Système nerveux

Soumises la nuit à six séries de sons de trente minutes espacées de trois heures, soit trois heures de stress sonore, certaines souris sont utilisées comme modèle de fibromyalgie. D'autres reçoivent jusqu'à dix injections d'une molécule qui déclenche la migraine chez les patients migraineux, avec application de filaments fins ou de jets d'air sur la face ou la patte toutes les trente minutes pendant quatre heures les jours d'injection. D'autres encore boivent pendant une semaine une eau contenant une molécule qui irrite l'intestin, et une partie subit une chirurgie de quarante-cinq minutes sans réveil. 672 souris en tout, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort à la fin parce que les protocoles se terminent par un prélèvement d'organes.

Objectifs

Parmi les douleurs chroniques, la migraine qui affecte environ 15% de la population générale, est sur-représentée dans certaines autres maladies douloureuses chroniques. Ainsi, environ 20% des patients souffrant de douleurs viscérales au niveau des intestins sont également migraineux. Cette proportion atteint jusqu’à 45 à 80% des patients fibromyalgiques (douleurs musculaires diffuses), selon les études. Malgré ces observations cliniques, le(s) mécanisme(s) pouvant expliquer la présence de la migraine dans d’autres maladies douloureuses est(sont) encore peu connu(s). Ainsi, le but de notre projet est de mieux comprendre si un mécanisme commun entre les douleurs viscérales, la fibromyalgie et la migraine pourrait exister. Parmi les mécanismes sous-tendant ce type de douleur chronique, une activation trop importante des neurones pourrait être à l’origine de la sensibilité exacerbée de ces patients. Des cellules particulières appelées les cellules satellites gliales, entourant les neurones, semblent jouer un rôle clef dans la régulation de l’activité des neurones. Le but de notre projet est donc de caractériser le rôle des cellules satellites gliales entre différents modèles de douleur chronique, que sont la fibromyalgie, la douleur viscérale et la migraine à la fois chez les mâles et les femelles. Pour cela, nous évaluerons l'expression de plusieurs marqueurs spécifiques d’activation des cellules satellites gliales dans (i) un modèle de douleur, mimant la fibromyalgie, induite par le stress sonore, (ii) un modèle de migraine induite par des injections répétées d’une molécule qui provoque des migraine chez les patients migraineux et (iii) un modèle de douleur viscérale induite par l'administration orale d’une molécule induisant une inflammation du côlon.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes qui expliqueraient pourquoi la migraine est plus fréquente chez des patients souffrant déjà d’autres douleurs (douleurs viscérales inflammatoires et fibromyalgie), notamment le rôle de cellules particulières, appelées les cellules satellites gliales qui entourent les neurones. A plus long terme, comprendre ces mécanismes permettrait de tester de nouvelles molécules pharmacologiques pour cibler plus spécifiquement les patients présentant la présence de la migraine et d’une autre maladie douloureuse viscérale ou de fibromyalgie.

Procédures

Les interventions seront : Injections d’une molécule : chaque injection dure moins d’une minute (au total 10 injections sur plusieurs semaines). Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h toutes les 30 minutes ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Les animaux peuvent être sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : elle a lieu une fois et elle sera sans réveil. La chirurgie dure environ 45 min. Stress induit par un son : série de sons pendant 30min, répétés toutes les 3 heures, soit 6 fois au cours de la nuit, ce qui représente un total de 3 heures de stress sonore.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée chez l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : cette mesure se fait par l'application de filaments fins ou de jets d'air sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte qui entraine une douleur modérée. Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. La répétition d’un son entraine un stress chez l’animal. Une douleur légère est provoquée par les injections de molécules qui durent moins d'une minute. Cette molécule induit une irritation de l’intestin et la douleur provoquée est modérée. Les animaux seront sous anesthésie pour réaliser une chirurgie : le début de cette anesthésie peut induire un stress transitoire de l’animal qui dure moins de 2 minutes.

Devenir

Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des techniques qui nécessitent le prélèvement d’organes : les animaux seront donc mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi pour toutes les procédures, nous aurons 12 animaux (6 males et 6 femelles) par groupe. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela limitera le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur et le stress engendrés dans le cadre des différents modèles. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique ou de jet d'air), nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les points limites fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher ainsi que de papier de nidification, chose importante pour la souris. Une des procédures nécessite une chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse par une personne expérimentée.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez le rat. Les animaux seront âgés de 8-12 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les souris sont considérées comme de jeunes adultes. Ce stade de développement a été choisi car c’est chez le jeune adulte que le plus souvent la maladie migraineuse débute chez l’être humain. Les animaux génétiquement modifiés seront âgés de moins d’une semaine (injection virus) à 12-14 semaines (expérience d’imagerie calcique).

Nées avec une mutation qui réduit leur poids dès le sevrage, des souris modèles d'une maladie mitochondriale deviennent apathiques entre un mois et un mois et demi, et certaines perdent brutalement du poids puis s'isolent entre quatre et sept mois. Une échographie cardiaque sous anesthésie générale, un test sur tapis roulant et cylindre rotatif, une IRM cérébrale de trente à soixante minutes, deux administrations orales par jour pendant deux mois et trois prélèvements de sang à la veine submandibulaire jalonnent le protocole appliqué à 2 720 animaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range en sévérité modérée les seules nuisances liées aux gestes expérimentaux et décrit à part la dégradation due à la mutation, tout animal isolé dans sa cage ou ayant perdu plus de 20 % de son poids étant mis à mort. Les reproducteurs sont gardés pendant leur phase reproductive, de deux à six mois, puis tués comme tous les autres.

Objectifs

Les mitochondries jouent le rôle essentiel de centrale énergétique dans nos cellules. Les maladies mitochondriales regroupent de nombreuses pathologies héréditaires qui résultent d'un dysfonctionnement du métabolisme énergétique mitochondrial. Ces pathologies ont été associées à de nombreux symptômes incluant désordres du mouvement, cécité, surdité, épilepsie, accidents vasculaires, atteintes cardiaques ou encore neurodégénérescence. Les maladies mitochondriales peuvent débuter à tout âge, de la naissance, dans l'enfance et chez l’adulte jeune. A ce jour il n’existe pas de traitement curatif pour ces maladies. De ce fait, la recherche dans ce domaine des thérapies pour ces maladies mitochondriales est capitale. Nous avons identifié des médicaments candidats pouvant améliorer le fonctionnement des mitochondries. Certaines de ces molécules prometteuses ont été ensuite testées sur des cellules de peau de patients de maladies mitochondriales. Afin de tester les effets bénéfiques de ces médicaments sur un modèle in vivo, nous avons généré des souris présentant une mutation retrouvée chez des patients humains. Notre objectif principal pour ce projet est donc de caractériser en profondeur la pathologie de ces souris et valider l'efficacité des médicaments candidats identifiés, qui pourront ensuite être testés chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet est justifié d'un point de vue scientifique, car il propose d'étudier les effets de médicaments candidats dans les maladies mitochondriales, maladies qui ne bénéficient pas actuellement de traitements curatifs. Le développement d’une médecine mitochondriale est fortement compromis par l’absence de thérapies efficaces avec un nombre limité d'essais cliniques à ce jour. Raison pour laquelle la recherche sur les pathologies mitochondriales humaines s’oriente aujourd'hui résolument vers la thérapeutique. La présence de mutations pathogènes mitochondriales est responsable de maladies mitochondriales sévères et souvent fatales. Ainsi, déterminer l’impact de plusieurs médicaments pourrait permettre de restaurer le fonctionnement mitochondrial, apparaissant comme un objectif important, qui pourrait déboucher sur des essais cliniques pour les patients souffrant de maladies mitochondriales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (30 minutes, 1 fois); Test de la fonction motrice sur tapis roulant et cylindre rotatif (durée variable en fonction des performances des animaux); Imagerie par Résonance Magnétique du cerveau (sous anesthésie, durée 30 à 60 minutes, 1 fois); Administration par voie orale par pipette du médicament supplémenté d’une solution appétante ayant pour but que les souris viennent spontanément prendre le médicament (gavage si nécessaire à l'aide d'une sonde adaptée dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par la technique d’administration orale par pipette ou si la solution appétante ne faciliterait pas le processus) (2 fois par jour pendant 2 mois) et un prélèvement sanguin au niveau de la veine faciale submandibulaire (5 minutes maximum) à 1.5 mois, 2.5 mois et 3.5 mois (1 fois à chaque temps).

Impact sur les animaux

Les souris des deux modèles, présentant une mutation que nous allons utiliser, sont de nouveaux modèles murins pour lesquels nous décrivons un phénotype pour la première fois. Les effets indésirables de cette mutation sur le modèle se traduit par un poids plus faible dès le sevrage et un comportement apathique qui apparaît entre 1 et 1,5 mois pour le modèle KI/KO et entre 2,5 et 4 mois pour le modèle KI/KI. Nous avons observé qu'entre l'âge de 4 mois et 7 mois, certains animaux présentent une perte de poids brutale et un isolement dans la cage. Les jeunes souris peuvent également parfois présenter une dépilation transitoire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins au niveau de la veine faciale submandibulaire sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquences sur le bien être de l'animal. Dans le cas où il serait difficile de délivrer le médicament par administration par voie orale par pipette, le gavage remplacera cette technique. Celle-ci, si utilisée régulièrement, pourrait entraîner un stress chez l'animal, lié au geste de contention et du geste de gavage, et une irritation de l’œsophage lié à la répétition de l'administration.

Devenir

Les reproducteurs seront utilisés pendant leur phase reproductive (2 à 6 mois) puis mis à mort. Pour toutes les autres expériences prévues, tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires humains tels que les fibroblastes de peau pour répondre à certaines questions scientifiques. Cependant ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans les maladies mitochondriales, puisqu'elles ne tiennent pas compte l’ensemble des interactions biologiques existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour la suite du programme de recherche et pouvoir valider et passer aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Aucune expérience inutile ne sera menée. Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, nos expériences solides des méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental par sexe pour la métabolomique. Pour la biologie moléculaire et l'histologie, des groupes de 8 animaux/génotype sont prévus, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux sans compromettre l'obtention de résultats statistiquement valides.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure de Bien-Etre Animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent, et seront pris en charge selon la grille de points limites suivante: Perte de poids 20% = 3 points Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points Isolement: 3 points. A partir de 1 point, un signalement sur la cage avec le numéro de l’animal concerné sera apposé, de telle sorte à ce qu’il y ait une attention particulière lors du contrôle quotidien pour déceler rapidement toute évolution négative, 2 points, surveillance bi-quotidienne de l'animal concerné, 3 points, l’animal est mis à mort en point limite. Pour les procédures de traitements des animaux, nous utiliserons au maximum, à la place du gavage, la technique dite MDA (micropipette-drug administration) qui consiste à donner oralement par pipette le médicament supplémentée d’une solution appétant pour habituer les souris à venir boire spontanément d’elle-même le médicament. En utilisant cette technique, nous évitons le stress et les irritations possibles par le gavage au niveau œsophage.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le présent projet, la souris que nous utilisons est un modèle de maladie mitochondriale unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des médicaments candidats sur les fonctions mitochondriales dans les tissus habituellement affectés dans ces pathologies, que sont le cerveau, les muscles squelettiques et les coeur. Les animaux utilisés pour la mise en place de l'élevage le seront dans leur phase reproductive (2 mois à 6 mois). Pour la caractérisation de la maladie, les animaux seront utilisés entre les âges de 2 mois et 12 mois. De plus, nous traiterons les souris avec des médicaments candidats de l'âge de 1.5 mois à 4 mois dans la phase d'expérimentation de traitements potentiels.

Toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé, 60 souris de quatre à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection de kaïnate déclenche chez elles des crises convulsives généralisées, cotées sur l'échelle de Racine, suivies d'un état épileptique puis de crises récurrentes. S'y ajoutent la pose d'un cathéter intraveineux et une incision du cuir chevelu avec fraisage du crâne pour installer une fenêtre crânienne, opération de trente minutes dont les animaux ne se réveillent pas. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro, ex vivo, in silico ou sur puce microfluidique ne reproduit la complexité en jeu, et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

L’épilepsie pharmacorésistante reste un défi thérapeutique majeur, notamment dans les formes sévères associées à des crises prolongées ou récurrentes. Le cannabidiol (Epidiolex®) et la fenfluramine (Fintepla®) ont montré une efficacité clinique dans certaines formes d’épilepsie pédiatrique (syndromes de Dravet et de Lennox-Gastaut), mais leurs mécanismes d’action restent mal compris, et leur efficacité dans d'autres contextes épileptiques n’a pas été pleinement explorée. Par ailleurs, des études chez la souris ont montré un rôle spécifique des récepteurs cannabinoïdes de type 2 (CB2) dans les mécanismes de protection dans le contexte d’épilepsie pédiatrique. Cependant, leurs effets sur les altérations neurovasculaires associées aux crises, notamment sur la barrière hématoencéphalique (BHE), restent peu étudiés. La BHE joue un rôle central dans le contrôle de l’environnement cérébral, et sa perturbation est maintenant reconnue comme un acteur clé dans la genèse et la chronicisation de l’épilepsie. Des études ont montré que les crises épileptiques induisent une ouverture de la BHE, facilitant l’infiltration de cellules immunitaires et de composants plasmatiques pro-inflammatoires dans le parenchyme cérébral, ce qui peut aggraver l’excitabilité neuronale. L’utilisation du modèle murin d’épilepsie induite par injection systémique de kainate chez la souris permet de reproduire de manière fiable des crises convulsives aiguës suivies d’un état épileptique et d’une phase chronique avec crises récurrentes, mimant certains aspects de l’épilepsie humaine. Ce modèle est largement validé pour l’étude des mécanismes physiopathologiques de l’épilepsie et pour l’évaluation préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Il est donc particulièrement adapté pour étudier l’impact de traitements antiépileptiques sur la restauration de l’intégrité de la BHE, la modulation de la neuroinflammation et les interactions neurovasculaires. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer si l’activation du système sérotoninergique et/ou du système endocannabinoïde (récepteurs CB2) est capable de préserver l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique et l’infiltration immunitaire dans le contexte des crises épileptiques pédiatriques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont significatifs. Il vise à évaluer l’effet thérapeutique d’un agoniste sélectif des récepteurs cannabinoïdes de type 2 (CB2) dans un modèle préclinique bien établi d’épilepsie induite par le kaïniate. En particulier, le projet se concentre sur l’impact de ce traitement sur l’intégrité et la perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE), qui joue un rôle central dans la physiopathologie de l’épilepsie, notamment dans les formes pharmacorésistantes. Ce travail pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des récepteurs CB2 dans la modulation de l’inflammation neurovasculaire et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le contexte de l’épilepsie pédiatrique. À terme, il pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches de traitement non seulement pour les patients pédiatriques mais aussi ceux atteints d’épilepsie réfractaire.

Procédures

Type d’interventions, nombre et durée : 1. Induction du modèle d’épilepsie: Cette procédure dure environ 1 à 2 heures par animal (1 seule fois). 2. Pose d’un cathéter intraveineux (10 minutes/souris ; 1 fois). Intervention légère sous anesthésie générale avec analgésie préopératoire. 3. Chirurgie pour la mise en place d’une fenêtre crânienne sous anesthésie générale et analgésie (30 minutes/souris ; 1 fois). 4. Traitements pharmacologiques expérimentaux (durée 2 minutes, 1 fois/jour).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, l’induction du modèle d’épilepsie est susceptible d’entraîner des effets indésirables chez les souris. Ces effets incluent des crises convulsives généralisées (évaluées selon l’échelle de Racine), une altération de l’état général (perte de poids, hypomotricité), ainsi qu’un stress aigu durant la phase d’induction. Cette phase est considérée à sévérité modérée, et restera strictement encadrée par des critères de surveillance clinique renforcée de la part des expérimentateurs, avec mise en place de points limites clairs pour interrompre l’expérience en cas de souffrance excessive. Cette étude prévoit également une chirurgie pour la mise en place d’une fenêtre crânien. Cette procédure est associée à une nuisance modérée, incluant une incision cutanée et un fraisage du crâne. Une anesthésie générale et une analgésie préopératoire sera systématiquement administrée pour réduire au minimum la douleur et le stress liés à cette intervention. Cette dernière intervention sera sans réveil. Les traitements pharmacologiques expérimentaux ne sont pas connus pour induire de toxicité aiguë aux doses prévues, mais une surveillance spécifique de la part des expérimentateurs sera mise en place pour détecter d’éventuels effets indésirables (notamment sédation excessive, modifications cardiovasculaires ou comportementales). L’ensemble des procédures expérimentales respectera les recommandations du 3R, avec un effort particulier sur le raffinement (analgésie systématique, suivi clinique rapproché, intervention immédiate en cas de souffrance non anticipée) et une justification du nombre d’animaux utilisés.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveau pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’un agoniste sélectif des récepteurs CB2, en comparaison avec la traitement utilisé en clinique, sur l’activité épileptique et l’intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE) dans un modèle in vivo d’épilepsie pharmacorésistante. À ce jour, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire fidèlement la complexité des interactions neurovasculaires, immunitaires et électrophysiologiques impliquées dans l’épilepsie et ses comorbidités, en particulier en ce qui concerne la dynamique de la BHE en situation pathologique. Les systèmes cellulaires en culture (cultures primaires, co-cultures ou organoïdes cérébraux) permettent d'étudier certains mécanismes moléculaires isolés, mais ils sont incapables de modéliser les crises épileptiques dans leur dimension systémique (réseau neuronal global, perfusion cérébrale, réponse immunitaire périphérique, comportement animal, etc.). De même, les modèles in silico ou les approches sur puce microfluidique ne peuvent pas intégrer la dimension spatiotemporelle et multifactorielle des altérations observées in vivo, notamment l’impact du traitement pharmacologique sur les paramètres physiologiques globaux. L’utilisation d’un modèle animal avec induction d’un status épileptique, est donc indispensable pour répondre à la problématique scientifique posée. Ce modèle est bien caractérisé, cliniquement pertinent et permet d’étudier de manière intégrée les effets d’un traitement sur les crises épileptiques, les altérations de la BHE, l'inflammation cérébrale et les effets comportementaux. Ainsi, aucun substitut expérimental ne permet aujourd’hui d’acquérir les données nécessaires avec un degré de pertinence biologique équivalent, ce qui justifie le recours à un modèle animal pour ce projet.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Tout d’abord, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives comme l’IRM permet de réduire le nombre d'animaux utilisés ; de cette manière, les procédures utilisées ont été réfléchies de manière à les rendre compatibles entre elles (nous utiliserons d’abord l’IRM –technique non invasive- et le lendemain l’imagerie biphotonique chez la même souris, ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre de souris à utiliser dans le projet). Ainsi, nous avons conçu ce projet de façon à ce que les mêmes souris nous permettent d’obtenir des résultats sur l’inflammation vasculaire, la perméabilité de la BHE, la réponse immunitaire des cellules résidentes du cerveau (microglie) et les phénomènes d’infiltration leukocytaire (rolling et adhésion de leukocytes circulants aux parois vasculaires).

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, il est prévu l'utilisation d’analgésie péri-opératoire et post-opératoire ainsi que d'anesthésie pour toute procédure chirurgicale et imageries. Les points limites adaptés à l’étude ont été établis; une grille de score (grimace-scale) sera utilisée. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par les expérimentateurs 7/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et en immunologie. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris se rapproche de celui de l'homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la dynamique de microglie dans les conséquences des crises épileptiques. Les animaux transgéniques utilisés seront âgés de 4 à 6 semaines et auront un poids d'environ 12-18 g. Nous réaliserons nos modèles sur des jeunes souris afin de pouvoir mimer la pathologie épileptique pédiatrique.

Ouvertes sous anesthésie générale pour qu'un mélange d'ADN soit injecté dans le cerveau de leurs embryons, des femelles gestantes comptent parmi les 706 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés d'un à quatre jours reçoivent une injection de tamoxifène ou de virus, et 346 animaux subissent une perfusion intracardiaque sous anesthésie, sans réveil. L'objet déclaré est le rôle d'une protéine dans la formation de l'interface entre astrocytes et vaisseaux sanguins du cerveau, sans application annoncée. Le porteur écrit que des points limites intermédiaires permettront de soigner les animaux en "évitant la mise à mort", alors que toutes les souris du projet sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé.

Objectifs

Les astrocytes sont les cellules gliales majoritaires du système nerveux central et sont maintenant des acteurs reconnus de la physiologie de celui-ci. Notamment, les astrocytes sont importants dans le maintien dans le cerveau adulte des fonctions vasculaires comme la barrière hémato-encéphalique. In vitro leur rôle dans l’induction de ces propriétés a été largement étudié. Cependant, aucune claire démonstration de ce rôle n’a été faite in vivo. Une des raisons pour cela est le manque de connaissance sur le développement du compartiment astrocytaire périvasculaire et plus généralement l’évolution de l’interaction entre les astrocytes et les vaisseaux sanguins au cours du développement cérébral. Au cours d'une première étude, nous avons identifié une protéine qui pourrait jouer un rôle important dans le développement de cette interaction au cours du développement postnatal. Nous cherchons donc maintenant à étudier son rôle, en utilisant plusieurs stratégies d'imagerie et moléculaires. La première partie du projet consistera à mettre en place la délétion précoce spécifiquement dans les astrocytes de ce gène. Dans la deuxième partie du projet, nous réaliserons une analyse histologique, pour les différents marqueurs astrocytaires et vasculaires, ainsi que la densité cellulaire, pour identifier si son absence a des conséquences sur les propriétés de l'unité gliovasculaire et sa composition moléculaire. La morphologie des astrocytes sera également étudiée. Dans la troisième partie du projet, nous analyserons les potentielles modulations au niveau moléculaire.

Bénéfices attendus

Les astrocytes sont des cellules gliales indispensables au fonctionnement du cerveau qui ont une morphologie très ramifiée et complexe et qui contactent en particulier les vaisseaux sanguins cérébraux. Les astrocytes régulent les fonctions cérébrovasculaires mais les modalités de ces régulations sont encore mal caractérisées. Notre projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle d’une protéine chaperonne des lipides gras polyinsaturés dans le développement et la maturation des astrocytes cérébraux et en conséquence, le développement de l’unité gliovasculaire.

Procédures

4 interventions sont utilisées dans ce projet. 1) injection dans le cerveau d’embryon (in utero) : des femelles gestantes sous anesthésie générale sont opérées. Un mélange d’ADN et de colorant est injecté dans le cerveau des embryons. Nombre d’embryons concernés : 60. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois (durée: 30 min maximum). 2) Injection de Tamoxifen : du tamoxifen est injecté chez des nouveau-nés de 1 ou 4 jours et à 30 jours de vie. Cette injection n’est réalisée qu’une seule fois (pour le snouveaux-nés) ou 5 jours de suite (chez les souris de 30 jours). Elle est sans douleur et ne nécessite pas d’anesthésie. Nombre d’animaux concernés : 700 (durée: 1min). 3) injection de virus chez des nouveaux-nés. Cette injection se fait une seule fois, sous anesthésie locale. Nombre d’animaux : 60 (durée 15min). 4) Perfusion intracardiaque: Réalisée sous anesthésie générale, cette intervention est sans réveil. Nombre d’animaux concernés : 346 (durée: 15min)

Impact sur les animaux

La totalité des animaux subiront une injection sous-cutanée d’un produit chimique, ce qui peut engendrer un stress lié à la contention de l’animal et une douleur locale liée à l’injection (nuisance légère). Certains animaux recevront une injection intraveineuse dans la joue de virus. Ce geste peut entrainer une gêne au niveau du site d’injection (nuisance modérée). Un lot de femelles gestantes subira une chirurgie pour l’injection d’ADN chez les embryons, qui peut entrainer des effets modérés. Une observation particulière des animaux dans les jours suivants et l’application des points limites permettent de limiter la nuisance et la souffrance des animaux.

Devenir

La mise à mort des animaux est nécessaire pour récupérer les cerveaux afin d’étudier les propriétés des astrocytes.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Tests statistiques : Pour l’ensemble des questions il faut obtenir les observations sur au minimum 5 réplicas biologiques pour chaque génotype, pur chaque sexe, à chaque stade et pour chaque condition de traitement. Ce nombre de 5 est un minimum pour intégrer dans notre étude la variabilité entre les animaux. C’est un prérequis dans l’ensemble des publications de travaux scientifiques. Elle est particulièrement cruciale pour l’étude développementale où les programmes de différentiation cellulaire peuvent légèrement varier d’un individu à l’autre. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets observés seront évalués

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les nouveau-nés subissant une injection feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux seront mis en place évitant la mise à mort des animaux. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront co-administrés pour limiter toute souffrance à l’animal. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous prévoyons 4 stades à étudier : 10, 15, 60 et 200 jours après la naissance. Ces stades ont été choisis sur la base de nos études préalables (en particulier dans notre laboratoire) qui montrent que l’Unité Gliovasculaire se met en place entre 5 et 15 jours après la naissance, avec une période critique entre les jours 10 et 15. Il est par ailleurs important de déterminer si ce sont des phénomènes uniquement développementaux (étude aux jours 10 et 15) ou maintenu chez l’adulte (études aux jours 60 et 200).

Comprendre comment des zones profondes du cerveau commandent le mouvement et la décision : six macaques rhésus sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur cinq ans. Chacun subit jusqu'à six chirurgies de six heures pour poser des implants crâniens, jusqu'à dix séances d'IRM de quatre heures sous anesthésie, et des sessions quotidiennes allant jusqu'à cinq heures pendant lesquelles de fines électrodes sont insérées dans son cerveau. Le porteur maintient les animaux sous contrôle alimentaire pour "maximiser" leur motivation, et décrit cet accès restreint à la nourriture comme un "levier motivationnel". Deux macaques seront tués pour analyse du cerveau, les quatre autres passant à un projet suivant ou, si leur état le permet, placés en sanctuaire.

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre comment certaines zones profondes de notre cerveau nous permettent de contrôler nos mouvements et de prendre des décisions. Pour comprendre leur rôle exact, nous réaliserons des enregistrements et des stimulations au niveau du cerveau chez le singe macaque, dont le cerveau est très proche du nôtre. L’objectif sera de corréler ces enregistrements et stimulations avec le comportement de l'animal afin de comprendre le lien de cause à effet entre l'activité des neurones des zones étudiées et les actions. Mieux comprendre le fonctionnement normal de ces circuits est une étape essentielle avant de pouvoir comprendre ce qui ne va pas dans certaines maladies neurologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera surtout des connaissances nouvelles et fondamentales sur le fonctionnement normal de notre cerveau. À court terme il pourrait permettre d’avoir une image beaucoup plus précise du rôle exact joué par une zone spécifique du cerveau dans le contrôle de nos actions et décisions. Il pourrait ainsi être possible de dire comment ces zones spécifiques contribuent à préparer, choisir, démarrer ou exécuter un mouvement. Obtenir ces informations détaillées chez le singe est très important car son cerveau ressemble beaucoup au nôtre et pourrait donc fournir des données cruciales pour l’identification des dysfonctionnements observés dans certaines pathologiques neurologiques. En effet, à plus long terme ce projet contribuera à obtenir une meilleure compréhension de la manière dont ces circuits fonctionnent normalement, ceci constituera la première étape indispensable pour ensuite comprendre pourquoi ils dysfonctionnent dans certaines maladies du cerveau qui affectent les mouvements ou les décisions (comme la maladie de Parkinson, les troubles obsessionnels compulsifs, les addictions...). Ces connaissances fondamentales pourraient, un jour, aider à développer de nouvelles pistes pour des traitements ou à améliorer les thérapies existantes comme la stimulation cérébrale profonde.

Procédures

Les singes seront d'abord entraînés à réaliser des exercices d’interactions avec l’écran. Ces apprentissages peuvent prendre plusieurs mois et seront réalisés à raison de 1 à 5h par session, 5 sessions par semaine sur toute la durée du projet. L’animal est en contrôle alimentaire pendant la durée de ces sessions pour maximiser sa motivation et le nombre d’essai réalisé Une fois entrainés les animaux auront 2 chirurgies sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour mettre en place deux implants sur leur tête (6 heures maximum) avec 3 semaines de récupération minimum entre chaque chirurgie. Ces interventions pourront être renouvelées en cas de perte des implants et avec l’accord du vétérinaire (6 chirurgies au total maximum). Avant et après les chirurgies, ils auront une imagerie par résonance magnétique sous anesthésie générale, ces imageries seront répétées après les premiers enregistrements neurophysiologiques et chaque année pour vérifier l’intégrité des tissus et implants (4heures maximum par imagerie, 10 imageries maximum). Après la première chirurgie, pendant plusieurs mois, lors de sessions quotidiennes de quelques heures (5 jours par semaine maximum, 5h maximum par session), de fines électrodes seront insérées temporairement au niveau du cerveau pour mesurer l'activité des neurones pendant que l'animal vigile réalise les exercices. L’animal sera aussi sous contrôle alimentaire pour augmenter sa motivation. Son dispositif d’enregistrement sera nettoyé avant et après chaque séance (animal vigile, acte indolore, 15 minutes environ). Une dernière intervention sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera faite pour injecter un composé au niveau du cerveau nous permettant de modifier génétiquement certaines cellules nerveuses spécifiques (durée 6h maximum). Après cette chirurgie et un temps d'attente entre un et deux mois, des sessions similaires à l’enregistrement de l’activité des neurones auront lieu, mais cette fois une fibre optique sera insérée pour envoyer de la lumière dans le cerveau et activer ou inhiber les cellules nerveuses modifiées. Une partie des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser des prélèvements et analyses post-mortem d’intérêt. Les autres animaux seront gardés en vie pour une utilisation continue ou pour être replacés dans un centre d’accueil.

Impact sur les animaux

L'entraînement aux tâches comportementales et le maintien de la tête au cours de ces tâches génèrera un stress et un inconfort pour l’animal pendant une durée propre à chaque animal (généralement inférieur à une semaine). L'accès contrôlé à la nourriture pourra créer une légère faim, un risque de perte ou de prise de poids et un stress pour l’animal. Les opérations chirurgicales comportent un risque de douleurs et d’inconfort post-opératoire. Les implants crâniens génèreront un inconfort, seront associés à un risque d’infection et un risque de perte suite à un rejet du matériel. L'injection dans le cerveau peut causer une petite inflammation locale. Les anesthésies générales nécessaires pour les chirurgies et les imageries génèreront un stress pour l’animal à l’induction et seront associées à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de difficultés cardiorespiratoires. La stimulation par la fibre optique peut causer un échauffement local extrêmement léger et modifier temporairement le comportement de l'animal (c'est le but de l'étude), ces effets sont temporaires et limités à la durée de la stimulation, mais pourraient éventuellement être associés à un stress ou léger inconfort pour l’animal.

Devenir

Sur les 6 macaques, 2 seront euthanasiés à la fin du projet pour pouvoir analyser précisément leur cerveau afin de répondre à nos objectifs scientifiques. Pour les 4 autres animaux, soit nous les mettrons en utilisation continue dans un futur projet, soit nous chercherons activement à les replacer dans des structures d'accueil spécialisées (sanctuaires ou centres agréés) pour leur retraite, à condition que leur état de santé et leur comportement le permettent (après évaluation vétérinaire). Notre objectif étant de ne pas euthanasier les animaux quand ce n'est pas indispensable pour les vérifications scientifiques finales.

Remplacement

Pour comprendre comment des circuits précis du cerveau contrôlent nos actions et décisions, et pour tester si l'activité de ces circuits est bien la cause des comportements observés, il faut étudier le cerveau en fonctionnement dans un organisme entier. Les méthodes alternatives (cellules en culture, ordinateurs) ne peuvent pas reproduire cette complexité. L'enregistrement direct de l'activité des neurones (électrophysiologie) et leur manipulation ciblée (optogénétique) pendant que l'animal réalise une tâche nécessitent un animal vivant. Le singe est choisi car son cerveau est le plus similaire à celui de l'homme parmi les animaux de laboratoire, rendant les résultats plus pertinents. Les techniques d'imagerie chez l'homme ne sont pas assez précises pour répondre à nos questions. L'utilisation de singes est donc indispensable ici.

Réduction

Nous utiliserons un maximum de 6 singes sur 5 ans. Ce nombre est le minimum nécessaire pour étudier les deux zones cérébrales d’intérêt avec 3 animaux pour chaque zone, ce qui permet des analyses statistiques fiables. Chaque animal participera à toutes les étapes, ce qui maximise les informations obtenues par animal et réduit le nombre total nécessaire. Seuls 2 animaux sur 6 seront euthanasiés pour des analyses post-mortem nécessaires pour répondre à nos objectifs scientifiques, les 4 autres étant destinés à l’utilisation continue ou au replacement. Nous partagerons les tissus des animaux euthanasiés afin de participer à réduire de manière plus globale le nombre de macaques utilisés à des fins scientifique. Si nous obtenons des résultats clairs plus tôt, nous arrêterons le projet avec moins d'animaux.

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation de 2 semaines avant d’entrer en procédure. Ils auront ensuite un entrainement progressif adapté au rythme de chaque animal et réalisé par renforcement positif. Ainsi, l’animal recevra une récompense (nourriture) à chaque comportement attendu durant l’entrainement, pour renforcer la fréquence de ce comportement. Un écran tactile sera fourni en cage pour débuter l’entrainement de manière volontaire avant qu’ils ne soient amenés dans le box de travail. Afin d’obtenir un levier motivationnel pour les tâches plus complexes nous mettrons en place un contrôle de la distribution des aliments, nous suivrons de manière rigoureuse et quotidienne l’équivalent énergétique fourni à l’animal pour nous assurer de couvrir ses besoins journaliers. L’animal sera également pesé chaque jour d’entrainement pour suivre sa courbe de poids et détecter toute variation liée au contrôle. Une diversification de l’apport alimentaire sera mise en place pour fournir des aliments pauvres en calories permettant d’augmenter le temps de disponibilité de nourriture sans influer significativement sur l’apport énergétique fourni à l’animal. Les chirurgies seront optimisées (neuro-navigation, équipe experte et matériel de qualité) et réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée et un suivi post-opératoire de plusieurs jours. Un suivi quotidien rigoureux (comportement et état général) sera assuré tout au long du projet par du personnel qualifié et le vétérinaire. En cas d’anomalie observée un avis vétérinaire sera demandé pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. Des points limites précis et précoces sont définis et seront appliqués pour éviter toute souffrance. En amont de l'implantation du matériel sur le crâne de l’animal, nous réaliserons une IRM pour localiser précisément les sites d’implantation et d’injection, nous permettant d’optimiser l’implantation et les enregistrements ou stimulations qui seront ensuite réalisés. Les enregistrements de l’activité du cerveau et les stimulations lumineuses seront réalisés via l’implant mis en place et ne nécessiteront donc pas de chirurgie supplémentaire pour l’animal et pourront être réalisés en état vigile (actes non douloureux) grâce à l’entrainement des animaux. Pour la stimulation lumineuse nous utiliserons des paramètres rigoureusement contrôlés pour minimiser l'échauffement tissulaire et surveillerons attentivement les effets comportementaux induits.

Choix des espèces

Nous utilisons des singes macaques rhésus (ou éventuellement cynomolgus en l’absence de rhésus disponible) car leur cerveau, notamment les zones cérébrales qui contrôlent les mouvements et les décisions, est très similaire à celui de l'homme. Cette ressemblance est cruciale pour que nos découvertes sur le fonctionnement de ces circuits soient utiles pour comprendre le cerveau humain. Ces singes peuvent apprendre les tâches complexes nécessaires et les techniques d'enregistrement et de stimulation cérébrales nécessaires dans ce projet sont bien maîtrisées chez eux. Nous utilisons des animaux adultes (3 à 16 ans). À cet âge, ils apprennent bien les tâches, s'adaptent bien à la vie en groupe (important pour leur bien-être), et cela permet d'étudier leur cerveau avant les effets du vieillissement. Cela facilite aussi leur replacement éventuel en fin de projet.

Cinq ans au maximum par animal, avec des sessions d'enregistrement de une à trois heures jusqu'à cinq fois par semaine : douze ouistitis sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit deux chirurgies d'une journée, l'une pour implanter des électrodes chroniques dans le cerveau, l'autre pour transfecter ses neurones à ocytocine afin de pouvoir les activer ou les inhiber à distance. Le projet enregistre ensuite leurs vocalisations et leur activité cérébrale pendant qu'ils interagissent avec leurs congénères, une situation que le porteur qualifie de semi-naturelle alors qu'elle repose sur des animaux implantés et équipés d'une veste à micro. Six d'entre eux seront réutilisés dans un autre protocole et six désimplantés en vue d'un placement en retraite, la décision étant prise au cas par cas.

Objectifs

Pour les primates, humains compris, les signaux acoustiques sont essentiels pour communiquer. Grâce à leurs capacités cognitives, ils sont capables d’ajuster leur production vocale selon le contexte social, mais on ne sait pas encore comment les neurones encodent les vocalisations des congénères et produisent une réponse appropriée. Ce projet permettra d’enregistrer les neurones et d’étudier les vocalisations de singes marmoset dans différents contextes sociaux, dans des conditions semi-naturelles, les animaux se déplaçant librement dans la colonie. En parallèle, les neurones à ocytocine, neurohormone impliquée dans les comportement sociaux et espoir thérapeutique, seront stimulés pour comprendre son influence sur la communication acoustique des primates. Cette approche multidisciplinaire et multisite permettra de mieux cerner le rôle de l'ocytocine et d’en savoir plus sur le fonctionnement du cerveau des primates lors de conversations naturelles dans différents contextes sociaux.

Bénéfices attendus

Le projet produira plusieurs résultats significatifs. Sur le plan scientifique, il révélera comment le cerveau encode la communication accoustique, c'est à dire les échanges vocaux entre individus, ainsig que les liens affiliatifs entre eux. Cela apportera une nouvelle perspective au domaine, où les bases neurales de la perception et de la production vocales sont étudiées ensemble dans le cadre d'une interaction sociale naturelle : les conversations. De plus, il montrera le rôle du neuropeptide ocytocine (OT) dans ce processus. Cela est crucial car ce sera la première preuve causale que l'OT endogène module le comportement social des primates, et, indépendamment, la communication acoustique. Ainsi ce projet avancera nos connaissances sur les bases neurales et chimiques de l'affiliation entre individus.

Procédures

Les animaux seront soumis d'abord habitués à l'environnement et aux expérimentateurs du laboratoire (1 à 3 mois). Ils seront notamment entrainés à coopérer afin que les expériences se déroulent sans stress. Ensuite, des examens de neuroimagerie nous permettrons d'identifier les structures cérébrales d'intérêts (une demi journée par examen). Les animaux seront implantés avec des électrodes chroniques (chirurgie d'une journée), et leurs neurones à ocytocine seront transfectés pour pouvoir les activer ou les inhiber sur commande (chirurgie d'une journée). Enfin, nous enregistreront conjointement l'activité cérébrale et les vocalisations des sujets lors de leur comportements naturels avec leurs partenaires, directement dans la pièce d'hébergement (sessions de 1 à 3h, entre 1 et 5 fois par semaine, pendant la durée du projet). Il s'agit d'une seule procédure modérée, chaque animal participera à ce projet pendant une durée maximale de 5 ans.

Impact sur les animaux

1. Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale, destinée à l'implantation d'électrodes et l'injection de virus AAV. La chirurgie suscitera un inconfort post-opératoire passager (quelques jours), maitrisé par l'administration d'analgésique. Par ailleurs, une légère perte de poids et une réduction de la mobilité sont possibles selon le temps pris par l'individu pour s'adapter à son implant (quelques jours). 2. Pour les tests comportementaux, ceux-ci auront lieu directement dans la cage d'habitat ou la cage d'expérimentation (enregistrement passif de l'animal libre). Cette cage d'expérimentation sera placée soit devant la cage d'habitat ou une autre cage, face à un autre individu. L'impossibilité d'interaction tactile et la nature prosociale des marmosets préviendront l'apparition de stress fort, mais une anxiété légère est possible. De plus, la pose de l'équipement d'enregistrement (neurologger + veste avec micro et ecg) nécessite une manipulation à la main par les expérimentateurs, ce qui peut également être stressant. Ce stress et cette anxiété seront graduellement réduits avec l'habituation des individus à ces situation (quelques semaines). 3. Les animaux seront aussi soumis à des examens d'IRM, de TEP (Tomographie à émission de positon), pour lesquels ils seront mis sous anesthésie générale, ce qui provoquera un léger stress lors de l'induction ainsi qu'un inconfort (quelques heures) au réveil. 4. La désimplantation ne laisse pas de séquelle (hormis une cicatrice), la peau et l’os se cicatrisent. Comme toutes les procédures chirurgicales, elle peut comporter des risques d’infection, ou plus rarement encore, entraîner des crises d’épilepsie. Dans l’éventualité où une infection ou des crises d’épilepsie se produiraient, une médication appropriée d’antibiotiques ou d’antiépileptiques serait administrée à l’animal, sous l’avis de notre vétérinaire. De même que pour l'implantation, toute douleur post opératoire sera traitée par analgésique (quelques jours).

Devenir

A la fin de la procédure, les singes seront réutilisés dans un autre protocole ou bien désimplanteés et replacés pour une mise en retraite. Cette décision sera prise par la Structure du Bien être Animal au cas par cas et avec l'accord des responsables et du vétérinaire référant.

Remplacement

Les modèles in silico du cerveau ne sont pas encore assez évolués pour simuler le comportement spontané de primates. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal. Le choix d'un modèle primate est justifié par les questions spécifiques du projet qui s'intéressent justement à la différence des effets de l'ocytocine chez le rongeur et chez le primate, ainsi qu'aux bases neurales de la communication acoustique du primate. L'OT module-t-elle le comportement social et l'activité cérébrale chez les primates comme elle le fait chez les rongeurs ? Comment les circuits cérébraux spécifiques aux primates (ACC) encodent-ils la communication acoustique ? Comment le contexte social riche et spécifique des primates influence-t-il la production vocale ? Pouvons-nous infecter et manipuler les neurones de primates en utilisant des AAV périphériques ? Nous avons sélectionné le marmoset, pour remplacer le modèle classique qu'est le macaque, en raison de sa plus petite taille, de ses capacités cognitives inférieures ainsi que par sa proximité phylogénétique plus lointaine et surtout du fait de son riche comportement acoustique et pro social.

Réduction

La principale réduction du nombre d'animaux vient des technologies utilisées, les électrodes choisies pour ce projet ont de nombreux contacts et sont implantées de manière chronique et ont une longue durée de vie, ce qui permet d'enregistrer beaucoup de neurones en peu de temps, et d'utiliser un même singe pour toutes les étapes du projet. Ainsi une grande quantité de données sera extraite de chaque session et de chaque singe impliqué, ce qui au final réduit le nombre de session et d'animaux nécessaires. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations (n =12 selon le calcul de puissance).

Raffinement

Plusieurs éléments de raffinement sont mis en oeuvre : Recours à l’imagerie (IRM et TEP), qui se substitue pour la plupart des animaux à l’histologie post-mortem et permet d’envisager leur replacement en sanctuaire à l'issue des expériences. Durant chaque transport, les animaux seront sédatés à la kétamine. Entrainement des singes via du renforcement positif, ce qui permet de les manipuler sans contention. De plus, l'intégralité des expériences seront conduites en conditions semi-éthologiques, c’est-à-dire en conditions expérimentales où les animaux sont libres de leurs mouvements et peuvent se déplacer et interagir avec des objets ou des congénères. La différence entre conditions purement éthologiques et semi-éthologiques est que ces dernières n’adviennent pas en milieu naturel. Ces conditions sont rendues possibles grâce à notre laboratoire d’enregistrement sans fil où les animaux pourront se déplacer librement et se comporter d’une manière naturelle. Surtout, ces enregistrements se déroulent directement dans ou à côté de la cage d'hébergement, à l'intérieur de la salle de stabulation, ce qui enlève le stress d'une sortie de cage prolongée. Ces conditions expérimentales dans lesquelles les animaux sont testés constituent un élément de raffinement important. De plus l'hébergement des marmosets se fera dans de grandes cages (1.7 voir 3.4m^3 pour deux animaux) ce qui est supérieur, relativement à leur taille, à ce qu'on les macaques en laboratoire. Tous les actes chirugicaux seront fait sous anésthésie et avec un traitement analgésique. Enfin, un traitement humain des animaux sera assuré par des points limites liés à la douleur éventuelle suite à la chirurgie ou un inconfort lié à un stress chronique.

Choix des espèces

Les aires de la communication acoustique et de l'affiliation ne sont pas équivalentes entre les rongeurs et les primates. Ces derniers ont en effet développé un cortex cingulaire antérieur qui leur est unique, en terme de connectivité et de type de neurones. Par ailleurs, les primates ont une cognition sociale bien plus élaborée et complexe que celle des autres modèles. Dans l'optique de transférer les connaissances acquises par le présent projet à l'humain, et notament à des patients, il est donc crucial de réaliser ces expériences sur un primate non humain. Enfin, un des objectifs du projet est de tester si l'on peut manipuler le comportement social des primates via le système ocytocinergique, comme on a pu le faire chez le rongeur. Il est donc obligatoire d'utiliser un primate non humain pour répondre à cette question. Les animaux utilisés seront adultes. Ce stade permet de documenter les bases neuronales d’un sujet normal adulte et sain, présentant un système de communication et d'affiliation dévelopés.

Pour mesurer l'effet de composés candidats sur la mémoire, 300 souris et 300 rats sains reçoivent des électrodes implantées dans l'hippocampe ou le cortex préfrontal au cours d'une chirurgie de deux heures. Tous sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue, le sang terminal étant prélevé au sinus rétro-orbitaire. Les administrations vont jusqu'à 180 fois par voie orale ou 21 injections intrapéritonéales par animal, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins. Les composés testés ont déjà été évalués in vitro par les clients du porteur, ce projet constituant l'étape suivante d'une prestation commerciale.

Objectifs

La mémoire est une fonction essentielle du cerveau, souvent perturbée dans de nombreuses maladies neurologiques ou psychiatriques. C’est pourquoi elle représente une cible importante pour développer de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier, chez des rongeurs sains (souris ou rats, selon les besoins), l’effet de nouveaux composés sur le fonctionnement du cerveau lié à la mémoire, et plus particulièrement sur la façon dont les connexions entre les neurones peuvent se renforcer ou s’affaiblir. La mémoire repose en grande partie sur ces modifications durables des connexions, appelées plasticité synaptique, comme la potentialisation à long terme (LTP) — un renforcement durable de la transmission entre deux neurones après leur activation répétée — ou la dépression à long terme (LTD) — une diminution prolongée de cette transmission synaptique. Ces mécanismes permettent au cerveau d’apprendre et de stocker des informations. Pour étudier ces mécanismes, nous utilisons une méthode appelée électrophysiologie in vivo, qui consiste à enregistrer l’activité électrique du cerveau chez des animaux éveillés. Concrètement, nous implantons de petites électrodes, avec une grande précision, dans des régions clés impliquées dans la mémoire, comme l’hippocampe ou le cortex préfrontal. Cela nous permet de mesurer l’activité des neurones et de voir comment les signaux entre eux changent après l’administration des composés testés. Les composés seront donnés par voie orale ou injectés, selon ce qui est le plus adapté, et nous mesurerons leurs effets à différents moments. En observant comment ces substances influencent l’activité des réseaux de neurones, nous espérons mieux comprendre leur impact potentiel sur la mémoire. Les résultats obtenus serviront de base pour des recherches futures dans des modèles animaux reproduisant des troubles de la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment de nouveaux composés agissent sur les mécanismes qui permettent au cerveau de renforcer ou d’ajuster les connexions entre neurones, un processus essentiel à la mémoire. En étudiant leur effet sur l’activité des réseaux de neurones dans un cerveau vivant, nous pourrons mieux cerner l’impact de ces candidats médicaments sur la plasticité cérébrale. Les données obtenues, issues d’un modèle préclinique dans des conditions proches du fonctionnement normal du cerveau, représenteront une étape clé avant de tester ces composés dans des modèles de maladies. Elles poseront ainsi les bases pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les dysfonctionnements des circuits neuronaux impliqués dans les troubles cognitifs liés à différentes maladies neurologiques ou psychiatriques.

Procédures

Sous analgésie anésthésie une seule étape de chirurgie (2 heures). Administrations : sous cutanée 1 à 14 fois max 5 sec ou Intrapéritonéale 1 à 21 fois max 5 sec ou 1 à 14 fois max 1 minute ou voie orale 1 à 180 fois max 5 sec. Prélèvements sanguins maximum 8 fois sur animal vigile ou anesthésiés (5 secondes).

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les administrations uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. Les produits administrés peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire transitoire. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré au lieu d'injection. Une injection provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo réalisés sur animal vigile, dans leur cage habituelle, limitent considérablement le stress et les perturbations comportementales. L’implantation d’électrodes lors de la procédure chirurgicale peut provoquer une douleur au site d'incision ou des saignements. En post chirurgie, un risque inflammatoire ou infectieux est présent.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée chez l’animal vigile à l’aide de techniques d’électrophysiologie in vivo. Ces approches permettent d’enregistrer l’activité neuronale dans un environnement physiologique préservé, en tenant compte des interactions complexes entre différentes structures cérébrales et des influences de l’état de vigilance ou du comportement spontané. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, ce qui a permis d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’intégration de ces effets dans un réseau cérébral fonctionnel et intact. C’est pourquoi l’expérimentation in vivo s’avère nécessaire dans ce contexte, afin de caractériser l’impact des composés sur l’activité neuronale dans des conditions physiologiques réalistes.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies avec des éléments favorisant leur bien-être, comme des bûchettes de bois à ronger, de la frisure de papier et des carrés de coton. Des tunnels en carton faciliteront les transferts entre cages tout en limitant le stress. Des interactions régulières avec le personnel, ainsi qu’une transition progressive de la lumière, contribueront à améliorer leur acclimatation. Une période d’adaptation d’au moins 10 jours est prévue afin de permettre aux animaux de récupérer du transport et de s’habituer à leur nouvel environnement. Ils seront surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Après chaque intervention technique, leur comportement et leur état général seront observés avec attention pour détecter rapidement toute réaction anormale ou signe de douleur. Si nécessaire, une surveillance renforcée sera mise en place, en lien avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les seuils définis dans le cadre du projet seront scrupuleusement respectés pour assurer une détection précoce de toute souffrance. Les animaux seront pesés au moins deux fois par semaine après le début des traitements, afin d’adapter précisément les volumes administrés. Pour les injections répétées (intrapéritonéales ou sous-cutanées), les sites d’administration seront régulièrement changés pour limiter les réactions locales. Concernant les interventions chirurgicales, les animaux seront placés sous anesthésie générale / analgésie pendant toute la durée de l’opération. Une analgésie locale préventive sera administrée, avec une injection 10 minutes avant l’incision, ainsi qu’une application locale d’un mélange anesthésique au niveau du site opératoire. Le maintien de la température corporelle (tapis chauffant), le suivi pendant l’opération (monitoring) et des techniques chirurgicales stériles seront appliqués pour limiter les complications. Une solution ophtalmique sera appliquée sur les yeux pendant l’anesthésie pour éviter leur dessèchement, et une injection de solution saline tiédie à la fin de la chirurgie permettra d’assurer l’hydratation. Enfin, une analgésie post-opératoire sera assurée par l’ajout d’un traitement antidouleur dans l’eau de boisson pendant deux jours.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées sur la souris et le rat, deux modèles couramment utilisés en neurosciences pour étudier les mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes majeures avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des circuits neuronaux et les mécanismes synaptiques. Ces caractéristiques en font des modèles particulièrement adaptés pour explorer les bases du fonctionnement normal du cerveau ainsi que les processus altérés dans les maladies affectant la mémoire. Grâce à un cerveau moins complexe tout en restant suffisamment proche de celui de l’humain, les souris et les rats permettent d’étudier des fonctions essentielles telles que la plasticité neuronale, l’apprentissage et la mémoire, souvent perturbées dans les pathologies du système nerveux central. Ces modèles offrent ainsi la possibilité d’observer et de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux du fonctionnement cérébral, fournissant des données précieuses pour le développement de traitements ciblés contre ces maladies. Les animaux seront utilisés du jeune l’âge adulte, c’est-à-dire à partir de 4 semaines. Ils seront suivis jusqu’à environ 8 mois, ce qui couvre la période d’âge adulte sans atteindre le stade de vieillissement avancé soit avant l’apparition des altérations liées à l’âge ou à d’éventuelles pathologies. Les données obtenues chez ces animaux fourniront une base fiable pour la comparaison avec des modèles pathologiques plus avancés.