Système nerveux
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- Système urogénital
Mise en évidence du rôle majeur du noyau dorsal du raphé et de ses circuits dans la dépression induite par la douleur neuropathique : Caractérisation neuroanatomique, fonctionnelle et moléculaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 460 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie de vingt minutes leur inflige une douleur neuropathique chronique que le porteur indique ne pas pouvoir soulager, puisqu'elle est l'objet même de l'étude. Suivent trois tests de douleur jusqu'à trois fois par semaine, puis, huit semaines après l'induction, six tests censés mesurer l'anxiété et la dépression, avec isolement et jeûne. L'objectif reste la compréhension des circuits cérébraux qui lient douleur chronique et dépression, et le porteur écrit qu'il lui est "indispensable" de travailler sur un animal entier, la souris étant selon lui "incontournable" en neurosciences.
Objectifs
La douleur chronique est fréquemment associée aux troubles émotionnels et cela affecte fortement la qualité de vie des patients. Elle représente un fardeau économique majeur sur la société, estimé à plus de 800 millions d’euros en Europe. Le taux de prévalence des troubles anxio-dépressifs est de l'ordre de 30 % chez les patients douloureux chroniques. Il est donc nécessaire de comprendre les circuits neuronaux qui sous-tendent cette comorbidité ainsi les potentiels cibles thérapeutiques. Grâce à l’utilisation de modèles animaux il est aujourd’hui montré que le décours temporel des comportements anxieux et/ou dépressif associés à une douleur neuropathique est hautement dépendant du sexe. De précédents résultats montrent l’implication de structures cérébrales clés. Nous souhaitons approfondir la caractérisation de ces réseaux en manipulant certains gènes ou populations neuronales. L’objectif est de mieux comprendre comment prévenir ou traiter la douleur et/ou la dépression. Ces travaux permettront d’éclairer les mécanismes génétiques et cellulaires impliqués dans le développement de cette comorbidité.
Bénéfices attendus
A l'issue de ce projet, nous serons dans la possibilité d’identifier des réseaux neuronaux et des marqueurs moléculaires impliqués dans la chronicisation de la douleur et le développement des troubles anxio-dépressifs en tenant compte du polymorphisme sexuel. Ces avancées permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant cette comorbidité et sans doute la mise en place de stratégies thérapeutiques adaptées.
Procédures
Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Les chirurgies (d’une durée de 20 minutes) se déroulent sous anesthésie générale avec une administration d’anesthésie locale et d’un anti-inflammatoire en post-chirurgie. Les animaux subissent 3 tests évaluant la douleur de 20 minutes maximum par jour, 1 à 3 fois par semaine. A partir de 8 semaines post-induction de la douleur, les animaux seront évalués avec 6 tests évaluant les comportements de type anxio-dépressifs d'une durée de 5 à 10 min selon le test (avec 48h minimum entre chaque test). Les animaux subissent une chirurgie terminale sous anesthésie générale afin de procéder au prélèvement de tissu d’intérêt. Ce geste a une durée maximale de 15min.
Impact sur les animaux
La présence de la douleur chez le modèle animal est inévitable et ne peut pas être soulagée car c'est l'objet de l'étude. La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48 h. Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec le développement d’un état dépressif. Les animaux subissent une injection pour l’administration des composés pharmacologiques, induisant une légère douleur transitoire. L'isolement et le jeûne nécessaire aux tests de comportement provoquent un stress.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxiodépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie générale et locale sont mises en place et selon les gestes chirurgicaux, des méthodes d’analgésie sont utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la structure chargée du bien-être des animaux à l'institut (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal, souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.
Evaluation de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de la dysplasie corticale focale chez des modèles murins de la pathologie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un bout de queue prélevé sans anesthésie entre sept et dix jours, puis des crises d'épilepsie quotidiennes vers deux mois chez la moitié des animaux : 11 298 souris vont être utilisées, dont 5 176 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent ensuite jusqu'à dix injections, ou dix administrations orales, ou une injection intracérébrale sous anesthésie, puis passent six tests comportementaux que le porteur nomme, locomotion, exploration, cognition, anxiété, sociabilité et mémoire, ce dernier jusqu'à huit essais par jour pendant treize jours. Une partie subit en plus une chirurgie d'une heure pour implanter des électrodes cérébrales, suivie d'un hébergement individuel dont le porteur reconnaît qu'il génère du stress. Toutes sont tuées à l'issue, pour prélever des tissus ou parce que leur modification génétique interdit de les réutiliser.
Objectifs
Les dysplasies corticales focales sont des pathologies cérébrales du développement induisant des malformations du cerveau (malformations corticales), une épilepsie résistante aux traitements actuels et des troubles neurodéveloppementaux. Pour mieux comprendre et traiter ces maladies, nous utiliserons deux modèles de souris génétiquement modifiées reproduisant les symptômes de la pathologie. Notre objectif sera tout d’abord d’élever les animaux pour produire nos lots expérimentaux. Puis, ces lots permettront ensuite d’évaluer les effets de traitements innovants sur les différentes caractéristiques de la maladie.
Bénéfices attendus
L'épilepsie touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Les épilepsies focales sont parmi les plus fréquentes et sévères des épilepsies, et sont souvent liées à une malformation cérébrale, en particulier ce que l’on appelle les dysplasies corticales focales, sujet de ce projet. Ces dysplasies sont actuellement la cause la plus fréquente de chirurgie cérébrale pédiatrique du fait de la forte proportion de patients résistants aux traitements antiépileptiques actuels. A court terme ce projet pourrait permettre de valider de nouvelles cibles thérapeutiques et de valider l’efficacité de nouveaux traitements agissant sur ces cibles chez des modèles murins de la pathologie. A plus long terme, cela pourrait permettre d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques aux patients atteints de dysplasie corticale focale, moins risquées qu’un retrait chirurgical de la zone responsable des crises d’épilepsies.
Procédures
Pour identifier le patrimoine génétique de nos animaux, un petit prélèvement de l’extrémité de la queue sera effectué sur tous les souriceaux (moins d’1 min par animal, 1 seule fois, sans anesthésie car le jeune âge des animaux rend l’extrémité de leur queue peu sensible). La moitié des animaux que nous produirons développera un phénotype dommageable c’est-à-dire qu’ils présenteront les mêmes symptômes que ceux de la pathologie à partir de 2 mois environ (crises d’épilepsie, modifications du comportement). Tous les animaux recevront un traitement ou son placebo soit par injection (1 injection par jour maximum, tous les 1 à 3 jours pendant maximum 2 semaines, soit 10 injections maximum, moins d’une minute par injection), soit par voie orale (10 administrations réparties sur un maximum de 3 semaines, moins d’une minute par administration), soit par voie intracérébrale (une injection unique réalisée au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée, durée 1h maximum). Pour une partie des lot expérimentaux, avant la phase de traitement, puis après, une partie des animaux participera à des tests comportementaux (6 tests avec 24h minimum entre chaque test, répartis sur une durée maximale d’un mois, trois fois maximum). Le test 1 permettra d’évaluer la locomotion (1 essai, 20 min), le test 2 évaluera la capacité exploratoire (10 minutes par jour, 2 jours), le test 3 évaluera les capacités intellectuelles (1 essai, 8 min), le test 4 évaluera l’anxiété (1 essai, 5 min), le test 5 évaluera la sociabilité (1 heure, 1 fois), et enfin le test 6 évaluera les capacités de mémorisation (au maximum : 8 essais par jour de 90 secondes par essai, pendant 13 jours). Pour une partie des lot expérimentaux, avant la phase de traitement (ou de façon concomitante en cas de traitement par voie intracérébrale), une partie des animaux aura une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée (durée 1h, une fois) pour implanter des électrodes au niveau du cerveau. L’activité électrique du cerveau des animaux sera ensuite mesurée en connectant (connexion simple et indolore) les électrodes à un système d’enregistrement (fait avant et, ou après la phase de traitement donc 2 fois 3 sessions de 5 jours consécutifs maximum, enregistrement en continu, 1 semaine minimum de repos entre chaque session de 5 jours). Les animaux seront vigiles lors des enregistrements, et pourront se déplacer librement durant le test.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : Premièrement, une légère et brève douleur lors du prélèvement pour déterminer le patrimoine génétique des animaux, ainsi qu’un stress lors des manipulations nécessitant une contention. Deuxièmement, le développement de crises d’épilepsies avec plusieurs crises par jour, la possible survenue de mort due aux crises et des modifications du comportement (diminution de l’anxiété et des interactions sociales entre animaux) Ensuite, une légère et brève douleur lors de l’administration de traitement par injection, avec une possible apparition d’hématome ou d’œdème suite à la répétition des injections. De même, possible douleur au niveau de l’œsophage suite à l’administration de traitement par voie orale. Les animaux pourront également subir un stress dû à l’analyse comportementale et au changement d’environnement pour la réalisation des tests. Il y aura également un risque hypothermique à la suite d’un test impliquant que les animaux soient mouillés. Enfin, la chirurgie nécessaire à l’implantation locale d’électrode et, ou, au traitement intracérébral pourra induire une douleur, une gêne et un inconfort post-opératoire. L’anesthésie générale pratiquée pour cette chirurgie sera associée à un risque d’hypothermie (stress thermique) et un risque d’arrêt cardiorespiratoire. L’hébergement individuel des animaux prévus pour l’enregistrement de l’activité électrique du cerveau engendrera un stress pour les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés pour prélever des tissus d’intérêt pour répondre à notre question scientifique ou parce qu’il n’est pas possible de les réutiliser ou de les replacer du fait de leur modification génétique.
Remplacement
Les études de tissus issus de chirurgies de patients ont permis de déterminer les gènes impliqués dans la pathologie, d'améliorer le diagnostic des patients, d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes à l’origine de la pathologie, et de créer des modèles animaux. Cependant, le faible nombre de tissus disponibles (environ une naissance sur 100 000) et le fait que ces tissus soient collectés après l’apparition des crises épileptiques limitent considérablement le champ des expérimentations possibles pour nos projets. Enfin, les études sur les patients de nouveaux traitements nécessitent une validation préalable sur des modèles proches de la physiologie humaine et reproduisant les crises épileptiques, comme les modèles de souris utilisés dans ce projet. Deuxièmement, la culture cellulaire seule ne suffit pas pour nos projets. Bien qu’elle ait permis de nombreuses avancées dans l’étude de ces pathologies (validation de mutations découvertes chez les patients, étude des mécanismes impliqués dans la pathologie, etc.), elle ne permet pas la création de modèles suffisamment complexes et représentatifs de l’ensemble des mécanismes en jeu in vivo. Elle ne permet pas non plus de reproduire les crises d'épilepsie observées chez les patients. Enfin, la modélisation informatique nécessite des données expérimentales encore manquantes. Les modèles de souris que nous utiliserons ont déjà été validés pour l’étude de cette pathologie et sont donc adaptés à la validation de nouvelles cibles thérapeutiques et à l’évaluation de l’efficacité de nouveaux traitements agissant sur ces cibles.
Réduction
Nous veillerons à générer le minimum d'animaux nécessaires pour leur utilisation dans des expériences visant à produire des conclusions scientifiques statistiquement fiables. Nous utiliserons au total dans ce projet un maximum de 11 298 animaux. La taille des effectifs par groupe a été établie grâce à un calcul de puissance et sera ajustée selon les premiers résultats obtenus. Ainsi, nous avons définis qu’un effectif de 10 à 15 animaux par groupes serait nécessaire en fonction des critères évalués. Nous procèderons à des tests statistiques sur les données obtenues pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils seront observés quotidiennement, et ceux susceptibles de développer un phénotype dommageable bénéficieront d’une surveillance spécifique. Pour chaque procédure, nous avons établie des points limites spécifiques pour éviter toute souffrance animale. Le geste de biopsie (prélèvement d’une petite quantité de tissus pour connaitre le statut génétique des animaux) sera de la plus petite taille possible. Le geste sera réalisé dans une pièce dédiée, au calme, avec du matériel propre et désinfecté entre chaque animal pour éviter toute infection ou contamination croisée. Les petits seront immédiatement replacés avec leur mère après le geste et il sera vérifié qu’ils soient bien repris en charge immédiatement après le retour en cage puis 20 minutes environ après. Pour les animaux recevant un traitement, nous les pèserons du premier au dernier jour de traitement afin de détecter une éventuelle perte de poids et d’adapter le volume administré. Pour les souris recevant une injection, la zone et la méthode ont été déterminées pour limiter au maximum les potentiels effets indésirables sur les animaux. Pour les souris recevant un traitement par voie orale, la prise dans l’eau de boisson ou dans du lait concentré-sucré avec une pipette sera préférée au maximum et le schéma thérapeutique pourra être réévalué en cours de traitement pour limiter au maximum la souffrance des animaux. Les tests comportementaux seront précédés d’une période d’habituation à l’expérimentateur. Les tests seront effectués du moins au plus stressant et avec une période d’habituation à la pièce avant chaque test. Nous observerons un temps de repos entre les traitements et les tests et inversement. Dans le cas du test impliquant de la nage, la température de l’eau sera rigoureusement vérifiée et les animaux seront séchés entre chaque phase du test. Pour la procédure chirurgicale, nous prendrons en compte le risque d’hypothermie en maintenant la température des animaux pour toute la durée de l’anesthésie. La douleur sera prévenue par analgésie et anesthésie. Après la chirurgie, l’expérimentateur réalisera une surveillance spécifique quotidienne durant 5 jours, puis une fois par semaine. Un enrichissement supplémentaire sera fourni aux animaux hébergés seuls en post-chirurgie, ils seront également surveillés spécifiquement pour détecter tout signe clinique en lien avec cet hébergement.
Choix des espèces
Ce projet nécessitera de travailler sur la souris. Ce choix a été motivé par des raisons scientifiques car le projet porte sur une pathologie génétique ce qui implique de générer un modèle reproduisant les mutations génétiques observées chez les patients. La souris fait partie des espèces permettant ce type de modifications. De plus, l’utilisation de cette espèce permet l’obtention rapide de groupe d’individus homogènes diminuant la variabilité de nos résultats et permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les souris ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des crises épileptiques. Plusieurs modèles de souris ont déjà été créés et étudiés pour modéliser les crises d’épilepsies. Les souris ont donc été explorées de manière exhaustive, permettant une solide base scientifique. Ce projet nécessitant l’administration de traitements, nous utiliserons donc des souris adultes. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera fait à l’âge de 7 à 10 jours. Cet âge précoce permet d’une part de profiter de la cicatrisation rapide des jeunes animaux et d’autre part de connaitre leur génotype très tôt et donc pouvoir inclure les animaux dans les procédures dès leur sevrage.
Impact de la signalisation du récepteur NMDA par le peptide AETA dans la cognition sociale
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 880 souris vont être utilisées, 2 160 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 720 d'un niveau léger. Une partie subit une chirurgie du cerveau de 40 minutes pour y injecter des outils viraux activant ou inhibant certaines cellules, d'autres une chirurgie terminale sans réveil, toutes une biopsie du bout de la queue sous anesthésie par le froid. Elles passent ensuite des tests nommés, test des trois chambres, interaction sociale, labyrinthe en Y et piscine de Morris avec six à sept jours d'apprentissage, avant d'être tuées pour prélèvement du cerveau, les souris dépourvues du génotype recherché étant tuées après génotypage ou gardées pour l'entretien de la lignée. L'objet déclaré est la mémoire sociale et ses défauts dans la schizophrénie, et le porteur prévoit pour certaines expériences un isolement de trois semaines qu'il reconnaît stressant, imposé à des animaux dont il mesure ensuite la sociabilité.
Objectifs
La cognition sociale est essentielle pour interagir correctement avec les autres. Elle nous permet de comprendre et de réagir aux pensées, émotions et intentions des gens autour de nous. Certaines maladies psychiatriques, comme la schizophrénie, affectent cette capacité. Les personnes atteintes ont du mal à interpréter les émotions et intentions des autres, ce qui complique leurs relations et peut aggraver leurs symptômes. Pour mieux comprendre ces troubles, il est important d’identifier les circuits cérébraux impliqués dans la cognition sociale. Des recherches récentes montrent qu’une connexion entre l’hippocampe (mémoire) et le cortex préfrontal (prise de décision) joue un rôle clé dans la mémoire sociale, un élément fondamental de la cognition sociale. Cette connexion repose sur la capacité des neurones à s’adapter et à traiter l’information. Notre équipe a récemment découvert qu’un peptide appelé AETA pourrait influencer cette connexion en régulant un type particulier de récepteurs du cerveau (récepteurs NMDA), connus pour être perturbés dans la schizophrénie. Nos premiers résultats suggèrent qu’un dysfonctionnement de cette régulation pourrait être responsable des difficultés sociales observées chez les patients. L’objectif de ce projet est donc de comprendre le rôle du peptide AETA dans la mémoire sociale et son impact sur les comportements sociaux. Nous voulons aussi explorer comment son dysfonctionnement pourrait être impliqué dans la schizophrénie, afin d’ouvrir la voie à de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux appréhender les origines biologiques, d’obtenir des informations sur les modifications cellulaires/moléculaires et d’ouvrir la voie vers des traitements adaptés en lien avec la cognition sociale. Par ailleurs, cela pourrait permettre l’identification d’une nouvelle cible prometteuse pour le traitement de la schizophrénie. La schizophrénie touche environ 0,25 % à 0,64 % de la population mondiale, selon les estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) et de l'Institut national de la santé mentale (NIMH). Cela signifie qu'environ 1 personne sur 200 à 1 personne sur 400 dans le monde est atteinte de schizophrénie. Cette étude est donc primordiale pour tester notre hypothèse in vivo et définir de nouvelles pistes de thérapie contre cette maladie psychiatrique qui affecte et qui reste sans traitement adapté à ce jour.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents protocoles. Notamment à une biopsie du bout de la queue afin de les génotyper, cela se fera suite à une anesthésie par le froid. Certaines souris recevront une chirurgie cérébrale afin d'injecter des outils permettant de modifier, activer ou inhiber certaines cellules du cerveau. Cela se fera sous médication pharmacologique anesthésique/analgésique et durera maximum 40 minutes. Certains animaux recevront une chirurgie terminale sans réveil sous anesthésie pharmacologique profonde, après administration d’analgésique/anesthésique. Cette technique est utilisée afin de maintenir les tissus du cerveau et de permettre une étude du site d’injection, elle durera maximum 10 minutes. les animaux seront soumis à différents tests comportementaux répartis sur plusieurs semaines, permettant d’évaluer l’apprentissage, la mémoire spatiale et de travail ainsi que les comportements sociaux. Certaines de ces expérimentations nécessiteront une période préalable d’isolement de trois semaines. Dans le cadre du 3-chamber test, les souris passeront par trois phases successives, chacune d’une durée de 10 minutes (soit 30 minutes au total). Pour le test d’interaction sociale, une période d’habituation de 5 minutes précédera une phase de test de 10 minutes (soit 15 minutes au total). Le test du labyrinthe en Y sera réalisé sur une durée de 10 minutes. Concernant la piscine de Morris, les souris seront d’abord familiarisées avec l’eau et la plateforme, puis suivront une phase d’apprentissage de 6 à 7 jours comprenant 4 essais séparés par 15 minutes. 24 heures après la fin de cette phase, elles effectueront un premier essai test, suivi d’un second essai sept jours plus tard. Enfin, chacun de ces tests sera espacé d’au minimum une semaine, voire davantage selon les protocoles.
Impact sur les animaux
Le projet s’intéresse à la composante sociale d’une pathologie psychiatrique. Par conséquent, les effets indésirables seront principalement liés à la dérégulation des circuits neuronaux et pourront se manifester à l’échelle comportementale par des troubles de sociabilité et de mémoire. Cela n’entraine pas de dérégulations des systèmes impliqués dans la douleur mais provoque des modifications des comportements sociaux. Les tests comportementaux seront sans douleur et basés sur la tendance naturelle des animaux à explorer ou éviter une zone nouvelle ou un nouveau congénère. Il pourrait y avoir une douleur transitoire post-opération lors de la biopsie du bout de la queue et suite à l'injection de la micropuce. Il pourrait y avoir des effets indésirables comme état confusionnel transitoire au réveil après chirurgie et une douleur post-chirurgicale. Une nuisance de l'injection lors de l'anesthésique est aussi attendue.
Devenir
Procédure 1 : après le génotypage, les animaux présentant le génotype d'intérêt seront gardés pour les procédure 2 et 3. Les animaux ne possédant pas le génotype d'intérêt seront soit euthanasiés, soit maintenus pour le maintien de la lignée. Procédure 2 : après les tests, les souris seront euthanasiées afin de prélever le cerveau et vérifier les résultats de la chirurgie ou réaliser des études post-mortem. Procédure 3 : Après les tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés pour prélever et réaliser des études post-mortem.
Remplacement
Notre projet étant en grande partie orienté sur des approches de physiologie intégrée, il n’existe, aujourd’hui, aucune méthode substitutive qui pourrait remplacer l’utilisation des animaux dans nos expériences. Les structures étudiées étant très conservée entre Homme et Souris, cela en fait un modèle de choix pour notre étude. De plus, les outils viraux qui seront utilisés sont très bien décrits et spécifiques pour la souris aussi, les lignées génétiquement modifiées que l'on va utiliser dans ce projet ne sont disponibles que chez la souris.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été évalué afin d'avoir une bonne estimation des effectifs suffisants pour l'obtention de données statistiquement fiables tout en s'assurant d'une utilisation des animaux au strict nécessaire. De plus, chaque souris suit le maximum de procédures envisageables sans interférence. Pour finir, la mise en groupe de souris est optimisée pour chaque lot d’animaux lors du sevrage grâce au génotypage avant sevrage.
Raffinement
Nous appliquerons plusieurs techniques de raffinement dans les différentes procédures. Lors des chirurgies, les soins opératoires et post-opératoires ainsi que la fréquence de suivi des animaux seront adaptés. Ainsi lors des chirurgies, une hydratation sous-cutanée pré et post-opératoire sera réalisée, de même que l’injection d’analgésique avant et une administration d’anti-inflammatoire/analgésique pendant 5 jours post-opératoire. Un tapis chauffant est placé sous l’animal lors de la chirurgie (régulation via sonde rectale) et également sous les cages de réveil afin de faciliter celui-ci et éviter toute hypothermie. Les souris auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Lors de la procédure de comportement, il faudra que les animaux soient isolés pendant 3 semaines. Bien que la procédure d’isolement puisse être stressante pour les animaux, leur bien-être restera le point le plus important. Par conséquent, nous ferons en sorte que les animaux aient des cages avec enrichissements (bâtons en bois, abris et oates pour la nidification), à limiter le stress. Ces animaux seront suivi de très près tout au long de l’isolement afin de détecter très rapidement des problèmes éventuels de comportement dû à l’isolement. Pour les animaux dans toutes les procédures les signes potentiels de souffrance sont recherchés et des points limites adaptés aux différentes phases des procédures ont été fixés.
Choix des espèces
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. De plus elles possèdent une proximité évolutive, un cycle de vie cours permettant de répéter les expériences afin de s’assurer de la robustesse des résultats, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre étude. C’est un très bon modèle pour l’étude des circuits neuronaux sous-jacent les comportements sociaux. Les mécanismes moléculaires et cellulaires ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures d’intérêt sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension des mécanismes impliqués dans la mémoire sociale et des effets de la schizophrénie et ainsi de pouvoir mieux cibler de possibles approches thérapeutiques. Nous disposons des modèles murins requis et des techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie), faisant de ces souris un excellent modèle pour l’étude de cette pathologie. Pour notre étude, la période d’intérêt étant d’environ 8 semaines (âge adulte), les animaux seront donc utilisés à cette période afin d’effectuer des tests comportementaux ou des mesures d’activité cellulaire.
Comprendre les causes de l’arrêt respiratoire dans le syndrome d’Ondine (maladie génétique qui touche le contrôle de la respiration) grâce à des souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
- Système respiratoire
Les souriceaux de ce projet naissent avec une mutation qui les empêche de respirer normalement, apnées, respiration faible et absence de réaction à l'excès de gaz carbonique dans le sang. 464 souris vont être utilisées, 180 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 264 modéré et 20 léger, toutes tuées à l'issue. Chaque nouveau-né est séparé de sa mère jusqu'à une heure pour les mesures cardio-respiratoires, subit le prélèvement de deux à trois millimètres de queue avant son quatrième jour de vie pour le génotypage, et est manipulé toutes les deux heures le jour de sa naissance pour vérifier sa vitalité. Les souriceaux sont tués par décapitation au quatrième jour, ou plus tôt si un point limite est atteint, le porteur ayant retenu comme critères le score d'adaptation à la vie extra-utérine et le comportement de la mère envers sa portée.
Objectifs
Nous voulons comprendre comment et pouquoi des mutations aboutissent au syndrome d'Ondine. Cette maladie se manifeste à la naissance par une apnée, une respiration faible et une absence de rélfexe respiratoire (pas d'augmentation de la respiration à une élévation de la teneur en gaz carbonique dans le sang). Ces problèmes se manifestent pendant le sommeil ce qui est dangeureux pour le nouveau-né. Il s'agit d'identifier les structures qui ne se forment pas et/ou les structures qui sont malformées à l'expression de la mutation et leurs conséquences sur la respiration.
Bénéfices attendus
Le projet pourrait avoir un impact fondamental par l’identification des circuits neuronaux impliqués dans les déficits respiratoires du syndrome d'Ondine. Le projet pourrait également apporter de nouvelles connaissances sur les structures du cerveau impliquées dans le maintien de la respiration pendant le sommeil, informations critiques à la compréhension du développement du syndrome d'Ondine et plus largement des pathologies respiratoires du sommeil comme les apnées obstructives.
Procédures
1/ Séparation maternelle d'une heure pour la mesure cardio-respiratoire 2/ Le prèlèvement d'un morceau de queue de 2-3 mm et d'une durée de 3 secondes pour l'identification du statut génétique est réalisée avant quatre jours de vie (souriceau sans poils) 3/ vérification de la vitalité du souriceaux (durée : 1 min par souriceau) le jour de naissance toutes les deux heures sur 6h d'observations puis deux fois par jour. Aucune necessité de recourir à de l'anesthésie.
Impact sur les animaux
1/ angoisse à la séparation maternelle d'une heure pour les mesures respiratoires 2/ Douleur au prèlèvement de 2-3mm de queue pour l'identification du statut génétique 3/ détresse respiratoire liée à la mutation 4/ angoisse à la vérification de la vitalité du souriceau (1 min par souriceau) 3 fois en 6h (le jour de naissance et 2 fois par jour juqu'à P4. 5/Stress lié à la detresse respiratoire engendrée par mutation.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Les souriceaux sont euthanasiés par décapitation à la fin de la procédure (4 jours de vie) ou en cas d'atteinte de point limite. S'il y a un besoin de prélèvement d'organes notamment du cerveau sur les souriceaux nouveau-nés, ça sera en postmortem.
Remplacement
Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique. Cependant, les modèles génétiques murins sont disponibles pour élaborer et/ou affiner les stratégies thérapeutiques. Si les avancées obtenues par les recherches sur les cultures cellulaires permettent d'éclaircir les mécanismes et les conséquences de la mutation à l'échelle moléculaire et cellulaire, une validation sur des animaux en développement est nécessaire pour comprendre la maladie et les conséquences fonctionnelles sur un organisme entier. L’utilisation de l’animal ne peut alors être évitée.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle et d'une éventuelle mortalité à la naissance, nous avons déterminé un lot expérimental de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Les études publiées sur les variables respiratoires valident l’effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir une puissance statistique satisfaisante. Cet effectif sera réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.
Raffinement
Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux sont décrits et comportent le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau et le comportement de la mère envers sa portée. Pour les mesures, nous utilisons une technique non invasive (animal non anesthésié) et contrôlée (durée de la mesure, température constante dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. La durée de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure au maximum. Les cages avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid. De plus, l’équipe de l’animalerie effectue une surveillance réglementaire quotidienne des espaces d'hébergement et de toutes les cages.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle pour l'étude du développement du cerveau humain. Plus largement, la souris génétiquement modifée contribue à la compréhension d'une maladie génétique. Dans le cas du syndrome d'Ondine, les modèles animaux existants sont murins. C’est une maladie qui se manifeste dès la naissance. Nous avons des outils adaptés pouvant prendre en charge les modèles murins dès la naissance permettant ainsi de tester et d’évaluer des stratégies thérapeutiques. De plus, le recours aux modèles animaux en développement constitue une des recommandations de l'Agence Européenne du médicament pour évaluer les médicaments à visée pédiatrique. Les souriceaux sont étudiés dans la période juste avant et après leur naissance, jusqu'à leurs 4 premiers jours de vie.
Effets de l’altération du microbiote intestinal sur le développement des neurofibromes cutanés (NFc) chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Pour vérifier si un déséquilibre du microbiote intestinal accélère l'apparition de tumeurs cutanées, 32 souris porteuses d'une neurofibromatose de type 1 vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la peau de leur dos. Elles boivent des antibiotiques pendant huit semaines au maximum et passent deux fois sous anesthésie pour un rasage, une épilation et des photographies du dos. Certaines sont isolées, un stress social que le porteur dit compenser par des abris et des matériaux de nidification. Il présente ce protocole comme un modèle "plus éthique" et moins invasif que les lésions cutanées jusqu'ici pratiquées, alors que l'objectif déclaré est d'évaluer l'efficacité des antibiotiques à accélérer la croissance des tumeurs.
Objectifs
La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique qui touche environ un million de personnes dans le monde. Les signes de cette maladie peuvent varier considérablement d’un individu à l’autre, même au sein d’une même famille. L’une de ses caractéristiques les plus visibles est l’apparition de petites tumeurs bénignes sur la peau, appelées neurofibromes cutanés (NFc), dont le nombre et la sévérité sont très hétérogènes. En plus de l’impact esthétique, ces tumeurs peuvent provoquer des démangeaisons, des douleurs et altérer fortement la qualité de vie. Cette grande variabilité suggère que, outre les causes génétiques, d’autres facteurs, notamment environnementaux, pourraient influencer l’apparition et la gravité des symptômes. Le microbiote intestinal désigne l’ensemble des micro-organismes (bactéries, virus, champignons, etc.) qui colonisent le tube digestif. Il joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions physiologiques, telles que la digestion, l’immunité et l’équilibre métabolique. Un déséquilibre de cette communauté microbienne, appelé dysbiose, est fréquemment associé à des pathologies inflammatoires ou tumorales. Des résultats préliminaires obtenus à partir d’un modèle murin reproduisant la NF1 humaine montrent que l’administration d’antibiotiques, connue pour induire une dysbiose, est associée à un développement des NFc. Le lien de causalité entre cette altération du microbiote et les effets observés reste toutefois à établir. Le projet proposé vise précisément à mieux comprendre ce lien et à identifier les mécanismes sous-jacents.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider et approfondir une observation préliminaire concernant l’effet d’un traitement antibiotique sur l’apparition et la progression des NFc. Il a pour objectif de mieux comprendre les liens entre le microbiote intestinal, l’inflammation et la tumorigenèse dans la NF1, ainsi que d’évaluer si ces effets peuvent être modulés par des interventions complémentaires. Les bénéfices attendus incluent des avancées scientifiques significatives sur le rôle des facteurs environnementaux dans la pathogénie de la NF1. Par ailleurs, grâce à un plan expérimental repensé, ce projet vise également à valider un nouveau modèle d’étude de la NF1 plus éthique, en proposant des protocoles moins invasifs ou stressants pour les animaux et cliniquement pertinent, reflétant davantage la diversité des patients.
Procédures
Les antibiotiques à tester seront administrés aux souris dans leur eau de boisson, pendant une période maximale de 8 semaines. Cette méthode est simple et ne cause aucune douleur ni gêne aux animaux, car elle ne nécessite pas d’anesthésie ni de manipulation particulière. Pour observer l’évolution des NFc, des photographies du dos des souris seront prises après un rasage et une épilation localisés. Ces interventions se dérouleront sous anesthésie générale (moins de 5 minutes par animal), afin d’éviter tout stress ou douleur. Deux séances seront réalisées, espacées de plusieurs semaines, dans des conditions standardisées garantissant la reproductibilité des observations et le respect du bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les NFc qui apparaissent dans ce modèle murin sont petits, plats et non douloureux. Des études récentes montrent que, chez les personnes atteintes de NF1, ces tumeurs sont souvent moins sensibles aux sensations de chaleur ou de pression que les zones de peau normales. Dans les observations précédentes, les animaux porteurs de la mutation ne présentent aucun signe de souffrance ni de détérioration de l’état de santé avant l’âge d’un an. Le traitement antibiotique utilisé dans cette étude peut toutefois entraîner des effets secondaires, comme des troubles digestifs ou des modifications du comportement. C’est pourquoi les animaux seront surveillés de près tout au long de l’expérience, afin d’identifier rapidement tout signe de gêne ou d’inconfort. Certaines manipulations, telles que le maintien doux pendant quelques minutes ou l’anesthésie courte pour les prises d’image, peuvent entraîner un stress modéré, maîtrisé grâce à un entraînement préalable à la manipulation. L’épilation occasionnelle peut provoquer une irritation cutanée temporaire, systématiquement contrôlée. Dans les cas où des souris doivent être isolées, des mesures spécifiques seront mises en place pour limiter l’impact du stress social, notamment par l’enrichissement du milieu (abris, matériaux de nidification). L’ensemble des procédures a été conçu pour minimiser les effets indésirables potentiels, dans le respect strict des standards de bien-être animal.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures décrites dans le projet, tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements, afin d’évaluer l’efficacité des antibiotiques à accélérer la croissance des tumeurs cutanées. Pour cela la peau du dos de chaque souris sera prélevée en vue de faire une analyse cellulaire et moléculaire et seront comparées au groupe contrôle qui n’a pas reçu les molécules.
Remplacement
À ce jour, aucun modèle alternatif in vitro ou in silico ne permet de reproduire fidèlement la formation des NFc observés chez les patients atteints de NF1. Le modèle murin utilisé ici reste actuellement le seul outil disponible pour l’étude de cette forme tumorale et pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Réduction
L’inclusion des femelles dans cette étude, et probablement dans les futures — rendue possible par l’induction des symptômes via l’antibiothérapie — permet d’optimiser l’utilisation des portées issues des croisements, tout en réduisant la nécessité de générer de nouveaux animaux. Le nombre total de souris par groupe a été défini à partir de la fréquence attendue des lésions, de leur sévérité et du nombre d’observations nécessaires pour obtenir des données statistiquement robustes. Les protocoles, le suivi et les méthodes d’analyse ont été standardisés à partir d’expériences antérieures, permettant une réduction notable du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Toutes les procédures ont été conçues pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort. L’administration des antibiotiques se fait par l’eau de boisson, sans manipulation directe. Les anesthésies nécessaires (épilations et photographies) sont brèves, réalisées avec précautions (utilisation d’un tapis chauffant et d’un gel ophtalmique). Des soins post-interventionnels comme l’application de vaseline limitent les irritations cutanées. L’isolement temporaire de certains animaux sera compensé par un enrichissement environnemental renforcé. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel technique, y compris les week-ends, avec l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être incluant des points limites. En cas de signe de détresse persistant plus de 24 h, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort selon les standards réglementaires. Enfin, ce projet permet de valider un modèle reposant sur la dysbiose intestinale comme facteur déclenchant, sans recours aux lésions cutanées jusqu’ici nécessaires. Cette avancée ouvre la voie à des pratiques plus respectueuses du bien-être animal dans les futures études sur la NF1.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est une lignée murine génétiquement modifiée reproduisant fidèlement les manifestations cutanées de la NF1, notamment l’apparition progressive des NFc. Ce modèle constitue à ce jour l’outil le plus adapté pour l’étude des mécanismes pathologiques de la NF1 et pour le criblage préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Les animaux utilisés seront des souris mâles et femelles âgées de 45 jours au début du protocole. Ce stade de développement correspond à la période initiale de formation des NFc dans ce modèle, garantissant la pertinence des observations et l’efficacité du suivi longitudinal.
Etude de la vascularisation au cours de la démyélinisation dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 70 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 30 d'un niveau léger. Une encéphalomyélite auto-immune leur est provoquée par deux administrations sous anesthésie, puis une injection sur animal vigile deux jours plus tard. Les troubles de la marche, de la coordination, la faiblesse musculaire et la perte de poids s'installent en deux semaines et culminent trois à cinq jours. L'objectif reste descriptif, caractériser la chronologie des modulations de la vascularisation cérébrale, et le porteur affirme que ce travail exige l'"organisme entier" parce que les modèles ex vivo ne rendent pas les échanges entre tissu nerveux et cellules immunitaires du sang.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neurodégénérative chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une démyélinisation et une dégénérescence axonale. La forme la plus courante de la maladie est la forme récurrente-rémittente (RRMS), dans laquelle des poussées répétées de symptômes neurologiques sont suivies de périodes de récupération partielle ou complète. Les altérations de la structure et de la fonction du système vasculaire jouent un rôle essentiel dans les troubles neurodégénératifs chroniques telle que la sclérose en plaques. Au début de la maladie, la barrière hémato-encéphalique perd son imperméabilité, ce qui permet l'infiltration ultérieure de cellules immunitaires périphériques qui provoquent une démyélinisation neuronale et des dommages axonaux. Des études récentes réalisées en imagerie cérébrale sur des cohortes de patients atteints de SEP ont décrit le remodelage vasculaire pendant la formation et l'évolution des lésions). En particulier, une augmentation du débit sanguin cérébral précède l'apparition des lésions et la démyélinisation. Les mécanismes cellulaires impliqués dans le remodelage vasculaire dans les maladies démyélinisantes n'ont pas encore été entièrement définis. L’objectif de ce projet sera donc de caractériser précisément les modulations de la vascularisation et leur chronologie dans un modèle murin de la SEP, notamment l’étude de l’angiogénèse, la prolifération des cellules endothéliales et vasculaire et l'expression de facteurs d’hypoxie dès l’apparition des premiers symptômes.
Bénéfices attendus
La sclérose en plaque (SEP) est la seconde cause de handicap chez l’adulte jeune en France, elle touche plus de 120 000 personnes en France, et plus de 2 millions dans le monde. Il n’existe présentement aucun traitement curatif pour cette pathologie. Ce projet permettra d'étudier des processus pathologiques et réparateurs dans un modèle murin de Sclérose en plaques dans l'organisme entier et ainsi compléter et valider des mécanismes qui semblent d’intérêt dans la pathologie d’après les études IRM récemment obtenues chez l’homme. Cela pourrait permettre notamment de mieux comprendre le rôle de la vascularisation et sa modulation dans la physiopathologie de la SEP.
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, recevront deux administrations d’un produit pour la mise en place de notre modèle pathologique et du groupe contrôle (10 minutes maximum). 2 jours après ils recevront une deuxième injection (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal, vigile). Afin de tester la perméabilité cérébrale, nous injecterons une molécule 1h avant l’euthanasie des animaux (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal, sous anesthésie générale).
Impact sur les animaux
Après induction de notre modèle pathologique, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement au bout de 2 semaines environ et atteignent un pic durant 3-5 jours, puis sont suivis d’une récupération partielle ou complète en quelques jours. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation lors de l’induction de la pathologie sera très courte (inférieure à 10 minutes) et sera donc associée à un risque infime de détresse cardio-respiratoire et d’hypothermie. Les injections génèreront un stress et une brève et légère douleur au point d’injection. Lors des injections d’induction de la pathologie, il existe également un risque de lésion cutanée du point d’injection dû à la molécule injectée, prise en charge par la stérilisation du lieu d’injection avant manipulation.
Devenir
Des analyses seront réalisées post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux pour le prélèvement des tissus d’intérêt.
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles ex vivo. Les modèles murins in vivo sont nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la réparation tissulaire dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux et cellules immunitaires sanguines, ainsi que les apports métaboliques en lien avec le réseau sanguin, qui sont des composantes essentielles à étudier de cette pathologie, d’après les travaux en imagerie effectués chez le patient.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 100 maximum, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après la première expérience. Les données obtenues seront analysées avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Un environnement enrichi leur est fourni, comprenant nidification (coton de nidification, kraft), et bâtonnet à ronger. Nous respecterons une période d’acclimatation d’une semaine à l’arrivée des animaux dans l’animalerie avant toute inclusion dans la procédure. Les animaux sont observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci est transmise à l’équipe de recherche, à la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et au vétérinaire afin de mettre en place une prise en charge rapide et adaptée pour éviter toute souffrance de l’animal. Ils seront également surveillés de manière spécifique par l’équipe dès l’induction de la pathologie : afin de suivre l’évolution des signes cliniques une grille de score adaptée à notre modèle est utilisée quotidiennement voir bi-quotidiennement lors de la phase aiguë de la pathologie. Nous mettrons en place une assistance nutritionnelle dès l’apparition de difficultés motrices (alimentation humide ou en gelée, facilement accessible dans la cage). L’induction de la pathologie sera réalisée sous anesthésie pour minimiser le stress et la douleur des animaux. On s’assurera du maintien de la température physiologique des animaux tout au long de l’anesthésie (chambres d’induction et de réveil chauffées, tapis chauffant) et on appliquera un gel oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. L’injection intraveineuse avant euthanasie sera également réalisée sous anesthésie générale afin de réduire le stress induit pour les animaux. L’euthanasie médicamenteuse sera ensuite réalisée après une pré-sédation des animaux pour éviter tout stress ou douleur lors de l’injection létale. Des points limites seront définis et respectés pour éviter toute souffrance animale non nécessaire pour la procédure.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proche de l'Homme. Le modèle de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) chez la souris est un modèle classique de sclérose en plaques (SEP), permettant de reproduire en partie l’aspect inflammatoire observé chez les patients, et qui apporte une approche intégrée des déficits observés dans la pathologie. Il s’agit donc d’un modèle particulièrement adapté pour notre objectif scientifique de suivi de l’évolution de la vascularisation au cours du développement des lésions de SEP. Des animaux adultes de souche commerciale, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de l’EAE (de même pour les contrôles), seront utilisés pour cette étude. Après une semaine d’acclimatation, les animaux sont tatoués. L’âge adulte est requis pour pouvoir induire l’EAE. L’usage de jeunes adultes reproduit par ailleurs les conditions d’initiation de la SEP chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
Rôle des senseurs métaboliques dans le comportement et la motivation alimentaires chez un modèle souris de dénutrition
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Trois à six semaines de restriction alimentaire, trois semaines d'isolement, deux séjours de cinq jours en cage métabolique : 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. S'y ajoutent la pose d'un implant crânien sous anesthésie, huit injections sous-cutanées, des prélèvements de sang à la queue deux à trois fois par semaine et une immobilisation par contention de deux à cinq minutes dans une machine IRM. L'objet est de tester si la ghréline et son antagoniste le LEAP-2 modifient la prise alimentaire. Le porteur reconnaît qu'il serait impossible de reproduire chez la souris les aspects multifactoriels de l'anorexie mentale et limite son ambition à un circuit cérébral de la récompense, tout en affirmant que les explorations comportementales sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro.
Objectifs
L’anorexie mentale est un trouble du comportement alimentaire qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique associées à de sévères complications. Parmi les troubles psychiatriques, l’anorexie mentale a le taux de mortalité le plus élevé et la compréhension de cette maladie ainsi que son évolution représente un enjeu de santé publique. On retrouve dans l’anorexie mentale un taux de rechute important notamment parce qu’elle implique des comportements de restriction alimentaire et d’hyperactivité physique compulsifs similaires aux comportements addictifs. L’objectif de ce projet, mené chez le modèle souris, est de mieux comprendre le rôle de la ghréline, une hormone digestive, et de son antagoniste, découvert récemment, le LEAP-2 (Liver Expressed Anti-microbial peptide-2) sur le cerveau. Tandis que la ghréline favorise l’initiation des comportements alimentaires et contrôle les aspects motivationnels et renforçateurs de l’alimentation, ses concentrations sanguines sont élevées dans l’anorexie mentale. Notre hypothèse est que le LEAP-2 pourrait avoir un effet inverse à la ghréline et inhiber la prise alimentaire dans l’anorexie mentale. Pour cela, nous allons tester dans quelle mesure la régulation des taux de ghréline et de LEAP-2 pourraient améliorer les symptômes de l’anorexie. Bien qu'il n'y ait pas de modèle parfait d'anorexie chez la souris, nous utilisons un protocole de restriction alimentaire mimant certaines caractéristiques de la pathologie. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques impliqués dans l’anorexie et d’amener des pistes de traitement pour cette pathologie.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous évaluerons comment un modèle souris innovant, rassemblant des facteurs de risque environnementaux de la maladie, peut apporter des éléments de compréhension des mécanismes neurobiologiques mis en jeu dans les anomalies du comportement alimentaire dans l’anorexie mentale. L'objectif à plus long terme de ce projet est d'identifier des biomarqueurs pertinents liés aux anomalies de la récompense, pouvant servir d'outils diagnostiques ou pronostiques en clinique. Il permettra également d'approfondir la compréhension du dialogue entre le métabolisme et les anomalies des processus de récompense dans l'anorexie, afin de fournir des connaissances utiles pour envisager de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Biopsie de la queue pour génotypage (1 fois durée 5 secondes). Pose d'implants pour l'imagerie ou la délivrance de composés pharmacologiques sous anesthésie générale et analgésie: 1 fois, durée environ 45 minutes à 1 heure. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure de la glycémie: 2 à 3 fois par semaine en cours de restriction alimentaire, durée 5 secondes. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure des marqueurs métaboliques : 1 fois au cours de la procédure, durée 60 secondes. Injections pharmacologiques sous-cutanées: 8 injections, durée 5 secondes. Durée de la restriction alimentaire : 3 à 6 semaines. Isolement dans des cages métaboliques (2 fois 5 jours).
Impact sur les animaux
Les animaux seront génotypés à l'aide d'une biopsie de queue faite vers 6 jours ce qui peut entraîner une légère douleur de courte durée. Les prises de glycémies basales sont effectuées en réalisant une petite incision au niveau de la queue pour prélever une goutte de sang, ce qui entraîne un stress transitoire chez les animaux. Le protocole de restriction alimentaire nécéssite un isolement des animaux pendant 3 semaines qui induit un stress. Ce protocole entraine également une perte de poids et une baisse de la glycémie. L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. La chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer une douleur et des problèmes de récupération. Le scan de la graisse corporelle est réalisée dans une machine IRM dans laquelle les souris doivent être immobilisées par contention pendant 2 à 5 minutes ce qui provoque un stress.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau afin de permettre des analyses biochimiques ou moléculaires de biomarqueurs en post-mortem dans les différentes structures cérébrales.
Remplacement
Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition, comportement alimentaire, activité motrice) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Les animaux non utilisés à l'issue du génotypage seront proposés au don. Lors du prélèvement des tissus, certains tissus non utilisés pourront être récupérés par d'autres membres du laboratoire.
Raffinement
Pour réduire le stress lié à l’isolement des animaux, ils sont hébergés en cages ouvertes permettant de sentir et entendre leurs congénères. La chirurgie s’effectue sur un coussin chauffant et une sonde permet de monitorer la température de ce dernier pour préserver l’animal de l’hypothermie. Lors de la chirurgie, des analgésiques sont utilisés en pré-opératoire et postopératoire pour limiter la douleur de l’animal. Au cours de la chirurgie, une solution est appliquée sur les yeux de l’animal pour les protéger de l’assèchement. Une injection sous cutanée de solution saline est effectuée en fin de chirurgie pour palier à la déshydratation de l’animal. A la fin de la chirurgie, les animaux sont placés sur un coussin chauffant jusqu’à leur réveil complet puis replacés avec leurs congénères en cage collective avec nourriture et eau à volonté. Pendant les 3 jours suivant la chirurgie les animaux sont surveillés journalièrement. Les animaux ont à disposition dans leur cage des aliments humidifiés pour facilité leur ingestion en cas de douleur. D’autre part, des grilles de points limites sont mis en place. En fonction des observations faites, des mesures sont prises, à savoir soit des soins quand ceux-ci peuvent être mis en place, soit la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire et des comportements dirigés vers un but permettant l’étude d’altération du système de la récompense. Les régulations mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. Notre objectif ici n'est pas de reproduire les aspects multifactoriels de l'anorexie nerveuse dans un modèle murin, car cela serait impossible. Au lieu de cela, notre but est de disséquer un circuit neural spécifique (lié aux anomalies des voies de la récompense) qui pourrait expliquer une dimension particulière de la pathologie. L’anorexie mentale fait partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets adolescents et jeunes adultes. Dans ce projet, les procédures sont réalisées chez des souris adolescentes ou adulte entre l'âge de 6 et 20 semaines.
Étude de l’impact de l’inflammation sur la sévérité du trouble du spectre autistique (TSA) chez des souris SHANK3 : Effet du LPS et intervention anti-inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quatre injections d'un agent inflammatoire pour 315 souriceaux, huit jours de gavage pour 180 autres, trois jours de test comportemental de dix minutes, puis l'exsanguination à quatorze ou trente-cinq jours de vie. 495 souris porteuses d'une mutation du gène SHANK3 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 315 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le projet cherche à savoir si des anti-inflammatoires atténuent les symptômes comportementaux associés à l'autisme dans ce modèle, mesurés par un test que le porteur ne nomme pas. Aucune souris ne dépasse cinq semaines de vie.
Objectifs
Le trouble du spectre autistique (TSA) est une pathologie neurodéveloppementale qui provoque des déficiences dans l’interaction sociale et des comportements répétitifs. En Europe, la prévalence des TSA est en augmentation, avec environ 1 enfant sur 100 recevant un diagnostic. Cette augmentation a des répercussions sociétales et financières majeures, le coût annuel des TSA dans l’Union européenne étant estimé à 258 milliards d’euros. Les programmes de santé européens, ainsi que des initiatives telles qu’ERA-NET et EURAS, mettent un fort accent sur le traitement des TSA. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement neurophysiologique et à la physiopathologie des TSA est l’objectif principal du projet pour ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En premier lieu on souhaite étudier les effets protecteurs des anti-inflammatoires dans un contexte pathologique, l’autisme. L’étude cherchera à savoir dans un deuxième temps si ces traitements anti-inflammatoires peuvent atténuer les symptômes comportementaux induits par l’inflammation comme l'autisme Cette étude permettra non seulement de tester une approche préventive contre l’aggravation des symptômes liés à l’autisme, mais aussi d'identifier les mécanismes par lesquels la modulation de la réponse inflammatoire peut corriger ou réduire les anomalies synaptiques et comportementales. Des mesures seront effectuées pour suivre l'évolution des marqueurs inflammatoires cérébraux et étudier la physiologie des neurones avec des mutations identifié dans le trouble du spectre de l'autisme
Bénéfices attendus
Le développement de modèles expérimentaux, tels que les souris portant des modifications génétiques SHANK3, pour tester l'effet des anti-inflammatoires, apporte des retombées significatives tant sur le plan scientifique que sur celui de la santé publique. Sur le plan scientifique, ces modèles permettent de mieux comprendre comment la modulation de l'inflammation peut influencer les symptômes associés à des mutations génétiques spécifiques. Les résultats de ces études ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les processus inflammatoires, avec un potentiel pour améliorer les traitements existants pour les patients atteints de troubles du spectre autistique (TSA). Ces avancées pourraient mener au développement d'interventions pharmacologiques innovantes, offrant des options supplémentaires, particulièrement pour les patients dont les symptômes sont exacerbés par l'inflammation. En matière de santé publique, l'amélioration de l'efficacité des traitements pourrait réduire les coûts de prise en charge des TSA en diminuant la nécessité de soins intensifs et en améliorant la qualité de vie des patients. Une meilleure gestion des symptômes permettrait également de soulager considérablement les aidants qui s'occupent quotidiennement des patients atteints de TSA, réduisant leur charge mentale et physique, et contribuant ainsi à un mieux-être global, tant pour les patients que pour leurs familles. Ces progrès entraîneraient des économies substantielles pour les systèmes de santé.
Procédures
315 souriceaux auront 4 injections et 180 souriceaux auront 8 jours de Gavage (10 secondes par injection/gavage). Le test comportementale dure 3 jours avec un essai de 10 min par jour. Tous les animaux seront prélevés après exsanguination pour les études sur tranches aigues ou histologiques soit à P14 ou P35.
Impact sur les animaux
Les étapes du gavage et l'induction de l'inflammation par injection entraînent des effets indésirables sur les animaux : douleurs, inflammation du site d'injection. Le test comportemental chez la souris induit un peu de stress lié à la manipulation, à l’exposition à un nouvel parfois renforcé par la présence d’odeurs et de signaux sociaux. Les nuisances sont réduites grâce l’habituation et des conditions expérimentales adaptées qui sont mises en place
Devenir
Euthanasie pour étude histologique ou electrophysiologique
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire de travail chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations synaptiques sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. Ce choix permet une analyse statistique robuste et adaptée à la complexité du plan expérimental. Le nombre d’animaux (n = 14–16 par condition expérimentale, en moyenne n=15) est basé sur des études antérieures de l’équipe montrant que ce nombre permet de détecter des différences d’au moins 20 % avec une puissance statistique ≥ 80 % et un seuil α = 0,05. Cette estimation tient compte de la variabilité biologique attendue dans les enregistrements électrophysiologiques et/ou les mesures comportementales. (3)Les deux sexes sont inclus pour assurer une meilleure représentativité biologique des résultats. Chaque groupe expérimental comprendra 7 à 8 mâles et 7 à 8 femelles, analysés séparément puis comparés pour évaluer les interactions liées au sexe
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur. Des critères de bien-être seront évalués : maternal care, état des souriceaux allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraîne la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures d'injection/gavage seront décrits dans les procédures. Si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous-cutanée une injection quotidienne d’Inflacam ou morphenique jusqu’à disparition des signes de mal-être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de réflexe est vérifiée avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale dans un contexte pathologique. De plus, ce modèle nous permet d'utiliser les modèles transgéniques d'intérêt. Le projet sera réalisé sur des animaux durant le développement et à l'age adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Etude d’une protéine impliquée dans l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin pour que leur cerveau soit prélevé, 774 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 346 d'entre elles inhalent un agent convulsivant cinq jours de suite, 146 reçoivent des injections pendant cinq jours, l'ensemble servant à créer deux lignées génétiquement modifiées pour étudier une protéine liée à l'épilepsie. Le porteur affirme qu'aucune douleur n'accompagne les crises, par analogie avec la perte de conscience décrite chez l'humain, tout en signalant que les souris épileptiques meurent subitement dans moins de 5 % des cas et que les crises provoquées pourraient augmenter cette fréquence. Il conclut que le recours à des animaux vivants est "absolument nécessaire".
Objectifs
L’épilepsie est une maladie cérébrale qui se manifeste par des crises soudaines et répétées. Ces crises sont causées par une activité électrique anormale dans les neurones. L’objectif de ce projet est de générer deux modèles de souris génétiquement modifiée afin d’étudier les mécanismes neuronaux impliqués dans cette pathologie à différents moments de la vie et lors des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Cette recherche pourrait aider à mieux comprendre les causes de l’épilepsie afin de développer de nouveaux traitements qui restaureraient l'excitabilité neuronale normale et atténueraient l'activité épileptique.
Procédures
Une injection sera faite pendant 5 jours sur 146 animaux. 346 animaux seront soumis à l’exposition répétée (5jours consécutifs) à un agent convulsivant par inhalation.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée et de faible intensité peut survenir au moment du prélèvement de la biopsie au niveau de la queue. Les injections peuvent entrainer un stress et un inconfort ainsi que des lésions ou de l’inflammation sur le site d’injection. Aucune douleur n’est associée aux crises d’épilepsie qui se traduisent par une « extinction » de la conscience chez les humains, ce qui est très probablement la même chose chez les souris. Les crises induites artificiellement et les crises spontanées apparaissant chez les animaux devenus épileptique sont absolument de même nature, elles ont une durée inférieure à 1 minute, suivi d'une période d’immobilité d’environ 1 minute. Les animaux épileptiques ont un comportement normal pendant leur élevage mais meurent soudainement avec une fréquence faible (moins de 5%). Les inductions artificielles de crises pourraient augmenter la fréquence des morts soudaines. Aucun autre comportement ou effet indésirable n’est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, et seront ensuite utilisés afin de récupérer le cerveau pour des analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Remplacement
L’épilepsie est un syndrome complexe avec des mécanismes de mise en place (épileptogenèse) peu connus qui impliquent le système nerveux central, le système nerveux périphérique, le système cardio-vasculaire et probablement le système immunitaire. Il est donc impossible d’étudier ces mécanismes dans des systèmes cellulaire et l’utilisation d’animaux vivants est absolument nécessaire.
Réduction
Nous utilisons indifféremment les mâles et les femelles qui seront randomisés dans les groupes d’étude, soit une perte minimale due au genre. En effet, il n'a pas été constaté de différences entre les sexes concernant les troubles épileptiques dans les modèles murins d'épilepsie. Les schémas d’accouplement ont été optimisés afin que la quasi-totalité des animaux à phénotype dommageable produits soient utilisés dans les procédures expérimentales ; Le nombre minimum d’animaux nécessaires a été calculé pour utiliser le moins d’animaux possibles tout en répondant à la question scientifique.
Raffinement
Les animaux seront stabulées avec un abri, de la ouate et une buchette pour leur permette des activités variées et éviter toute souffrance ou inconfort. Une grille d'observation est utilisée par le personnel pour surveiller attentivement l'état des animaux pendant l'expérimentation. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement est notée. Les animaux concernés sont alors suivis chaque jour et peuvent recevoir un traitement contre la douleur si nécessaire. Si certains signes de mal-être persistent plus de 48 heures, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies dont l’épilepsie. Les crises peuvent être induite sans limite à partir du 19eme jour postnatal jusqu’à l’âge adulte. Nous utiliserons les animaux dès le sevrage à l’âge de 3 semaines pour avoir des animaux assez robustes et mimer l’apparition des crises chez les jeunes ainsi qu’a l’âge adulte.
Neuroprotection dans le syndrome de déficit en GLUT1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
680 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès quatorze jours de vie, une moitié reçoit des électrodes implantées dans le crâne au cours d'une opération de quatre-vingts minutes, d'autres une mini-pompe sous la peau renouvelée chaque mois, et tous subissent trois ponctions lombaires, des injections et des tests moteurs, de réflexes et de mémoire. Un test dit de dépression leur impose quatre jours de restriction alimentaire. Le projet teste des esters de cétones et du lactate comme sources d'énergie de remplacement, chez des rats porteurs d'une mutation qui prive leur cerveau de glucose. Le porteur explique avoir écarté la souris parce qu'elle ne fait pas de crises d'épilepsie, et parce que l'IRM donne une meilleure image sur un animal plus gros.
Objectifs
Le glucose est la principale source d’énergie du cerveau. Pour qu’il puisse atteindre les cellules cérébrales, il doit traverser certaines barrières naturelles grâce à des protéines spécialisées, notamment une appelée transporteur de glucose de type 1. Lorsque ce transporteur ne fonctionne pas correctement, le cerveau ne reçoit pas assez d’énergie. Cela provoque une maladie rare appelée syndrome de déficit en transport de glucose de type 1. Cette maladie débute généralement dans l’enfance et entraîne des crises d’épilepsie difficiles à traiter avec les médicaments classiques, un développement cérébral ralenti, de possibles malformations du crâne, et des troubles du mouvement comme des raideurs, des troubles de l’équilibre ou des mouvements involontaires. Actuellement, le traitement repose sur un régime alimentaire très particulier, appelé régime cétogène, qui fournit une autre source d’énergie au cerveau : les corps cétoniques. Mais ce régime ne fonctionne pas pour tous les patients, et il ne corrige pas les effets du manque d’énergie pendant les premières étapes du développement cérébral. Ce projet de recherche a pour objectif de tester de nouvelles sources d’énergie plus efficaces et plus faciles à administrer. Il s’agit notamment : d’esters de cétones, ajoutés dans l’eau de boisson, qui permettent d’atteindre rapidement un état favorable au fonctionnement du cerveau, et du lactate, administré de façon continue par une petite pompe implantée sous la peau. Ces traitements seront testés sur des rats porteurs d’une mutation qui réduit fortement l’expression du transporteur de glucose, afin de mieux comprendre leur efficacité et leur potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de démontrer un effet protecteur sur le cerveau grâce à l’administration d’esters de cétones ou de lactate, en alternative au régime cétogène. Ce régime, bien que thérapeutique, est très contraignant et souvent mal toléré par les patients. Si ces nouvelles approches s’avèrent efficaces, elles pourraient représenter une solution plus simple et mieux acceptée. Cela ouvrirait la voie à l’élaboration de protocoles d’administration adaptés, avec pour objectif une amélioration significative de la qualité de vie des patients atteints du déficit en transport de glucose.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - biopsie de la queue pour génotypage : 1 fois, 5 min - mise en place du système d'enregistrement électroencéphalogramme, sous anesthésie gazeuse: procédure chirurgicale , réalisée 1 fois, durée 80 min - implantation des mini-pompes permettant de délivrer le lactate, sous anesthésie gazeuse :procédure chirurgicale, réalisée 1 fois par mois, 60 min. - injection intrapéritonéale : 2 fois, quelques secondes -ponction lombaire : prélèvement sur animaux anesthésiés , réalisés 3 fois, durée 10 min - prélèvements pour dosages biologiques : 4 fois, quelques secondes - La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements moteurs (1 fois, 10 min), de réflexes (3 fois, 5 min) et de mémoire (1 fois, 5 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (1 fois, test sur 4 jours)
Impact sur les animaux
La biopsie de la queue, réalisée pour le génotypage, provoque une douleur légère et de courte durée. L’implantation des mini-pompes ou des électrodes pour l’électroencéphalogramme, qui permet d’enregistrer l’activité électrique du cerveau, peut entraîner une douleur modérée. Les anesthésies nécessaires à ces enregistrements peuvent provoquer une variation du rythme cardiaque et, si elles sont prolongées, un risque de déshydratation. Les tests comportementaux peuvent induire du stress ou de l’anxiété. Enfin, lors du test évaluant des comportements de type dépressif, une restriction alimentaire est appliquée, pouvant entraîner une perte de poids et être une source d’inconfort pour l’animal (nuisance modérée).
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes
Remplacement
Des modèles cellulaires de déficit en GLUT1 existent, cependant, ces modèles s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier. Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.
Réduction
Le recours à l’IRM, une technique d’imagerie non invasive, permet d’étudier les animaux sans avoir à les sacrifier, ce qui réduit le nombre total d’animaux nécessaires. Grâce à cette méthode, nous pouvons suivre l’évolution des mêmes animaux au fil du temps, tout en réalisant aussi des tests comportementaux sur eux. Le nombre d’animaux a été calculé à l’avance pour qu’il soit le plus faible possible, tout en assurant que les résultats soient fiables. Pour analyser les différences entre les groupes, nous utiliserons des méthodes statistiques reconnues.
Raffinement
Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés à leur arrivée et seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Les chirurgies (implantation des pompes osmotiques, pour le groupe traité avec du lactate et mise en place des systèmes d'enregistrement EEG, ponction lombaire) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les IRM sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardiorespiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.
Choix des espèces
Il existe un modèle du syndrome de déficit en GLUT1 chez la souris mais ce modèle en présente pas de crises d'épilepsie. De plus, l'IRM est une technique non-invasive mais qui présente une faible sensibilité : plus les modèles sont gros et meilleure est sa résolution. Le rat est donc un modèle plus approprié que la souris Les animaux seront utilisés de 14 jours de vie à 60 jours. Les dispositifs d'EEG (la moitié des aniamux) seront implantés à 14 jours de vie afin de pouvoir monitorer dès le sevrage les effets des différents traitements. Les animaux seront suivis jusqu'à 60 jours pour mesurer les effets des différents traitements sur le court et le long terme afin d'optimiser le pouvoir translationnel du projet.
Implications des circuits du BNST dans le comportement d’anxiété en situation physiologique et pathologique: Etude éléctrophysiologique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Opérées du crâne pour recevoir une injection de virus, implantées, puis maintenues sous anesthésie pendant quatre à huit heures pour l'enregistrement de leurs neurones, 2 176 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Certaines sont isolées de leurs congénères dès le sevrage à trois semaines et gardées seules jusqu'à l'âge adulte, d'autres soumises à un stress par contention. Le projet cartographie les circuits d'une structure cérébrale impliquée dans l'anxiété, chez des souris suivies jusqu'à dix-huit mois. Un animal encore douloureux trois jours après l'opération sera tué. Toutes sont tuées à l'issue, pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans la thématique d’une dissection des circuits neuronaux à l’origine de l’anxiété. Les troubles de l’anxiété représentent un enjeu de société majeur. Aujourd’hui encore, le diagnostic des troubles de l’anxiété reste compliqué à poser notamment quand ces troubles sont associés à différentes comorbidités telles que la maladie de Parkinson rendant le diagnostic et la prise en charge des symptômes encore plus complexe Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l’anxiété et potentiellement développer des stratégies pour diminuer les troubles de l’anxiété. Une de ces stratégies est de définir dans quelles circonstances les structures impliquées dans le contrôle de l’anxiété s’activent. Le noyau du lit de la strie terminale (BNST) joue un rôle central dans l’anxiété. Notre projet sera conduit chez des souris C57B6/J et des souris transgéniques afin de manipuler sélectivement différentes populations neuronales. De plus, le facteur « sexe » sera partie intégrante de notre projet puisqu’un dimorphisme sexuel dans le BNST chez l’homme et le rongeur ont pu être observé. Notre projet s’articulera autour de quatre objectifs pour étudier le fonctionnement et le rôle des différentes sous-populations du BNST dans le contrôle de l’anxiété et des comportements moteurs en situation physiologique et pathologique
Bénéfices attendus
Ce projet sera une caractérisation unique des circuits du BNST, structure clef dans le contrôle de l’anxiété en condition physiologique et pathologique. Nous pourrons ainsi déterminer si l’altération d’une sous-population ou d’une afférence spécifique du BNST pourrait être à l’origine de troubles anxieux notamment observés dans la maladie de Parkinson. A long terme, ce projet pourrait aider à améliorer le diagnostic des troubles anxieux et favoriser l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de réduire les symptômes anxieux des patients et en particulier ceux atteints de la maladie de Parkinson.
Procédures
Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30min et 1H, - procédure chirurgicale avec implantation : entre 1H et 2H, Electrophysiologie in vivo sur animal anesthésié entre 4h et 8h, Electrophysiologie in vivo sur tête restreinte: 30 min de chirurgie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire , 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants , 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte 4/ un stress induit par notre protocole de stress par contention ou d’isolement social. Les expérimentateurs ont une solide expérience dans l'exécution des procédures décrite. L'effet indésirable attendu sur les animaux transgéniques restent néanmoins modéré sur cette lignée transgénique mimant les stade précoces de la maladie de Parkinson avec une présence de constipation et une baisse de coordination motrice à partir de 18 mois. Pour notre projet, nous étudierons cette lignée a différents âges (étude longitudinale jusqu’à 18 mois).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour des prélèvements pour des études histologiques
Remplacement
Le but du projet est de connaître la fonction de différentes sous-population neuronale du noyau du lit de la Strie terminale (BNST) et du reste de son circuit dans le contrôle de l’anxiété. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections stéréotaxiques, afin de faire exprimer des protéines capables d’activer ou d’inhiber l’activité neuronale combinées avec des d'enregistrements électrophysiologiques ou optique ex vivo sur tranches de cerveau, ou in vivo sur souris anesthésiée ou en tête restreinte et in vivo chez l’animal se comportant et nécessite donc le recours à l’animal. Aucun modèle "in vitro" ne peut reproduire la connectivité complexe des circuits du BNST.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 2176 animaux sur cinq ans. Nous travaillons sur des souris males et femelles issues des lignées transgéniques ainsi tous les animaux produits seront utilisés. La taille des groupes a été déterminée à l'aide d'analyses statistiques basées sur des calculs de puissance (power analysis). Ces analyses permettent de garantir que les groupes sont suffisamment grands pour détecter des différences significatives entre les conditions expérimentales tout en limitant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs procédures de raffinement, à savoir: 1/ choisir un modèle rongeur de la maladie de Parkinson à un stade précoce n’induisant pas de fort phénotype moteur nous permettant ainsi d’étudier le fonctionnement des circuits de l’anxiété 2/ l'utilisation d'animaux hébergés majoritairement dans la même structure ce qui ne nécessite aucun transport et donc limite le stress des animaux 3/ une manipulation des animaux par l'expérimentateur afin là aussi de limiter le stress 4/ l'établissement de points limites 5/ La mise en place de soins adéquats si nécessaire pendant et après l’opération et l'utilisation de l’anesthésie/analgésie lors de chaque protocole invasif. A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux transgéniques naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures chirurgicales. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Un analgésique sera administré afin de gérer la douleur péri-opératoire. Au cas où l’animal serait encore en souffrance 24 heures après l’injection d’antalgique postopératoire, une nouvelle injection aux mêmes doses et voie d’administration sera réalisée. Si la souffrance persiste au-delà de 3 jours, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. En effet, c'est un mammifère présentant une proximité phylogénique avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment le comportement d’anxiété, les interactions sociales et la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologie neurologique telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris avec des surexpressions de la protéine alpha synucléine. Ce modèle possède aussi l'avantage de permettre des approches invasives (approches pharmacologiques, optogénétiques, pharmacogénétiques, électrophysiologiques et imagerie cellulaire) permettant d'étudier l'action de molécules ou d'une population neuronale sur le fonctionnement des circuits neuronaux de l’anxiété et les phénomènes synaptiques associés. Enfin, c'est chez cette espèce que sont faites des modifications génétiques permettant de cibler des populations neuronales précises que nous souhaitons étudier. Pour ce projet les chirurgies stéréotaxiques auront lieu sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge où l’animal sera plus à même de récupérer après les protocoles de chirurgie. Leur poids et leur taille sont stabilisés, la taille du cerveau homogène assurant une bonne reproductibilité des sites d’injection. Les enregistrements électrophysiologiques, les manipulations chémo/optogénétiques et l'imagerie calcique seront réalisés entre 15 et 49 jours après la dernière chirurgie. Pour les expériences d’interactions sociales, nous utiliserons des souris jeunes comme stimulus social entre P28- P35. Pour le protocole de stress, nous réaliserons un protocole de stress développemental que nous détaillerons ci-après où les souris expérimentales seront isolées après leur sevrage à P21 puis les souris seront utilisées à l'âge adulte (12 semaines) Pour l’étude longitudinale du phénotype anxieux chez les souris, nous utiliserons des souris âgées de 6 mois, 12 mois et 18 mois. Pour les expériences de comportement, d'enregistrement électrophysiologique et calcique, les souris seront adultes, au moins 11 semaines.
Impact d’un peptide sur le comportement social et l’activité cérébrale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois interventions chirurgicales crâniennes d'une heure à une heure trente, la pose d'un "chapeau" en ciment dentaire et un isolement social pouvant durer douze semaines attendent 108 mâles et 108 femelles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 336 souris sont concernées au total, 216 tuées pour des analyses histologiques et 120 souris dites visiteuses gardées vivantes pour d'autres projets, la moitié d'entre elles subissant en plus une restriction d'eau de onze heures. Le projet cherche à relier un peptide à l'activité d'un circuit cérébral et au comportement social, avec une ouverture annoncée vers la schizophrénie. Le porteur qualifie l'isolement de douze semaines d'"indispensable" à la motivation sociale des animaux, et annonce neuf passages en tâches comportementales, six de trente minutes et trois de dix minutes, sans dire lesquelles.
Objectifs
Ce projet de recherche porte sur le rôle physiologique d'un peptide et son impact sur l’activité cérébral d’un circuit entre deux zones du cerveau, l’hippocampe et le cortex frontal, qui participe au comportement social de la souris. Ce peptide est impliqué dans la plasticité et l’activité cérébrale ainsi que dans le comportement social. Grâce à des animaux transgéniques sur-exprimant ou sous-exprimant ce peptide , nous testerons comment de l’impact de ce peptide sur l’activité cérébrale dans ce circuit sous-tend les altérations des comportements sociaux et anxieux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre l'impact de la modulation de ce peptide sur l’activité du circuit cérébral entre les différentes parties de l’hippocampe et le cortex préfrontal. On pourra également confirmer que cette altération est à la base des altérations des comportements sociaux et anxieux dues à la modulation de l’expression de ce peptide . Finalement, cette modulation des comportements sociaux pourrait sous-tendre les troubles dans des maladies neuropsychiatriques telle que la Schizophrénie. Les résultats de cette étude permettront également d’évaluer l’intérêt de la modulation cérébrale par ce peptide comme cible thérapeutique possible dans ces pathologies.
Procédures
Les animaux expérimentaux (108 mâles et 108 femelles) seront soumis à trois procédures chirurgicale entre 1h00 à 1h30. Des tests comportementaux sont réalisés à l’âge adulte grâce à 9 passages dans des tâches (6 tâches de 30 min, trois tâches de 10min environs). Uniquement à l'âge adulte, un isolement de 12 semaines maximum sera réalisé. Les animaux visiteurs, qui sont un renforcement social dans nos comportements, seront soumis à trois tâches de 10 min avec au maximum deux restriction dans une zone de 20 x 10 cm. Une moitié de ces animaux visiteurs seront également soumis à une restriction hydrique de 11h.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet la majeure nuisance sera un isolement à l'âge adulte qui entraîne un stress, mais est indispensable pour la motivation sociale des animaux. la chirurgie pourrait entrainer une douleur post-opératoire (douleur modérée et limitée dans le temps par une prise en charge antalgique). L'anesthésie est également une nuisance via les risques (déshydratation, hypothermie, dépression respiratoire), ainsi que la présence de chapeau en ciment dentaire qui pourrait gêner certains animaux. Pour une partie des animaux visiteurs, ils subiront une restriction hydrique de 11h.
Devenir
Dans la procédure, les animaux expérimentaux seront euthanasiés pour nous permettre de réaliser des analyses histologiques. Toutes les souris visiteurs mâles et femelles seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets
Remplacement
Ce projet de recherche porte sur le rôle du peptide Aeta sur l’activité cérébral et son impact sur le comportement social et anxieux chez la souris. Le comportement social ne peut pas encore être remplacé par des modélisations informatiques, ni par des études de neurones en culture.
Réduction
Au sein d'une même expérience sociale, nous passerons l’animal d’intérêt testé plusieurs fois pour avoir un maximum de mesure d’activité cérébrale avec un minimum d’animaux. De plus, nous passons deux fois les animaux "visiteurs" en tests sociaux pour éviter d'avoir autant d'animaux visiteurs que d'animaux expérimentaux. Le nombre d'animaux est choisi en lien avec nos expérimentations précédente et le fait que les comportements sociaux sont très variables. Les tests statistiques adhoc seront réalisés en fonction de la normalité ou non des distributions. Toutes les souris visiteurs mâles et femelles des procédures seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets. S’ils ont subi de l'agressivité, l'avis du vétérinaire référent sera sollicité.
Raffinement
Pour les chirurgies, les animaux sont anesthésiés globalement et également localement au niveau de la peau avant ouverture. Une analgésie opératoire et post-opératoire est également réalisée. Ensuite lors du suivi post-opératoire, une analgésie pourra être utilisée en fonction des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, un suivi sera réalisé grâce à une grille de score avec des points limite adaptés. Afin de réduire les effets anxiogènes de l'isolement social, des objets permettant de faire un nid seront disposés dans les cages de vie. En ce qui concerne les gènes possibles en lien avec les chapeaux en ciment dentaire, nous observerons le comportement des animaux et adapterons l'enrichissement des cages pour éviter que les animaux s'y accrochent avec le chapeau
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que la souris est un mammifère social dont des capacités cognitives et sociales sont adaptées aux questions posées dans le projet. De plus, la souris est choisie car les lignées modèles ont été développées chez cet animal Les animaux seront étudiés à l'âge adulte (à partir de 70 jours) pour voir l’activité cérébrale durant leur comportement social et anxieux établis.