Système nerveux
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Ciblage des Glioblastomes par transfert adoptif de lymphocytes T Vγ9Vδ2 exprimant OAcGD2-CAR
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Deux passages d'IRM par semaine sous anesthésie générale, pendant jusqu'à quatre-vingts jours, attendent chacune des 404 souris du projet. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tuées pour récupérer leur cerveau. Après l'implantation d'un glioblastome humain dans le cerveau, 192 reçoivent une irradiation cérébrale de 15 Gy en une séance et 288 une injection intracrânienne de lymphocytes T modifiés, le porteur attendant une perte de poids, de motricité et de sensibilité. Les souris NSG sont choisies pour leur absence d'immunité, qui permet la greffe de cellules humaines et évite les réactions contre le traitement, et le porteur ajoute que le laboratoire partenaire maîtrise déjà ce modèle.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne dont l’hétérogénéité et l’agressivité limitent l’efficacité du traitement. Parmis les nouveaux enjeux thérapeutiques, l’immunothérapie constitue une piste intéressante. A ce jour, la meilleure approche d’immunothérapie réside dans le transfert cellulaire adoptif, basé sur l’administration d’effecteurs cellulaires immunitaires spécifiques aux antigènes tumoraux afin de stimuler et promouvoir la prolifération, l’expansion et le maintien des fonctions effectrices immunitaires anti-tumorales. L’utilisation de cette technique avec des cellules T modifiées par des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) représente une piste thérapeutique pertinente contre les GBM. Ce projet a ainsi pour but d’évaluer l’efficacité préclinique d’un transfert adoptif de lymphocytes T Vγ9Vδ2-CAR (LTgd) expriment un CAR dirigé contre la forme acétylée du disialoganglioside GD2 (CAR-OAcGD2), cible prometteuse pour la thérapie par cellules CAR T contre les GBM. Le protocole d’injection du traitement par CAR-LT (ou solution saline) correspond à une injection intracrânienne intratumorale à un débit de 0.6µL/min. Cette procédure d’administration fait suite à une précédente saisine.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles pour les tumeurs cérébrales (GBM).
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - chirurgie : implantation de tumeurs cérébrales sous anesthésie générale, 20 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 404 animaux sont concernés. - imagerie IRM : pour suivie de la croissance tumorale : sous anesthésie générale, 10 minutes par animal maximum, réalisée deux fois par semaine jusqu’à 80 jours. 404 animaux sont concernés. - radiothérapie : irradiation cérébrale (15 Gy en une fraction) sous anesthésie générale, 15 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 192 animaux sont concernés. - injection intracrânienne du traitement sous anesthésie générale, 30 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 288 animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
L’établissement du modèle de tumeur cérébrale est permis grâce à une procédure chirurgicale sévère qui peut induire des douleurs. Les animaux recevront une prise en charge analgésique pré- et post-opératoire et seront surveillés jusqu'à leur réveil, puis replacés dans leur cage et remis à l'animalerie. Les animaux seront surveillés quotidiennement. D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à observer une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les aniamux ayant développé un GBM, suite à l'injection (procédure sévère). Les séquences d’imagerie par IRM (procédure légère) n’induisent pas de douleur, de perte de poids ou de perturbation du comportement, mais elles peuvent induire un autre point limite qui est défini pendant l’acquisition IRM : c’est la diminution de la fréquence respiratoire en deçà de 30 respirations par minutes. S’il est atteint et que la diminution du pourcentage d’isoflurane ne suffit pas à augmenter la fréquence respiratoire, la procédure sera arrêtée. A chaque sortie des animaux de la zone EOPS, lors des séquences d'imagerie par IRM, un risque d'infection ou de contamination par les autres animaux n'ayant pas de phénotype dommageable existe. D'après l'expérience du laboratoire, la radiothérapie cérébrale (procédure légère) induit une perte de poids transitoire chez les animaux.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort dans le but de récupérer le cerveau pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les tumeurs de type GBM sont connues pour être multi-compartimentales, hétérogènes et caractérisées par une immunosuppression forte. Au-delà du compartiment tumoral, d’autres composantes jouent un rôle essentiel dans la réponse au traitement, telles que la vascularisation, l’hypoxie et l’immunité. Leurs interactions réciproques avec les cellules tumorales influencent la réponse au traitement et la survie des patients. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de GBM afin de déterminer le comportement des cellules de ces lignées de GBM. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation de méthodes d’imagerie non-invasives se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasie de plusieurs animaux à chaque temps. Chaque animal constitue dans ce cas son prorpre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Pour pouvoir obtenir des analyses statistiques robustes, ces simulations ont été faites à l’aide d'un l’outil statistique en ligne et selon des données préliminaires acquises dans l’unité, pour lesquelles la survie du modèle murin de glioblastome du 1er groupe (tumeur) est de 28 jours et celle du 2ème groupe (tumeur + radiothérapie) est de 10 jours. Les paramètre saisis sur BiostaTGV sont les suivants : valeur de variabilité = 14 (écart type commun σ), risque de première espèce α = 0.05, puissance 1-β = 0.8, avec un test de nature bilatéral. Un nombre de 12 animaux par sous-groupe de traitement est donc nécessaire afin d'obtenir une différence significative avec une valeur statistique de 5 % pour un effet de 80 % du traitement. Ce nombre d’animaux est considéré comme maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude. Nous justifions également le nombre d’animaux par sous-groupe d’après l’expérience du laboratoire et la DAP issue du laboratoire collaborateur au projet.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de quatre individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéfécieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, craft). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. La mesure du poids sera faite trois fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de leur cage ainsi que de complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter et compenser la perte de poids attendue suite aux procédures expérimentales. Les différences procédures ont été pensées de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés ainsi que par le choix de points limites cohérents. A chaque sortie des aniamux de la zone EOPS, une désinfection au phagospray est réalisée sur chaque matériel utilisé avant chaque expérimentation et pour chaque procédure.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la tumeur tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral dont les interactions avec les cellules tumorales peuvent biaiser l’effet thérapeutique du traitement. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe. Nous utiliserons donc des souris immunodéprimées NSG. Notre traitement étant constitué de CAR-T, l’absence d’immunité de ces souris évitera les réactions croisées et dirigées contre les CAR-T. Ce modèle permettra donc la croissance de cellules tumorales humaines et la survie des cellules immunitaires humaines, permettant ainsi d’étudier l’effet du traitement sur un modèle de tumeur cérébrale reposant sur l’implantation de cellules de glioblastome d’origine humaine et reflétant l’hétérogénéité moléculaire des GBM observée en clinique. Le choix de la souris NSG est idéal car ce modèle étant déjà maîtrisé dans le laboratoire partenaire, il permettra d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. Nous utiliserons des souris mâles et femelles, en lien avec les recommandations actuelles pour mieux représenter la réalité clinique car, si le sexe ratio du GBM est de 1.6 (en faveur des hommes), il touche aussi bien des femmes que des hommes. L’ensemble des animaux utiliés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, le cerveau est mature et cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. Il sera possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps plus longs.
Implications des circuits du BNST dans le comportement d’anxiété en situation physiologique et pathologique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Un animal encore en souffrance trois jours après son opération est tué, le porteur prévoyant de renouveler l'antalgique à vingt-quatre heures puis d'attendre. 1 560 souris vont être utilisées sur cinq ans, dont 1 152 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses histologiques. Elles subissent des injections de virus dans le cerveau, la pose d'implants crâniens pendant une à deux heures, des enregistrements électriques allant jusqu'à huit heures sous anesthésie ou tête maintenue immobile, ainsi que des protocoles de stress par contention et d'isolement après le sevrage. L'objet est de cartographier les circuits cérébraux de l'anxiété, y compris chez des souris modifiées pour reproduire un stade précoce de la maladie de Parkinson, et le porteur écrit que tous les animaux produits par ces lignées seront utilisés.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans la thématique d’une caractérisation des circuits neuronaux à l’origine de l’anxiété. Les troubles de l’anxiété représentent un enjeu de société majeur. Aujourd’hui encore, le diagnostic des troubles de l’anxiété reste compliqué à poser notamment quand ces troubles sont associés à différentes comorbidités telles que la maladie de Parkinson rendant le diagnostic et la prise en charge des symptômes encore plus complexe Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l’anxiété et potentiellement développer des stratégies pour diminuer les troubles de l’anxiété. Une de ces stratégies est de définir dans quelles circonstances les structures impliquées dans le contrôle de l’anxiété s’activent. Notre projet sera conduit chez des souris afin de manipuler sélectivement différentes populations neuronales. De plus, le facteur « sexe » sera partie intégrante de notre projet puisqu’un dimorphisme sexuel au niveau de certaines zones du cerveau chez l’homme et le rongeur ont pu être observé. Notre projet s’articulera autour de quatre objectifs pour étudier le fonctionnement et le rôle des différentes régions du cerveau dans le contrôle de l’anxiété et des comportements moteurs en situation physiologique et pathologique.
Bénéfices attendus
Ce projet sera une caractérisation unique de structures clefs du cerveau dans le contrôle de l’anxiété en condition physiologique et pathologique. Nous pourrons ainsi déterminer si l’altération de ces zones cérébrales pourrait être à l’origine de troubles anxieux notamment observés dans la maladie de Parkinson. A long terme, ce projet pourrait aider à améliorer le diagnostic des troubles anxieux et favoriser l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de réduire les symptômes anxieux des patients et en particulier ceux atteints de la maladie de Parkinson.
Procédures
Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30min et 1H, - procédure chirurgicale avec implantation : entre 1H et 2H, Electrophysiologie in vivo sur animal anesthésié entre 4h et 8h, Electrophysiologie in vivo sur tête restreinte: 30 min de chirurgie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire , 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants , 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte 4/ un stress induit par notre protocole de stress par contention ou d’isolement social. Les expérimentateurs ont une solide expérience dans l'exécution des procédures décrite. L'effet indésirable attendu sur les animaux transgéniques restent néanmoins modéré sur cette lignée transgénique mimant les stades précoces de la maladie de Parkinson avec une présence de constipation et une baisse de coordination motrice à partir de 18 mois. Pour notre projet, nous étudierons cette lignée a différents âges (étude longitudinale jusqu’à 18 mois).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour des prélèvements pour des études histologiques
Remplacement
Le but du projet est de connaître la fonction de différentes sous-population neuronale du noyau du lit de la Strie terminale (BNST) et du reste de son circuit dans le contrôle de l’anxiété. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections stéréotaxiques, afin de faire exprimer des protéines capables d’activer ou d’inhiber l’activité neuronale combinées avec des d'enregistrements électrophysiologiques ou optique ex vivo sur tranches de cerveau, ou in vivo sur souris anesthésiée ou en tête restreinte et in vivo chez l’animal se comportant et nécessite donc le recours à l’animal. Aucun modèle "in vitro" ne peut reproduire la connectivité complexe des circuits du BNST.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 1560 animaux sur cinq ans. Nous travaillons sur des souris males et femelles issues des lignées transgéniques ainsi tous les animaux produits seront utilisés.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs procédures de raffinement, à savoir: 1/ choisir un modèle rongeur de la maladie de Parkinson à un stade précoce n’induisant pas de fort phénotype moteur nous permettant ainsi d’étudier le fonctionnement des circuits de l’anxiété 2/ l'utilisation d'animaux hébergés majoritairement dans la même structure ce qui ne nécessite aucun transport et donc limite le stress des animaux 3/ une manipulation des animaux par l'expérimentateur afin là aussi de limiter le stress 4/ l'établissement de points limites 5/ La mise en place de soins adéquats si nécessaire pendant et après l’opération et l'utilisation de l’anesthésie/analgésie lors de chaque protocole invasif. A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux transgéniques naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures chirurgicales. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Un analgésique sera administré afin de gérer la douleur péri-opératoire. Au cas où l’animal serait encore en souffrance 24 heures après l’injection d’antalgique postopératoire, une nouvelle injection aux mêmes doses et voie d’administration sera réalisée. Si la souffrance persiste au-delà de 3 jours, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. En effet, c'est un mammifère présentant une proximité phylogénique avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment le comportement d’anxiété, les interactions sociales et la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologie neurologique telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris avec des surexpressions de la protéine alpha synucléine. Ce modèle possède aussi l'avantage de permettre des approches invasives (approches pharmacologiques, optogénétiques, pharmacogénétiques, électrophysiologiques et imagerie cellulaire) permettant d'étudier l'action de molécules ou d'une population neuronale sur le fonctionnement des circuits neuronaux de l’anxiété et les phénomènes synaptiques associés. Enfin, c'est chez cette espèce que sont faites des modifications génétiques permettant de cibler des populations neuronales précises que nous souhaitons étudier. Pour ce projet les chirurgies stéréotaxiques auront lieu sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge où l’animal sera plus à même de récupérer après les protocoles de chirurgie. Leur poids et leur taille sont stabilisés, la taille du cerveau homogène assurant une bonne reproductibilité des sites d’injection. Les enregistrements électrophysiologiques, les manipulations chémo/optogénétiques et l'imagerie calcique seront réalisés entre 15 et 49 jours après la dernière chirurgie. Pour les expériences d’interactions sociales, nous utiliserons des souris jeunes comme stimulus social entre P28- P35. Pour le protocole de stress, nous réaliserons un protocole de stress développemental que nous détaillerons ci-après où les souris expérimentales seront isolées après leur sevrage à P21 puis les souris seront utilisées à l'âge adulte (12 semaines) Pour l’étude longitudinale du phénotype anxieux chez les souris, nous utiliserons des souris âgées de 6 mois, 12 mois et 18 mois. Pour les expériences de comportement, d'enregistrement électrophysiologique et calcique, les souris seront adultes, au moins 11 semaines.
Développement d’un modèle complet de la maladie de Parkinson chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rendues parkinsoniennes par une injection intraveineuse censée détruire environ la moitié de certaines populations de neurones, 252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse du cerveau et d'organes périphériques. Le niveau de souffrance déclaré est léger pour 126 d'entre elles et modéré pour les 126 autres. Deux mois après l'induction, elles enchaînent sur trois jours des tests comportementaux dont la durée va de trois minutes à une heure, sans que le résumé indique lesquels. Parmi les bénéfices avancés, le porteur met en avant que sa méthode, une simple injection intraveineuse au lieu d'une chirurgie stéréotaxique, rendra ce modèle de la maladie de Parkinson "accessible à une plus grande communauté de chercheurs".
Objectifs
La maladie de Parkinson est, après la maladie d’Alzheimer, la pathologie neurodégénérative la plus répandue. Elle touche actuellement environ 300.000 personnes en France et représente par conséquent un véritable enjeu de santé publique. Comme pour toutes les maladies, les modèles animaux représentent un outil essentiel pour répondre aux limites des modèles informatiques et cellulaires. Ils permettent notamment d’élucider de manière plus intégrée des mécanismes pathologiques et de tester l’efficacité de médicaments candidats. La majorité des modèles animaux présentent des avantages et des inconvénients. Il est donc essentiel de poursuivre leur optimisation. Dans le contexte de la maladie de Parkinson, les modèles de souris induits par expression d’une protéine impliquée dans le développement de la maladie de Parkinson, sont considérés comme les plus pertinents. Les souris transgéniques surexprimant cette protéine dès les stades embryonnaires présentent une pathologie tissulaire large mais peu de troubles comportementaux. Il faut donc poursuivre le développement de nouveaux modèles mimant le plus possible la pathologie humaine. Pour reproduire assez fidèlement la maladie de Parkinson chez le rongeur, les caractéristiques recherchés sont : une pathologie dans une large partie du système nerveux et des organes périphériques, une neurodégénérescence bilatérale et l’apparition progressive de symptômes moteurs et non-moteurs (olfactifs, digestifs,…). L’objectif de cette étude est de tirer avantage de nouveaux outils moléculaires (vecteurs viraux) pour développer un modèle murin de la maladie de Parkinson qui concilie de nombreux avantages des modèles précédents. En particulier, nous souhaitons générer un modèle pertinent, complet et plus accessible à la communauté scientifique.
Bénéfices attendus
Comme pour les autres maladies, les modèles animaux de la maladie de Parkinson sont des outils essentiels pour mieux comprendre les mécanismes pathologiques et développer des thérapies. Par le développement de ce nouveau modèle, nous espérons identifier de nouveaux mécanismes responsables de la pathologie aussi bien à l’échelle cellulaire qu’au niveau de la communication inter-organes. En effet, notre approche permettra l’apparition de signes pathologiques non seulement dans le système nerveux mais aussi dans des organes périphériques tels que l’intestin et le cœur comme ce qui est observé chez les patients parkinsoniens. Tous ces traits permettront une modélisation plus fidèle de cette maladie chez l’animal. Enfin, de nombreux chercheurs n’ont actuellement pas accès à des modèles animaux de la maladie de Parkinson, souvent car les chirurgies stéréotaxiques nécessitent beaucoup d’expertise et de matériel. Notre méthode de modélisation, obtenue par une simple injection intra-veineuse, permettra de rendre ce modèle accessible à une plus grande communauté de chercheurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale qui consiste en l’induction du modèle. Cette procédure dure environ 5 minutes entre l’induction de l’anesthésie et le réveil de l’animal. Deux et mois après cette procédure, les animaux réaliserons des test de comportements répartis sur 3 jours. Chacun de ces tests peut durer entre 3 minutes et environ une heure.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : 1- L’injection intra-veineuse qui peut induire un stress léger; 2- L’induction du modèle qui peut induire une dégénérescence d’environ 50% de certaines populations neuronales et l’apparition de légers troubles moteurs et non-moteurs; 3- Les test comportementaux qui peuvent induire des stresses légers, y compris lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour l’analyse du cerveaux et d’autres tissus périphériques
Remplacement
Ce projet a pour but de mesurer des marqueurs de la maladie, notamment comportementaux, au cours du développement de la maladie de Parkinson. De ce fait, il est impossible de reproduire la complexité d’un organisme vivant et de remplacer notre approche in vivo par un modèle cellulaire ou une simulation informatique.
Réduction
La détermination du nombre d’animaux est basée a priori sur nos études antérieures et celle d’autres équipes démontrant des résultats statistiquement significatifs avec une taille d’échantillon de 20 animaux par condition. Ce nombre pourra être corrigé après obtention des résultats des expériences pilotes qui nous fourniront une estimation de la taille de l’effet du traitement. Celle-ci nous permettra de calculer le nombre minimal théorique d’animaux nécessaires pour détecter une différence statistiquement significative (p
Raffinement
Suite à leur arrivée dans l'animalerie, les animaux auront une semaine d'acclimatation. Le projet implique ensuite la mise en place d'un état pathologique chez le rongeur avec une approche lésionnelle de classe modérée. L'injection du vecteur virale sera réalisé sous anesthésie et anti-douleur. La mise au point de ce modèle a l’avantage de ne pas nécessiter de chirurgie. Cette approche est donc moins invasive et impactante pour l’animal. Les tests comportementaux ont été répartis sur plusieurs jours et les animaux seront acclimatés à la salle avant de réaliser les tests. La mise à mort des animaux sera réalisée selon un protocole d'anesthésie et de double analgésie adaptée. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau de la structure de la barrière hémato-encéphalique et des réseaux neuronaux impliqués dans la maladie de Parkinson. Le modèle sera induit chez des animaux jeunes adultes (10 semaines). À ce stade, les systèmes cérébraux sont matures et stables et le resteront tout au long des procédures expérimentales proposées.
MODIFICATION_Validation d’un dispositif médical clinique libérant un traitement neuroprotecteur chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à 39 prélèvements sanguins par animal à raison d'un par semaine pendant quatre mois, ou huit heures d'anesthésie continue ponctuées de 21 prises de sang et six mesures dans le muscle, 60 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue. 28 d'entre eux sont opérés puis maintenus sous anesthésie et tués sans réveil, les 32 autres relevant de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent sous la peau un implant censé libérer en continu une molécule protectrice des neurones, dispositif que le porteur veut valider avant un essai chez des personnes atteintes de la maladie de Parkinson. Le lapin a été retenu pour sa taille, seule compatible selon lui avec ce prototype clinique, plus gros que celui déjà testé sur des rats.
Objectifs
Ce projet a pour but d'étudier les effets d’un dispositif ayant des propriétés protectrices contre la mort des neurones impliqués dans des maladies comme la maladie de parkinson. Avant de pouvoir tester ce dispositif chez des patients atteints de la maladie de parkinson, une validation chez un modèle animal de plus grande taille que le rongeur est nécessaire. Le lapin est le modèle animal le plus adapté pour cette phase de validation. Ce projet a comme objectifs de : (1) vérifier la faisabilité de l’implantation du dispositif, (2) vérifier la production de la molécule thérapeutique libérée en continu (3) évaluer le bon fonctionnement du dispositif sur le court et long terme. Pour atteindre ces objectifs, le projet nécessite une modification (rajout d'une mesure de la molécule thérapeutique dans le cerveau) sans changement du nombre d'animaux. Ces objectifs permettront d’avancer le projet vers un essai clinique chez les patients parkinsoniens.
Bénéfices attendus
Ce projet aura pour bénéfice d’apporter les dernières preuves de sécurité d'un dispositif implantable sous la peau avec un effet protecteur des neurones. Ce dispositif représente une opportunité unique de ralentir, voire d’arrêter, la progression de la maladie dès ses premiers stades. Valider son fonctionnement sur le modèle lapin, plus grand que les rongeurs, est une étape essentielle avant les essais cliniques. L’objectif est d’apporter une solution thérapeutique innovante, capable d’améliorer durablement la qualité de vie des patients et de ralentir l’évolution des patients vers des stades de plus en plus handicapants.
Procédures
1) Tous les animaux subiront une chirurgie d’implantation du dispositif sous la peau (environ 30-45 minutes, incluant l'anesthésie). 2) La moitié des animaux restera sous anesthésie pendant 8 heures au maximum après l'implantation. Ils subiront des prélèvements sanguins et des mesures dans le muscle qui seront répétés à différentes temps de l'expérience (1 minute par prélèvement, 21 prélèvements sanguins , 6 mesures dans le muscle). MODIFICATION: 2 mesures dans le cerveau seront effectuées sous anesthésie générale et analgésie générale et locale. 3) L’autre moitié des animaux sera surveillée pendant 4 mois au maximum après l’implantation du dispositif. Ils subiront des prélèvements sanguins en vigile ou sous anesthésie (1 minute par prélèvement, une fois par semaine, 39 prélèvements au maximum).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables suivants peuvent être observés. Implantation du dispositif sous la peau : elle peut induire une douleur locale sous la peau et une légère perte de poids en période post-chirurgicale. Une inflammation locale au niveau de la peau peut parfois survenir suite à un rejet du dispositif par le corps. Très rarement, une infection de la peau ou des problèmes de cicatrisation peuvent se manifester. Prélèvements sanguins : ils peuvent induire une légère chute de tension et un stress de courte durée dû à la manipulation ainsi qu'une légère douleur locale.
Devenir
Une partie des animaux sera mise à mort afin de prélever les cerveaux et organes pour analyses ou à la fin de l'expérience planifiée. Le reste des animaux sont mis à mort pour les expériences sans réveil de prélèvements de sang. Les prélèvements finals (sang, organes) ne permettent pas que les animaux soient gardés en vie.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent d'évaluer l'impact du dispositif sur l'organisme entier. Il est nécessaire d’effectuer des études dans des animaux afin d'assurer le bon fonctionnement du dispositif dans un organisme entier avant l’implantation chez l’homme. Les dispositifs sont d’abord testés in vitro avant d’être utilisés dans des animaux. Les premières mises au point ont déjà été effectuées dans des rongeurs mais la réglementation impose des tests du dispositif clinique dans une espèce animale plus grande avant qu’il puisse être utilisé dans des patients humains.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Si les résultats sont suffisants pour mettre en évidence un bon fonctionnement du dispositif, il ne sera pas nécessaire de tester la totalité des animaux. Aucun groupe contrôle supplémentaire n’est requis pour cette phase car chaque animal est son propre contrôle grâce aux mesures effectuées avant l'implantation du dispositif. Les animaux seront utilisés pour effectuer différentes analyses biologiques afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire pour chaque analyse.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation est prévue à l’arrivée des lapins avant l’expérience. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Le projet implique une chirurgie pour implanter le dispositif sous la peau qui sera effectuée sous anesthésie générale et analgésie préopératoire. Afin de prévenir toute douleur post-opératoire, une injection d’un anesthésique local sera effectuée avant incision ainsi qu’une injection d'un anti-douleur toutes les 12 à 24 heures. Suite à la chirurgie, les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Pour les prélèvements sanguins, la zone de prélèvement sera alternée entre chaque prélèvement. Des solutions salines seront injectées fréquemment pour éviter une déshydratation. Les animaux auront accès à une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Afin de réduire le plus possible toute douleur ou détresse que les animaux pourraient ressentir, ils seront observés au moins une fois par jour par le personnel compétent impliqué dans la réalisation des procédures expérimentales et/ou dans le soin des animaux. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir les points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal.
Choix des espèces
Le lapin a été choisi pour cette étude en raison de sa taille, permettant l’implantation du prototype clinique du dispositif en cours d’évaluation. Ce modèle est particulièrement adapté à l’évaluation du dispositif dans des conditions physiologiques proches de l’humain. Ce modèle permet d’obtenir des résultats pertinents tout en respectant les exigences éthiques et réglementaires relatives au bien-être animal. Nous utiliserons des lapins et lapines à l’âge de 11 semaines quand la moyenne de poids aura atteinte environ 2.5kg. En effet, nous devons respecter un poids minimum qui permettra d’implanter le dispositif clinique ayant une taille plus importante que celui utilisé en pré-clinique chez le rat. Il s’agit donc d’animaux ayant un stade de développement avancé.
Système histaminergique et compensation vestibulaire dans un modèle de vestibulopathie chez le rat MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tués à la fin des procédures pour que leur cerveau et leur sang soient analysés, 252 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une solution chimique détruisant les récepteurs de l'équilibre est injectée à travers le tympan d'une oreille, geste de 72 minutes par animal qui provoque vertiges, pertes d'équilibre, chutes, perte de poids et anxiété. Un médicament anti-vertigineux ou un placebo leur est ensuite administré chaque jour pendant trois, sept ou dix jours, avec tests comportementaux. Le porteur explique avoir quitté le modèle félin pour le rat parce que le syndrome vestibulaire y dure deux à trois semaines contre 90 jours chez l'humain, "gain temporel avantageux" pour tester des composés.
Objectifs
Ce projet porte sur le système vestibulaire, responsable de l’équilibre postural et locomoteur, ainsi que de la stabilisation du regard lors de mouvements de la tête. L’information perçue par les récepteurs vestibulaires localisés dans l’oreille interne est transmise via le nerf vestibulaire aux noyaux vestibulaires (situés dans le tronc cérébral). Un dysfonctionnement de ce système peut causer des symptômes tels que des vertiges, des déséquilibres, des chutes ou encore de l’anxiété, qui affectent la vie quotidienne des patients. La thérapie vestibulaire implique une rééducation vestibulaire et un traitement médicamenteux. Toutefois, le manque d’efficacité des médicaments utilisés ou encore la méconnaissance de leurs sites et mécanismes d’action représentent un obstacle de taille. Un médicament couramment utilisé en France dans la pathologie du vertige est la bétahistine. Certains de ses mécanismes d’action sont connus dans le modèle animal de lésion chirurgicale du nerf vestibulaire. Toutefois, ce modèle est comparable, en clinique, à une ablation curative du nerf vestibulaire, pratiquée uniquement dans le cas de schwannomes (tumeurs bénignes du nerf vestibulaire). Les effets et mécanismes d’action de ce médicament ne sont pas connus dans un modèle animal de lésion vestibulaire mimant des pathologies telles que la névrite ou la maladie de Ménière, qui sont plus couramment observées en clinique. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de la bétahistine sur un modèle de lésion vestibulaire induisant une inflammation telle qu’observée dans la névrite en clinique. Nous savons que la bétahistine augmente la concentration d’histamine, un neurotransmetteur qui module l’inflammation, dans le cerveau. De plus, des cellules intervenant dans l’inflammation sont importantes pour la récupération des fonctions vestibulaires. Ainsi, nous supposons que ce traitement va favoriser des mécanismes essentiels à la compensation vestibulaire via des récepteurs à l’histamine dans ce modèle. Enfin, nous supposons que la bétahistine aura un effet anxiolytique dans notre modèle car elle module un neurotransmetteur intervenant dans l’anxiété (sérotonine). Des tests comportementaux, l’utilisation de molécules chimiques bloquants des récepteurs à l’histamine (antagonistes), ainsi que des analyses sur les tissus des animaux nous permettront de réaliser ce projet.
Bénéfices attendus
Les désordres vestibulaires touchent un tiers des adultes de plus de quarante ans aux Etats-Unis. En France, les vertiges constituent un des motifs prépondérants de consultation chez le généraliste, avec plus de 15 millions par an. En Allemagne, la prévalence des troubles vestibulaires est de 6,5% selon une étude épidémiologique. Ainsi, les désordres vestibulaires représentent un enjeu de santé publique majeur et l’étude des désordres vestibulaires ainsi que des traitements pharmacologiques utilisés restent primordiaux. Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont nécessaires afin d’étudier les déficits vestibulaires et leur compensation. Le modèle de lésion utilisé dans ce projet est un modèle se rapprochant de pathologies humaines telles que la vestibulopathie périphérique aiguë (névrite) ou la maladie de Ménière. Il mime des symptômes vestibulaires retrouvés chez l’humain. A court terme, ce modèle animal et ces tests comportementaux vont permettre d’observer l’efficacité de la bétahistine (traitement étudié prescrit en clinique humaine) sur les symptômes posturo-locomoteurs induits par la pathologie et également sur l’anxiété des animaux. D’un point de vue fondamental, nous mettrons en évidence l’impact de ce traitement sur l’inflammation et sur l’anxiété des animaux dans un contexte de pathologie vestibulaire. Nous préciserons également le rôle de l’histamine dans la pathologie vestibulaire. Enfin, ce projet permettra d’élucider la compensation vestibulaire à un niveau plus global que seulement au sein des noyaux vestibulaires. Plus globalement, d’un point de vue clinique, ce projet pourrait amener à des nouveaux mécanismes quant aux fonctionnements d’un composé pharmacologique de référence prescrit en clinique. A plus long terme, les résultats obtenus permettront d’adapter la prise en charge médicamenteuse des patients afin de mieux traiter les pathologies vestibulaires.
Procédures
Pour induire des vertiges, un groupe d’animaux est soumis à une injection transtympanique d’une solution chimique détruisant les récepteurs vestibulaires de l’oreille interne alors qu’un autre groupe d’animaux reçoit une solution saline. L’injection transtympanique a lieu une fois, chez l’ensemble des animaux de l’étude. Avant la lésion, les animaux sont soumis à une injection d’analgésique 30 minutes avant d’être placés sous anesthésie gazeuse et un anesthésique local est appliqué 5 minutes avant incision. L’injection transtympanique se fait dans l’oreille moyenne des animaux en utilisant une aiguille. Les gestes décrits ci-dessus durent 72 minutes par animal. L’administration d’un marqueur de la prolifération cellulaire a lieu une seule fois, chez les animaux, au 3ème ou 7ème jour après la lésion vestibulaire. L’administration d’un médicament anti-vertigineux ou du placebo a lieu une fois par jour chez de nombreux animaux. Elle s’effectuera pendant les 10 jours qui suivent la lésion pour les animaux soumis aux tests comportementaux ou pendant les 3 ou 7 jours après la lésion pour les animaux non soumis aux tests comportementaux qui sont utilisés afin d’étudier les effets à court terme du traitement. Les tests comportementaux ont une durée de 25 min10 secondes par animal à plusieurs délais (avant la lésion, J2, J3, J7, J15 et J30). Les tests effectués pour un groupe ont une durée correspondant à une matinée. Pour mesurer l’audition des animaux, les animaux sont anesthésiés pendant 40 minutes. Cette mesure est répétée à 3 délais chez un petit nombre d’animaux : avant la lésion, 3 et 30ème jour après la lésion. L’exposition à des stimuli sonores répétés, sont calibrés en intensité et en durée, ce qui n’engendre pas de gêne auditive chez les animaux. Cependant, l’insertion des électrodes sous-cutanées peut provoquer une gêne passagère au point d’application et une anesthésie est pratiquée pour éviter cette gêne. Après cette mesure, les animaux peuvent présenter un stress au réveil de l’anesthésie.
Impact sur les animaux
Pour tous les animaux de ce projet, l’introduction d’un liquide dans l’oreille moyenne et l’incision cutanée (qui ont lieu lors de l’administration transtympanique) peuvent être source de douleur et d’inconfort. Dans les 3 procédures de ce projet, les mêmes effets indésirables sont prévus sur les animaux lésés. Les animaux soumis à une lésion transtympanique peuvent avoir un déficit d’hydratation dans les 24-48 heures après l’atteinte vestibulaire et une perte de poids est attendue chez ces animaux lésés. Le syndrome vestibulaire conduit à d’autres effets indésirables tels que des problèmes de maintien de posture et de perte d’équilibre. Également, l’anxiété est connue pour être une des composantes du syndrome vestibulaire. L’injection des antagonistes (quotidiennement durant 10 jours), l’injection d’un marqueur de la prolifération cellulaire (une fois, J3 ou J7 post-lésionnel) ainsi que l’injection d’un analgésique (une fois avant l’administration transtympanique et une fois avant la mise à mort de l’animal) peuvent être perçues comme une nuisance par l’animal. L’ensemble du groupe d’animaux testé est délocalisé hors de son environnement (correspondant à la salle d’hébergement de l’animalerie) pendant une matinée aux différents délais des tests comportementaux (délais pré-administration, J2, J3, J7, J15 et J30 post-lésionnels). Cela pourrait être perçu comme une nuisance par l’animal. L’exposition à des stimuli sonores répétés, sont calibrés en intensité et en durée, ce qui n’engendre pas de gêne auditive chez les animaux. Cependant, l’insertion des électrodes sous-cutanées peut provoquer une gêne passagère au point d’application. Après mesure de l'audition, les animaux peuvent présenter un stress au réveil de l’anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures et le sang et les tissus seront récupérés pour procéder à des analyses. Il est nécessaire de procéder à des dosages et marquages histologiques spécifiques dans le cerveau des animaux utilisés dans ce projet afin d’élucider les effets de notre médicament dans notre modèle animal. Le sang récupéré permettra de procéder à des dosages de marqueurs spécifiques du stress et de l’anxiété. Ces mises à mort sont nécessaires pour la mise en évidence des effets à court et à long terme du traitement.
Remplacement
Il existe des alternatives n’utilisant pas de modèles animaux telles que la méthode in silico ou encore in vitro. La méthode in silico utilise des modèles informatiques dans le but de prédire ce qui se passerait dans la réalité. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle informatique mimant de manière aussi complexe la physiologie et la physiopathologie du syndrome vestibulaire. Un autre modèle serait le modèle in vitro qui consiste en l’étude d’éléments hors de leur environnement en conditions définies et contrôlées. Puisque nous avons besoin de l’individu dans son ensemble, autant au niveau cérébral qu’au niveau périphérique (informations quant à la posture et concernant l’état d’anxiété des animaux), nous ne pouvons pas substituer le modèle animal par ces modèles.
Réduction
Afin de respecter le principe de réduction, les rats correctement lésés lors de l’apprentissage de la lésion par l’expérimentateur seront inclus dans l’étude pilote. De plus, cette étude sera effectuée dans le but de permettre une mise à mort des animaux à deux délais au lieu de trois délais différents (J3 ou J7 post-lésionnel et J30 post-lésionnel). L’étude de ces deux délais est nécessaire afin d’élucider les effets à court terme du traitement et la prolifération cellulaire (J3 ou J7 post-lésionnel) mais aussi afin de comprendre les effets à long terme du traitement et la survie et différenciation cellulaire (J30 post-lésionnel). De plus, les animaux mis à mort au 30ème jour après la lésion pour les investigations cellulaires sont les animaux soumis aux tests comportementaux. Également, il a été choisi de faire un test qualitatif permettant d’observer l’expression de plusieurs protéines pro- et anti-inflammatoires, pouvant être modulées dans le syndrome vertigineux. Ce test permettra de cibler les protéines à étudier en profondeur en utilisant des tests semi-quantitatifs et ainsi de ne pas multiplier le nombre d’essai et d’animaux. Enfin, les mêmes animaux seront utilisés afin de réaliser l’ensemble des études biochimiques (correspondant aux dosages des protéines et des marqueurs du stress et de l’anxiété). Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour chaque groupe en fonction de l’expérience précédente de l’équipe et avec l’aide d’un statisticien. Enfin, la répartition des animaux dans les groupes sera randomisée et l’expérimentateur travaillera en aveugle. Dans la dernière procédure de ce projet, les groupes qui auront préalablement été faits lors de la procédure précédente ne seront pas répétés afin de limiter le nombre d’animaux.
Raffinement
Notre modèle d’étude est un modèle de vestibulopathie unilatérale périphérique aiguë, obtenu par une administration transtympanique (TT) d’un composé ototoxique. Avant cette administration TT, les animaux sont anesthésiés pour éviter tout inconfort ou angoisse. Leur température est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée par une sonde anale et une solution d'hydrogel est appliquée sur leurs yeux pour assurer une hydratation oculaire. Après l’administration TT (ou lésion), l’animal est observé jusqu'à récupération de l’anesthésie. Avant le réveil, l’animal est hydraté (injection sous-cutanée d’un liquide) afin de compenser les pertes liquidiennes associées à la lésion. Les biberons sont équipés d'une pipette allongée pour faciliter l’hydratation et une solution nutritionnelle complète est déposée dans la cage pour assurer une bonne alimentation durant 1 semaine. Un examen clinique journalier à la même heure sera effectué afin de surveiller l’état des animaux prévenant une souffrance de ces derniers : allure du pelage, prostration, état des oreilles et des yeux. Puisqu’une perte de poids est un effet indésirable connu suite à une lésion vestibulaire, un suivi de poids régulier sera également effectué. L’administration TT n’occasionne pas de douleur post-opératoire et ne nécessite donc pas d’administration d’analgésiques. Elle est pratiquée en clinique chez les patients sans anesthésie préalable pour détruire le vestibule chez des patients résistants aux traitements pharmacologiques et souffrants de syndromes vestibulaires invalidants. Tous les animaux sont soumis à une phase d’habituation à l’expérimentateur ainsi qu’à la salle d’expérimentation pendant une semaine limitant ainsi tout stress ou angoisse potentielle. Les co-porteurs du projet sont formés en expérimentation animale (niveau concepteur de projet) et sensibilisés au bien-être animal. MODIFICATION : en cas de besoin, une crème sera appliquée en soins post-opératoires (2×/jour, 1–2 semaines) pour améliorer le confort et limiter la variabilité liée aux complications locales. Lors des enregistrements électrophysiologiques, une anesthésie locale est réalisée aux points d’insertion des électrodes. La température est maintenue par couverture chauffante.
Choix des espèces
La compensation vestibulaire est un processus présent chez les mammifères. Précédemment, notre laboratoire étudiait le modèle félin, espèce la mieux adaptée au comportement d’équilibration. Les tests comportementaux utilisés chez le chat ont ensuite été adaptés chez le rat. Le modèle rongeur présente de nombreux avantages en termes de manipulation et il reproduit le syndrome vestibulaire rencontré chez différentes espèces, dont l’humain. De plus, la durée totale du syndrome vestibulaire est significativement réduite chez le rat (2 à 3 semaines) par rapport à l’humain (90 jours). Ce gain temporel est avantageux pour l’étude de composés anti-vertigineux et pour la compréhension des mécanismes neurobiologiques responsables du syndrome. De plus, à un niveau cellulaire, nous retrouvons les mêmes modifications post-lésionnelles que celles observées chez le chat (production de cellules, modification dans l’inflammation et dans les marqueurs de l’excitabilité neuronale). La présente étude s’intéresse aux processus de compensation post-lésionnelle adultes présents après lésion vestibulaire et à l’effet anxiolytique de la bétahistine. L’étude de ces mécanismes dans les noyaux vestibulaires sera donc réalisée sur des rats adultes (10 à 13 semaines), afin de s'assurer d’être sorti de la période développementale. Pour un rat, la maturation des neurotransmetteurs et la densité synaptique est atteinte à plus de 8 semaines. De plus, en période développementale, un marqueur de l’excitabilité neuronale (co-transporteur membranaire) est moins exprimé qu'à l'âge adulte. Puisque nous étudions cet élément comme étant une des modifications post-lésionnelles, il est nécessaire d'avoir des rats adultes d'au moins 10 semaines pour tester nos différents composés et avoir une maturation complète du système nerveux central.
Évaluation de l’activité hippocampique pendant l’oubli adaptatif chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Choisis parce que le rat se concentre mieux sur une tâche que la souris et se montre "très gourmand", 30 rats sont équipés d'électrodes implantées dans quatre régions du cerveau. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. La chirurgie avec ouverture du crâne dure quatre heures, suivie de deux périodes de dix jours de restriction alimentaire et d'isolement, pendant lesquelles l'activité cérébrale est enregistrée en continu. Le porteur écrit que la prise en charge de la douleur est optimisée "pour que les animaux ne ressentent aucune douleur", et prévoit de tuer les 30 rats à la fin pour ouvrir leur cerveau et vérifier où les électrodes avaient été posées.
Objectifs
Ce projet vise à élucider les mécanismes neuronaux qui sous-tendent la mémoire de travail et sa sensibilité aux interférences, en s’appuyant sur des enregistrements électrophysiologiques multi-sites chez le rat. Il permettra de répondre aux questions suivantes : (1) Comment différentes régions cérébrales (hippocampe, cortex préfrontal, pariétal et rétrosplénial) coopèrent-elles pour a) maintenir à court terme des informations en mémoire, puis b) effacer celles-ci afin qu’elles n’interfèrent pas avec le stockage et rappel ultérieur de nouvelles informations ? (2) Quelles sont les signatures oscillatoires et les mécanismes synaptiques associés à ce stockage des informations en mémoire et à leur oubli ? (3) Ces signatures diffèrent-elles selon que la tâche impose un haut ou faible niveau d’interférence ?
Bénéfices attendus
Le projet proposé vise à caractériser les dynamiques synaptiques et neuronales impliquées dans la mémoire de travail et les processus d’oubli adaptatif chez le rat. En combinant des tâches comportementales bien contrôlées à des enregistrements électrophysiologiques multi-sites, ce travail permettra de documenter avec une résolution inégalée les interactions entre hippocampe, cortex pariétal, rétrosplénial et préfrontal dans la gestion flexible des traces mnésiques. À court terme, le projet apportera des données fondamentales sur les signatures oscillatoires et synaptiques liées à la gestion des interférences en mémoire de travail. Il permettra également de valider l’usage des sondes d'enregistrements multi-sites pour l’étude de fonctions cognitives complexes en contexte comportemental, renforçant la faisabilité technique de futures recherches multi-régions chez le rongeur. À long terme, ces résultats pourraient contribuer à l’élaboration de nouveaux modèles intégrés de la mémoire de travail, en rupture avec les approches cloisonnées classiques. Une meilleure compréhension de l’équilibre entre persistance et effacement des souvenirs pourrait éclairer certains déficits cognitifs observés dans des pathologies comme le vieillissement cérébral, le TDAH ou les troubles liés à un excès de rigidité cognitive (ex. autisme, troubles obsessionnels). Bien que ce projet ne soit pas directement translationnel, ses retombées théoriques pourraient guider des recherches ultérieures visant à identifier des biomarqueurs électrophysiologiques exploitables en clinique ou à développer de nouvelles stratégies de remédiation cognitive. D’un point de vue méthodologique, il contribuera aussi à renforcer les normes de raffinement en neurophysiologie in vivo, notamment via la réduction du stress expérimental grâce à une instrumentation légère, continue, et intégrée au comportement libre de l’animal.
Procédures
les animaux subissent une chirurgie invasive avec craniotomie (4 heures). Puis, ils subissent deux périodes de restriction alimentaire couplées à un isolement de leurs congénères (2 fois 10 jours) et seront enregistrés en continu pendant ces deux périodes.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont liés aux procédures chirurgicales et aux protocoles comportementaux. En effet, les animaux peuvent souffrir de douleurs post-opératoires, qui sont minorées par les antalgiques. Les tests comportementaux peuvent provoquer un stress du fait de l’hébergement individuel.
Devenir
tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir prélever leur cerveau et confirmer les sites d’implantation des électrodes.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine étude du comportement chez le rat pendant des tâches d’apprentissage faisant intervenir des formes de mémoires distinctes et enregistrements simultanés de plusieurs aires cérébrales. Il est à ce jour impossible de mimer des apprentissages aussi complexes impliquant le traitement d’interférences en mémoire de travail dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connexions entre les différentes aires corticales.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques appropriés qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. Ces tests puissants permettent d'inclure des animaux même en cas de données manquantes et de réduire le nombre d'animaux grâce aux mesures répétées. De plus, chaque animal sera enregistré en situation contrôle (avant apprentissage) et de test (après apprentissage) afin de pairer les résultats ce qui les rend plus puissants.
Raffinement
Le haut niveau de complexité des chirurgies effectuées sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrement pendant plusieurs jours consécutifs. Dans ce projet, les enregistrements électrophysiologiques seront combinés à des tâches comportementales complexes qui ont été largement validées dans notre équipe ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés pour protéger les implants. Or, l’isolement représente un stress majeur pour les rats. Nos étapes d’habituation et d’isolement ont donc été raffinées afin de limiter le stress des animaux, et ceci nous permet de maintenir les animaux au minimum par deux. Dans cette étude, les rats seront ainsi équipés d’un chapeau de protection en plastique solide afin de protéger les implants et de permettre de maintenir les animaux en groupe lorsqu’ils ne sont pas cablés. Enfin, la prise en charge de la douleur pendant la chirurgie et en post-chirurgie est optimisée pour que les animaux ne ressentent aucune douleur et une habituation lente et progressive est effectuée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Une grille de score est utilisée pendant les 5 jours post-opératoires afin d’avoir une mesure objective de la récupération de l’animal. Des points limites clairs et objectifs ont été définis afin de limiter au maximum toute souffrance.
Choix des espèces
Ce projet requiert l’utilisation de rats du fait du haut niveau de dextérité et de complexité cognitive attendus. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales et activités neuronales sur les réponses synaptiques. Les rats possèdent des rythmes cérébraux oscillatoires très similaires à ceux de l’homme. D’autre part, le rat possède les capacités cognitives et les facultés de se concentrer sur une tâche qui ne sont pas aussi développées chez la souris par exemple. Ils sont aussi très gourmands, ce qui permet d’effectuer l’étude sans une restriction alimentaire très poussée une fois qu’ils sont habitués à récupérer leurs récompenses alimentaires (en fin d’habituation, les rats sont souvent motivés à rechercher les récompenses alimentaires en étant seulement à -10 voire -5% de leur poids initial). Les animaux seront des jeunes adultes suivant ce protocole : arrivée à 8 semaines, chirurgie et post-chirurgie de 0 à 12 semaines, enregistrements et comportement des semaines 12 à 17. Ce projet vise à étudier le comportement et l’activité cérébrale associée chez des animaux adultes non âgés.
Démonstration fonctionnelle du rôle d’une protéine cérébrale dans le développement d’un comportement compulsif de prise d’héroïne chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
94 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit d'abord une chirurgie crânienne de 80 minutes, puis 31 séances d'auto-administration d'héroïne, onze de deux heures et vingt d'une à six heures selon le groupe, couplées à des injections de substances directement dans le cerveau par un dispositif implanté. Le porteur signale une possible stagnation du poids liée au cumul de la chirurgie, des injections ciblées et des séances prolongées. Le bénéfice qu'il avance, faire de cette protéine une "cible thérapeutique prometteuse" contre la rechute chez les personnes dépendantes aux opioïdes, reste une perspective, quand la dépendance à l'héroïne provoquée chez ces 94 rats est le point de départ du protocole.
Objectifs
Dans une étude en cours de publication, nous avons observé que certains rats, qui développent un comportement de consommation compulsive d’héroïne, présentent une baisse du niveau d’expression d’une certaine protéine dans une région précise du cerveau. En revanche, les rats qui ne deviennent pas dépendants ne montrent pas cette diminution. Pour mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l'apparition du comportement addictif, nous prévoyons de bloquer sa production spécifiquement dans cette zone du cerveau. Cela nous permettra de voir si cette protéine joue un rôle clé dans la consommation excessive d’héroïne.
Bénéfices attendus
Cette caractérisation permettra de faire de cette protéine une cible thérapeutique prometteuse pour diminuer le risque de rechute chez les patients dépendants aux opioïdes.
Procédures
Chaque animal participe à un parcours expérimental structuré en différentes étapes :chirurgie (80 min) puis, après récupération, séances de comportement (11 séances de 2 h suivies de 20 séances d’1 h ou de 6 h selon le groupe) couplées à l’injection intracérébrale de substances via un dispositif implanté (3 injections ou 6 injection selon les groupes).
Impact sur les animaux
• Après chirurgie : douleur légère à modérée et gêne transitoire, prévenues et traitées par une prise en charge antalgique et des soins adaptés. • Pendant les séances de comportement : fatigue transitoire possible chez certains animaux très actifs ; surveillance du poids et de l’état général tout au long du projet. • Effets cumulés : la combinaison d’une chirurgie, d’injections ciblées et de séances prolongées peut entraîner une stagnation temporaire du poids chez quelques animaux. Des points limites sont définis et déclenchent, si besoin, une sortie anticipée de l’animal du protocole.
Devenir
A l'issue des 2 procédures, les animaux sont mis à mort pour prélèvement des cerveaux.
Remplacement
Ce projet ayant pour but d’étudier le rôle fonctionnel d’une protéine sur le comportement d’auto-administration de drogue, aucune méthode alternative n'existe. Il s'agit en effet d'étudier le comportement spontané et volontaire des animaux après apprentissage, ce qui ne peut être réalisé sur des modèles alternatifs (approches in silico, in vitro ou ex vivo).
Réduction
La taille des groupes est fondée sur des données antérieures afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d’animaux. Les comparaisons prévues utilisent des méthodes statistiques appropriées ; les analyses intermédiaires permettront, si nécessaire, d’ajuster les effectifs pour éviter toute inclusion non indispensable.
Raffinement
•Anesthésie/analgésie adaptées à chaque étape ; soins oculaires, maintien de la température •Chirurgie stérile réalisée par du personnel formé ; surveillance rapprochée pendant l’anesthésie et au réveil. •Hébergement enrichi, habituation à la manipulation, et points limites prédéfinis (poids, aspect, comportement) déclenchant une prise en charge ou une sortie anticipée. •Utilisation de dispositifs implantés pour limiter les manipulations répétées et garantir des injections ciblées courtes.
Choix des espèces
L’investigation d’une pathologie telle que l’addiction nécessite d’étudier une espèce animale phylogénétiquement voisine de l’être humain pour pouvoir reproduire la maladie. Le rat est un modèle de référence dans le domaine des addictions. Il possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. De plus, il est idéal pour les études comportementales. Le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés. Les animaux testés seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 6 semaines environ et ne seront pas testés avant leur 7ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte pour pouvoir éviter le facteur confondant de l’âge sur les facteurs comportementaux mesurés. En effet, l’âge peut influencer de manière significative l’état émotionnel et le comportement de l’animal, un animal vieux pourra ainsi présenter un déclin cognitif ou une diminution de l’exploration par exemple. De même un rat adolescent pourra présenter un comportement différent de l’adulte (exploration plus importante, une prise de risque et une recherche de la nouveauté plus importantes).
Cryo-préservation, redérivation et reproduction assistée pour un archivage et une gestion sanitaire de lignées murines
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 545
Injectées deux fois à deux jours d'intervalle pour provoquer une superovulation, des femelles sont tuées à la fin de la procédure. D'autres souris sont stérilisées par une chirurgie de vingt minutes, les mâles vasectomisés étant ensuite isolés puis accouplés chaque semaine aux futures mères porteuses. 8 960 souris et 545 rats vont être utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 6 300 d'entre eux et modéré pour 3 205. Le service revendique un "changement de paradigme" au bénéfice des animaux non-humains grâce à la congélation des gamètes, et prévoit de tuer les mâles vasectomisés et les femelles stérilisées "lorsque trop âgés pour assurer la fonction".
Objectifs
Les prestations de reproduction contrôlée et cryoconservation (congélation de semence ou d’embryons) offrent aux unités de recherches un soutien dans la gestion de leurs projets de productions expérimentales. Elles permettent d’intégrer les étapes inhérentes à l’introduction des lignées dans le plan de production global du projet. Le service répond aux besoins des projets des équipes de recherches concernant les méthodes d’archivage (stockage de semence/gamètes) et de reproduction assistée (FIV : Fécondation in Vitro) de lignées murines (souris & rat). Il réalise des importations & exportations de lignées vivantes ou congelées (semence). Les missions sont : -Prise en charge systématique des lignées murines arrivant dans les animaleries du site universitaire pour protéger leur patrimoine génétique originel et garantir un environnement sanitaire général de qualité nécessaire au bon déroulé des projets de recherche. –Congeler le sperme ou les embryons de l’ensemble des lignées murines de la communauté scientifique afin d’assurer un archivage sécurisé et remplacer des animaux par des produits congelés lors des imports/exports. Limiter l’élevage aux lignées impliquées dans des projets de recherche les autres étant en stock congelé. -Proposer la FIV comme technique de reproduction assistée ou la décongélation d’embryons préalablement stockés en masse pour produire des lots expérimentaux. -Remplacer des rafraichissements génétiques par croisement naturel par des décongélations de sperme ou d’embryons de génération antérieure qui seront réveillés lorsque nécessaire. Ces missions s’inscrivent dans la réduction du nombre d’animaux utilisés et présents.
Bénéfices attendus
Par l’ensemble de ces techniques nous assurons un changement de paradigme dans la gestion de la production animale au bénéfice de tous ; : chercheurs, hébergeurs/producteurs et surtout animaux. Celles-ci permettent d’appliquer pleinement les 3Rs à différents niveaux de la gestion de colonies et surtout réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques.
Procédures
1/Superovulation : Douleur légère & stress lors des injections. durée deux fois 30 secondes.2/ Males vasectomisés : Douleur légère ou modérée lors de la chirurgie. Une seule fois, durée 20 minutes de chirurgie. Pas d’effet à long terme. 3/Mères porteuses & femelles stérilisée : Douleur légère ou modérée lors de la chirurgie. Pas d’effet à long terme.Une seule fois, Durée de la chirurgie 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les actions de contention lors des injections (hormones, anesthésie, analgésie) génèrent du stress. Nous effectuons pour les superovulations, deux contentions à deux jours d’intervalles. Pour la chirurgie deux contentions à l’initiation du protocole (anesthésie, analgésie) Les conséquences des chirurgies : sutures, cicatrisations génèrent un inconfort limité, une douleur légère. Les mâles vasectomisés sont isolés et accouplés aux futures mères porteuses chaque semaine. Les souris étant des animaux grégaires, leur isolement génère du stress. En période de non-activité de plus d’une semaine, une femelle de compagnie est ajoutée dans la cage du mâle isolé.
Devenir
Superovulation : mise à mort à la fin de la procédure. Mâles vasectomisés : mise à mort lorsque trop âgés pour assurer la fonction Mères porteuses : mise à mort à la fin de la procédure Femelles stérilisée : mise à mort lorsque trop âgée pour assurer la fonction
Remplacement
La congélation d’ovocyte permet de remplacer des femelles superovulées par des lots d’ovocytes pour les FIV. Ajustement plus précis entre besoin et consommation. Les différentes congélations de gamètes (sperme –ovocytes-embryons ) permettent de réduire le nombre de lignées respirantes en congelant les lignées non utilisées, tout en ayant la possibilité de la réveiller ou d’assurer une fécondation via la FIV. Congélation/décongélation : Remplacer des étapes de production et de croisements par des FIV ou des décongélations. Réduire les étapes de rafraichissements génétiques par des décongélations de sperme ou d’embryons de génération plus faible.Remplacer des producteurs par des paillettes de spermes/embryons : Congeler des lots d’embryons et les réveiller par petite quantité pour répondre a des besoins précis. Exemple une femelle gestante issue de la réimplantation d’embryons congelés pour disposer tous les 2mois de petits sans avoir de colonie respirante. Produire une cohorte par an par décongélation ou FIV /réimplantation massive sans avoir de colonie respirante.
Réduction
Archivage : Les différentes congélations de semences (sperme –ovocytes) permettent de réduire le nombre de lignées respirantes en congelant les lignées non utilisées, tout en ayant la possibilité de la réveiller ou d’assurer une fécondation via la FIV. Congélation/décongélation : Réduire les étapes de rafraichissements génétiques par des décongélations de sperme ou d’embryons de génération plus faible. FIV : Réduire le nombre de mâles en fécondant massivement via des paillettes. Amplifier rapidement en utilisant peu d’animaux Superovulation : réduire le nombre de femelles donneuses d’ovocytes en superovulant. Synchronisation . Le cheptel de femelles nécessaire est ainsi réduit de 30 à 40%. Idem pour les mâles vasectomisés car il faut moins de couples pour avoir autant de femelles porteuses. Stérilisation des femelles de disposer de femelles compagne pour mâles isolés, permet de valoriser ces femelles plutôt que de les mettre à mort .
Raffinement
L’utilisation d’aiguilles 30G : permet de limiter la douleur lors des injections. Congélation d’ovocytes Lorsque la production commune destinée à l’ensemble des usagés produit un excédent de femelles mais qu’aucune FIV n’est programmée à la même période, nous pouvons superovuler les femelles et congeler les ovocytes. Lors d’un besoin pour FIV ces stocks serviront à affiner les quantités ou remplacer une superovulation. FIV : Une paillette de sperme permet de féconder plusieurs lignées d’ovocytes en même temps, ceci accélère et synchronise les croisements. Un sperme d’animal homozygote permet d’accroitre les rendements
Choix des espèces
Nous avons développé nos compétences sur les deux modèles animaux expérimentaux présents dans nos structures de productions et d’expérimentations. Ils sont les plus Les équipes de recherche pour lesquelles nous avons développé ce service travaillent sur les espèces rat et souris. Nous avons donc développé nos compétences sur les deux modèles animaux expérimentaux présents dans nos structures de productions et d’expérimentations. Elles sont les plus fréquemment utilisées en recherche animale et pour lesquels les techniques de manipulation et congélation des gamètes sont les plus abouties. La vasectomie s’effectue à l’âge de 6 semaines. Après 3 semaines de récupération post opératoire les mâles sont mis en accouplement pour confirmer la stérilité pour être utilisé jusqu’à environ l’âge de 26 semaines – 6 mois. Réimplantation –transfert d’embryons : Les mères porteuses sont utilisées dès l’âge adulte (8 semaines), jusqu’à l’âge de 3 mois (15 semaines) période qui est optimale entre 8 et 12 semaines d’âges Superovulation : Les femelles doivent de préférence être pré-pubères pour que l’effet de contrôle du cycle hormonal soit optimum. Selon les fonds génétiques cela se situe entre 4 et 6 semaines d’âge. Mais la stimulation d’adulte est envisageable en cas de nécessité.
Impact de l’activation immunitaire maternelle sur les comportements dépendants de la dopamine chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Nées de femelles auxquelles un composé mimant une infection virale a été injecté pendant la gestation, une partie des 1 016 souris de ce projet sert à mesurer les effets comportementaux de cette activation immunitaire. Le niveau de souffrance déclaré est léger pour 474 d'entre elles et modéré pour 542, et toutes sont tuées à l'issue pour des analyses de biochimie. Elles subissent quatre semaines de restriction alimentaire destinée à les motiver pendant les tests, trois semaines de séances comportementales quotidiennes d'une heure, et pour certaines une chirurgie cérébrale de 45 minutes pour injecter un virus dans le cerveau. Le porteur indique travailler par ailleurs sur des modèles in vitro pour les bases neurobiologiques de la schizophrénie, et conclut pourtant que l'étude du comportement "ne peut pas être reproduite in vitro".
Objectifs
L’activation du système immunitaire de la mère au cours de la grossesse (activation immunitaire maternelle), par exemple par des virus communs comme le virus de la grippe, est un facteur de risque pour plusieurs troubles psychiatriques et neurologiques, en particulier l’autisme et la schizophrénie. Les animaux utilisés à des fins scientifiques sont des modèles puissants et indispensables pour étudier les liens entre activation imunitaire maternelle et altérations du comportement chez la descendance. Les rongeurs dont la mère a reçu pendant la gestation un composé qui induit une activation immunitaire maternelle en simulant une infection virale, présentent des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. La dopamine est un neurotransmetteur notamment impliqué dans la physiopathologie de la schizophrénie. Cependant les conséquences comportementales des dysfonctions de ces neurones sont inconnues. Dans ce projet, nous tenterons d’identifier les conséquences comportementales des dysfonctions des neurones dopaminergiques dans un modèle d’activation immunitaire maternelle chez la souris.
Bénéfices attendus
Parmi les pathologies dont le risque est augmenté par l’activation immunitaire maternelle, la schizophrénie est une pathologie très courante (500 000 à 600 000 patients en France) directement associée à des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. Ainsi, presque tous les traitements pharmacologiques de la schizophrénie disponibles actuellement sont basés sur l’inhibition d’une molécule sur laquelle se fixe la dopamine. Ces thérapies traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Le ciblage des voies de la dopamine dans la schizophrénie est issu de découvertes fortuites et n’est pas fondé sur une compréhension fine des dysfonctions sous-jacentes. Notre projet permettra de comprendre le lien entre un facteur de risque identifié de la schizophrénie (l’activation immunitaire chez la mère), des dysfonctions du système dopaminergique et des altérations des phénotypes comportementaux liés à la dopamine.
Procédures
Une injection unique de solution est administrée par voie intraveineuse aux femelles gestantes vigiles sur une durée de 5 minutes. Un traitement antibiotique est également administré par prise volontaire orale via l’eau de boisson à un lot de femelles allaitantes vigiles, pendant une période de 15 jours. Un protocole comportemental sur un lot d’animaux vigiles durant 1h par jour (ou 1h20 le dernier jour) est réalisé pendant 3 semaines. Ce protocole inclut une restriction alimentaire modérée de 4 semaines (dont une semaine de mise en place) permettant de motiver les animaux à obtenir une récompense lors du test. Une intervention chirurgicale est réalisée sur un lot d’animaux sous anesthésie générale et analgésie, consistant à administrer un virus ou une solution contrôle dans le cerveau, durant 45 minutes. Une chirurgie sans réveil (sous anesthésie et analgésie) de moins de 5 minutes sera réalisée sur un lot d’animaux.
Impact sur les animaux
L’injection du composé mimant un virus induit une activation immunitaire transitoire, corrélée à une perte de poids d’environ 1 à 2 pour cent du poids total par rapport au poids des animaux témoins deux jours après l’injection. Cependant, cette perte de poids ne persiste pas : dès le troisième jour après l’injection, les poids des souris ayant reçu le composé et celui des souris ayant reçu l’injection contrôle redeviennent similaires. Pendant la période transitoire d’activation immunitaire (c’est-à-dire dans les 24h après injection), il est attendu que les souris présentent un comportement modérément altéré, avec prise de nourriture amoindrie. Le traitement antibiotique peut entraîner une altération du microbiote intestinal qui peut se traduire par des troubles digestifs modérés. La restriction alimentaire imposée dans un objectif motivationnel pour le test comportemental entraîne une sensation de faim. L’anesthésie lors de la chirurgie peut entraîner des risques de détresse respiratoire, cardiaque et d’hypothermie. Des effets indésirables comme le stress ou la douleur peuvent persister après l’opération et sont dans ce cas pris en charge.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés selon des méthodes réglementaires pour des expériences de biochimie, après la fin du protocole comportemental ou après sevrage de la progéniture. Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.
Remplacement
Une partie de notre travail (bases neurobiologiques de la schizophrénie) est axée sur l’utilisation de modèles in vitro pour des caractérisations d’effets génétiques. Cependant, pour ce projet portant sur le même thème, l’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à des pathologies psychiatriques, nécessite d’avoir recours à des animaux. En particulier, l’étude du comportement ne peut pas être reproduite in vitro.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre de souris incluses dans le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Le nombre total d’animaux impliqués est de 1016.
Raffinement
Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. Un enrichissement (bâtonnets à ronger) est prévu pendant la durée de la restriction alimentaire. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement anti-inflammatoire/antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis. Les conditions d’hébergement (luminosité, température, etc.) seront conformes à la réglementation pour l’espèce concernée. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans des pathologies humaines. Les souris gestantes recevant une injection sont de jeunes adultes fécondes (8-15 semaines). Les souris soumises aux expériences comportementales sont également de jeunes adultes (jour postnatal 90 à 120) afin d’étudier les conséquences comportementales de l’activation immunitaire maternelle sur le long terme.
Développement d’un paradigme comportemental pour l’étude de la généralisation de la peur chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune testée deux fois par jour pendant quatre semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie d'une heure trente pose des électrodes intracérébrales, puis chaque animal vit seul en cage pour éviter que ses congénères n'arrachent l'implant. Les tests appliquent des stimulations aux pattes et aux paupières afin d'installer une mémoire de peur, puis de mesurer à quel point elle se généralise à des contextes ambigus. Les troubles anxieux touchent 15 à 20 % de la population selon le porteur, mais les stratégies thérapeutiques annoncées relèvent du long terme, quand l'isolement et les stimulations sont, eux, immédiats.
Objectifs
Le cerveau utilise un mécanisme pour déterminer si une situation ressemble à une expérience connue (complétion de motif) ou si elle est perçue comme nouvelle (séparation de motif). Ce processus a été principalement étudié dans une région du cerveau appelée l’hippocampe dorsal. En revanche, une autre région, l’hippocampe ventral impliquée dans la régulation de l’anxiété reste encore peu explorée dans ce contexte. Dans ce projet, nous émettons l’hypothèse que, dans des contextes flous, le cerveau tend à « combler les vides » en associant la situation à des souvenirs de peur. Ce mécanisme pourrait expliquer pourquoi certaines personnes généralisent leur peur à des situations qui ne présentent pourtant aucun danger réel. L’objectif de ce projet sera de développer une tâche comportementale chez la souris permettant d’évaluer comment la généralisation de la mémoire de la peur peut être modulée par l’information contextuelle présentée.
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 pour cent de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Une chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L’intervention dure environ 1h30, et chaque animal bénéficie ensuite d’une période de récupération post-chirurgicale de 7 jours. À l’issue de cette période de récupération, les animaux commencent le protocole de comportement qui s’étend sur environ quatre semaines. Chaque souris vigile est testée deux fois par jour, dans des sessions de 30 minutes, séparées par une récupération de 3 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances induites par la procédure comprennent, en lien avec la chirurgie, une légère perte de poids, des difficultés de cicatrisation et une douleur post-opératoire durant environ 48 heures, ainsi que des risques anesthésiques tels que l’hypothermie, la détresse respiratoire ou un arrêt cardio-respiratoire. L’hébergement individuel est susceptible d’induire un stress social. Dans le cadre des tests comportementaux, les stimulations appliquées au niveau des pattes et des paupières peuvent engendrer un stress modéré accompagné d’une douleur transitoire.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue du projet afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses nécessaires post-mortem).
Remplacement
Un impératif majeur des études portant sur les récepteurs naturels du cerveau est de préserver l’intégrité des réseaux neuronaux, afin de maintenir leurs connexions synaptiques. À ce jour, il n’existe aucune méthode alternative à l’utilisation du modèle rongeur pour répondre à cette condition. Les techniques d’enregistrement chronique sont invasives et ne peuvent pas être réalisées chez l’humain ni chez le sujet sain. Elles sont réservées à des patients épileptiques, dont l’activité cérébrale est déjà altérée, et ne permettent pas de mener des études systématiques, car le placement des électrodes dépend des besoins médicaux. Par ailleurs, les connaissances actuelles et les capacités technologiques ne permettent pas encore de reproduire avec précision le fonctionnement de ces réseaux neuronaux à l’aide de modèles informatiques.
Réduction
Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Les statistiques utilisés sont des tests paramétriques et non paramétriques classiques ainsi que des tests en lien avec les analyses de réseaux neuronaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 3 ans, ce projet de recherche impliquera 84 animaux
Raffinement
Après leur réception, les animaux commerciaux sont habitués à l’animalerie pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Durant la chirurgie, la température corporelle des animaux est maintenue constante à l’aide d’un tapis chauffant, afin d’éviter toute hypothermie liée à l’anesthésie. Les administrations seront effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés (suivi à l’aide d’une grille post-opératoire) seront maintenus en hébergement individuel : la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire pour éviter que les souris ne s’arrachent mutuellement leurs implants, permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’hébergement individuel les animaux implantés sont maintenus dans de grandes cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal isolé d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Lorsqu’un animal est implanté, pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture ne sera plus placée dans la mangeoire au niveau de la grille de la cage, mais sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une surveillance sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé.En cas de signe de douleur (échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central (SNC) développé. Il s’agit également d’un animal qui se prête aux modifications génomiques. Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. Il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de l’animal. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifie comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Etude pilote pour la réalisation d’approches thérapeutiques en neurologie chez la souris EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des femelles gestantes au dernier tiers de la gestation sont opérées sous anesthésie pour une injection dans le cerveau de leurs embryons, d'autres souris recevant un vecteur viral. Cent souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet sert de test préliminaire pour sélectionner un sérotype de virus et une dose en vue d'un futur essai de thérapie génique, sans tester de traitement à ce stade. Le porteur indique qu'il n'y aura ni analyse statistique ni test de puissance, annonce deux souris par condition chirurgicale et trois par dose de virus, et ne précise pas comment ces chiffres aboutissent à un effectif de cent.
Objectifs
La connaissance des mécanismes impliqués dans le développement de réseaux neuronaux fonctionnels est essentielle pour comprendre l’origine des troubles du neurodéveloppement (TDNs), des atteintes du développement cognitif ou fonctionnel du cerveau ayant un impact important sur la vie des patients. Il est estimé que près d’une naissance sur 6 est concernée par un trouble du neurodéveloppement, et les options thérapeutiques restent dans la majorité des cas limitées. Ce projet, qui se déroulera dans deux établissements utilisateurs, s’inscrit dans le cadre d’un projet de recherche translationnelle, conduit chez la souris, qui constitue des essais préliminaires à visée thérapeutique. D’abord, nous testerons les fonctions neuronales d'un gène identifié comme un régulateur du trafic de membranes intracellulaires. In vitro, ce gène a un effet sur la pousse neuronale, dont la prédiction serait qu'elle module la connectivité cérébrale. Dans le cadre d’une approche translationnelle, il a développé des molécules interférantes qui bloquent la fonction de ce gène in vitro. Nous testerons l'effet de ces molécules in vivo. Dans un second temps, nous ferons la mise au point de virus vecteurs pour un futur projet de thérapie génique. Notre objectif sera de tester des virus contrôle, afin de sélectionner le sérotype et la dose de virus adaptés à de futurs essais thérapeutiques. A terme, le sérotype de virus sélectionné nous permettra d’exprimer les molécules d’intérêt dans des populations de neurones ciblées.
Bénéfices attendus
Les résultats de ces travaux permettront de comprendre les fonctions d’un gène impliqué dans le développement cérébral. Les outils développés dans ce projet seront la base d’études précliniques qui à terme pourront aboutir à la composition de thérapies ciblées pour le système nerveux.
Procédures
Dans l'EU1 : Les animaux inclus dans ce projet subiront entre une et trois injections d’analgésiques (durée contention/injection : 10 secondes par animal par injection). Certaines femelles subiront une chirurgie avec réveil, sous anesthésie et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La chirurgie dure environ 30 minutes et sera réalisée une seule fois. La procédure peut entraîner une douleur et du stress dans les heures suivant la chirurgie. Des animaux subiront une injection d’un vecteur de thérapie génique, une seule fois, sous anesthésie. Dans l'EU2 : Certains animaux seront mis à mort par injection d'un fixateur, sous anesthésie et analgésie (durée 3 minutes).
Impact sur les animaux
Certains animaux subiront une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, qui peut entraîner une douleur le temps de la cicatrisation. Certains animaux subiront une injection au stade embryonnaire qui n'entraine aucune lésion ou nuisance chez les embryons à cet âge. Certains animaux recevront une injection de virus, une seule fois, qui entraînera un léger stress au moment de l’injection.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques
Remplacement
Ce projet a pour objectif de caractériser les changements de connectivité cérébrale lors de la modulation d'un gène dont les fonctions ont été étudiées au préalable in vitro. Il est à présent nécessaire de tester l’effet de ce gène in vivo afin de valider les conséquences sur le ciblage des connexions neuronales, qui ne peut être reproduit in vitro en raison de la complexité cérébrale et de la diversité des types neuronaux impliqués. Dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cortex cérébral et la mise en place des circuits neuronaux ne peuvent être modélisées entièrement in vitro. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré. De même, nous souhaitons tester la distribution d’un virus pour la thérapie génique, ce qui ne peut être reproduit fidèlement in vitro (effet de la circulation et des barrières sang-cerveau, entre autres).
Réduction
Dans ce projet, nous limiterons le nombre d’animaux au strict minimum pour atteindre les résultats scientifiques et faire la preuve de concept de l’efficacité de nos approches en vue d’applications précliniques ultérieures. Il n’y aura pas d’analyse statistique et pas de test de puissance réalisé au préalable. Les chirurgies seront réalisées sur deux souris par condition, ce qui est le nombre minimum pour nous assurer de la reproductibilité des résultats sur deux expériences indépendantes. Les injections de virus seront réalisées sur des groupes de trois souris, ce qui est le nombre minimum pour nous assurer de résultats interprétables (en cas de variabilité d’un animal à l’autre). Nous commencerons par la dose la plus faible de virus, si celle-ci donne satisfaction, nous n’aurons pas besoin de réaliser la dose la plus importante.
Raffinement
Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. La procédure chirurgicale est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur. Les mises à mort pourront se dérouler dans un autre EU, dans ce cas le transport des animaux est rapide puisque les deux établissements utilisateurs sont dans le même bâtiment. Les animaux seront placés dans une cage de transport adaptée et pris en charge immédiatement à leur arrivée afin de limiter le stress lié à un nouvel environnement. Les animaux seront traités individuellement, pendant que le reste de la portée sera isolée dans un portoir ventilé qui procure une isolation visuelle, acoustique et olfactive.
Choix des espèces
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Les outils moléculaires que nous allons tester sont adaptés à la souris. La chirurgie se fera chez des femelles au 3ème tiers de la gestation chez la souris, qui est le stade auquel le développement cérébral a lieu chez la souris. Cette procédure est parfaitement standardisée au laboratoire. L’injection de virus sera faite dans des animaux jeunes adultes, entre 8 et 14 semaines. Il n’est pas attendu d’incidence de l’âge sur la distribution des virus. Le stade jeune adulte correspond à une cible thérapeutique potentielle à terme pour les maladies neuropsychiatriques.
Etude du rôle des récepteurs astrocytaires dans la mémoire.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une perte de poids de 5 à 12 % est planifiée et un score de souffrance égal ou supérieur à 7 déclenche la mise à mort : 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chacune subit une chirurgie cérébrale avec implantation d'une lentille ou d'une fibre optique, puis reste isolée en cage pendant les tests. Quatre-vingts souris reçoivent des chocs électriques aux pattes lors d'un conditionnement de trace, cent autres passent douze jours consécutifs de labyrinthe à raison de quarante minutes par jour, sous restriction alimentaire. Le projet relève de la recherche fondamentale sur le rôle des astrocytes dans la mémoire, les retombées annoncées pour la maladie d'Alzheimer restant au conditionnel, tandis que le porteur écrit qu'il est "indispensable" de déterminer la contribution de ces récepteurs.
Objectifs
Depuis maintenant plusieurs décennies, de nombreuses études indiquent que l’astrocyte, une cellule support des neurones, joue un rôle clé au cours de la communication neuronale aussi appelée transmission synaptique. En effet, cette cellule détecte l’information transmise au niveau de la synapse (zone de communication entre deux neurones) et en retour régule la transmission synaptique via la libération de transmetteurs. L’astrocyte est capable de réguler l’efficacité de la transmission synaptique lorsqu’un récepteur astrocytaire est activé. En retour cette cellule libère des transmetteurs qui pourraient jouer un rôle clé dans la mémoire. Dès lors, il est indispensable de déterminer la contribution des récepteurs astrocytaires dans la mémoire.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la mémoire et l’apprentissage. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 4 : - Chirurgie : les animaux seront anesthésiés durant toute la chirurgie (soit environ 30min par animal, ou 1h pour les études nécessitant l’implantation de la lentille ou de la canule optique). Les animaux subiront au total 2 injections (2min30 chacune). La totalité des animaux seront concernés, soit 180 animaux; - Implantation des lentilles ou fibres : 20min. Un animal sera implanté une seule fois. Le système sera laissé en place le temps de réaliser les tests comportementaux. La totalité des animaux est concernée, soit 180 animaux; - Test comportemental de conditionnement de trace : les animaux seront testés sur 3 jours consécutifs (8 minutes par jour). 80 animaux sont concernés; - Test comportemental en labyrinthe : les animaux seront testés pendant 12 jours consécutifs (environ 40min par jour de test). 100 animaux sont concernés par ce test comportemental.
Impact sur les animaux
Les effets stressants chez les animaux sont liés à : - une chirurgie - une privation alimentaire - une mise en cage individuelle pour les tests comportementaux - l'application de chocs électriques. Néanmoins, afin de réaliser nos études neurobiologiques, les animaux sont mis à mort rapidement (90 min après le début du test comportemental). Concernant les procédures chirurgicales, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir dans des cas très rares. Si tel est le cas, une injection d'antalgiques sera réalisée pour calmer la douleur. La plaie chirurgicale sera observée quotidiennement afin de déceler les traces d’infection au niveau du site opératoire (rougeur, enflure, écoulement, saignement). Si la plaie présente un de ces signes, nous appliquerons un spray désinfectant et cicatrisant à base de cire d’abeille quotidiennement, jusqu’à complète cicatrisation et pendant 7 jours maximum. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort. Concernant les chocs électriques, lors de la phase de conditionnement (un seul jour), l’animal ressentira une douleur peu intense et très brève au niveau de ses pattes suite aux chocs électriques. Après l’application de ces chocs, aucun autre effet indésirable n’est attendu. En effet, les diverses expériences réalisées précédemment ont montré qu’il n’y avait aucune augmentation de bagarres ou de comportements anormaux des animaux (prostration, freezing). Si au cours de l’expérience, les lentilles se détachent, ce qui arrive très rarement, l’animal sera aussitôt exclu de l’expérimentation et mis à mort. Si l’animal présente des signes de douleur suite aux chirurgies, nous injecterons immédiatement un antalgique pour calmer la douleur. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.
Remplacement
Travaillant sur les interactions des cellules neuronales et astrocytaires dans le contexte de la mémoire, il est impossible de recourir à des modèles bioinformatiques ou à des cellules en culture. L’étude in vivo est donc indispensable.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles. Si au cours du projet nous observons que les résultats sont similaires entre les mâles et les femelles, nous poolerons les données obtenues ce qui permettra de REDUIRE de moitié le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront classiquement hébergés dans des cages enrichies, en petits groupes sociaux de 8 individus. Ils auront accès à l’eau et nourriture ad libitum jusqu’au début des tâches comportementales. Les animaux seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée. Un changement de litière sera effectué une fois par semaine. Pour les procédures avec restriction alimentaire, les animaux seront isolés dès le début de la restriction, et ce pendant toute la tâche comportementale, afin de contrôler le rationnement alimentaire de chaque animal. Ces animaux sont surveillés et pesés quotidiennement à partir du moment où les animaux seront en restriction alimentaire et la quantité quotidienne de nourriture sera adaptée en fonction de leur poids. Leur perte de poids (5 à 12 % de leur poids de base) sera ainsi progressive et contrôlée. Si la perte de poids dépasse les 12%, alors on augmentera la ration alimentaire. Si l’animal continue à perdre du poids, alors on rajoutera de la nourriture en poudre. Si malgré ces mesures, l’animal ne reprend pas son poids initial, ceci sera considéré comme un point limite et l’animal sera mis à mort. Pour le test de conditionnement de trace, les animaux seront isolés 3 jours avant le début de la tâche, pendant une durée totale de 5 à 6 jours. Lors de l’isolement, un tube en carton sera rajouté dans la cage pour augmenter l’enrichissement. De plus, on vérifiera tous les jours que les cages avec des animaux seuls seront collées les unes aux autres pour augmenter les interactions olfactives et visuelles. Outre le poids, d’autres indices seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures et des points limites précis et adaptés ont été définis. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation). Au cours de l'expérimentation, si l'animal présente des signes de douleur, nous injecterons immédiatement un antalgique pour calmer la douleur. Les injections seront répétées si besoin toutes les 24h jusqu'à amélioration de l'état de l'animal. En revanche, si le score obtenu après évaluation de l'état de l'animal est égal ou supérieur à 7 (annexe 2), il sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont les comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. De plus, la souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des cellules gliales dans la communication neuronale et les processus de mémoire. Enfin, la souris offre une possibilité plus grande de manipulations génétiques. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 16 à 20 semaines.