apparaissent les crises d’épilepsie. 2. Analyser le comportement des souris. 3. Observer ce qui se passe dans le cerveau, au niveau des cellules et de l’activité électrique, pendant les crises. Grâce à ces travaux, les chercheurs espèrent mieux comprendre cette maladie et, à terme, contribuer au développement de nouveaux traitements pour les enfants concernés.
Bénéfices attendus
Cette étude cherche à mieux comprendre pourquoi certaines maladies du cerveau provoquent de l’épilepsie. Ces maladies sont liées à des dysfonctionnements des certaines molécules présentes dans les cellules du cerveau, qui permettent de transmettre les signaux électriques. Les souris étudiées portent une mutation dans l’un de ces molécules, semblable à celle observée chez certaines personnes malades. En les observant, les chercheurs veulent comprendre comment cette mutation modifie le fonctionnement du cerveau. Ces connaissances pourraient, à terme, aider à développer de nouvelles méthodes de diagnostic et de traitement pour ces maladies, qui restent aujourd’hui sans solution. Une partie des données recueillies servira aussi à créer des modèles informatiques. Ces modèles, comparables à des « cerveaux virtuels », permettent de simuler les effets d’une mutation. À long terme, ce type d’outil pourrait réduire l’utilisation d’animaux dans la recherche, car certaines expériences pourraient être reproduites directement sur ordinateur.
Procédures
1. Prélèvement pour identifier les souris Un petit morceau (2mm) de queue sera retiré (durée environ 10 secondes). 2. Tests de comportement Les souris réaliseront un test par jour pendant 10jours, d’une durée de 5 à 30 minutes. Les procédures prévues sont : • Exploration d’une arène éclairée. • Enterrement de billes. • Parcours dans un labyrinthe en Y. • Test de reconnaissance d’objets. • Parcours dans un labyrinthe en croix surélevé. • Test d’interaction sociale à trois chambres. 3. Chirurgie pour poser des électrodes Certaines souris subiront une intervention de 40 à 90 minutes pour l’implantation de très fines électrodes dans le cerveau. Elles seront ensuite hébergées séparément pendant 40 jours. 4. Enregistrements cérébraux L’activité électrique du cerveau sera enregistrée chaque jour pendant 60 jours. Avant chaque enregistrement, la souris sera connectée à l’appareil par une manipulation de 30 à 60 secondes. Elles seront hébergées séparément pendant 60 jours.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées présentent des problèmes de santé : elles ont des crises d’épilepsie et un comportement différent de celui des autres souris. Pour certaines procédures, une opération chirurgicale d’implantation d’électrodes sera réalisée. Après l’opération, les souris peuvent ressentir une légère douleur pendant quelques jours et montrer des signes de stress. Elles seront hébergées séparément, mais resteront dans un environnement où elles pourront voir, entendre ou sentir les autres souris, sans être totalement isolées. Les test de comportement peuvent causer un stress léger lié à la manipulation et la nouveauté.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les cerveaux et réaliser des analyses.
Remplacement
Ce projet veut comprendre ce qui se passe dans le cerveau quand certaines maladies causent de l’épilepsie et des difficultés de développement. Pour cela, il est nécessaire de travailler sur un modèle intégré qui gardent toute la complexité du cerveau et du comportement. Les informations recueillies seront aussi utilisées pour créer des modèles informatiques du cerveau. Ces modèles aident à comprendre comment les erreurs dans les gènes changent le fonctionnement du cerveau, sans toujours avoir besoin de nouvelles expériences sur les animaux. À long terme, ces méthodes pourraient permettre de faire moins d’expériences sur les animaux, en aidant à remplacer ou réduire leur utilisation tout en continuant à apprendre sur le cerveau.
Réduction
On utilisera juste assez de souris pour obtenir des résultats fiables, mais pas plus que nécessaire (calcul effectué avec des approches statistiques). Les tests de comportement qu'on utilisera ont déjà été essayés avant sur des souris similaires, et ils ont déjà un plan précis. Cela veut dire qu’on n’aura pas besoin de refaire des tests préliminaires de perfectionnement.
Raffinement
L’état de santé des souris sera régulièrement surveillé à l’aide d’une grille d’évaluation pour repérer d’éventuels signes de douleur ou d’inconfort. En cas de douleur, elles recevront de l’anti-douleur pour être soulagée. La surveillance sera renforcée durant la semaine suivant une intervention au niveau du cerveau. Cette intervention sera réalisé avec une prise en charge adaptée de la douleur (anesthésie et traitement antidouleur).
Choix des espèces
Même si la maladie est pédiatrique, on utilise des souris adultes car il est nécessaire qu’elles aient atteint un stade de développement stable pour réaliser certaines procédures en toute sécurité, comme les évaluations comportementales ou l’implantation d’électrodes. Chez des souris trop jeunes, ces interventions seraient moins fiables et pourraient présenter davantage de risques. On choisit les souris comme espèce parce qu’elles partagent de nombreux gènes et fonctions cérébrales avec l’humain, et qu’elles sont bien adaptées à des études en laboratoire. Leur taille, leur reproduction rapide et la possibilité de contrôler leur environnement en font un modèle pratique et fiable pour étudier les mécanismes de la maladie. Par ailleurs, à l’âge adulte, les effets de la mutation sont déjà clairement exprimés. On peut ainsi observer la maladie de manière stable et obtenir des données plus robustes et comparables.
Stratégies innovantes et mécanismes moléculaires pour une action antidépressive renforcée dans des modèles murins de stress social
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, dont 400 sans même être prélevées une fois écoulée la période maximale de maintien, 6 856 souris vont être utilisées dans ce projet sur la dépression. 984 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 5 472 un niveau modéré. Le protocole associe dix jours de stress social répété face à des souris agresseuses, une chirurgie du cerveau de trois à cinq heures pour une partie des animaux, des injections quotidiennes pouvant courir sur un mois, des restrictions alimentaires et des batteries de tests comportementaux répétées quatre fois. Le porteur écrit que ce stress psychologique intense provoque anhédonie, anxiété et retrait social, et présente le projet comme une réponse à un "besoin urgent" de meilleures thérapies pour les 300 millions de personnes concernées.
Objectifs
Ce projet répond à un besoin urgent de meilleures thérapies pour le trouble dépressif majeur. Il repose sur la récente découverte d'un facteur de transcription en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la dépression, ce qui permet de développer des stratégies d'appoint innovantes répondant aux critères suivants : (i) elles offrent une action antidépressive plus rapide et une efficacité accrue, (ii) elles se basent sur des mécanismes biologiques solides et plausibles, (iii) elles sont applicables à la physiopathologie humaine, ainsi qu'aux phases de Recherche et Développement et aux futurs essais cliniques. Les antidépresseurs occupent une place centrale dans la prise en charge de la dépression, grâce à leur accessibilité étendue et à leur efficacité prouvée, qui s'avère similaire d'un médicament à l'autre. La monothérapie est privilégiée en première ligne de traitement, alors qu'une combinaison d'antidépresseurs n'est considérée qu'en cas d'échec de la monothérapie initiale, un scénario survenant dans environ la moitié des situations. Nous formulons l'hypothèse qu'une association d'antidépresseurs classiques avec des approches pharmacologiques visant à inhiber le facteur de transcription identifié accroîtrait l'efficacité du traitement, en accélérant son onset d'action et en augmentant la proportion de patients répondeurs. Nous voulons vérifier comment le mécanisme d'action de notre combinaison synergique, (i) dépend des propriétés spécifiques de l'antidépresseur, comme sa capacité à bloquer la recapture d’un neurotransmetteur en particulier, (ii) modifie les fonctions cérébrales impactés par le trouble dépressif majeur, (iii) modifie l’expression génétique permettant l’identification de biomarqueurs de la réponse au traitement. Pour mieux refléter la complexité des situations cliniques, nous proposons d’évaluer ces traitements dans un modèle murin de traumatisme combiné, intégrant des dimensions physiques, psychologiques et sociales. Ce modèle nous permettra d’étudier les effets du traitement prophylactique, ainsi que ses effets à long terme.
Bénéfices attendus
Nous déploierons ensuite des efforts de Recherche et Développement auprès des acteurs cliniques, institutionnels et privés. Les résultats à long terme créeraient idéalement une valeur supplémentaire par rapport aux stratégies thérapeutiques existantes avec des approches complémentaires, un potentiel d'amélioration majeur dans la pharmacologie du trouble dépressif majeur (action rapide, meilleure efficacité). Une prise en charge pharmacologique plus abordable de la dépression signifie (i) une guérison plus précoce réduisant les souffrances et les effets secondaires inutiles, (ii) une amélioration de la qualité de vie des 300 millions de personnes souffrant de dépression dans le monde et de leurs familles, (iii) réduction du fardeau social et des coûts de santé publique.
Procédures
Les interventions prévues incluent une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée d’environ 3-5 heures par souris, accompagnée d’infusion d’anesthésiques gazeux et d’analgésiques en préopératoire, ainsi que de traitements anti-inflammatoires et analgésiques en postopératoire pendant 1 à 3 jours. Les souris seront soumises à une procédure de stress social répétés, consistant en des sessions quotidiennes de 5-10 minutes pendant 10 jours. Les animaux stressés recevront une injection quotidienne de l’antidépresseur ou de combinaison de composés ayant des effets antidépresseurs allant de 1 injection à 1 mois de traitement (animal vigile à raison de quelques secondes par animal). Leur état émotionnel d’anxiété/dépression, de nociception et de cognition sera suivi avec tâches comportementales sur animaux vigiles. Ce suivi se fera avec une batterie hebdomadaire de 3 tests répétés 4 fois. La dernière batterie comportementale sera plus complète, elle comportera de 4 à 10 tests et s’étalera sur 1 à deux semaines. Les animaux ayant subis une intervention chirurgicale seront suivis avec une batterie comportementale de 5-7 tests répétés en 4 temporalités (avant stress, après stress, après traitement et après rémission). Leur activité cérébrale sera mesurée en vigile pendant les taches comportementales. La durée d’un test sera de 10 minutes à 1 heure et l’animal effectuera jusqu’à deux tests par jour. Certains tests cognitifs nécessiteront une diminution de la prise de nourriture pendant 5-15 jours. Jusqu’à trois prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile, avec une intervention de moins d’une minute. Chaque prélèvement sanguin sera espacé d’au moins 10-15 jours.
Impact sur les animaux
Dans le protocole de stress social, plus du stress physique les souris seront soumises de façon répétée à un stress psychologique intense susceptible de causer symptôme de dépression, anhédonie, anxiété et un retrait social chez un sous-groupe d’individus. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur légère et transitoire au moment du prélèvement ainsi qu’un hématome et un saignement incontrôlé. Les injections intrapéritonéales chroniques peuvent provoquer des effets secondaires mineurs, ou inconfort comme une douleur légère et transitoire, voir une irritation locale autour du site d’injection. La chirurgie stéréotaxique peut engendrer dans certains cas une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire suite à l’anesthésie. Des douleurs post-opératoires ainsi que des risques infectieux sont possibles. Les souris qui seront hébergées individuellement pendant les tests de comportement pourront montrer une perte du poids (5-10 pourcent), une diminution du toilettage ou une diminution de la locomotion ainsi qu’éventuellement une anxiété. Cependant, dans nos conditions expérimentales, l’hébergement individuel n’induit ni stéréotypies ni modifications du comportement émotionnel. Les tests de comportement ne montrent pas de changements notables. Les tests cognitifs nécessitent une restriction alimentaire pouvant entraîner une sensation de faim. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées.
Devenir
L'euthanasie de l'ensemble des animaux est requise. Pour une grande partie des animaux du sang, leurs cerveaux et des organes périphériques seront récoltés en vue de procéder à des analyses de biologie moléculaire ou d'anatomie/imagerie et, où chaque animal représente un individu unique. Une partie des animaux (400) ne seront pas prélevés mais euthanasié à la fin de la période maximal de maintien. Ces animaux sont mutualisés (utilisation continue) sur plusieurs projets où ils ne seront pas comptabilisés contribuant à la réduction.
Remplacement
Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro avec des modèles cellulaires, les effets de la dépression, du stress, et des antidépresseurs se produisent à l’échelle de l’organisme. Les procédures d’expérimentations animales décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la signification des évènements moléculaires causés par le stress ou les drogues sur des circuits neuronaux intacts. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. Nous essayons continuellement d’évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux pour pouvoir effectuer des études invasives qui ne sont pas faisables chez les sujets humains. Avec l’approche translationelle que nous avons adopté, les résultats obtenus au sein de notre laboratoire sont complémentaires de ceux obtenus chez l’homme.
Réduction
Les études prévues nécessiteront l’utilisation de 6856 animaux. Cet effectif représente un maximum. Le nombre d’animaux par lot a été déterminé par un calcul de puissance afin de s'assurer qu'il soit suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, tout en réduisant au maximum le nombre d'animaux impliqués. Les effectifs sont déterminés de manière à fournir des résultats analysables par des méthodes statistiques scientifiquement adaptées. Cette approche nous permet de répondre à la question principale du projet et en optimisant l'effectif, nous garantissons non seulement des résultats fiables, mais aussi une minimisation de l'impact sur les animaux.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 2-6 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal et supplémenté avec un morceau de bois ou un tube en carton pour les animaux placés hébergement individuel pour traitement pharmacologique. Les cages utilisées sont transparentes, fermées par une grille et placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. Ainsi les informations visuelles, auditives et les odeurs peuvent circuler entre les souris. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation puis expériences). Une pesée hebdomadaire sera effectuée (voire quotidienne en post-opératoire ou lors des restrictions alimentaires pour les tâches cognitives). Des points limites spécifiques ont été établis pour permettre d’évaluer l’état de douleur de l’animal agir en conséquence afin d’éviter toute souffrance supplémentaire, soit par un renforcement du traitement antalgique/analgésique, soit par une euthanasie. Pour le suivi post opératoire, une grille de scoring sera mise en place pour garantir le bien-être des animaux. De plus, un anesthésique local sous forme de crème est appliqué au niveau des oreilles où les barres sont fixées. Les souris sont placées sur un tapis chauffant et une solution physiologique est injectée au début et à la fin de l’intervention afin d’éviter une hypothermie et une déshydratation. Afin d’éliminer tout risque d’inflammation et de douleur post opératoire, les souris recevront à la fin de la chirurgie et pendant 48 heures une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pour éviter tout risque de détérioration de l'implant des souris par leurs congénères après la chirurgie les animaux seront en hébergement individuel pendant environ 4 mois.
Choix des espèces
L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Par ailleurs, il existe beaucoup d’endophénotypes de la dépression clairement établis chez la souris. En effet, l’intérêt croissant pour la souris comme modèle a alimenté le développement de techniques sophistiquées pour l’étude des gènes dans le cerveau permettant l’identification de biomarqueurs de la réponse au traitement. Expériences chez des animaux adultes : Les souris tests seront réceptionnés à l'âge de 6-7 semaines puis utilisés en procédure à l'âge adultes (âge entre 8 et 16 semaines). Les agresseurs seront des anciens reproducteurs ou des réformés âgées de 6-10 mois à réception puis utilisé pendant environ 1 an. Cette partie du projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des troubles affectifs à l’âge adulte en prenant en compte la variabilité individuelle et le dimorphisme sexuel.
Evaluation des altérations comportementales et neurobiologiques chez un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des composés pharmacologiques sont administrés à des souris porteuses de mutations humaines, avant des tests de mémoire et d'état émotionnel et jusqu'à deux prélèvements sanguins sous anesthésie. 990 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à relier les troubles du comportement de ces animaux aux marqueurs biologiques de la maladie d'Alzheimer et à évaluer l'effet thérapeutique des composés testés. Le résumé annonce des tests comportementaux et un effectif de quinze souris par groupe sans nommer un seul de ces tests, tout en concluant qu'aucun effet durable n'est attendu.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une affection neurodégénérative qui se manifeste par une perte progressive de la mémoire et des capacités cognitives, ainsi que par des troubles émotionnels tels que l’anxiété ou la dépression. Sur le plan biologique, elle est caractérisée par l’accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Cette pathologie peut être modélisée chez la souris grâce à certaines modifications génétiques. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris portant des mutations humaines sur des gènes impliqués dans les processus physiopathologiques aboutissant à l'apparition d'une pathologie proche de la maladie d'Alzheimer. Les objectifs de ce projet sont (i) d’étudier les altérations comportementales et neurobiologiques à différents stades de la pathologie, (ii) de voir si ces altérations ont un lien entre elles et (iii) d’évaluer l’effet thérapeutique de certains composés pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des altérations comportementales et neurobiologiques associées à la maladie d’Alzheimer, en s’appuyant sur un modèle murin transgénique pertinent et largement utilisé par la communauté scientifique internationale. L’évaluation combinée de dimensions émotionnelles et cognitives, associée à l’administration de composés d’intérêt, fournira des données intégrées sur l’évolution des symptômes et leur régression potentielle. Les prélèvements biologiques permettront de relier les observations comportementales à des marqueurs neurobiologiques. Les résultats attendus contribueront à l’identification de mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la maladie et à l’évaluation préclinique de nouvelles stratégies thérapeutiques, avec un impact potentiel à moyen et long terme pour la recherche translationnelle sur les maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions au cours du projet. Des composés thérapeutique seront administrées puis des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer la mémoire et l'état émotionnel des animaux. Chaque animal subira uniquement le nombre nécessaire de tests pour répondre aux objectifs expérimentaux. Des prélèvements sanguins sur animal analgésié et anesthésié sera réalisé au cours des expérimentations.
Impact sur les animaux
Les procédures mises en œuvre sont susceptibles d’induire des nuisances transitoires, légères à modérées. L’administration de composés peut entraîner un inconfort local bref. Les tests comportementaux peuvent générer un stress variable selon les tests, mais toujours de courte durée. Les prélèvements sanguins (deux par animal maximum) réalisés sur des souris anesthésiées peuvent provoquer un inconfort transitoire. Ces effets sont strictement limités par le raffinement des procédures (habituation, manipulation douce, limitation du nombre de tests et de prélèvements, surveillance comportementale continue et critères d’arrêt précoces). Aucun effet durable n’est attendu, et l’ensemble du projet est conçu pour limiter la douleur et la souffrance au strict minimum compatible avec les objectifs scientifiques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus.
Remplacement
La nature de ce projet, qui modélise une pathologie neurologique complexe afin d’étudier les interactions entre neurobiologie et altérations comportementales, nécessite l’utilisation d’un organisme entier. Les phénomènes étudiés (comportements émotionnels, régulations neurobiologiques) résultent d’interactions dynamiques entre différents organes et réseaux neuronaux, impossibles à reproduire de manière pertinente sur des modèles in vitro, ex vivo ou in silico. Le recours à la souris s’impose comme le modèle mammifère le plus approprié en raison de la richesse des outils génétiques (permettant d’induire la maladie d’Alzheimer dans ce projet).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé à l'aide d'outils statistiques. Pour chaque groupe expérimental, un effectif minimum de 15 souris est nécessaire afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour détecter les différences attendues entre groupes, tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Cette approche garantit que le nombre d’animaux est le plus faible possible pour atteindre les objectifs scientifiques tout en respectant les principes des 3R.
Raffinement
Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé et qualifié, dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés en fratries dans des cages enrichies, avec des dômes en carton et des cotons pour la confection de nids. Nous contrôlerons quotidiennement et au cours des différentes expériences leur état général et l’absence de signes généraux de souffrance. Les souris seront habituées aux expérimentateurs par une période de handling (manipulation douce des souris) et un minimum de personnel interviendra pour chaque procédure. Des composés analgésiques et anesthésiques seront utilisés pour réaliser les prélèvements sanguins.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle pour ce projet pour plusieurs raisons : •Validité expérimentale : le modèlede souris utilisé permet de modéliser la maladie d’Alzheimer. Un grand nombre d’études permet une utilisation pertinente de ce modèle. •Disponibilité des tests comportementaux : les tests permettant d’évaluer les comportements émotionnels et cognitifs pertinents pour caractériser l’état comportemental associé à la maladie d’Alzheimer sont disponibles au laboratoire et standardisés pour cette espèce. •Expertise du personnel : les expérimentateurs du laboratoire possèdent une expérience confirmée dans l’utilisation de ces souris et de ces tests, ce qui permet de réaliser les manipulations de manière optimale tout en limitant le stress des animaux. Ainsi, la souris constitue le modèle mammifère le plus adapté pour répondre aux objectifs scientifiques du projet, en combinant validité scientifique, faisabilité technique et respect du bien-être animal.
Étude d’un gène, facteur de protection de la maladie d’Alzheimer, chez la souris EU1/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
226 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue entre sept et dix jours de vie, puis une injection de vecteur de thérapie génique dans le cerveau sous trente minutes d'anesthésie, acte dont le porteur reconnaît qu'il provoque une douleur aiguë modérée à sévère liée à l'incision, au forage et à l'inflammation. À sept et dix mois, chaque animal passe un test de reconnaissance d'objet puis un test de mémoire en labyrinthe, la question étant de savoir si une protéine du recyclage cellulaire freine l'accumulation de protéine Tau. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'agrégation de Tau est "particulièrement difficile" à reproduire in vitro et conclut que la souris génétiquement altérée reste "nécessaire".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie du cerveau qui entraîne des troubles de la mémoire et une perte progressive des capacités cognitives. Elle débute par l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés dans les neurones, ce qui provoque la dégénérescence des cellules nerveuses. Les traitements actuels sont généralement administrés trop tard pour être pleinement efficaces. Il est donc important de développer de nouvelles approches capables d’agir plus tôt et de favoriser l’élimination des substances nocives dans les cellules. Ce projet, effectué dans 3 établissements utilisateurs, vise à étudier l’effet d’une protéine particulière qui participe au nettoyage et au recyclage des composants cellulaires endommagés. Une variante naturelle de cette protéine semble améliorer ce processus et réduire l’accumulation de substances toxiques dans les cellules, ce qui pourrait protéger le cerveau et améliorer la mémoire et les fonctions cognitives. Pour tester cette hypothèse, l’effet préventif de la protéine sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de la protéine sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette approche permettra de déterminer si cette protéine peut limiter les dommages cérébraux et améliorer les performances cognitives. La lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Dans ce projet multi-établissements nous étudions comment la cellule se débarrasse des déchets, comme la protéine Tau anormale et les mitochondries abîmées, qui s’accumulent dans le cerveau lors de la maladie d’Alzheimer. Comprendre ce mécanisme pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour cette maladie et d’autres maladies qui touchent le cerveau.
Procédures
Les animaux issus des croisements subiront, au sein de l’EU2, une seule biopsie de la queue (1 mm) un prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), entre 7 et 10 jours, période durant laquelle les terminaisons nerveuses sont encore peu développées, afin de limiter la douleur. Chaque animal sera ensuite soumis, au sein de l’EU1, à une anesthésie unique (environ 30 minutes) pour une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique, d’une durée approximative de 25 à 30 minutes. À l’âge de 7 et 10 mois, les animaux participeront, au sein de l’EU1, à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une seule fois par animal et dans un ordre fixe : d’abord le test de reconnaissance d’objet, puis le test de mémoire dans un labyrinthe. Les mâles seront testés en premier (en matinée) pour éviter toute influence de la présence des femelles, qui pourrait biaiser les résultats. Les femelles seront ensuite testées dans l’après-midi. Chaque test durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée et la contention des animaux peuvent provoquer un stress modéré, qui diminue toutefois à mesure qu’ils s’habituent à l’expérimentateur dans les différentes structures d’hébergement. Au moment du sevrage le prélèvement à l’extrémité de la queue (< 1 mm), peut provoquer une douleur aigüe transitoire, qui sera minimisée grâce à une manipulation rapide et adaptée. Selon leur génotype (notamment les souris Tau22), certains animaux développeront progressivement des altérations cérébrales associées à des déficits de mémoire à partir de 6–9 mois. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’injection intracérébrale, pouvant exceptionnellement provoquer une infection locale avec douleur et inflammation. Cette intervention entraîne une douleur aiguë modérée à sévère immédiatement après l’intervention, liée à l’incision, au forage et à l’inflammation locale, pouvant persister sous forme d’inconfort pendant quelques jours. Le modèle ou les vecteurs utilisés ne devraient pas induire directement de troubles neurologiques. Cependant, des effets secondaires accidentels, tels que des troubles moteurs ou de convulsions, peuvent exceptionnellement survenir après l’injection intracérébrale. Les manipulations nécessaires à l’évaluation des performances comportementales (tests de mémoire, exploration, etc.) peuvent provoquer un stress modéré. Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test afin de limiter ce stress. La thoracotomie (EU3) sera réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une mise à mort. Bien que la perfusion post-mortem soit techniquement possible, elle compromet la qualité des tissus pour l’analyse histologique que nous prévoyons. En particulier elle compromet la morphologie des mitochondries. La méthode standard reste pour le moment la perfusion sous anesthésie profonde, avant l’arrêt respiratoire, afin de concilier bien-être animal et la qualité expérimentale.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet multi-établissements sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement.
Remplacement
Dans la maladie d'Alzheimer, une forme anormale de la protéine Tau s’agrège et se propage de neurone en neurone. Cette protéine Tau constitue le principal composant des dégénérescences neurofibrillaires observées dans les neurones atteints. Ces neurones sont envahis par des amas protéiques filamenteux qui perturbent leur fonctionnement normal. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro est particulièrement difficile. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et actuellement les modèles murins génétiquement altérés sont les plus compatibles. Par la suite, le prélèvement de tissus cérébraux de souris modèles de la maladie d’Alzheimer est essentiel : il permet de détecter la forme pathologique de Tau et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans sa dégradation, notamment en étudiant ses interacteurs in vivo. Dans le cadre de ce projet, l’accent sera mis sur l’étude de la protéine autophagique NDP52, afin d’explorer son rôle potentiel dans l’élimination de Tau
Réduction
Le calcul d’effectif a été réalisé à partir du paramètre le plus sensible et le plus représentatif de l’effet attendu, à savoir la variable cognitive principale. Nous avons ensuite appliqué ce même effectif aux autres paramètres (Tau, neuroinflammation) afin de conserver une cohérence expérimentale et une puissance suffisante pour détecter un effet de même ordre de grandeur (≈15 %). Les moyennes et écarts-types exacts peuvent différer entre paramètres, mais l’effectif retenu (16 animaux/groupe) garantit une puissance ≥80 % pour les principales mesures continues, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux. Nous comparerons uniquement les trois groupes d’animaux non transgéniques entre eux, ainsi que les trois groupes d’animaux transgéniques injectés entre eux, et ce, à deux stades d’âge différents. Ainsi, le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production de génotypes utiles. Toutes les expérimentations sont ensuite planifiées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garantir une pertinence statistique. En raison des variabilités interindividuelles un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats non valides, c’est pourquoi l’effectif de seize animaux par groupe constitue le meilleur compromis entre réduction des effectifs et puissance d'analyses.
Raffinement
Les animaux reproducteurs seront habitués à l’expérimentateur grâce à une routine stricte : même intervenant, même heure d’intervention. Cette régularité contribue à réduire le stress des animaux. Ils disposent de conditions d’hébergement optimales avec des enrichissements (tunnels, carré de coton) et de la nourriture et de l’eau ad libitum. L’hébergement en groupe sera assuré afin de préserver le comportement social naturel. Le transfert entre les différentes structures d’accueil se fera en 5 à 10 minutes. Conformément à la réglementation, les animaux seront placés dans des caisses de transport homologuées, sécurisées et ventilées, contenant de la litière propre, du matériel d’enrichissement (coton, tunnel en carton) et de la nourriture solide adaptée. À l’arrivée, les animaux sont immédiatement transférés en zone d’hébergement et replacés dans des cages propres et enrichies, puis laissés au repos afin de limiter le stress. Leur état général est systématiquement contrôlé à la réception par le personnel compétent. Afin de limiter le stress lors des manipulations et des transferts, une contention douce sera privilégiée, en tenant les animaux dans la main ou dans un tube. La chirurgie se déroulera sous conditions d’asepsie et d’anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur : Analgésique opioïde en sous cutané 30 minutes avant l’intervention. Induction par anesthésique dissociatif+ sédatif relaxant musculaire (sous-cutanée). pour une anesthésie plus stable, une meilleure analgésie et une récupération plus rapide. Pour limiter les blessures au réveil, les griffes postérieures seront raccourcies avant la fin de l’anesthésie. Une crème est appliquée sur les sutures pour favoriser la cicatrisation. Après chirurgie, les animaux seront réchauffés en couveuse puis surveillés jusqu’au réveil complet avant d’être replacés dans leur cage habituelle. Pendant 12 à 20 heures, de la nourriture humide sera mise au sol pour faciliter l’accès. Le lendemain de l’intervention, les animaux recevront un traitement analgésique à base de afin de limiter toute douleur et favoriser leur confort. Les jours suivants, la reprise des fonctions physiologiques de base (miction, alimentation, urine) sera vérifiée.
Choix des espèces
Notre étude cherche à déterminer comment l’autophagie médiée par la protéine NDP52 peut limiter l’accumulation de la protéine Tau pathologique et des mitochondries endommagées dans l’hippocampe, altérations associées aux troubles de mémoire. Les mécanismes conduisant à l’agrégation de Tau et à la formation de ces lésions étant à ce jour mal compris, leur reproduction in vitro serait particulièrement difficile. Ainsi, nous utilisons un modèle murin présentant plusieurs avantages scientifiques. D’une part, la proximité entre le génome humain et murin en fait un outil pertinent pour les recherches génétiques et molécules. D’autre part, son organisation cérébrale est similaire à celle de l’humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, son développement embryonnaire rapide (21 jours) facilite la planification expérimentale. Les animaux reproducteurs seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entraînant leur réforme. En cas de nécessité, et en l’absence de reproducteurs plus jeunes, des animaux plus âgés pourront toutefois être mis en reproduction. L’effet préventif de NDP52 sera étudié sur les animaux âgés de 3 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique légère. L’effet curatif de NDP52 sera lui étudié sur les animaux âgés de 6 mois, stade correspondant à une atteinte pathologique modérée. Cette progression de la pathologie Tau en fonction de l’âge dans un modèle de la maladie d’Alzheimer (bien caractérisé et largement utilisé pour l’étude de ses mécanismes), est conforme aux données disponibles dans la littérature et décrite sur le site de référence : Alzforum – THY-Tau22 Model. Cette lignée étant déjà disponible dans l’établissement, il n’est pas nécessaire d’importer ou créer une nouvelle souche, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le choix du modèle murin est justifié par la similitude de son architecture cérébrale avec celle du cerveau humain, notamment au niveau de l’hippocampe. De plus, la souris présente un développement embryonnaire rapide, d’environ 21 jours. Les animaux seront sélectionnés à l’âge de maturité sexuelle (6 semaines pour les mâles, 7 semaines pour les femelles) et utilisés en reproduction de préférence jusqu’à l’âge de 6 mois, âge à partir duquel la fertilité diminue, entrainant leur réforme. Les injections seronts effectuées sur des animaux de 3-6 mois.
Caractérisation des liens entre les mitochondries et les maladies neurologiques à l’aide de modèles murins génétiquement modifiés
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
48 souris porteuses d'une mutation humaine liée à la sclérose latérale amyotrophique subissent une chirurgie unique de moins de cinq minutes, sous anesthésie, et sont tuées avant tout réveil. Le porteur décrit chez 36 d'entre elles une dégradation qui court sur des mois avant cet acte, prise de poids réduite dès dix semaines, tremblements, cardiomyopathie sévère, survie médiane de 10,8 mois. La gravité déclarée pour le projet reste "sans réveil", la maladie qui précède l'opération n'y figurant pas. Les tissus sont prélevés juste après la mise à mort, à un stade précoce de cinq mois ou avancé de dix mois.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative. Elle se déclare à l'âge adulte (40-80 ans) et évolue, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient. Elle est causée par la mort de certains neurones, entraînant un affaiblissement progressif et une atrophie des muscles. A ce jour, il n'existe pas de traitement contre la SLA car les mécanismes physiopathologiques sont méconnus. La SLA touche les deux sexes et son incidence augmente avec l'âge à partir de 40 ans. De plus, elle peut dans certains cas être associée à des troubles cognitifs de type démence. Des travaux précédents sur une cohorte de patients souffrant de cette forme de démence, avaient permis d’identifier une mutation sur le gène d'une protéine de la mitochondrie. Un modèle murin portant la même mutation a été créé et caractérisé. Parmi tous les facteurs impliqués dans la pathogenèse, certains défauts structurels dans la cellule s’avèrent essentiels et pourrait contribuer à la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Nous émettons l'hypothèse qu’un type de désorganisation cellulaire déclenche des cascades inflammatoires dans le système nerveux central, contribuant à la pathogenèse des maladies mitochondriales et neurodégénératives. L’objectif de ce projet sera d’évaluer l’effet de l’inhibition de cette cascade sur la neurodégénération grâce au modèle de souris génétiquement modifiées qui a été créé.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine de la neurodégénérescence. Il permettra également de mieux caractériser un modèle animal pertinent pour tester de nouveaux traitements ciblant les maladies mitochondriales et neurodégénératives, en vue de prévenir ou ralentir leur progression. Si l’invalidation de certains gènes montre un effet protecteur, cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet financé et mené en collaboration avec des cliniciens, s’inscrit dans une démarche translationnelle. Il présente des retombées cliniques et sociétales potentielles, notamment en améliorant le diagnostic moléculaire et l’implication des patients pour plusieurs maladies rares. En ciblant les mécanismes pathogènes, il contribuera à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. À ce jour, les options thérapeutiques restent limitées, et la prise en charge de ces maladies a un fort impact sur la santé publique. Si les bénéfices économiques sont difficiles à quantifier à ce stade, les avancées attendues en matière de diagnostic et de traitement pourraient avoir un impact majeur pour les patients.
Procédures
Tous les animaux subiront une unique chirurgie sans réveil de l’animal d’une durée de moins de 5 minutes, sous anesthésie et analgésie
Impact sur les animaux
Chez cette lignée de souris, les animaux naissent sans problème apparent. À partir de 10 semaines, ils prennent moins de poids que les autres, puis commencent à en perdre vers 6 mois, en raison d’un dérèglement de leur métabolisme. Vers un an, ils développent une maladie musculaire liée à un dysfonctionnement des mitochondries. Leur état se détériore alors rapidement, avec une perte de poids importante, des tremblements et de graves problèmes cardiaques, entraînant la mort autour de 14 mois (avec une survie moyenne de 10,8 mois). Des troubles de l’apprentissage et de la mémoire apparaissent dès 10 mois, mais l’atteinte neurologique reste modérée et n’est pas la cause principale de la mort, qui est due à l’insuffisance cardiaque. Les signes visibles de la maladie apparaissent en fin de vie, notamment une perte de poids de plus de 5 pour cent, parfois supérieure à 15 pour cent en une semaine. Les animaux peuvent ressentir un inconfort et une légère douleur passagère lors des injections. L'opération sera pratiquée sous anesthésie générale, qui peut entraîner certains effets secondaires comme un refroidissement du corps, une sécheresse des yeux ou, très rarement, une baisse du rythme cardiaque ou respiratoire.
Devenir
Un total de 48 animaux sera donc utilisé dans cette procédure. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de prélever les tissus d’intérêt à analyser pour répondre à notre question scientifique.
Remplacement
Pour mieux comprendre le lien entre mutation génétique et pathologie, une première étape a consisté en la caractérisation d’un modèle cellulaire : des expériences ont été réalisées sur des fibroblastes issus de patients porteurs de la mutation d'intérêt. Ces expériences ont permis d'identifier de potentiels mécanismes impliqués dans les atteintes mitochondriale et neurodégénérative. Cependant, pour l’étude de maladies neurodégénératives avec des composantes motrices et cognitives, les modèles cellulaires ne peuvent pas être utilisés pour disséquer les effets des variations moléculaires sur des profils de comportements. C’est pourquoi nous devons utiliser le modèle murin pour mieux comprendre la pathologie au cours du temps et pour tester si l’inactivation d’un processus moléculaire peut ralentir ou inverser les processus pathologiques permettant d’envisager des voies d’intérêt thérapeutiques dans l’avenir. L'utilisation de modèles murins, permet aussi d'accéder à des tissus auxquels on n'a pas accès chez l'homme, en particulier la récupération de tissus post mortem permettant des études électrophysiologiques.
Réduction
Avec l’aide de biostatisticiens, des protocoles ont été établis pour analyser plusieurs paramètres à partir d’un même prélèvement, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Dans cette logique de réduction, un calcul de puissance a été réalisé afin de déterminer la taille minimale des groupes nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Des statistiques prédictives ont également été utilisées pour ajuster les effectifs, en tenant compte de notre expérience, de la nature des expériences, des paramètres mesurés et de leur variabilité. Il a ainsi été déterminé que des groupes de 3 souris par stade d’analyse sont suffisants. Deux stades de développement seront étudiés, avec 4 génotypes d’intérêt, chez les mâles et les femelles. Cela représente un total de 48 souris. Parmi elles, 36 développeront un phénotype dommageable, les 12 autres n’en présenteront pas. Enfin, des tests statistiques seront réalisés pour garantir une interprétation fiable et robuste des résultats obtenus.
Raffinement
La dimension des cages permettra aux souris d’être hébergées dans un groupe dont la taille dépendra du poids des animaux (6 animaux (25-30g), 5 animaux si poids supérieur à 30g) leur permettant de répondre à leurs besoins comportementaux. Un suivi quotidien des animaux, axé sur leur état général de santé, est prévu. Il sera associé à l’utilisation d’une fiche d'observation détaillée permettant un suivi optimal des animaux. Ce suivi quotidien permettra d’identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur notamment en lien avec le phénotype dommageable des animaux. Le phénotype de notre modèle murin étant associé à une perte de poids, nous pèserons nos animaux chaque semaine dès leur entrée en procédure, et renforcerons la fréquence de pesée en cas d’observation d’une perte de poids . De plus l'analyse de survie a révélé que les souris avaient une survie significativement réduite par rapport à leurs compagnons de cages non génétiquement modifiés, avec une survie médiane de 10.8 mois. Ainsi, dès 8 mois, en plus d’être pesés une fois par semaine, une surveillance accrue sera mise en place : la fréquence du suivi augmentera, de l'eau et de la nourriture gélifiées seront placées au sol dans la cage pour éviter des complications si les animaux éprouvent de l'inconfort ou des difficultés à atteindre la nourriture et la source d'eau. De plus si des signes de stress sont observés, l’enrichissement de la cage sera amplifié (maison en carton, coton, etc.). Tous les animaux seront euthanasiés à 10 mois maximum afin d’éviter d’observer une mortalité liée au phénotype dommageable. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car il s’agit de l’espèce la plus utilisée et la mieux caractérisée en recherche biomédicale, notamment pour l’étude des maladies neurodégénératives. Son système nerveux présente de fortes similarités avec celui de l’humain et il existe de nombreux modèles transgéniques validés de sclérose latérale amyotrophique (SLA) permettant de reproduire des aspects essentiels de la pathologie. La souris est également adaptée pour des suivis sur plusieurs mois, grâce à sa durée de vie relativement courte, sa taille permettant des manipulations standardisées et l’existence de nombreuses ressources génétiques. Dans notre projet, nous utiliserons un croisement de deux lignées génétiquement modifiées : l’une reproduit une mutation retrouvée chez des patients atteints de SLA, l’autre est modifiée au niveau d’un gène impliqué dans l’inflammation. Ce croisement nous permettra d’évaluer si l’invalidation de certains gènes liés à l’inflammation peut limiter les effets de la neurodégénérescence. Deux stades de développement seront étudiés, avec 24 animaux par stade : – un stade précoce (5 mois), correspondant à l’apparition des premiers signes moléculaires, sans symptômes visibles ; – un stade avancé (10 mois), proche de la phase terminale de la maladie, où les animaux présentent une perte de poids importante et une cardiomyopathie sévère
Identification de cibles thérapeutiques dans un modèle de comorbidité addiction/stress traumatique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 928 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit six chocs électriques dans les pattes associés à un son, puis jusqu'à huit rappels de ce son sur trois semaines, avant huit jours de conditionnement à la morphine ou à la cocaïne et jusqu'à six injections de composés pharmacologiques. Le projet cherche des cibles médicamenteuses pour l'association addiction et stress post-traumatique, en faisant varier la drogue et le sexe des animaux. Le porteur compare ces chocs électriques à "la sensation ressentie après une décharge d'électricité statique" et présente les tests comportementaux qui suivent comme "non stressants et à caractère plutôt ludique".
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la prédisposition au développement de comportements addictifs suite à un état de stress post-traumatique (ESPT). Dans ce projet, nous avons pour but (1) d’identifier ce qui mènent à ces comportements ; ainsi que (2) d’évaluer l’efficacité de certains médicaments utilisés en psychiatrie. Le but à long terme est de proposer des traitements efficaces, ciblant autant les symptômes de l'ESPT que de l’addiction.
Bénéfices attendus
L’addiction aux drogues d’abus et les états de stress post-traumatique (ESPT) sont fréquemment diagnostiqués chez un même patient. Cette association de maladie a pour conséquence une efficacité moindre des traitements existants pour l’une ou l’autre des pathologies. De plus, cette association pathologique est prévalente chez la femme. Ce projet permettra une meilleure compréhension des symptômes et mécanismes de l’addiction associé à l’ESPT. De plus, nous évaluerons les effets de traitements d’ores et déjà utilisés dans le traitement de l’une ou l’autre maladie, et le potentiel de nouvelles cibles pharmacologiques. La multiplication de nos paramètres (drogue, sexe), permettra de trouver des cibles pharmacologiques adaptées à diverses caractéristiques individuelles.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à un modèle de formation de la mémoire de peur, qui associera 1 son, à un léger choc électrique plantaire (2sec) à 6 reprises (2 minutes d’intervalle). La mémoire de peur sera ré-évoquée par exposition au son seulement (au maximum 8 fois, sur une période de trois semaines). Ils seront également soumis à un conditionnement de préférence de place à la drogue (durant 8 jours), consistant par jour, en une injection de drogue (1sec) avant placement dans un contexte particulier. Des tests comportementaux non stressants et à caractère plutôt ludique permettant d’évaluer l’exploration et les comportements spontanés de l’animal seront réalisés par la suite. Certains animaux seront soumis à différents traitements (1 traitement comportemental ou à un parmi 5 agents pharmacologiques testés). Parmi ces agents pharmacologiques, trois sont des médicaments déjà utilisés en thérapeutique chez l’homme, et deux sont couramment utilisés dans les études précliniques chez la souris. Les administrations d’agents pharmacologiques seront effectuées par injection (1sec), à maxima 6 fois, à raison de 1 fois par jour.
Impact sur les animaux
Le modèle de formation de la mémoire de peur, utilisant des chocs électriques quoique légèrement douloureux et très désagréables, sont de courte durée (2 sec) et bénins. Ils correspondent, chez l’homme, à la sensation ressentie après une décharge d’électricité statique. La ré-évoquation de la mémoire de peur associée au son seul évoque un état d’appréhension pour une courte période (30 sec), qui disparait dans les minutes suivant le test. Le traitement des animaux par des drogues d’abus (morphine, cocaïne) peut entrainer une perte de poids légère de l’animal d’un jour à l’autre, mais il est extrêmement rare que cette perte de poids atteigne les points limites. Enfin, les traitements pharmacologiques seront toujours administrés à un temps et à une dose connue pour n’entrainer ni interaction médicamenteuse avec les drogues d’abus, ni effet indésirable.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort pour analyse post-mortem.
Remplacement
Nos recherches portent sur les modulations dynamiques du cerveau en contexte de comorbidité addiction/ état de stress traumatique, en s’intéressant plus particulièrement aux comportements qui modélisent les symptômes de la pathologie psychiatrique en clinique, et aux mécanismes physiopathologiques et moléculaires impliqués. Aucun de ces mécanismes ne peuvent être étudiés à l’aide de modèles in vitro ou de modélisation.
Réduction
Les études prévues nécessiteront l’utilisation 2928 animaux au maximum. L’effectif nécessaire a été évalué par une approche statistique de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant d’atteindre les objectifs spécifiques fixés en s’intéressant notamment aux deux sexes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes de 4 individus dans un environnement enrichi (nids). Une évaluation régulière des comportements spontanés de l’animal par l’expérimentateur permettent de limiter tout stress à la manipulation, et certains à caractère ludique, permettent l’enrichissement des conditions de vie de l’animal. Le modèle de formation de la mémoire de peur, utilisant des chocs électriques quoique légèrement douloureux et très désagréables, sont de courte durée (2 sec) et au nombre de 6 seulement. Afin de garantir l’aspect bénin de ces chocs, ils sont distribués de manière intermittente sur l’ensemble de la grille. Ils correspondent, chez l’homme, à la sensation ressentie après une décharge d’électricité statique. La ré-évoquation de la mémoire de peur associée à un seul son est effectuée sur une durée courte (30 secondes), afin de n’évoquer qu’un état d’appréhension transitoire disparaissant dans les minutes suivant le test. La répétition de cette ré-évocation, faite pour tester ses conséquences dans les symptômes d’addiction, n’est effectuée qu’au maximum 8 fois sur trois semaines, dans la mesure de nos nécessités expérimentales. Le poids, et l’état général des animaux sera vérifié à minima 1 fois par semaine, et chaque jour où une injection est effectuée. Cette surveillance permettra de s’assurer que les points limites ne sont pas atteints. La mise à mort des animaux sera effectuée sous anesthésie/analgésie profonde.
Choix des espèces
Le modèle murin est utilisé en raison de sa pertinence biologique, génétique et comportementale, permettant d'étudier de manière fiable les mécanismes impliqués dans le domaine des neurosciences dans le respect des principes des 3R. Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles d’addiction, et de conditionnement de la peur. Son utilisation permet également de tester plus facilement des stratégies thérapeutiques innovantes, et offre la possibilité de travailler ultérieurement sur des animaux génétiquement modifiés. Les animaux que nous utiliserons seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 7 semaines environ et ne seront pas testés avant leur 8ème semaine. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte, le cerveau adolescent comportant des spécificités différentes sur les comportements étudiés. Les mâles et les femelles seront hébergés séparément.
Circuits neuronaux pour la catégorisation de sons naturels chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quatorze jours consécutifs de restriction en eau, suivis de deux jours de pause, sur une période pouvant atteindre trois mois. 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement du cerveau. Elles subissent la pose d'un dispositif de maintien de la tête, l'ouverture du crâne, des injections de traceurs viraux, puis des séances quotidiennes pouvant durer quatre heures, tête fixée dans un tube de carton, pour apprendre à classer des sons selon leur hauteur, leur distance ou leur mouvement. Le porteur y voit aussi un dispositif technique valorisable et brevetable, l'AudioSphere, et retient la souris en affirmant que les populations de neurones étudiées sont à 90 % semblables à celles de l'être humain.
Objectifs
La catégorisation - la capacité de regrouper des expériences individuelles en catégories mentales abstraites - représente l'une des opérations cognitives les plus fondamentales effectuées par le cerveau et un élément essentiel de capacités cognitives plus avancées chez l'humain (langage, pensée symbolique). Bien que la catégorisation visuelle ait été déjà étudiée, notre compréhension de la manière dont le cerveau traite et catégorise les informations auditives complexes reste limitée, en particulier concernant les circuits neuronaux qui supportent cette capacité. Les objectifs de cette étude sont: 1. Objectif comportemental : Tester si les souris peuvent apprendre à catégoriser de manière flexible des stimuli auditifs complexes spatialisés en fonction de différentes caractéristiques acoustiques (élévation: haut vs bas, distance: proche vs loin, mouvement: statique vs mobile) 2. Objectif anatomique : Caractériser le détail des connexions anatomiques entre les sous-régions du cortex auditif (AUD) et les sous-régions du cortex préfrontal (PFC) qui rendent possible la catégorisation auditive, en utilisant des traceurs viraux antérogrades et rétrogrades 3. Objectif fonctionnel : Comprendre comment les populations neuronales distribuées dans AUD et PFC encodent les caractéristiques sensorielles, l'information catégorielle, et les choix comportementaux pendant la catégorisation auditive. Déterminer comment l’animal utilise le système de catégorisation auditive afin de générer des actions apropriées. 4. Objectif émotionnel : L’utilisation de sons naturels (vocalisations de souris, appels de prédateurs, sons environnementaux) permettra aussi de caractériser la représentation neuronale du traitement émotionnel des sons et et de déterminer comment les aspects émotionnels des sons influencent la catégorisation auditive
Bénéfices attendus
Ce projet, de nature fondamentale, vise à éclairer comment le cerveau transforme des informations sensorielles en représentations abstraites — un processus essentiel à l’intelligence. Bénéfices scientifiques : La tâche comportementale de catégorisation fournira un nouveau cadre pour étudier la flexibilité cognitive chez les rongeurs, en combinant catégorisation, apprentissage de règles et prise de décision. Son développement offrira un outil utile à la communauté des neurosciences. La cartographie des connexions entre cortex auditif et préfrontal précisera l’architecture des circuits impliqués dans le traitement cognitif des sons, possiblement organisés en voies fonctionnelles distinctes. Les enregistrements à large échelle apporteront une description inédite de la représentation conjointe des indices sensoriels, des catégories abstraites et des choix dans ces deux régions. Nous chercherons notamment à identifier des neurones sensibles aux catégories et à préciser la dynamique du transfert d’information entre aires cérébrales impliquées dans la décision. Les jeux de données et bibliothèques sonores générés seront mis à disposition de la communauté scientifique. Bénéfices technologiques : Le projet comprend un développement technique : l’AudioSphere, un système immersif de stimulation auditive fondé sur des techniques avancées de spatialisation. Cet outil permettra d’étudier le traitement de sons naturels avec un réalisme inédit et pourrait être diffusé plus largement dans la recherche ou l’industrie. Ce dispositif, une fois validé, pourrait être valorisé (potentiel de brevet) et utilisé pour enrichir les environnements expérimentaux par des paysages sonores naturels. Par ailleurs, mieux comprendre comment les circuits biologiques apprennent des catégories pourrait inspirer de nouveaux algorithmes pour l’intelligence artificielle. Bénéfices sociétaux : Les troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques, tels que l’autisme ou la schizophrénie, impliquent souvent une altération de la communication entre régions cérébrales, ce qui affecte la capacité à catégoriser. En éclairant les mécanismes neuronaux de la catégorisation, ce projet pourrait contribuer à une meilleure compréhension de ces pathologies et, à long terme, à l’élaboration de nouvelles pistes thérapeutiques. Il fournira également une base pour l’étude d’autres fonctions cognitives complexes.
Procédures
Les animaux seront soumis à 8 interventions différentes : • Interventions chirurgicales : 1. Chirurgie d'implantation (1 intervention par animal, durée : 1-2h) - Pose d'un dispositif de maintien de la tête - Construction de chambres d'enregistrement 2. Injection de traceurs viraux (1 intervention, durée : 1-4h) - Peut être réalisée en même temps que la chirurgie d'implantation 3. Craniotomie (1 intervention, durée : 1-2h) - Ouverture du crâne pour accéder aux régions cérébrales d'intérêt • Interventions comportementales : 4. Manipulation et habituation (sessions quotidiennes de 10 minutes à 2h, sur plusieurs semaines) 5. Entraînement comportemental (1 session par jour, maximum 4h par session, sur une période maximale de 3 mois avec pauses régulières) 6. Enregistrements de l'activité cérébrale (1 session par jour pendant 1 à 5 jours consécutifs, durée maximale par session : 4h) 7. Restriction hydrique (14 jours consécutifs suivis de 2 jours de pause, sur une période maximale de 3 mois) • Intervention terminale : 8. Prélèvement du cerveau pour analyses anatomiques et moléculaires Durée moyenne d’une procédure complète : 1 à 3 mois maximum par animal
Impact sur les animaux
Ce projet nécessite des enregistrements électrophysiologiques chez la souris vigile. L’immobilisation pouvant être une source de stress, les animaux ne sont ici que partiellement contenus : ils sont placés dans un tube de carton sur un matelas doux et absorbant, régulièrement changé, tandis que seule la tête est maintenue de manière indolore par un système adapté. Le corps et les pattes restent libres, permettant des ajustements de posture et le toilettage. Aucun prélèvement ni manipulation douloureuse n’est réalisé sur un animal éveillé ; toutes les interventions chirurgicales sont effectuées sous anesthésie générale profonde, avec analgésie appropriée. Ces chirurgies, de sévérité modérée, impliquent plusieurs craniectomies pour l’insertion d’électrodes et, dans certains cas, une injection virale. Elles nécessitent l’ouverture de la peau, l’écartement des tissus et le percement du crâne, procédures intrinsèquement douloureuses mais totalement couvertes par l’anesthésie. L’anesthésie gazeuse peut entraîner une irritation de la trachée, et la mise en cadre stéréotaxique peut provoquer une gêne transitoire au niveau des barres d’oreilles. Dans de rares cas, une accumulation de mucus peut survenir pendant l’anesthésie et induire une dépression respiratoire, immédiatement prise en charge. Après l’intervention, les souris peuvent présenter une perte de poids, une hypothermie ou des signes passagers de douleur (posture anormale, réduction de mobilité), ainsi qu’un stress transitoire, une diminution du toilettage ou des expressions faciales évocatrices de douleur. L’habituation à l’implant peut provoquer un grattage temporaire, parfois responsable d’une irritation locale ou d’une cicatrisation imparfaite, voire exceptionnellement d’une inflammation de la patte. La majorité de ces signes disparaissent dans les 1 à 4 heures suivant le réveil. Les animaux retrouvent leur poids initial sous 2 à 3 jours et la cicatrisation complète s’établit généralement en moins de 5 jours. La procédure de restriction hydrique peut entrainer un léger stress et une diminution de poids.
Devenir
Toutes les experiences seront terminees par la mise à mort des animaux pour prélèvement d’organes pour des études post mortem.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine étude de plusieurs paramètres comportementaux chez la souris et enregistrement de plusieurs aires corticales simultanément pendant la perception sensorielle et des processus cognitifs. Il est à ce jour impossible de mimer un apprentissage mnésique dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales.
Réduction
La technique de l’animal tête-fixée est un modèle unique qui permet de réduire considérablement le nombre de souris nécessaires pour une étude donnée : - un même animal peut participer à plusieurs sessions d’enregistrements, jusqu’à 7 jours consécutifs - différents tests comportementaux (différent stimuli) peuvent être réalisés sur chacune des souris, évitant la multiplication des groupes d’animaux - les données recueillies sur chaque animal sont multiples : activité de plusieurs régions cérébrales, au cours de différents états de vigilance et comportements et partagées avec le reste de la communauté scientifique. - chaque souris est son propre contrôle pour toutes les procédures, divisant par deux le nombre d’animaux nécessaires et permettant d'appliquer des tests statistiques pour mesures répétées, plus puissants et non paramétriques au regard de la normalité de la distribution des valeurs : Wilcoxon et Friedman (donc moins de souris nécessaires). Le nombre d’animaux sera également réduit par l’utilisation de tests statistiques basés sur des modèles linéaires généralisés et/ou mixtes qui prennent en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre animaux.
Raffinement
Dans ce projet, les enregistrements électrophysiologiques seront combinés à des tâches comportementales ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux et d'obtenir des données riches. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont en hébergement individuel. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l'hébergement individuel est également un stress majeur pour les souris, les étapes d'habituation et de contention ont donc été raffinées afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux. Les animaux implantés sont souvent en hébergement individuel pour protéger les implants. Dans cette étude, les souris seront soit maintenues en groupe soit maintenues dans des cages spécifiques développées au laboratoire qui, grâce à une cloison avec des larges trous, permet aux animaux de se sentir et de se côtoyer sans pour autant pouvoir ronger le connecteur de son compagnon de cage. Enfin, la prise en charge de la douleur pendant la chirurgie et en post-chirurgie est optimisée pour que les animaux ne ressentent aucune douleur et une habituation lente et progressive est effectuée afin de réduire au maximum le stress de l'animal. Une grille de score est utilisée pendant toute la durée post-opératoires afin d'avoir une mesure objective de la récupération de l'animale et de son bien-être. Des points limites clairs et objectifs ont été définis afin de limiter au maximum toute souffrance. Plus spécifiquement, la technique de la souris tête-fixée a été développée dans un souci de raffinement et avec une attention particulière au bien-être de nos souris : 1- pour réaliser des enregistrements au cours du cycle veille-sommeil naturel de l'animal 2- sans générer de douleur. Toutes les interventions chirurgicales étant réalisées sous anesthésie 3- en prenant soin de juguler le stress de l'animal par une habituation adaptée, douce et très progressive, au système de contention 4- avec de nombreuses périodes de "handling" de l'animal. De plus, après chaque manipulation (habituation ou handling) l'animal retourne dans sa cage et est récompensé (eau sucrée). La procédure d'habituation permet à la souris de se familiariser avec la contention par la tête. La répétition des manipulations, toujours récompensées, permet à l'animal d'appréhender le caractère prédictif, récompensé, et non douloureux de la contention.
Choix des espèces
Il existe présentement nombre important de techniques moléculaires et de modèles génétiques développés chez la souris, non disponibles pour d’autres espèces animales. Travailler avec la souris, un organisme modèle en biologie, permet d’accéder à ces outils techniques uniques, assurant la caractérisation fine de l’identité des neurones étudiés, ainsi que la manipulation de réseaux neuronaux donnés. Le stade de développement jeune adulte/adulte (autour de 3-4 mois d'âge) est essentiel pour étudier un système mature stable (croissance terminée) mais non vieillissant. De surcroît, ce projet se place au niveau de l’étude des circuits neuronaux (enregistrement d’activité neuronale). Les populations de neurones étudiées sont à 90% similaires à celle de l’Homme assurant une bonne transférabilité des résultats pour le niveau d’étude considéré.