Système nerveux

24 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la plupart et modéré pour 2 160 d'entre elles. L'acte consiste à couper l'extrémité de la queue de chaque souriceau, animal jeune et vigile, pour lire son génotype, avec parfois un second prélèvement à l'oreille sur l'adulte. Une partie des souriceaux porte une mutation qui arrête leur croissance et 561 seront tuées pour cette raison. Le porteur prévoit d'en garder 16 175 vivantes pour ses propres projets sur la maladie de Parkinson et la dystonie, et de tuer les 8 104 restantes s'il ne trouve pas d'équipe pour les reprendre.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l’élevage et le maintien de plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées avec la nécessité de réaliser un prélèvement invasif pour connaitre le patrimoine génétique des souriceaux. Ces animaux sont produits pour être utilisées comme modèle animal pour l’étude des mécanismes moléculaires en lien avec des maladies du mouvement comme la maladie de Parkinson et la dystonie. Ils seront également utilisés pour étudier les causes des effets indésirables graves des traitements observés chez les patients traités pour ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de produire et maintenir les souris nécessaires pour permettre des recherches sur la maladie de Parkinson et la dystonie. Actuellement en France, on estime que près de 200 000 personnes sont touchées par la maladie de Parkinson, avec plus de 25 000 personnes nouvellement diagnostiquées tous les ans. La maladie de Parkinson est la 2ème maladie neurodégénérative la plus fréquente en France après la maladie d’Alzheimer et une cause majeure de handicap chez les personnes âgées. Les autres maladies du mouvement sont également un enjeu sociétal car multiples et atteignant diversement les patients avec parfois une forme génétique. Ces maladies plus rares nécessitent également une exploration qui permettra d’améliorer la vie de patients à terme. Les animaux produits dans ce projet contribueront entre autres à tester des nouvelles technologies thérapeutiques pour la maladie de Parkinson. Cela pourrait permettre à long terme de développer de nouveaux traitements ciblés afin de prévenir ces troubles invalidants, ayant un bénéfice direct pour chaque patient et son entourage. Ces animaux permettront également de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l'apparition d'effets indésirables graves lors du traitement des patients parkinsoniens et potentiellement, à plus long terme, améliorer la prévention et la prise en charge de ces effets.

Procédures

Pour tous les animaux produits au cours de ce projet, un petit prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animal jeune et vigile pour connaitre le patrimoine génétique des animaux (une seule fois, moins d’une minute par animal). Rarement un re-prélèvement à l’oreille (1 seule fois, moins d’une minute, animal vigile) aura lieu sur un animal adulte si cela est jugé nécessaire après avis de la structure chargée du bien-être animal.

Impact sur les animaux

L’ensemble des manipulations (nécessitant notamment des contentions) génèreront un stress pour les animaux. Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement de l’extrémité de la queue (ou de l’oreille) pour connaitre leur patrimoine génétique. La mutation génétique de certains des souriceaux se traduira par un arrêt précoce de la croissance nécessitant leur euthanasie.

Devenir

Les animaux qui ne seront pas utilisés pour nos projets de recherche, seront euthanasiés s’il n’est pas possible de les donner à d’autres équipes (8104). Une partie des souriceaux sera euthanasiée pour éviter toute souffrance car ils présenteront un arrêt précoce de leur croissance (561). Nous estimons que 16175 animaux seront gardés en vie et transférés, en utilisation continue, dans nos projets de recherche.

Remplacement

Les projets pour lesquels ces animaux sont élevés porteront sur l’étude des comportements moteurs et impulsif, il est donc impossible de remplacer les animaux par un modèle cellulaire afin de pouvoir réaliser des tests comportementaux. Les études in vitro et sur les invertébrés ne permettent pas l’étude de comportements tels que les mouvements anormaux et leurs conséquences.

Réduction

Dans ce projet nous estimons que nous produirons 24840 animaux maximum afin de fournir les animaux nécessaires à nos projets de recherche en cours, les projets en cours de validation ou de révision ou futurs. . Ce nombre tient compte d’un pourcentage de perte lié aux aléas de l’élevage et aux effets indésirables induits par certaines mutations génétiques ainsi que du pourcentage d’animaux porteurs du patrimoine génétique d’intérêt. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaires pour nos lots expérimentaux. Ces lots ont été définis en utilisant des tests statistiques afin de limiter au strict minimum les effectifs par groupe tout en obtenant des résultats statistiquement exploitables. En fonction des besoins expérimentaux pour les projets de recherche il est possible que nous produisions moins d’animaux que prévu. Si certaines des lignées de maintiennent ne seront plus utilisées, nous pourront envisager de faire de la cryopréservation afin de réduire la production des animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement (carré de coton et bâtonnet de bois à ronger). Un suivi spécifique sera mis en place pour les petits porteurs de la mutation génétique impliquant un arrêt précoce de la croissance : il sera vérifié la présence de lait dans l’estomac et l’évolution du poids afin de détecter l’atteinte potentielle de points limites nécessitant l’euthanasie des animaux. Lors du prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux nous amènerons la mère avec la portée dans leur cage d’origine dans une pièce dédiée, au calme. La taille de la biopsie sera limitée au strict minimum afin d’être le moins invasif possible pour les animaux. Le geste, parfaitement maitrisé, sera réalisé de manière rapide en utilisant du matériel propre et désinfecté entre chaque animal pour prévenir tout risque de contamination ou d’infection. Une surveillance des petits sera assurée à leur retour en cage et 20 minutes après la biopsie. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Ce projet s’intéresse à la production et au maintien de lignée de souris qui seront utilisées pour l’étude de la pathogenèse et thérapeutique des troubles moteurs et comportementaux de la maladie de Parkinson, une pathologie neurodégénérative fréquente ; et de la dystonie, une maladie génétique rare. Les animaux élevés dans ce projet seront prélevés pour connaitre leur génotype à l’âge de 7-10 jours et si correspondant au génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche à l’âge adulte de 6-10 semaines. Ces animaux aideront à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et de réponse au traitement dans ces différentes maladies et le déclenchement des troubles comportementaux et cognitifs induits par les traitements dopaminergiques. Ces comportements ne peuvent être reproduits ni modélisés par des modèles in vitro ou computationnels. Les approches expérimentales dans lesquelles ces animaux seront utilisés nécessite des souris transgéniques et ne peut se faire qu’à l’aide d’études comportementales au niveau de l’animal. Une fois les acteurs pharmacologiques et moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles cellulaires lorsque cela est possible pour limiter le nombre d’animaux utilisés

Surexposées au bruit pendant quelques heures ou injectées trois jours de suite dans l'abdomen pour déclencher une inflammation de l'oreille, 4 660 souris sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes tuées à l'issue. Leur audition est mesurée environ toutes les deux semaines, chaque séance durant une heure, et une partie subit une chirurgie de deux heures sans réveil. L'équipe cherche à identifier les mécanismes de la perte auditive chez les patients porteurs de mutations d'un gène de l'inflammasome, symptôme qu'elle décrit comme le plus invalidant de la maladie. Le porteur affirme pourtant que ces mêmes atteintes auditives sont "largement compensées" chez la souris et n'entraînent pas de phénotype dommageable, et que les chirurgies terminales ne sont "pas susceptibles d'entraîner une douleur".

Objectifs

Les patients atteints de syndrome auto-inflammatoire rare appelé syndrome périodique associé à la cryopyrine (CAPS) présentent une inflammation chronique, une fièvre intermittente et des douleurs articulaires, ainsi que des caractéristiques très spécifiques comme une éruption type urticaire (> 95 % des patients) et des caractéristiques neuroinflammatoires telles qu'une perte auditive neurosensorielle (60 %). Les traitements actuels ciblant certaines molécules stabilisent la maladie ; cependant, dans la plupart des cas, ils ne font pas régresser la perte auditive, qui reste le symptôme le plus invalidant. Les mécanismes qui sous-tendent le phénotype de perte auditive chez les patients restent inconnus, ce qui empêche le développement de tests audiologiques et de traitements appropriés. Nous avons récemment découvert que certaines mutations pour un gène entraînaient une forme atypique de maladie avec perte auditive mais où la plupart des autres symptômes sont atténués. Notre projet a pour but i) d'identifier et de caractériser de manière approfondie chez la souris les événements responsables de la perte auditive progressive chez les individus porteurs de mutations de ce gène aux niveaux moléculaire, cellulaire et tissulaire, et ii) de décrire, aux niveaux moléculaire et cellulaire, le nouveau mécanisme physiopathologique qui sous-tend la perte auditive chez les patients porteurs de mutations. Le projet bénéficiera de modèles animaux spécifiques pour les formes classiques et atypiques de cette maladie.

Bénéfices attendus

En caractérisant les atteintes auditives dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : -Nous déterminerons les mécanismes physiopathologiques à l’origine des surdités dans les patients porteurs des mutations du gène étudiées. -Ce gène étant impliqué dans un complexe impliqué dans l’immunité innée, notre travail ouvrira la porte à l’identification d’autres protéines du complexe comme potentiellement impliquées dans la surdité -Un grand nombre de cas de surdités progressives reste souvent inexpliqué. En caractérisant très finement la signature audiologique des souris mutantes et avec un travail similaire qui est en cours chez les patients porteurs de mutations dans ce gène, notre travail aidera à identifier les cas de surdités non expliqués qui pourraient être liés à une mutation de ce gène. Enfin, notre travail générera des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir la surdité chez les patients porteurs de mutations de ce gène. L’existence de médicaments capables d’inhiber le complexe dont fait partie cette molécule rend cette perspective très concrète.

Procédures

Les interventions seront : - Une inflammation de l’oreille sera induite sur les modèles animaux de deux façons possibles : i) soit par une surexposition sonore de quelques heures soit ii) par l’injection d’une faible dose d’une substance dans l’abdomen sur trois jours par doses croissantes pour mimer une petite infection. - Nous effectuerons un suivi de l’audition de modèles de souris pour des atteintes auditives à la suite de l’activation de l’inflammation dépendant du gène étudié. Ce suivi aura lieu approximativement toutes les deux semaines afin de suivre l’évolution de la surdité induite par l’inflammation de l‘oreille. Chaque suivi dure environ 1h. - Une partie des animaux auront une chirurgie terminale de 2h pour faire des mesures fonctionnelles dans l’oreille.

Impact sur les animaux

La plupart des procédures impliquent des expérimentations légères ou une succession d’expérimentations légères. On ne s’attend donc pas à des nuisances majeures ou effets indésirables sur les animaux. Les modèles de souris que nous utilisons ont des modifications génétiques entraînant des surdités périphériques associées parfois à des atteintes auditives centrales. La souris reposant principalement sur l’olfaction, son système sensoriel et dans une moindre mesure sur son système visuel lors des interactions sociales, ces atteintes auditives sont largement compensées et n’entrainent pas de phénotype dommageable. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : -Certaines expositions sonores pourraient induire un stress temporaire sur l’animal. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. -En ce qui concerne les chirurgies, celles-ci sont terminales et donc ne sont pas susceptibles d’entraîner une douleur. -En ce qui concerne l’induction de la réaction inflammatoire, celle-ci sera limitée à l’oreille et pourrait causer une douleur légère et/ou un inconfort léger. - Les doses typiquement utilisées sont 4-5 fois inférieures à celles utilisées pour induire une réaction inflammatoire forte qui peut entraîner des pertes de poids importantes les deux premiers jours après injection puis une reprise de poids les jours suivants. Aux doses plus faibles, on s’attend à pas d’effet ou un effet mineur. De plus, une douleur légère au point d’injection de et une réduction de l’activité et de la mobilité peut survenir pendant quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations ex vivo. D’autres procédures impliquent des interventions qui signifient qu’on ne peut pas les réutiliser. La plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par d’autres équipes. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles lorsque c’est possible. Ces partages se font typiquement à l’échelle du centre de recherche au-delà de notre équipe.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soient des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux a été réalisée en tenant compte à la fois des contraintes techniques (coût, hébergement, temps, etc.) et de l’expertise développée dans l’équipe sur des expériences similaires. Pour les procédures qui en nécessitent, une analyse de puissance détaillée a été effectuée. Dans toutes les procédures, des cages standard de 5 animaux seront utilisées.

Raffinement

Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des enregistrement de données sous anesthésie, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Nous utilisons également des enrichissements de cage par défaut et renforcés après certaines procédures. En cas d’hypothermie, des couvertures chauffantes sur le fond de la cage sont également utilisées. En cas de déshydratation, des réhydratation sous-cutanées sont réalisées ainsi que la fourniture de gel hydrique.

Choix des espèces

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. Le projet impliquera des animaux de stades différents. Nous étudierons les conséquences de l’inflammation principalement à des âges adultes mais nous serons amenés à considérer de temps en temps des expériences de suivi chez la jeune souris afin de s’assurer (en cas de doute) qu’il n’y a par exemple pas d’inflammation spontanée avant son induction. L’étude utilisera des animaux âgés de 0 jour (naissance) à l’âge adulte (15 mois maximum).

648 souris de trois à quatre semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent jusqu'à quatre séances d'irradiation cérébrale sous anesthésie générale, puis jusqu'à trois séries de tests portant sur la motricité, la vision, l'anxiété et la mémoire épisodique, des séances d'IRM de deux heures sous anesthésie et jusqu'à dix administrations de molécules étalées sur douze mois. L'objet du travail est de mesurer le vieillissement accéléré des vaisseaux du cerveau après radiothérapie. Le porteur décrit des modèles de culture en trois dimensions déjà développés par son consortium, les juge "largement insuffisants" pour reproduire la cognition, et conclut que le passage par un organisme vivant est "indispensable".

Objectifs

Notre équipe étudie l’impact de la radiothérapie sur le vieillissement accéléré (ou sénescence) du cerveau, dans le contexte des cancers du cerveau chez l’adulte (glioblastome) mais également chez l’enfant (gliome, médulloblastome). Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant et la majorité de ces tumeurs surviennent avant l’âge de 10 ans. La combinaison de la chirurgie et d’une radiothérapie agressive a permis d’obtenir une survie à 5 ans de l’ordre de 50%. La surveillance à long terme des patients qui ont survécu plus de 5 ans sans récidive a montré qu’un tel traitement entraîne fréquemment de lourdes séquelles notamment cognitives. Des données de la littérature indiquent que la radiothérapie cérébrale induirait un vieillissement accéléré d’un certain type de cellules dans le cerveau, notamment celles impliquées dans sa vascularisation. Le rôle joué par ce vieillissement sur l’apparition des déficits cognitifs n’est pas connu. L’objectif de ce projet est donc d’étudier l’ampleur de ce vieillissement accéléré induit par une radiothérapie et son impact sur les troubles cognitifs. Notre étude sera réalisée dans 3 établissements utilisateurs différents sur des modèles animaux : de jeunes souris recevront une dose d’irradiation équivalente à celle d’un protocole de radiothérapie. Des tests comportementaux et des examens d’imagerie seront réalisés. Une étude en histologie du cerveau des animaux complétera le protocole. Toujours à l’aide d’un modèle murin, nous évaluerons la capacité de molécules pharmacologiques à limiter l’apparition des lésions cérébrales et des déficits cognitifs liés à la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif une meilleure connaissance du rôle du vieillissement accéléré (ou sénescence) sur les troubles cognitifs après radiothérapie. Les résultats obtenus seront exploités pour permettre de proposer de nouveaux traitements visant à protéger au mieux les fonctions cognitives. L’utilisation de notre modèle pour étudier et traiter les troubles cérébraux radio-induits doit permettre une rapide application aux jeunes patients souffrant des médulloblastomes traités par radiothérapie. À plus long terme, les connaissances qui découleront de notre étude devront également bénéficier à d’autres cancers du cerveau aussi bien chez l’adulte (glioblastome) que chez l’enfant (gliome).

Procédures

Le projet se déroule dans 3 établissements utilisateurs nommés EU1, EU2 et EU3. Les animaux recevront une dose d’irradiation équivalente à celle d’un protocole de radiothérapie utilisé en clinique dans l’EU2, sous anesthésie générale gazeuse, à raison de quatre séances maximum espacées de 24h (séance d’une durée de de 5 min maximum). Les tests comportementaux réalisés dans l’EU1 sur une partie des animaux se focaliseront sur les capacités motrice et visuelle, l’anxiété et la mémoire épisodique. Ils seront répétés 3 fois maximum sur 12 mois et entraîneront environ une quinzaine de jours d’expérimentation (au maximum, 3 à 4 tests par animal, avec une phase d’entraînement et des phases de récupération, chaque test durant moins de 30 minutes par jour). Une partie des animaux recevront un examen d'imagerie par résonance magnétique dans l’EU3, examen d’une durée maximale de 2 heures réalisé sous anesthésie générale. Une partie des animaux recevra un traitement pharmacologique visant à limiter les effets de la radiothérapie. Le traitement se fera dans l’EU1 en plusieurs prises, entre 2 et 10 selon la molécule testée, sur une période de 12 mois maximum. L’administration dure moins d’une minute). Enfin des prélèvements de fluides biologiques seront réalisés en fin d’expérimentation, sur animaux anesthésiés, dans les EU1 ou EU3.

Impact sur les animaux

L’irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l’animal mais peut engendrer un stress léger du fait de la contention pour l’anesthésie (placement dans la chambre d’induction). Cette nuisance liée à l’induction de l’anesthésie sera légère et de courte durée. De plus, l’irradiation et les protocoles d’imagerie étant réalisés sous anesthésie légère, les potentiels effets indésirables sont une hypothermie légère transitoire et un risque faible d’arrêt respiratoire. Les déplacements pourront provoquer un stress modéré et éventuellement l’apparition d’agressivité. Cet effet pourra perdurer jusqu’au retour au lieu d’hébergement initial. Cependant, ces changements d’environnement seront les plus courts possible et il n’y aura pas de modifications des groupes sociaux. Les différentes études de comportement seront précédées d’une phase d’habituation à l’expérimentateur et à l’environnement de travail afin de limiter au maximum l’apparition de stress pour les animaux. Les administrations de molécules pharmacologiques pourront provoquer un stress léger lors de la contention et des effets secondaires. Les injections, quant à elles, entraînent une douleur légère de courte durée. Cependant, ces administrations étant répétées lors des semaines de traitements, la douleur pourrait passer de légère à modérée lors des phases de traitement. Enfin, avant la mise à mort des animaux, les prélèvements biologiques (sang et/ou liquide céphalo-rachidien) seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie complète (l’injection pourra provoquer une douleur légère de courte durée).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d’étude afin de corréler nos résultats obtenus in vivo avec des analyses histopathologiques.

Remplacement

Notre consortium a développé de nombreux modèles de culture cellulaire afin de pouvoir étudier les effets de l’irradiation in vitro. Ces modèles 2D ont été récemment complétés par le développement de modèles 3D multicellulaires (bioprint, organes sur puces). Ces modèles 3D permettent de recréer des conditions tissulaires simplifiées et ainsi étudier les effets de l’irradiation pour trier certaines conditions expérimentales et molécules pharmacologiques. Cependant ces modèles in vitro sont encore préliminaires et sont largement insuffisants pour reproduire la complexité d’organisation du cerveau et étudier des processus aussi compliqués que la cognition. Ainsi, le passage par un organisme vivant complexe est indispensable.

Réduction

L’utilisation des modèles in vitro 2D et 3D permet d’optimiser le design expérimental de nos études in vivo, et ainsi de limiter l’utilisation des animaux à leur stricte nécessité. Des études préliminaires nous ont permis d’optimiser la mise en place de notre modèle. Nous avons ainsi pu réduire la gamme de certaines modalités d’irradiation (doses, fréquence) pour lesquelles un effet ne serait pas suffisamment détectable. Différentes études statistiques ont été menées et ont permis de déterminer un nombre réduit d’animaux pour chaque procédure : entre 10 et 16 animaux par lot selon la procédure. Enfin, nous procéderons à une analyse statistique après chaque expérience qui sera stoppée dès que la significativité sera atteinte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon des conditions d’hébergements réglementaires au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages de taille adaptée sur portoir ventilé (avec hygrométrie, température et cycle jour/nuit 12h/12h contrôlés). Les animaux auront de l’eau et de la nourriture à disposition à volonté et auront également à disposition dans leur environnement deux éléments d’enrichissement à minima : papier kraft pour la constitution du nid, tunnel en polycarbonate rouge et/ou une maison en cellulose pour l’abri. Les transports vers l’irradiateur ou l’IRM se feront par transporteur et véhicule agréés. Le confort et la sécurité des animaux seront garantis durant toute la durée du transport (aliment et eau à volonté, sans modifications des groupes sociaux, présence d'enrichissement). Une période d'acclimatation à l'arrivée sera observée pour garantir aux animaux une période de repos. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie générale. Afin de limiter l’hypothermie due à l’anesthésie, les animaux seront placés sur tapis chauffant jusqu’au réveil complet. Un suivi clinique approfondi des animaux sera fait dans les 24h suivant l’irradiation, puis deux fois par semaine, ce qui permettra d’évaluer sur le long terme l’apparition éventuelle de points cliniques limites. Une phase d’habituation (à l’environnement, l’expérimentateur et la préhension) sera réalisée dans les 15 jours précédant les tests cognitifs afin de limiter le stress. L’imagerie IRM est réalisée sous anesthésie, dans un berceau chauffé, avec contrôle de la respiration et de la température. Lors d’une acquisition IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Les prélèvements de fin d’expérimentation ainsi que les mises à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie complète.

Choix des espèces

Le modèle retenu pour nos études est la souris car c’est une espèce couramment utilisée en neurosciences, qui présente l’avantage d’avoir une organisation des structures cérébrales relativement proche de celle de l’homme et un comportement très bien documenté dans la littérature. Ce modèle est très répandu en études pré-cliniques en cancérologie, et l'ensemble des études préliminaires du consortium (notamment de mise au point en histologie) ont été réalisées chez la souris. De plus, nous disposons de l'ensemble des équipements adaptés à cet espèce pour nos études : irradiateur, imageur IRM et enceintes pour études cognitives. . Les études seront menées sur animaux juvéniles, c’est-à-dire des animaux de 3 à 4 semaines au moment de l’irradiation. Ce stade est privilégié pour reproduire le cadre clinique des traitements du médulloblastome qui intervient durant le développement cérébral chez l’enfant âgé de 10 à 14 ans environ.

Injections intrapéritonéales et sous-cutanées à deux, quatre, six et neuf jours de vie, souriceaux sortis du nid et frottés à la sciure maternelle avant d'y être replacés sous lampe chauffante, puis prélèvements échelonnés de J9 à J60 : 2 400 souris vont être utilisées, dont 2 304 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit un virus neurotrope qui déclenche une infection du système nerveux central, les animaux étant tués avant qu'elle ne devienne systémique. Le projet porte sur des canaux osseux du crâne par lesquels des cellules immunitaires rejoignent les méninges, et sur les conséquences d'une modulation de leur taille et de leur nombre. Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure pour prélever les tissus du crâne, des méninges et du cerveau, dont l'organisation entre eux est l'objet même de l'étude.

Objectifs

Les méninges, situées entre le cerveau et le crâne, constituent une plateforme de recrutement pour les cellules immunitaires et protègent le cerveau des infections. Notamment, après une infection par un virus neurotrope, nous avons observé que des cellules immunitaires se regroupent dans les méninges, sous les canaux osseux reliant le crâne à la moelle osseuse. Ceci suggère que des cellules de la moelle osseuse voyagent à travers ces canaux osseux vers les méninges pendant l'infection. Récemment décrits, ces canaux osseux sont depuis intensément étudiés, et il a été rapporté qu'ils sont cruciaux pour la communication entre le cerveau et la moelle du crâne que ce soit dans une situation physiologique mais aussi lors d'une inflammation comme lors d’un accident vasculaire cérébral, un cancer, ou une infection et qu’ils sont utilisés par certaines cellules immunitaires pour migrer de la moelle du crâne vers le cerveau. Il a notamment été décrit qu’augmenter cette migration immunitaire était protectrice dans le cas d’un cancer de type glioblastome, une tumeur primitive du cerveau la plus fréquente et la plus agressive. Les objectifs de ce projet sont 1/ d’étudier le développement de ces canaux osseux, 2/ de moduler leur formation, et 3/ d’évaluer les conséquences d’une modulation de ces canaux (en taille et/ou en nombre) sur la protection immunitaire du cerveau en cas d’infection. Ce travail vise donc à explorer les interactions entre le cerveau, les méninges et le crâne, ainsi que la migration des cellules immunitaires entre ces trois compartiments.

Bénéfices attendus

Cette étude apportera une compréhension approfondie des canaux osseux du crâne, de leur rôle dans la protection immunitaire du système nerveux central (SNC) et dans le développement de pathologies inflammatoires ou post infection. Elle examinera le rôle des ostéoblastes (cellules sécrétant la matrice osseuse) dans la structuration des canaux osseux, révélant ainsi des mécanismes fondamentaux de la formation osseuse en lien avec les méninges. D’autre part, elle permettra d’identifier comment certaines cellules influencent la formation de ces canaux osseux durant la période périnatale. Nous étudierons également si la modulation des canaux osseux en taille et/ou en nombre impacte l’infiltration immunitaire vers le cerveau, en cas d’infection virale. Ces résultats pourraient avoir des implications majeures sur la connaissance du système immunitaire des méninges, et la protection du SNC. En définitive, ce travail ouvrira la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter les pathologies inflammatoires du SNC, notamment les méningites.

Procédures

Injections intrapéritonéales (15s), 2 par souriceau + 1 au stade de développement souriceau ou souris Injections sous cutanées (15s), 1 à 4 par souriceau

Impact sur les animaux

Stress et douleur modérés pour les injections intrapéritonéales et sous cutanées. Les molécules injectées sont non toxiques pour les volumes et les doses utilisées. Le virus injecté déclenche une infection du système nerveux central de bas grade et les souris seront mises à mort à des temps ne permettant pas le développement d’une infection systémique. Les souriceaux seront manipulés et donc sortis du nid, manipulation pouvant entrainer une hypothermie.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les tissus pour analyse.

Remplacement

L’objectif de ce travail est de comprendre les interactions entre le cerveau, les méninges et le crâne ; et la migration de cellules immunitaires entre ces 3 compartiments dans différents contextes. Du fait de la complexité anatomique de notre objet d’étude, et du fait qu’il soit à l’interface entre plusieurs tissus (méninges, os, cerveau), il n’est pas possible de se passer d’un animal modèle, et les études in vitro et in silico, bien qu’intéressantes, ne suffiront pas à comprendre le système dans son ensemble. L’organisation physique des tissus entre eux est cruciale et ne peut pas être modélisée in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé à l’aide d’un outil informatique et les effectifs réduits au minimum tout en permettant d’obtenir un effet statistique significatif.

Raffinement

S’agissant d’études réalisées en partie sur des souriceaux, des précautions supplémentaires seront prises pour leur manipulation : avant manipulation l’utilisateur se frottera les mains avec la sciure en provenance de la cage de la mère, ce qui limitera les dépôts d’odeur et favorisera la réintégration au sein du nid. Les souriceaux seront réchauffés grâce à une lampe à infra-rouge, avant d’être replacés. Les souriceaux et les souris seront suivis régulièrement et des points limites adaptés et précoces permettront en cas de souffrance avérée de prendre des mesures adéquates en concertation avec notre vétérinaire référent ou notre structure SBEA (analgésie, surveillance renforcée).

Choix des espèces

De nombreux modèles physiopathologiques étant partagés entre l’Homme et la souris, nous utiliserons des souches de souris consanguines ainsi que des lignées génétiquement modifiées. Le vaste développement de modèles transgéniques rapporteurs permettant de visualiser certains types cellulaires nous donnera la possibilité de tester plus rapidement et plus efficacement nos hypothèses. En effet, la disponibilité de ces modèles rapporteurs uniques permet pour la première fois la visualisation de l’organisation complexe entre le crâne, les méninges et le cerveau ; et des communications entre ces systèmes. Ce n'est qu'en utilisant ces lignées de souris transgéniques que nous pouvons clairement distinguer les différents compartiments du système nerveux central et ses interactions avec le crâne. Étant donné cette organisation anatomiquement complexe, le modèle murin reste indispensable pour effectuer cette étude. Les animaux des 2 sexes seront utilisés pour ne pas avoir de biais dans les résultats. Nos études commencent tôt après la naissance à des moments où nous pouvons agir sur la maturation ou l’ossification du crâne en développement ( J2-J4-J6-J9). Les prélèvements seront réalisés à différents temps selon les procédures (J9, J11, J13, J15, J17, J30, J60) afin d’obtenir une cinétique des effets de nos traitements à court terme sur des souriceaux ou à plus long terme sur des souris adultes.