Système nerveux

Élevées pour porter la mutation SOD1G93A qui détruit progressivement leurs neurones moteurs, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Cette gravité tient au prélèvement d'un morceau de queue pour le génotypage et à un tatouage des doigts, réalisés sur animal vigile. Le protocole ne produit aucune donnée scientifique par lui-même, il alimente d'autres projets en animaux malades, et le porteur prévoit de tuer les mâles reproducteurs si les atteintes motrices apparaissent avant trois mois. Les souris dont le génotype ou le sexe ne sert ni à l'élevage ni aux expériences sont tuées, les autres partent vers des projets scientifiques.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), également connue sous le nom de maladie de Charcot, est une maladie qui entraîne une dégradation progressive des neurones moteurs – les cellules chargées de transmettre la commande motrice produite par le cerveau vers les muscles. Chez l’homme, cette maladie est fatale dans les 3 à 5 ans suivant le diagnostic. La découverte de mutations génétiques à l’origine des formes familiales de SLA chez les patients a permis l’élaboration de modèles de souris génétiquement modifiées qui sont atteintes de la SLA. Cette demande d’autorisation de protocole concerne l’élevage d’une de ces lignées de souris transgéniques qui est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour essayer de comprendre pourquoi les neurones moteurs dégénèrent dans la SLA.

Bénéfices attendus

Les recherches que nous effectuons sur ce modèle animal pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ou ralentir la progression de la SLA.

Procédures

Pour l’ensemble des animaux : une biopsie d’1 à 2 mm de queue sera réalisée pour le génotypage ainsi qu’un tatouage au niveau des doigts des pattes pour identification sur les souris vigiles. Ces deux gestes s’effectuent en quelques secondes.

Impact sur les animaux

La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices des membres antérieurs mais surtout postérieurs. Afin de déterminer le génotype des animaux, une biopsie de queue sera faite durant la seconde semaine de vie des animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux à part les femelles reproductrices issues d'un fournisseur privé, sont dans une procédure modérée liée au prélèvement caudal dans le but du génotypage. Les animaux dont le génotype/sexe n’a pas d’intérêt dans le cadre de l’élevage ou des expérimentations seront euthanasiés. Des males porteurs de la mutation génétique à l'origine de la maladie de Charcot seront utilisés comme géniteurs, les autres animaux seront tous utilisés dans le cadre des projets scientifiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthode alternative suffisamment prédictive qui permettrait de se passer de l’utilisation d’animaux pour étudier la maladie de Charcot. Lorsqu’on s’intéresse aux altérations physiologiques induites par la dégénérescence neuronale il est impossible de se passer d’un modèle d’étude animal mammifère et de travailler sur des invertébrés ou des cellules différenciées.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par l’expérience que nous avons acquise au laboratoire depuis de nombreuses années sur ce modèle animal dans lequel il y a une variabilité interindividuelle importante quant à l’évolution des processus neurodégénératifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions favorisant leur bien-être (enrichissement, suivi quotidien par du personnel qualifié). Les animaux présentant des atteintes motrices seront suivis quotidiennement. Si de façon exceptionnelle ces altérations étaient visibles avant trois mois, les mâles reproducteurs seront euthanasiés. Les mâles étant agressifs entre eux, leur nombre est limité à 4 dans une cage de taille moyenne et à 6 dans une grande cage. Nous ne regroupons jamais des animaux de portées différentes. Nous maintenons les animaux par portée d’origine et ne les séparons pas en fonction du génotype afin de limiter le stress du regroupement. De l’enrichissement sera aussi ajouté pour permettre un maximum de cachettes (maison en carton, tunnel, sizzlenest). Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Les animaliers sont formés à leur détection et préviennent les chercheurs dès les premiers signes.

Choix des espèces

L’identification de mutations génétiques à l’origine des formes héréditaires de SLA chez l’humain a permis l’élaboration de modéles murins de cette pathologie qui se développe à l’âge adulte avec l’apparition des premiers symptômes moteurs autour de 90 jours après la naissance.

2 323 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par chirurgie terminale pour prélever leurs organes. Rendues obèses et diabétiques par leur alimentation, elles subissent une biopsie de la queue, une chirurgie cérébrale de quarante minutes pour activer ou inhiber un groupe de neurones, jusqu'à six sessions de deux heures de prélèvements sanguins à la queue toutes les quinze minutes après mise à jeun, et quinze jours d'isolement en cage d'enregistrement. Le bénéfice avancé, de nouvelles pistes contre la "diabésité", reste une perspective, quand le protocole décrit des atteintes datées et répétées. Le porteur conclut qu'un modèle in vivo intégré est "obligatoire" et qu'il n'existe "pas d'alternative non-animale".

Objectifs

Depuis plus de vingt ans, il est clairement établi que des systèmes de régulation situés dans l’hypothalamus jouent un rôle central dans le contrôle de l’équilibre énergétique et glycémique de l’organisme. Un dysfonctionnement de l’un de ces systèmes pourrait ainsi contribuer au développement de maladies métaboliques telles que l’obésité et le diabète de type 2. Ces pathologies sont étroitement liées, donnant naissance au terme « diabésité ». Aujourd’hui elles touchent des centaines de millions de personnes dans le monde et constituent un enjeu majeur de santé publique. Ainsi, mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces maladies permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et de nouveaux traitements pour leur prévention et leur prise en charge. Néanmoins, notre connaissance des réseaux de neurones et systèmes moléculaires impliqués dans ces processus de régulation reste encore très limitée. Ce projet s’intéresse plus particulièrement à une population de neurones hypothalamiques impliqués dans la régulation de la balance énergétique et glucidique. Ces observations nous ont conduits à proposer le présent projet. Celui-ci vise à étudier chez des souris rendues obèses et diabétiques les altérations du fonctionnement, de l’activité et de la signalisation de ce réseau de neurones, dans son rôle régulateur de la glycémie. L’objectif est donc de déterminer si ce circuit neuronal peut représenter une cible thérapeutique pertinente pour améliorer le contrôle de la balance énergétique et glycémique dans un contexte d’obésité et de diabète de type 2.

Bénéfices attendus

De récentes études ont permis d’élucider le rôle et le fonctionnement d’une population neuronale dans la régulation de la balance énergétique et glucidique en condition physiologique. L’objectif de cette présente étude est donc d’étudier les potentielles altérations fonctionnelles, et potentiels défauts de l’activité électrique et de signalisation de cette population de neurones en condition pathologique d’obésité/diabète. Ces recherches apparaissent cruciales non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi dans la lutte contre la pandémie de « diabésité », afin de proposer des solutions innovantes dans la prévention, la prise en charge et le traitement de ces maladies.

Procédures

- Afin d'activer ou d'inhiber les neurones à 26RFa ou bien d’administrer des composés pharmacologiques dans le système nerveux central, les animaux subiront une chirurgie réalisée sous anesthésie / analgésie durant 40 minutes. - Pour établir le profil glycémique des souris, leur glycémie sera suivie par un prélèvement sanguin à l’extrémité de la queue, pendant moins de 10 secondes toutes les 15 minutes, au cours de sessions expérimentales de deux heures. Chaque animal sera soumis à 6 expérimentations au maximum, chacune espacée d’une semaine de repos. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés individuellement durant 15 jours dans des cages d’enregistrement, permettant d'évaluer les paramètres métaboliques, avant d’être réunis avec leurs congénères préalablement connus. - Afin de prélever des tissus à l’issus des tests physiologiques, les animaux subiront une chirurgie terminale sous profonde anesthésie / analgésie.

Impact sur les animaux

Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chronique chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. - Afin d'être génotypés, les animaux subiront une biopsie de l'extrémité de la queue. Nuisances prévues : douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique et potentielle infection prévenue par la désinfection systématique des plaies. - Afin de moduler l’activité de la population neuronale d’intérêt, les souris subiront une chirurgie. Nuisances prévues : douleurs post opératoires minorées par des analgésiques. - Afin de suivre la glycémie, les animaux subiront une mise à jeun avant chaque test physiologique et une incision à l’extrémité de la queue permettant la ponction de gouttes de sang. Nuisances prévues : perte de poids consécutive à la mise à jeun dont le retour à la normale sera surveillé après chaque test, une semaine de repos minimum entre chacun d'entre eux ; douleur à l’incision couverte par l’application locale d’analgésique et potentielle infection prévenue par la désinfection systématique des plaies. - Pour le suivi métabolique, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages d’enregistrement. Nuisance prévue : hébergement individuel des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, minoré par un temps de test le plus court possible et une mise à mort qui suit immédiatement le test.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèver les organes.

Remplacement

Afin de mieux comprendre la physiopathologie de l’obésité/diabète, et de caractériser dans ce contexte le fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines dans leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme, l’utilisation d’un modèle in vivo intégré est obligatoire. Il est nécessaire de pouvoir étudier la communication qu’il existe entre le système nerveux et les systèmes périphériques de l’organisme afin de comprendre l’influence du premier sur le second ; dans notre cas l’influence du réseau de neurones à 26RFa/orexines sur la régulation de la glycémie et du métabolisme énergétique (tel le comportement alimentaire ou l’activité physique). La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. Il n’existe alors à ce jour pas d’alternative non-animale.

Réduction

Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, une planification expérimentale a été réalisée en amont. De plus, pour chaque expérience, le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé afin d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés. Anticiper ainsi les effectifs adaptés permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, de diminuer le risque de devoir répliquer une expérience avec de plus gros effectifs ainsi que le double emploi. Ces estimations ont été réalisées avec le site BiostaTGV® qui calcule le nombre d’animaux requis en fonctions de plusieurs paramètres : la force de l’effet attendu, la variabilité entre individus, et les paramètres statistiques souhaités. Le design de nos expérimentations prévoit quand cela est possible (différents tests physiologiques par exemple) qu’une souris subisse successivement différents tests, réduisant de ce fait de façon significative le nombre de groupe d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Ils seront maintenus à un minimum de trois par cage pour éviter l’isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. La taille des cages est réglementaire. L’état général des animaux sera quotidiennement évalué et les signes de mal-être seront surveillés attentivement. L’établissement de points limites nous permettra de veiller au bon suivi des animaux et de leur apporter au besoin les soins adéquats. Si les points limites sont dépassés, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et l’animal sera en fonction des cas, écarté des expérimentations ou mis à mort. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie/analgésie (locale ou générale). Il sera prévu, pour les animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, une période de rétablissement minimum d’une semaine entre chaque test, leur permettant une stabilisation de leur poids corporel et la reconstitution initiale de leur volume sanguin après prélèvement.

Choix des espèces

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre d’étudier la physiopathologie de l’obésité/diabète, et de caractériser dans ce contexte le fonctionnement des réseaux de neurones hypothalamiques à 26RFa/orexines dans leur rôle de régulateur de la glycémie et du métabolisme. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, utiliser cet animal nous permet de pouvoir imaginer une recherche translationnelle, les innovations thérapeutiques proposées seront donc potentiellement applicables à l’Homme dans le futur. La souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.

Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 70 d'entre elles recevant en plus un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Elles subissent des injections d'insuline, de glucagon, d'adrénaline et de dexaméthasone, des mesures de pression artérielle en tube de contention, des échographies cardiaques sous anesthésie et des transferts entre trois établissements. Toutes sont tuées après les seize semaines pour prélever des organes, une partie de ces prélèvements étant redistribuée à d'autres chercheurs du laboratoire pour des mises au point techniques.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.