Système nerveux
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Influence de la stimulation vagale sur la Restauration Cognitivo-motrice et la Modulation Inflammatoire Post-Traumatisme Crânien.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
95 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un poids est lâché sur leur crâne pour reproduire un traumatisme crânien, avec des fractures et des apnées attendues dont certaines peuvent se compliquer d'un arrêt cardiaque, puis une électrode est posée autour du nerf vague dans le cou et retirée après une séance de stimulation vraie ou simulée. Vingt souris servent uniquement à ce que les expérimentateurs s'entraînent aux deux gestes, et l'effectif intègre une mortalité anticipée de 20 %. Le porteur espère que la stimulation réduira l'étendue de la lésion et conclut que ces informations sont "impossibles à générer autrement qu'avec l'utilisation d'animaux".
Objectifs
Chaque année, les traumatismes crâniens touchent environ 55 millions de personnes dans le monde. Ils sont principalement causés par les accidents de la route et les chutes. Un grand nombre de ces patients conservent des séquelles durables, affectant leurs fonctions motrices, cognitives, comportementales ou psychologiques. Ces troubles entraînent une altération significative de leur qualité de vie. À ce jour, les solutions thérapeutiques disponibles – qu’elles soient médicales, chirurgicales ou issues de la rééducation – ne permettent pas de prévenir efficacement la mort neuronale, à l’origine de ces déficits. Il est donc essentiel d’explorer de nouvelles approches. L’une des pistes actuellement étudiées par notre laboratoire repose sur la stimulation du nerf vague. Ce nerf, situé au niveau du cou, est capable de transmettre des signaux au cerveau. Lorsqu’il est stimulé par des impulsions électriques délivrées par une électrode, ces signaux peuvent modifier l’activité de certaines régions cérébrales, notamment celles impliquées dans le contrôle du mouvement. Cette technique est déjà utilisée en pratique clinique pour traiter des pathologies telles que l’épilepsie, la dépression ou les migraines, tant chez l’animal que chez l’humain. Elle pourrait également représenter une solution prometteuse pour les traumatismes crâniens puisqu’elle permettrait d’amplifier la récupération motrice des rongeurs et de l’Homme après un accident vasculaire cérébral. Certaines études de traumatismes crâniens chez les rongeurs vont également dans ce sens à la fois pour les capacités motrices et cognitives lorsque la stimulation est réalisée plus tardivement. De surcroît, plusieurs études rapportent que cette stimulation diminuerait l’inflammation du cerveau, qui est l’une des causes de l’aggravation des lésions tant sur les modèles d’accident vasculaire cérébral que de traumatisme crânien. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de la stimulation du nerf vague dans les suites précoces d’un traumatisme crânien chez la souris. L’étude portera à la fois sur la réponse inflammatoire du cerveau après le traumatisme, et la récupération des fonctions motrices, cognitives et psychiques. En favorisant une récupération plus complète via la stimulation du nerf vague, cette approche innovante contribuerait à améliorer leur qualité de vie et à réduire les séquelles à long terme.
Bénéfices attendus
D’après nos hypothèses, nous prévoyons qu’une séance de stimulation dans les heures qui suivent le traumatisme crânien, devrait réduire l’étendue et la sévérité de la lésion en modulant la réponse des acteurs de l’inflammation ce qui contribuerait à restaurer un environnement favorable au bon fonctionnement des neurones. Nous espérons que cette intervention se traduira, à terme, par une amélioration des capacités motrices, cognitives et comportementales. Le parallèle entre les mécanismes impliqués dans le traumatisme crânien et ceux observés lors d’un accident vasculaire cérébral renforce la crédibilité de cette approche. En effet, les bénéfices observés dans les modèles expérimentaux d’accident vasculaire cérébral sont encourageants et confortent notre démarche. Ce projet ouvre ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des patients touchés par un traumatisme crânien, offrant un espoir d'une récupération optimale.
Procédures
Dans cette étude, les souris subiront deux interventions chirurgicales : la première consiste à reproduire un traumatisme crânien, et la seconde à placer une électrode autour d’un nerf situé dans le cou, appelé nerf vague. Cette électrode permet d’envoyer, ou non, de légères stimulations électriques selon les groupes. Elle sera retirée à la fin de la chirurgie, après la séance de vraie ou de fausse stimulation. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale, et les animaux recevront des médicaments contre la douleur avant et après l’intervention. Un suivi attentif sera mis en place pour surveiller leur état de santé et repérer tout signe de souffrance. Certaines souris ne subiront pas de traumatisme crânien mais auront par les mêmes étapes de chirurgie à l’exception de la chute du poids. De même, certaines souris ne recevront pas de stimulation électrique malgré la pose de l’électrode mais suivront les mêmes étapes chirurgicales que celles stimulées. Au total, 95 souris seront impliquées dans le projet : – 10 seront utilisées pour s’entraîner à la procédure du traumatisme crânien – 10 pour s’entraîner à la pose de l’électrode – 25 auront uniquement une incision sans traumatisme crânien – 50 auront un traumatisme crânien – 25 recevront la stimulation du nerf vague après implantation – 50 auront l’implantation de l’électrode sans stimulation Pour mesurer les effets des interventions, des tests du comportement seront réalisés. Ces tests évaluent les mouvements, les réflexes et les capacités de mémoire des souris. Deux outils seront principalement utilisés : – un test neurologique permettant d’évaluer les séquelles motrices, cognitives et les réflexes sur 85 souris, réalisé entre 4 à 8 fois selon les groupes ; – un test de reconnaissance d’objets, permettant d’évaluer la mémoire spatiale sur 51 souris, réalisé deux fois avant le traumatisme, puis quatre fois après. À la fin du protocole, les animaux seront profondément anesthésiés en ayant préalablement reçus une dose d’anti-douleur, puis mis à mort pour permettre des prélèvements du cerveau destinés à l’analyse des tissus cérébraux.
Impact sur les animaux
Lors de la chirurgie du traumatisme crânien et dans les minutes suivant celui-ci, des fractures du crâne, des apnées inférieures à 5 secondes, dont certaines peuvent se compliquer d’un arrêt cardiaque, peuvent être attendus.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort afin d’étudier leur cerveau et de comparer entre elles les différences de taille de lésion, de réponse des acteurs de l’inflammation, et de la survie des neurones.
Remplacement
Cette étude ne peut être réalisée chez l'être humain car cela nécessiterait une analyse post-mortem immédiate du cerveau. Les mécanismes pathologiques consécutifs au traumatisme crânien et les séquelles motrices et cognitives post-traumatiques sont trop complexes pour être étudiés in vitro (système cellulaire ou tranche de cerveau) ou in silico (modélisation par un programme informatique). Les informations qui seront recueillies dans cette étude sont donc impossibles à générer autrement qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Ce projet est conçu de manière à n’utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux, tout en garantissant la fiabilité des résultats. En effet, il est bien établi dans la littérature scientifique que les comportements et les réactions inflammatoires du cerveau peuvent varier fortement d’un individu à l’autre après une lésion cérébrale, en particulier dans le cas du traumatisme crânien. Cette variabilité naturelle impose d’inclure un nombre minimal d’animaux pour pouvoir détecter des différences significatives entre les groupes étudiés. Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé par des test statistiques adaptés en tenant compte de la fiabilité des tests comportementaux utilisés, de notre expérience acquise dans des études précédentes, et des recommandations présentes dans la littérature scientifique actuelle. Ainsi, l’effectif théorique de 8 souris dans chacun des 3 groupes pour la partie 1 et l’effectif de 17 souris par groupe (3 groupes) dans la seconde partie permettra de mettre en évidence des différences en prenant en compte une mortalité maximale de 20%. Ce modèle de traumatisme crânien a été choisi en raison d’un taux de mortalité réduit en comparaison aux autres modèles avec des lésions cérébrales identiques permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés et la souffrance en permettant une récupération fonctionnelle rapide. De plus, nous anticipons les éventuelles complications post-opératoires afin de garantir les meilleures conditions de récupération pour les animaux, permettant ainsi de réduire les pertes animales, de favoriser une récupération rapide, et donc de limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires, tout en veillant à leur bien-être.
Raffinement
Avant l’entrée dans l’étude, afin de diminuer le stress de l'animal, nous réaliserons du "Handling", c’est-à-dire une habituation au contact de la main de l’expérimentateur, ainsi qu’une habituation préalable aux tests comportementaux. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrière. Les cages sont enrichies d’un tunnel afin de limiter l’ennui de l’animal et de favoriser son enrichissement cognitif. Pour éviter tout stress inutile, les cages seront placées dans une pièce calme et isolée du bruit extérieur. Le suivi des animaux sera effectué trois fois par jour en semaine, et une fois par jour les week-ends et jours fériés, tout au long du projet. Cette surveillance commencera avant l’opération et se poursuivra jusqu’à la fin de leur participation à l’étude. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et des médicaments contre la douleur seront également administrés avant et après l’opération afin que les animaux ne ressentent aucune douleur pendant et après l’intervention. L’état de chaque animal sera contrôlé régulièrement, toutes les six heures après la chirurgie, grâce à une échelle spécifique appelée Mouse Grimace Scale, qui permet de détecter la douleur chez la souris de façon fiable. Seules des personnes spécialement formées et expérimentées seront autorisées à pratiquer les opérations et à surveiller le bien-être des animaux. Le bien-être des animaux est au cœur de nos préoccupations, et toute douleur ou signe de souffrance fera l’objet d’une prise en charge immédiate. Depuis leur arrivée jusqu’à la fin de leur prise en charge, tout sera mis en œuvre pour respecter les principes éthiques et garantir aux animaux des conditions de vie adaptées et aussi confortables que possible.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est un mammifère non primate proche génétiquement de l’Homme : son degré́ d’homologie avec l’Homme est donc très élevé́. De fait, la souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser des lésions cérébrales acquises et le niveau de compréhension du fonctionnement de leur organisme et de leur cerveau est très avancé. L’anatomie du système nerveux et son fonctionnement proche de celui de l’Homme en font un très bon modèle pour le traumatisme crânien. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifère (autres groupes de vertébrés ou invertébrés) ne permettrait pas d’obtenir des résultats aussi pertinents. Les animaux seront âgés de 16 à 24 semaines en début du protocole, ce qui correspond à la maturité́ cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des souris adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité́ des données déjà̀ disponibles dans la littérature scientifique sur les modèles de traumatisme crânien. Cet âge nous semble cohérent souhaitant être au plus proche des traumatismes crâniens par accident de la route chez l’Homme survenant majoritairement chez l’adulte de plus de 15 ans.
Obtention d’une lignée simple transgénique à deux génotypes non dissociables
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un prélèvement de poils sous anesthésie sur chaque souris des deux premières générations : c'est la seule procédure décrite pour un élevage de 1 200 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet du projet est de fabriquer une lignée transgénique portant deux modifications indissociables, destinée à d'autres travaux sur les enzymes qui font communiquer cellules cérébrales et vaisseaux sanguins. Le porteur écrit qu'aucune souris ne sera élevée en excès ou sans raison, tout en prévoyant la mise à mort de celles dont le génotype ne présente pas d'intérêt. Celles qui portent le génotype recherché restent en vie, pour la reproduction ou pour être versées à des expériences ultérieures.
Objectifs
L’objectif est d’obtenir une lignée de souris modifiées, avec deux caractéristiques non différenciables, destinée à être utilisée dans des projets de recherche scientifique. Ces souris sont des outils précieux en recherche médicale, particulièrement utiles pour comprendre comment certains gènes agissent dans différentes parties du corps et à différents moments. Elles nous aideront à mieux comprendre le rôle et le fonctionnement de certaines enzymes impliquées dans la communication entre les cellules du cerveau et les vaisseaux sanguins, que ce soit en situation normale ou en cas de maladie. L’objectif final est de proposer des traitements mieux adaptés. Le bien-être des animaux sera suivi attentivement pour vérifier si ces modifications entraînent ou non des effets indésirables. Toutefois, d’après la manière dont ces souris ont été conçues, aucun effet négatif n’est attendu.
Bénéfices attendus
Etablir une lignée de souris modifiées possédant deux caractéristiques particulières qui ne peuvent pas être différenciées. Élever cette lignée a pour but de disposer d’un modèle fiable et spécifique pour étudier le rôle d’un gène ou d’un type de cellule dans un tissu ou un organe précis. Cela aidera à mieux comprendre certains mécanismes biologiques ou liés à des maladies, en lien avec les projets de recherche. Dans un premier temps, les chercheurs vérifieront que la modification apportée fonctionne comme prévu. Ensuite, les souris seront utilisées dans des expériences ciblées pour répondre aux questions posées par ces projets. Ce type de modèle permet d’obtenir des résultats plus précis, de limiter les erreurs et, à long terme, de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. Il pourra aussi être utilisé dans d’autres projets ou collaborations, ce qui renforce son intérêt scientifique.
Procédures
Prélèvement de poils sous anesthésie. Tous les animaux de première et deuxième génération seront concernés jusqu'à ce que la lignée soit établie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement liées aux manipulations (ex: génotypage), et restent légères. Aucun effet indésirable majeur n’est prévu du fait de la modification génétique, mais un suivi clinique sera mis en place pour détecter tout phénotype inattendu. Des mesures seront prises si des signes de souffrance ou de gêne apparaissent, en accord avec les critères d’arrêt définis.
Devenir
Les souris de génotypes qui ne sont pas d'intérêt seront mise à mort ou utilisé pour de la mise au point dans le cadre des projets de recherches. Les autres souris serviront à la reproduction ou à l'expériementation.
Remplacement
À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris modifiées pour atteindre les objectifs des projets de recherche. Les expériences réalisées en laboratoire sur des cellules ou par ordinateur ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. L’utilisation de ces souris reste donc nécessaire pour comprendre certains mécanismes biologiques, notamment les effets de certaines modifications dans un corps vivant. Dans ce cadre, ce modèle reste indispensable.
Réduction
Le nombre de souris élevées est strictement limité aux besoins réels des projets de recherche et au maintien de la lignée. Aucun animal ne sera produit en excès ou sans raison. La reproduction est planifiée de façon centralisée et régulièrement ajustée en fonction des demandes des chercheurs et du responsable de l’élevage. Des outils de suivi permettent d’éviter les excédents. Quand c’est possible, les animaux sont partagés entre différents projets ayant des besoins similaires, pour éviter de faire plusieurs élevages séparés. Si certains animaux produits ne sont pas utilisés, la nécessité de poursuivre les prochaines portées est systématiquement réévaluée.
Raffinement
L’environnement des souris sera adapté aux besoins spécifiques de cette nouvelle lignée. Pour l’identification génétique, un simple prélèvement de poil sera préféré à une méthode plus invasive. Le bien-être des animaux sera contrôlé deux fois par jour en semaine, et une fois par jour les week-ends et jours fériés, par du personnel qualifié. Si un effet indésirable devait apparaître chez certains descendants, une surveillance renforcée sera mise en place pour les premières générations. L’état de santé des souris sera évalué chaque jour selon une méthode standard, incluant l’observation de leur comportement, de leur poids, de leur aspect général et d’autres signes spécifiques liés au modèle utilisé. En cas de problème ou de souffrance, une intervention rapide sera déclenchée, selon des critères établis avec le vétérinaire. Lors des prélèvements et de l’identification, les animaux seront endormis avec un gaz anesthésiant pour éviter toute douleur. Le personnel est formé pour manipuler les souris avec douceur et effectuer les gestes rapidement. Après chaque prélèvement, une surveillance sera assurée pour vérifier qu’il n’y a pas de complications.
Choix des espèces
La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Son utilisation est essentielle pour étudier finement le rôle de certaines enzymes dans les interactions entre les cellules du cerveau et les vaisseaux sanguins. Elle permet de contrôler précisément leur activité, d’observer leurs effets dans un organisme vivant, et de tester des traitements potentiels. Cette approche, qui combine plusieurs domaines de recherche, est indispensable pour avancer vers des thérapies mieux adaptées aux maladies du cerveau. Les animaux seront génotypés à 4 semaines de vie.
Impact de l’exposition précoce à un insecticide sur le développement cérébral chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour mesurer si un insecticide perturbe la formation de la myéline dans le cerveau en développement, 1 636 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes reçoivent de la deltaméthrine dans leurs croquettes du septième jour de gestation au vingt-deuxième jour après la naissance, leurs petits sont séparés d'elles vingt minutes pour être comptés et sexés, puis testés à l'âge adulte sur l'activité locomotrice pendant vingt-quatre heures, l'anxiété, les interactions sociales et la mémoire spatiale. Les descendants et les mères sont tués pour prélever les cerveaux, seules seize souris servant d'inconnues dans le test social pouvant être réutilisées ailleurs. Le porteur attend des effets modérés sur le développement cérébral et le comportement des souriceaux exposés, sans impact selon lui sur leur bien-être général, et annonce une surveillance toutes les 48 heures assortie de points limites déclenchant la mise à mort.
Objectifs
Les troubles du neurodéveloppement tels que les déficits d’apprentissage, les troubles de l’attention et les troubles du spectre autistique touchent de nombreux enfants et représentent un problème de santé publique majeur. Souvent associés à des handicaps durables, ils sont en partie attribués à l’exposition aux polluants environnementaux durant le développement cérébral qui s’étend de la vie fœtale à l’adolescence. Parmi ces polluants, les pesticides, largement utilisés en agriculture pour améliorer les rendements et assurer la sécurité alimentaire, sont aussi couramment employés dans les habitations pour lutter contre les nuisibles. Leur usage intensif n’est pas sans conséquences pour la santé humaine et l’environnement. Des initiatives visent à réduire leur usage et à remplacer les substances les plus toxiques. Cela a conduit à une utilisation accrue d’insecticides plus récents. Ils contaminent désormais une grande partie de la population, y compris les femmes enceintes et les enfants. Certaines études indiquent un lien entre exposition précoce à ces insecticides et des troubles du neurodéveloppement, mais les mécanismes restent inconnus. Parmi les étapes clés du développement cérébral, la myélinisation est un processus par lequel une gaine riche en lipides se forme autour des fibres nerveuses. Toute perturbation de la mise en place de la myéline peut contribuer aux troubles du neurodéveloppement. Ce projet étudiera l’impact d’une exposition précoce à un insecticide récemment développé sur la myélinisation cérébrale chez la souris. Le pesticide sera administré aux souris pendant la gestation et l’allaitement par l’alimentation. Ses impacts seront évalués chez les descendants à différents stades de développement par plusieurs approches expérimentales. Ces travaux visent à mieux comprendre les effets de ces composés pour éclairer les décisions concernant la régulation des pesticides.
Bénéfices attendus
L’utilisation croissante de certains insecticides dans l’agriculture a conduit à une exposition généralisée de la population, y compris les femmes enceintes et les enfants. C’est pourquoi il est nécessaire de mieux comprendre leurs effets possibles sur la santé, notamment pendant les périodes où le cerveau se développe rapidement. Ce projet vise à combler une lacune importante : on en sait encore très peu sur la manière dont ces insecticides pourraient perturber la formation de la myéline, une gaine protectrice qui entoure les fibres nerveuses et joue un rôle clé dans le bon fonctionnement du cerveau. Une myéline anormale peut contribuer à l’apparition de troubles du développement. Ces recherches permettront d’apporter de nouvelles informations sur les effets des insecticides sur le cerveau en développement. Elles aideront aussi à mieux évaluer les risques liés à ces substances et à mieux protéger les personnes les plus vulnérables comme les enfants. Enfin, les résultats pourront éclairer les décisions des autorités pour une utilisation plus sûre des pesticides.
Procédures
Les souris seront soumises à une série de tests comportementaux à l’âge adulte, répartis sur plusieurs jours. Les tests incluent l’évaluation de l’activité locomotrice (24 h), de l’exploration et de l’anxiété (environ 10 min), des interactions sociales (5 min) et de la mémoire spatiale (4 jours consécutifs de test d’environ 10 min/jour). Lors de la mise à mort, l’anesthésie et l’analgésie seront réalisées par injection sous-cutanée (moins d’une minute chacune). La perfusion intracardiaque dure environ 7-8 minutes.
Impact sur les animaux
Les croquettes contenant le pesticide pourraient perturber la prise alimentaire et entraîner une perte de poids. Un stress pourra être engendré par la séparation des souriceaux nouveaux-nés de leurs mères pendant environ 20 minutes lors de l’étape de comptage des souriceaux, de détermination de leur sexe et d’homogénéisation des portées le jour suivant la naissance. La contention des souris pour réaliser les injections sous-cutanées pourrait également être source de stress correspondant à la durée du geste c’est à dire moins d’une minute. Chez les souriceaux exposés, des effets modérés sur le développement du cerveau sont attendus, pouvant influencer leur comportement (anxiété, mémoire, relations sociales), sans impact sur leur bien-être général ni sur leurs fonctions vitales.
Devenir
A la fin de la procédure visant à vérifier l’absence de modification de l’appétit des souris nourries aux croquettes contenant l’insecticide, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés. Du sang sera également prélevé pour mettre au point le dosage de l’insecticide. A la fin de la procédure d’exposition pendant la gestation et l’allaitement, tous les descendants seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour réaliser différentes analyses. Les mères seront mises à mort au moment du sevrage. Les animaux utilisés comme « souris inconnues » dans le test d’interactions sociales pourront être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
La myélinisation est un processus développemental long et complexe impliquant de nombreuses interactions cellulaires entre les différents types cellulaires cérébraux et dépendant également de facteurs circulants tels que les hormones. Pour cette raison, son étude ne peut être envisagée qu’« in vivo ». De plus, l’exposition par voie orale chez l’animal constitue à ce jour le modèle le plus pertinent pour reproduire la principale voie d’exposition chronique à la deltaméthrine dans la population humaine.
Réduction
Au début du projet, une première étude sera réalisée pour vérifier que la présence de l’insecticide dans la nourriture n’affecte pas l’appétit des souris. Ceci permettra d’éviter d'utiliser inutilement un grand nombre d'animaux si les conditions ne sont pas optimales. Le nombre d'animaux prévu a été calculé en fonction de notre expérience pour chaque type d’analyse prévue. Ce nombre d’animaux sera suffisant pour appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions pour analyser les résultats obtenus. Plusieurs analyses seront réalisées à partir du même animal pour limiter leur nombre.
Raffinement
Les souris adultes non gestantes, les mères et les souriceaux après sevrage seront hébergés en groupes sociaux stables, afin de limiter tout stress et modification de hiérarchie. Les souris femelles utilisées présentent d’excellentes qualités maternelles, ce qui permettra de minimiser le stress et la souffrance des petits. La méthode d’exposition des animaux à l’insecticide par incorporation dans les croquettes, non invasive, ne générera pas de stress ou de souffrance. Au cours des tests comportementaux, des précautions seront prises pour minimiser le stress des animaux et assurer la qualité et l’exploitabilité des résultats, incluant des sessions d’habituation aux enceintes. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale et après administration d’un analgésique. Des points limites sont définis pour anticiper et prendre en charge la détresse et la douleur. Une surveillance toutes les 48h (ou 72h du vendredi au lundi), sera mise en œuvre incluant l’observation de l’apparence, de signes cliniques et du comportement des animaux. Un score sera établi pour évaluer un éventuel stress et/ou douleur et le prendre en charge de manière adaptée selon la gravité à l’aide de grilles pour lesquelles des points limites ont été définis. Si les points limites sont atteints, nous procéderons au renforcement de la surveillance ou à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Les souris sont couramment utilisées pour ce type d’étude. De plus, le laboratoire dispose d’une expertise spécifique sur ce modèle, ainsi que des outils nécessaires à l’étude des anomalies de la myéline. Au début du projet, des souris femelles adultes âgées d’environ 3 mois seront utilisées afin de vérifier que l’incorporation de l’insecticide dans les croquettes n’a pas d’influence sur l’appétit de souris. Ce stade a été choisi car, par la suite, les souris exposées directement à l’insecticide seront des femelles adultes gestantes d’un âge comparable. L’exposition à l’insecticide sera réalisée pendant la gestation et l’allaitement, de la 7ᵉ journée de gestation jusqu’au 22ᵉ jour postnatal. Cette période a été choisie pour cibler le développement cérébral. Elle couvre également une période critique où le cerveau est particulièrement sensible aux influences extérieures. Les stades auquels seront réalisées les différentes analyses ont été choisis en fonction des périodes auxquelles se produisent les évènements étudiés. Pendant les 3 premières semaines après la naissance, les cellules responsables de la synthèse de myéline seront étudiées. La formation de myéline sera suivie jusqu’à l’âge adulte. Enfin, des tests comportementaux seront réalisés chez les souris adultes afin d’évaluer les impacts à long terme de l’exposition pendant le développement.
Etude des mécanismes neuronaux de l’apprentissage moteur itératif chez la Souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 souris vont être utilisées, chacune subissant une chirurgie du crâne de quatre-vingt-dix minutes puis, jusqu'à deux mois durant, trente minutes par jour la tête fixée dans un dispositif. Une partie d'entre elles est opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil, les autres relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélever leur cerveau. L'apprentissage étudié consiste à souffler de l'air sur l'œil de l'animal après un signal lumineux, jusqu'à ce qu'il ferme la paupière au signal seul. Le porteur situe ce travail dans la recherche fondamentale et renvoie à un repérage seulement "possible" de pathologies de l'apprentissage.
Objectifs
Le cerveau est composé de très nombreuses cellules nerveuses qui communiquent entre elles via des synapses. La recherche fondamentale en neurosciences vise à comprendre comment ces éléments relativement simples mais nombreux peuvent se concerter pour assurer les fonctions complexes du cerveau. Ce projet s'intéresse à l'apprentissage de gestes par la répétition, un processus présumé impliquer une partie du cerveau appelé le cervelet. Il existe plusieurs théories qui tentent d'expliquer la concertation des cellules nerveuses pour permettre ce type d'apprentissage. L'objectif de ce projet est de mener des mesures au cours d'un apprentissage progressif chez la souris pour tester les théories concurrentes. L'apprentissage étudié consiste en un clignement de la paupière en réponse à un petit souffle d'air dirigé vers l'oeil. Si de façon répété le souffle d'air est précédé par un signal lumineux, initialement sans effet, l'animal développe un clignement suite au signal lumineux avant même que le souffle n'ait lieu. Il est connu que le cervelet intervient dans cet apprentissage. Nous mesurerons l'activité des cellules nerveuses pendant l'apprentissage. Dans d'autres expériences, nous influencerons leur activité pour voir si et comment l'apprentissage est modifié. En parallèle, nous quantifierons le nombre de certaines protéines d'intérêt aux synapses du cervelet. Ces mesures et manipulations nous permettront de tester l'adéquation des théories différentes et si besoin était en proposer de nouvelles. L'apprentissage est un processus primordial dans le fonctionnement du cervelet et notre projet vise à approfondir nos connaissances des mécanismes sous-jacentes.
Bénéfices attendus
Le fonctionnement détaillé du cerveau reste largement inconnu et constitue aussi un chantier central pour la compréhension de cerveau ainsi que de ses dysfonctionnements. Notre projet vise à comprendre au niveau synaptique, cellulaire et du réseau l'apprentissage et optimisation de mouvements par la répétition. Au delà de l'importance de cette problématique spécifique et l'intérêt de ce type de travail pour la recherche fondamentale, il est possible qu'à terme la compréhension des mécanismes de l'apprentissage nous permettrait d'identifier des pathologies liées aux dysfonctionnements de l'apprentissage et/ou proposer des thérapies basées sur l'apprentissage.
Procédures
Une partie des animaux seront impliqués dans une chirurgie (90 minutes) au niveau du crane et du cerveau sous anesthésie et analgésie. Après récupération ils suivent un protocole d'apprentissage et des mesures d'activité neuronale (30 minutes par jour) pendant une période allant jusqu'à 2 mois. D'autres animaux sont impliqués dans une procédure (45 minutes) sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus ou envisageables sont les suivants. Stress (estimé faible) lié à l'hébergement, à la manipulation, à la contrainte d'être maintenue tête fixe, au jet d'air, au gêne dû à l'implant. Pendant la chirurgie, des évènements rares : anesthésie insuffisante, détresse respiratoire, douleur, écart de température, saignement. En période post-opératoire, des évènements rares : douleur, écart de température, infection, notamment des plaies autour de l'implant, signe neurologiques dus à l'implantation de l'électrode ou l'injection de virus. Avant l'euthanasie, des évènements rares : anesthésie insuffisante, douleur, détresse respiratoire, saignement.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux dans toutes les procédures est nécessaire afin de permettre le prélèvement du cerveau pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Le projet vise à comprendre les l'apprentissage moteur. Une analyse théorique préalable a permis de faire des hypothèses précises, mais les tester nécessite des mesures lors du comportement, in vivo. Des techniques de modélisation seront utilisées pour analyser les résultats et pour concevoir les expériences suivantes. Cela optimisera le rendement de l'expérimentation animale. Les expériences in vitro visent à étudier l'implication du cervelet dans cet apprentissage et nécessitent de prélever le tissu chez l'animal après l'apprentissage in vivo. Des méthodes de culture ne sauraient reproduire la structure 3-dimensionnelle du cervelet ni l'influence de l'expérience de l'animal.
Réduction
En total 200 souris seront nécessaire pour ce projet. Les effectifs ont été estimés suivant un calcul de puissance basé sur des expériences précédentes. Une analyse statistique optimisée sera appliquée pour interpréter de manière fiable les résultats.
Raffinement
Les animaux commandés auprès d'un fournisseur agréé externe bénéficient d'une semaine d'acclimatation suivant leur arrivée. Tous les animaux sont hébergés dans une animalerie respectant l'ensemble de normes sur la température (régulée à 22 C), ventilation (salle d'hébergement centrale en surpression), hygrométrie (55 pourcent), nourriture et eau ad libitum, change de litière (hebdomadaire), socialisation (plusieurs souris par cage, maximum 6), vérification quotidienne. Enrichissement avec papier Kraft ou de type igloo. Avant la chirurgie, les animaux sont habitués progressivement à la présence de et à la manipulation par l'expérimentateur (4 séances minimum). La chirurgie a lieu sous anesthésie et avec administration d'un analgésique péri- et postopératoire. L'ensemble des interventions ont été regroupées afin de pratiquer une seule chirurgie. La récupération post-opératoire est aidée par un tapis chauffant. Les animaux opérés bénéficient d'un temps de récupération (minimum une semaine). Avant les expériences comportementales, les animaux sont habitués progressivement au poste expérimental. Un comportement où le renforcement n'est que légèrement aversif (un bref jet d'air vers l'oeil) a été sélectionné. Pour l'euthanasie avant le prélèvement du cerveau, une anesthésie profonde est pratiquée. Des points limites adaptés ont été définis pour l'ensemble des phases du projet et seront appliqués.
Choix des espèces
La Souris représente un modèle important des mammifères, fournit une grande partie des travaux de la littérature existante sur lesquels le projet se base, offre des outils génétiques optimisés. Les procédures expérimentales ont été optimisées chez la Souris pour réduire la souffrance des animaux. Le projet utilise des souris adultes exclusivement, âgées au 2--3 mois. Le projet vise à comprendre les mécanismes d'apprentissage de l'adulte.
Etude multimodale de la comorbidité inflammation périphérique chronique et trouble de l’usage d’alcool.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Choisis parce qu'ils boivent de l'alcool de façon stable et prévisible dans les protocoles d'auto-administration, 608 rats mâles et femelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une injection dans la patte arrière entretient une inflammation pendant deux mois, à quoi s'ajoutent des chirurgies abdominales, sous-cutanées ou intracérébrales de trente minutes à deux heures, des prises de sang sublinguales et trois séances d'IRM fonctionnelle d'une heure sous anesthésie. Le porteur annonce des douleurs postopératoires de trois jours, un risque infectieux au site d'incision et une douleur à la patte enflammée. Tous les rats sont tués à la fin de leur procédure, pour prélever du tissu ou vérifier que les canules et les lentilles implantées se trouvaient au bon endroit.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment une inflammation périphérique chronique influence les comportements de consommation d’alcool chez le rat, en tenant compte des différences entre mâles et femelles. Nous combinerons des approches comportementales, physiologiques, d’imagerie cérébrale et de neurobiologie pour caractériser les mécanismes cérébraux impliqués dans cette comorbidité. Toutes les études se feront aussi bien chez les mâles que chez les femelles.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les interactions entre inflammation périphérique chronique et trouble de l’usage d’alcool (TUA), deux conditions fréquemment comorbides chez l’humain. En utilisant des approches précliniques chez le rat, ce travail permettra de caractériser les effets de l’inflammation sur les comportements de consommation d’alcool et sur les altérations fonctionnelles entre les structures responsables de la motivation à consommer et celles responsables du contrôle inhibiteur du comportement. L’étude intégrera des analyses différenciées selon le sexe, afin de mieux appréhender les éventuels mécanismes neurobiologiques spécifiques. Les mesures comportementales et d’IRM fonctionnelle réalisées sont directement transposables à l’humain, renforçant la valeur translationnelle de ce projet. L’exploration complémentaire de l’implication de la voie vagale permettra d’identifier de potentielles cibles périphériques pour moduler cette comorbidité. À terme, ce projet contribuera à l’identification de biomarqueurs et de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients souffrant de TUA associé à un état inflammatoire chronique.
Procédures
- Injection dans la patte arrière d'un produit pro-inflammatoire (1 fois, durée : 2 mois) - Chirurgies abdominale, sous-cutanée ou intra-cérébrale (1 fois chacune dans la majorité des cas, un seul groupe sera soumis à 2 chirurgies de 20 minutes chacune espacées de 1 à 2 semaines, durées de 30 minutes à 2h selon le type de chirurgie)- Anesthésie générale pour imagerie cérébrale - Prise de sang (sublingual) - IRM fonctionnelle (3 fois 1 heure espacées de 1 et 2 semaines).
Impact sur les animaux
Douleurs post-opératoire (3 jours), risque infectieux au site d'incision (5 jours), douleur à la patte inflammée (3-4 jours), perte de poids transitoire en post-opératoire (2 jours).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures pour soit permettre le prélèvement de tissu en post-mortem, soit pour vérifier les sites d'implantation des canules guide ou des lentilles.
Remplacement
Les modèles in vitro actuels (organoïdes, et organ-on-chips) ne permettent pas de rendre compte du lien complexe existant entre les organes périphériques et le cerveau, ainsi que de l’organisation complexe du cerveau nécessaires à l’étude des interactions entre le cerveau et les atteintes périphériques (inflammation chronique). L'animal dans son entièreté est le seul modèle disponible actuellement pour remplir les objectifs de ce projet.
Réduction
Nous avons mis en place une rationnalaisation de l'utilisation des animaux pour nous permettre d'obtenir des données comportementales, physiologiques et neurobiologiques sur les mêmes animaux nous permettant ainsi de réduire grandement le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Nous avons évalués le nombre d'animaux nécessaires dans chacun des groupes expérimentaux pour nous assurer d'une puissance statistique suffisante tout en utilisant le moins d'animaux, ceci basé sur les résultats déjà obtenus dans d'autres expériences réalisées soit au sein de notre laboratoire ou dans le laboratoire de nos collaborateurs.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans un environnement enrichi d'un tube en carton et d'une buchette en bois. De la musique sera diffusée en continu dans les pièces de stabulation. Les rats seront manu pilés tous les jours permettant un enrichissement inter-espèce. Les rats seront placés 5 jours par semaine dans une cage d'auto-administration permettant un enrichissement moteur (appui sur les leviers) et un enrichissement cognitif (apprentissage d'une tâche d'auto-administration nécessitant une planification de l'action). Au cours des différentes étapes, les soins appropriés seront apportés aussi bien pendant les phases de consommation que dans les périodes per-opératoires en respectant les points limites fixés et déterminés par une échelle de bien-être animal reconnue internationalement.
Choix des espèces
Le rat constitue le modèle le plus adapté pour ce projet, en raison de ses capacités d’apprentissage, de sa robustesse physiologique et de la richesse des données disponibles en neurosciences comportementales. Contrairement à la souris, le rat développe des comportements stables et fiables dans les protocoles d’auto-administration orale d’alcool, ce qui est essentiel pour modéliser le trouble de l’usage d’alcool (TUA) de manière pertinente. Par ailleurs, le rat présente une réponse plus homogène et plus facilement interprétable dans les modèles d’inflammation chronique et de douleur, avec une meilleure transposabilité aux phénomènes observés chez l’humain. Sa taille permet également l’implantation plus fiable de dispositifs de télémétrie permettant l'enregistrement d’un électrocardiogramme et d'un électro-encéphalogramme (EEG/ECG), la réalisation d’imagerie fonctionnelle cérébrale (IRM) de qualité, et l’utilisation de techniques comme l’imagerie calcique sur animal vigile. L’ensemble de ces éléments rend le rat indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Les rats arriveront au laboratoire à l'âge de 7 semaines et seront conservés pendant 5 à 6 mois. L'addiction à l'alcool ainsi que la douleur chronique apparait en général à l'âge adulte.
Prélèvements « invasifs » en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
105 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour un seul geste, l'amputation des deux millimètres distaux de la queue au sevrage, à vingt et un jours, en une dizaine de secondes. Ces souris portent une mutation identifiée chez deux jeunes patients atteints d'épilepsie sévère, et le porteur indique qu'elles font des crises récurrentes, sont hyperactives et se toilettent davantage. L'amputation se pratique sans anesthésie, le porteur estimant qu'une anesthésie générale serait "une nuisance additionnelle non justifiée" au regard de la gravité de la procédure. Celles qui n'ont ni le génotype ni le sexe voulus, seuls les mâles modifiés étant gardés, sont tuées "très rapidement", les autres après reproduction, à six mois au plus tard.
Objectifs
Notre projet a pour but de maintenir une lignée de souris génétiquement altérées qui permettent d'étudier l'encéphalopathie épileptique du développement (DEE). Ces souris reproduisent une mutation humaine identifiée chez deux jeunes patients atteints d’épilepsie sévère accompagnée par un retard cognitif grave et progressif. Les souris portant cette mutation ont des crises d’épilepsie récurrentes et présentent des troubles du comportement et de la cognition (elles ont hyperactive et moins anxieuse que les souris normales). L’étude des mécanismes neuronaux causant les DEEs est le principal domaine de recherche de notre équipe. L’utilisation des souris génétiquement altérées s’inscrira dans le cadre d'un programme de recherche multicentrique (= impliquant plusieurs laboratoires) qui se propose de développer des nouvelles méthodologies diagnostiques et thérapeutiques pour les DDE.
Bénéfices attendus
L’utilisation de nos souris génétiquement altérées permettra de mieux comprendre les mécanismes de base de l'encéphalopathie épileptique du développement. Cette pathologie restent actuellement intraitable. En outre, le programme multicentrique auquel nous contribuons en nous appuyant sur nos souris génétiquement altérées, se propose de développer des nouvelles méthodologies diagnostiques et thérapeutiques à appliquer à l'encéphalopathie épileptique du développement. Le présent projet permettra de maintenir la lignée de nos souris génétiquement altérées pour que l'on puisse en disposer pour les projets qui porteront sur notre thématique.
Procédures
Au moment du sevrage (à l'âge de 21 jours) on effectuera une biopsie de la queue par prélèvement de 2mm à son extrémité. La durée de la manipulation est d'environ 10 secondes.
Impact sur les animaux
Des publications précédentes ont mis en évidence que nos souris génétiquement altérées présentaient des crises d’épilepsie, de l’hyperactivité, une réduction de l'anxiété et une augmentation du comportement d'auto-toilettage. La gestion de la lignée impliquera de réaliser une caractérisation génétique à partir d'un prélèvement de tissu. Ce prélèvement consistera en l'amputation des 2 mm distaux de la queue des animaux. Cela peut générer une légère douleur et un léger stress.
Devenir
Les souris incluses dans la présente demande permettront de maintenir une lignée d'intérêt et de produire des lots expérimentaux pour alimenter les projets de l"équipe portant sur l'encéphalopathie épileptique du développement. Les souris qui n'auront pas les bonnes caractéristiques génétiques ou le bon sexe (on ne gardera que les mâles génétiquement altérés) seront mises à mort très rapidement. Les autres seront gardés le temps qu'ils se reproduisent puis seront mises à mort (à l'âge de 6 mois au maximum).
Remplacement
Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux génétiquement modifiés utilisés dans le cadre d’autres projets. Il n’existe aucune alternative satisfaisante (pour notre lignée) à la biopsie de tissus pour avoir accès au matériel génétique afin de le caractériser. Les projets qui seront alimentés par les souris reproductrices décrites dans cette demande d'autorisation, consistent typiquement à explorer les mécanismes neuronaux sous-jacents à l'encéphalopathie épileptique du développement, en utilisant des souris réalisant certains types de comportements (enregistrements de neurones sur souris vigiles) ou en ayant recours à des enregistrements électrophysiologiques sur tranches de cerveau. Dans les deux cas, l'utilisation de souris est, par nature, indispensable.
Réduction
Le schéma de reproduction vise la génération de la population minimale de reproducteurs nécessaires au maintien de la lignée et à la gestion des projets de recherche.
Raffinement
Les méthodes mises en oeuvre pour réaliser la biopsie nécessaire au génotypage sont éprouvées, précises, rapides et standardisées permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une anesthésie générale constituerait une nuisance additionnelle non justifiées au regard du niveau de gravité de la procédure. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.
Choix des espèces
Nos souris génétiquement altérées portent une mutation génétique isolée chez des patients humains atteints d’encéphalopathies épileptique du développement. En outre, ces souris présentent des caractéristiques qui miment plusieurs aspects de la maladie comme les crises d’épilepsie et des comorbidités comme les troubles du comportement et de la cognition. Les animaux du présent projet seront utilisés en tant que reproducteurs jusqu’à l’âge de 6 mois. Un mâle est un bon reproducteur jsuqu'à cet âge; au-delà l'efficacité des accouplements peut baisser.
Étude de facteurs de sensibilité aux encéphalites à JEV (Japanese Encephalitis Virus)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une injection intrapéritonéale de virus de l'encéphalite japonaise, à forte dose : 202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une injection quotidienne pendant cinq jours. Deux lignées portent des mutations trouvées chez des enfants atteints d'encéphalite grave, et le projet cherche à savoir si ces mutations aggravent l'infection, le virus se répliquant notamment dans le système nerveux central. Le porteur classe la sévérité globale comme modérée tout en annonçant des symptômes neurologiques sévères possibles, dont une paralysie des membres postérieurs, et se limite pour tout raffinement à des gels hydriques, une réhydratation, du chauffage des cages et de l'enrichissement.
Objectifs
Les encéphalites virales chez les enfants sont un problème majeur de santé publique dans la région Asie-Pacifique. Des altérations de la réponse immunitaire semblent entrainer une sensibilité accrue au développement de symptômes neurologiques sévères. Le but de ce projet est d'étudier deux mutations conduisant à l'inactivation de deux protéines distinctes, retrouvées chez des patients souffrant d’une encéphalite au virus de l'encéphalite japonaise afin de savoir si elles sont potentiellement impliquées dans la sévérité de la maladie. L’étude in vivo des infections invasives au virus de l’encéphalite japonaise nécessite un modèle murin pour évaluer l’impact de ces deux mutations génétiques sur la sévérité de l’infection. En effet, le virus est capable d’induire des symptômes sévères et des séquelles à long terme du fait de son neurotropisme, chez la souris comme chez l'homme. Nous utiliserons deux lignées de souris distinctes, dans lesquelles les mutations dans les deux gènes d'intérêt empêcheront la synthèse des protéines à étudier. Lors de l’infection des souris par voie intrapéritonéale, le virus va se disséminer dans la circulation sanguine et se répliquer dans différents tissus notamment le système nerveux central, permettant un suivi de l'infection dans les souris porteuses des mutations comparées aux souris contrôle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la mise en évidence de facteurs de sensibilité dans le cadre d’encéphalites causées par le virus de l’encéphalite japonaise.
Procédures
Certains animaux recevront une injection quotidienne intrapéritonéale pendant 5 jours (1 injection dure quelques secondes). Les souris recevront une injection intrapéritonéale de virus le jour de l’infection, (1 fois pendant quelques secondes).
Impact sur les animaux
Le degré́ de sévérité global dû à l'infection est considéré́ comme modéré pour les animaux contrôle et génétiquement modifiés. Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des procédures expérimentales présentes dans ce projet : • La piqure de l’aiguille lors des injections intrapéritonéales pourra entrainer une douleur faible et de courte durée (quelques secondes) • Du fait des fortes doses de virus injectées dans les souris contrôles et des mutations induites dans les lignées génétiquement modifiées, les animaux seront potentiellement plus sensibles à l’infection et pourront développer des symptômes neurologiques sévères (paralysie des membres inférieurs…).
Devenir
A la fin de chaque procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort soit pour pour des analyses ex-vivo ou par ce qu’ils sont infectés par le virus de l’encéphalite japonaise.
Remplacement
Ce projet vise à mettre en évidence des gènes conduisant à une plus grande sensibilité vis à vis de l'infection. Il est encore impossible de reproduire in vitro la complexité de l’organisme et le rôle du système immunitaire. Si des phénotypes sont obtenus dans le modèle murin (sensibilité ou non à l'infection) alors des études sur des cellules en culture (i.e. culture et infection de cellules cérébrales humaines in-vitro) ou des organes sur puce (i.e. développement d’un modèle de « organ on chip ») pourront être effectuées pour caractériser les mécanismes mis en œuvre dans la pathologie. Ce modèle permet une alternative aux modèles historiques d’études des infections humaines que sont les primates non-humains. En proposant comme alternative la souris, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet utilisera des mâles et des femelles. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les comparaisons entre les groupes expérimentaux seront réalisées grâce à des analyses de variance et l’effectif des groupes expérimentaux a été déterminé avec l’aide de biostatisticiens. Cela permettra d’utiliser le nombre d’animaux minimum et adapté. Notre expérience sur la procédure mise en œuvre dans ce projet nous a aidé à établir en amont un plan d’étude adapté aux objectifs. Elle nous permet également une optimisation des expériences et une limitation des variabilités inter-individuelles liées au modèle. Les animaux ne pourront pas être réutilisés puisqu’il est nécessaire de les mettre à mort pour prélever différents tissus.
Raffinement
Des signes cliniques spécifiques et précoces sont définis pour éviter toute souffrance inutile. Des aliments appétents (gel hydrique), la réhydratation, le chauffage des cages ou le renforcement de l’enrichissement sont mis en place pour améliorer le bien-être des animaux infectés.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille permettant une manipulation aisée. Leur système immunitaire est proche du système immunitaire humain, ce qui facilite l’étude physiopathologique du virus. Elles ont déjà été utilisées pour étudier l'infection qui fait l’objet de ce projet. De plus, il est possible d’utiliser l’ingénierie génétique pour permettre de générer des souches ayant les mêmes mutations que celles mises en évidence chez l’humain et donc d’étudier la sensibilité des ces souches au virus. Les animaux seront utilisés à l’âge de 12 semaines, car à l’âge adulte les souris non génétiquement modifiées sont résistantes à l’infection tandis que les souris modifiées génétiquement sont potentiellement sensibles. Pour voir si les gènes étudiés augmentent la sensibilité à l’infection il est essentiel que les animaux du groupe non génétiquement modifié soient plus résistants que les animaux modifiés génétiquement.
Effet de la consommation de saccharose sur le cerveau : modulation de l’activité neuronale et implication du microbiote
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Jusqu'à vingt-deux semaines en cage individuelle pour mesurer la consommation de sucre de chaque animal, une chirurgie cérébrale de quarante-cinq minutes, quatre à huit semaines d'antibiotiques puis sept jours de gavage : 3 804 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse post-mortem. Elles ont chaque jour le choix entre de l'eau et une boisson sucrée, quatre ou vingt-quatre heures selon le groupe, et subissent trois prélèvements sanguins. L'objet déclaré est de comprendre l'hyperphagie boulimique en passant par le microbiote intestinal, transféré par gavage d'une souris à l'autre. Le porteur écrit que l'isolement "n'interfère pas avec le bien-être des animaux" dans ses conditions, et annonce dans le même texte des troubles de l'humeur et de la motivation chez les souris consommatrices de boisson sucrée, qu'il compte justement mettre en évidence.
Objectifs
Les troubles du comportement alimentaire se définissent par une relation dysfonctionnelle avec l’alimentation, souvent orientée vers la consommation excessive d’aliments, riches en graisses et en sucres. Ces comportements, au-delà de leur dimension psychologique et comportementale, sont associés à des conséquences sanitaires majeures telles que les maladies cardiovasculaires, l’obésité et le diabète. L’hyperphagie boulimique est le plus prévalent de ces troubles et se caractérise par des épisodes récurrents de perte de contrôle sur la prise alimentaire, mais les mécanismes biologiques sous-jacents demeurent en grande partie méconnus. Des travaux récents mettent en lumière l’importance du microbiote intestinal dans l’émergence et/ou le maintien des troubles alimentaires. Le projet souhaite caractériser les altérations comportementales, cérébrales et du microbiote induites par une consommation excessive de saccharose ; examiner l’impact d’une manipulation ciblée du microbiote sur les comportements alimentaires ; et explorer les interactions entre le microbiote et le cerveau. Ces investigations seront menées sur des souris des deux sexes, afin d’identifier d’éventuelles différences intersexuelles, déjà décrites chez l’humain.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre, au niveau préclinique, comment un régime riche en saccharose altère la physiologie animale, en tenant compte des interactions intestin-cerveau. Les résultats attendus permettront d’approfondir la compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents à ce trouble alimentaire. En outre, à long terme, ces travaux précliniques fourniront une base scientifique pour le développement de stratégies hygiéno-diététiques innovantes et mieux adaptées à la prise en charge des patients.
Procédures
Les animaux sont soumis à une chirurgie et des injections pour l'anesthésie (1 chirurgie par animal, durée 45 min; une injection intrapéritonéale d’une durée d’environ 20 secondes). Ils seront également soumis à des traitements chroniques d’antibiotiques (sur 4 ou 8 semaines maximum) et un transfert de leur microbiote intestinal (gavage, 1/jour sur 7 jours, d’une durée d’environ 30 sec). Il y aura des prélèvements de sang à 3 reprises lors du protocole (durée environ 30 sec).
Impact sur les animaux
Consommation excessive de saccharose : les animaux ont le choix entre de l’eau et du sucre tous les jours, pendant 4h ou 24h selon le groupe expérimental. Nous devons évaluer précisément la consommation individuelle de saccharose des souris et nous avons montré que l’isolement nécessaire (au maximum 22 semaines en cage ouverte permettant un contact auditif et olfactif) n’interfère pas avec le bien-être des animaux dans nos conditions. Nous n’avons à ce jour pas mis en évidence de pathologies chroniques dans notre modèle, mais justement, nous poursuivons notre caractérisation et le suivi de différents paramètres afin de suivre l’évolution chez les souris. Nous n’avons pas identifié d’effets sur les seuils nociceptifs. De plus, des troubles de l'humeur et de la motivation sont envisageables chez les animaux consommateurs de boisson sucrée (le but de l'étude est de les mettre en évidence). Lors de l’utilisation de traitement antibiotique, une attention particulière sera portée sur les potentielles pertes de poids et diarrhées. Le gavage intra-gastrique répété (1x/J, 7j) peut conduire à un inconfort léger lié au stress de la contention au moment de l’administration. La chirurgie sur animal anesthésié (1 heure maximum/animal) peut induire de la douleur et une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. Le prélèvement de sang lors du protocole de consommation de saccharose peut induire une douleur légère de courte durée et une inflammation. L’injection d’anesthésique avant la perfusion peut engendrer une douleur aigüe.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.
Remplacement
La compréhension des mécanismes de mises en place et des conséquences des troubles du comportement alimentaire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal entier, vigile. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus neuronaux mis en jeu. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines. Il nous est donc impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d'animaux pour permettre des analyses statistiques pour les analyses comportementales et moléculaires et les analyses de l'activité cérébrale. Les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation de tests longitudinaux permettra d’obtenir des informations concernant l’activité des circuits cérébraux lors de l’ensemble de l’exposition au saccharose. De même, les prélèvements d’organes après perfusions permettront de décrire les altérations provoquées par le régime alimentaire autant au niveau cérébral que périphérique.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris sera assurée. De plus, une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (nourriture/saccharose/eau), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours accès à de l’eau. Les souris seront habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire et les souris seront placées sur des tapis chauffants, permettant de maintenir la température corporelle de l’animal durant la procédure en plus de monitorer cette donnée physiologique. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel formé, avec une attention particulière la première semaine post-chirurgicale. L’état de santé des animaux est évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale (ciblant notamment les risques d’inflammation au niveau de la zone opérée et la reprise de poids de l’animal). Des points limites spécifiques ont été définis pour l'état général, la prise alimentaire.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (au moins 8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires
Approche métabolomique de l’impact du vieillissement sur la neurogénèse et sur les fonctions cognitives
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés sous anesthésie générale pendant environ cinquante minutes pour recevoir des marqueurs directement dans le cerveau, 150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués au terme d'une ponction de liquide cérébrospinal. Ils passent aussi par une contention en tube destinée à provoquer un stress, trois prélèvements sanguins, cinq injections sous-cutanées de BrdU, et un labyrinthe aquatique où ils nagent quatre fois par jour pendant neuf jours, à 3,5 mois puis à 8, 12 et 18 mois. Le projet cherche quelles molécules franchissent la barrière hémato-encéphalique en vieillissant, pour identifier des marqueurs précoces du déclin cognitif chez les personnes âgées. Les rats vieillissent jusqu'à dix-huit mois avec les tumeurs, l'alopécie et les plaies que le porteur anticipe, sous une grille de score où un total de 9 ou de 12 selon la période déclenche la mise à mort.
Objectifs
En vieillissant, notre mémoire peut souffrir, ce qui affecte notre bien-être et notre qualité de vie. Le vieillissement entraîne souvent une baisse progressive des capacités cognitives, mais l’intensité varie d'une personne à l'autre. Une partie du cerveau, l'hippocampe, est particulièrement touchée. Cependant, certaines personnes en vieillissant arrivent à maintenir une bonne mémoire, tandis que d'autres voient leur mémoire se dégrader de manière irréversible. Ce phénomène montre que le cerveau essaie de compenser cette perte en formant de nouveaux neurones, notamment dans l'hippocampe, grâce à un processus appelé neurogenèse. Ce processus est lié au stress et a été observé dans des tests chez les animaux, où une bonne neurogenèse favorisait de meilleures performances cognitives, comme la mémoire spatiale. Les nouveaux neurones formés dans l'hippocampe aident à préserver la mémoire pendant le vieillissement. Nous pensions que seuls les neurones étaient responsables des fonctions du cerveau, cependant nous avons émis l'hypothèse que la barrière hémato-encéphalique (BHE), une barrière entre le cerveau et le reste du corps, jouerait aussi un rôle important dans le déclin cognitif. Quand cette barrière augmente sa perméabilité, cela peut permettre à des éléments externes ou internes de perturber les processus neuro-cognitifs. C'est notamment le cas dans des maladies neurodégénératives, où la BHE devient plus perméable, laissant passer des substances qui déséquilibrent l'équilibre de la fonction cérébrale. Cela pourrait expliquer pourquoi les capacités cognitives des individus vieillissant se détériorent avec le temps. L’objectif de ce projet est de comprendre quelles molécules traversent cette barrière quand elle est perméable et comment cela affecte notre mémoire. Il permettrait également de déterminer des biomarqueurs précoces du vieillissement cognitif de manière à envisager des thérapies de préventions.
Bénéfices attendus
Ce projet est le premier à étudier comment les échanges de substances entre le sang et le cerveau changent avec le vieillissement. Il propose une approche nouvelle, car la recherche jusqu'ici s'est surtout concentrée sur l'idée que c'est l'activité des neurones qui cause le déclin cognitif lié à l'âge. Cette étude pourrait donc aider à mieux comprendre les mécanismes du vieillissement cérébral. En mesurant les substances contenues dans le sang des animaux vieillissants, nous espérons identifier des marqueurs qui pourraient indiquer la vulnérabilité cognitive des personnes âgées. Cela ouvrirait la voie à des traitements préventifs ou des recommandations alimentaires pour prévenir ou ralentir ce déclin cognitif.
Procédures
Six interventions seront réalisées sur les animaux pour les besoins de l’étude. Test de réaction au stress : À 2,5 mois, les animaux sont placés brièvement dans un petit tube, ce qui provoque un stress. Du sang est ensuite prélevé juste après, puis à 2 autres temps (30 et 120 minutes plus tard), pour mesurer leur réaction biologique au stress. Chirurgie pour l’injection intra-cérébrales : Une opération chirurgicale est réalisée sous anesthésie générale pour injecter des marqueurs directement dans le cerveau. Cette intervention dure environ 50 minutes. Injections de BrdU : Ce produit permet de repérer les nouveaux neurones. Il est injecté (en sous-cutanée) à plusieurs reprises (5 fois au total), directement sur l’animal éveillé. Chaque injection prend environ 4 minutes. Test du labyrinthe aquatique : Les animaux doivent apprendre à trouver une plateforme cachée dans une piscine. Ils s’entraînent pendant plusieurs jours, en nageant plusieurs fois par jour (4 essais par jour pendant 9 jours avec 90 secondes par essai espacés de 30 secondes, maximum 450s dans la piscine). Ce test permet d’évaluer leur mémoire et leur capacité d’apprentissage. Il est réalisé à 3,5 mois pour chaque lot, puis selon les lots, à 8, 12 et 18 mois. Un test final est aussi réalisé sans la plateforme, pour voir s’ils se souviennent de son emplacement. Prélèvement de sang : un prélèvement de sang est réalisé à la queue avant le deuxième test du labyrinthe aquatique. Cette intervention dure 3 minutes. Ponction du liquide cérébrospinal : une ponction de leur liquide cérébrospinal sous anesthésie profonde est réalisée pour étudier les substances qui sont retrouvées dans le cerveau. Cette intervention dure 10 minutes avec la mise à mort de l’animal à la fin de la ponction.
Impact sur les animaux
Comme pour tout projet impliquant des injections et des opérations précises sur le cerveau, certains effets secondaires peuvent apparaître, même si nous faisons très attention et suivons des procédures adaptées. Par exemple, il arrive, même si c’est rare, que les endroits où l’on fait les injections (dans le ventre ou sous la peau) ou les plaies liées à l’opération s’irritent. En plus, dans les deux jours qui suivent l’opération au niveau du cerveau, les animaux peuvent perdre un peu de poids (jusqu’à 5 % de leur poids de départ). C’est pour cela que nous les surveillons de près pendant les 3 jours qui suivent ces interventions, pour nous assurer qu’ils vont bien. De plus, les animaux sont susceptibles de souffrir des effets secondaires dus au vieillissement, comme par exemple une alopécie spontanée, un manque de toilettage dans le dos ou au niveau des yeux, l’apparition de tumeurs. Pendant cette période, la personne responsable du projet remplit une fiche de suivi de l’état de santé et du bien-être des animaux, à l’aide d’une grille d’évaluation et met en œuvre toute mesure compensatoire jugée utile et conservatoire.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour permettre l'étude poussée du cerveau.
Remplacement
Dans ce projet, l'objectif est de comprendre comment le vieillissement affecte le métabolisme et la mémoire des animaux, et comment cela se relie à la création de nouvelles cellules nerveuses. Pour ce faire, on va tester leur comportement, puis analyser leurs capacités cognitives et leur cerveau dans un cadre global. C'est une approche qui nécessite d'étudier l'animal dans son ensemble, en observant comment son cerveau et son corps interagissent. Nous ne pouvons pas reproduire ça en laboratoire avec des cellules isolées ou des simulations sur ordinateur. De plus, pour avoir une vue complète de l'impact du vieillissement et de l'altération de la barrière hémato-encéphalique (BHE) — qui protège le cerveau — on doit utiliser un organisme entier. C'est pourquoi on ne peut pas se contenter de méthodes de remplacement comme les cultures cellulaires ou les modèles 3D.
Réduction
Ce projet vise à étudier les effets du vieillissement sur le cerveau à trois étapes de la vie : adulte (8 mois), milieu de vie (12 mois) et fin de vie (18 mois). Pour cela, trois lots d’animaux seront constitués, correspondant à ces âges. Dans chaque lot, les animaux seront répartis en un groupe contrôle de l’apprentissage et 2 groupes expérimentaux selon leurs performances à un test comportemental à 3,5 mois (groupe contrôle, groupe résilient et groupe vulnérable). Le nombre de rats a été estimé en tenant compte de nos données précédentes et des pertes possibles liées à l’âge (problèmes de santé, décès naturel) ou aux procédures expérimentales (comme des chirurgies). Pour garantir des résultats fiables, 50 rats seront utilisés par lot (6 rats contrôles, 22 rats résilients, 22 rats vulnérables), soit un total de 150 animaux. Ce nombre pourra être réduit si les différences entre les groupes sont plus marquées que prévu et sans nuire à la qualité scientifique de l’étude.
Raffinement
À leur arrivée, les rats seront placés par 2 dans des cages collectives, avec des nids faits de fibres de bois compressées pour réduire le stress et l'ennui. Les rats pesant plus d'1kg seront mis en cage individuelle. L'environnement sera contrôlé, avec une température et un taux d'humidité constants, et un cycle jour/nuit de 12 heures. Ils auront de la nourriture et de l'eau à volonté, et la litière ainsi que les enrichissements seront changés chaque semaine. Les rats seront observés tous les jours pour vérifier leur état de santé général et leur comportement, et manipulés une fois par semaine jusqu'à leur euthanasie. Leur poids sera vérifié tous les mois. Si une opération chirurgicale est réalisée, un suivi précis sera effectué pendant trois jours. Leur état sera noté sur une grille qui évalue différents critères comme la plaie chirurgicale, la perte de poids, l'hydratation, l'aspect général, la mobilité, et les signes de mal-être. Si un rat a un score élevé (12 ou plus), il sera euthanasié. Si son score est entre 0 et 5, il est considéré en bonne santé, entre 6 et 11 il nécessite des soins vétérinaires (par exemple, des médicaments contre la douleur), et si aucune amélioration n'est constatée après 48 heures, il sera euthanasié. Au fur et à mesure de leur vieillissement, les rats seront suivis chaque semaine avec la même grille. Si des maladies ou des problèmes apparaissent (comme des tumeurs ou des plaies nécessitant une chirurgie), le même suivi post-opératoire sera appliqué. Si aucune chirurgie n'est nécessaire, la grille sera utilisée sans la partie concernant les plaies. Un score de 9 ou plus entraînera l'euthanasie de l'animal, tandis qu'un score entre 0 et 3 indique une bonne santé, et entre 4 et 8, un état de détresse nécessitant une attention vétérinaire.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est le rat (Sprague-Dawley). La complexité du système nerveux des mammifères et les comportements qu’il régit rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (e.g., invertébrés). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la néo-neurogénèse hippocampique est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’Homme. Enfin, cette étude vient compléter nos investigations menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, constituant une base de données importante (continuité et contrôle des résultats). Les rats seront réceptionnés à l’âge de 2,5 mois (10 semaines) afin d’être âgés de 3 mois (12 semaines) au moment des chirurgies stéréotaxiques. Ensuite, les études seront réalisées de 5 à 15 mois après les injections intracérébrales. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : 3 mois - jeune adulte ; 8 mois - adulte ; 12 mois - milieu de vie ; 18 mois - fin de vie. Ces âges ont été choisis rendant possible une étude pseudo-longitudinale du rôle des néo-neurones nés à l’âge adulte dans l’apparition de déficits mnésiques.
Etude de la perturbation de production de derives reactifs de l’oxygene sur la maturation astrocytaire au cours du developpement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 180 mises à mort dans les quarante-cinq minutes suivant une injection sous anesthésie générale. Les autres reçoivent une injection à un, deux, trois ou quatre jours de vie, sur nouveau-né vigile, que le porteur déclare sans douleur et sans nécessité d'anesthésie. Ces animaux sont modifiés génétiquement pour altérer la production de dérivés réactifs de l'oxygène dans leurs seuls astrocytes, et leurs cerveaux sont prélevés à cinq stades, de cinq à soixante jours après la naissance. Le bénéfice annoncé se limite à des connaissances nouvelles sur le développement cérébral et vasculaire et à l'identification de cibles mitochondriales, sans application énoncée.
Objectifs
Le cerveau contient différents types de cellules, dont des cellules appelées astrocytes. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans le bon fonctionnement du cerveau, en particulier dans la communication entre les neurones et l’apport de nutriments depuis les vaisseaux sanguins. Certaines substances produites naturellement par les cellules, appelées dérivés réactifs de l’oxygène (ou ROS), sont impliquées dans le bon développement et le fonctionnement des astrocytes. Bien que souvent associées au stress cellulaire, ces molécules ont aussi des effets bénéfiques, que ce projet vise à mieux comprendre. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris modifiées génétiquement, dans lequel la production de ROS est altérée uniquement dans les astrocytes. Dans ce projet nous souhaitons évaluer le rôle des ROS dans la maturation des astrocytes en analysant le réseau mitochondrial, le niveau d’expression de gènes impliqués dans la maturation ; mais également la morphologie de ces cellules. Toutes nos analyses seront réalisées à plusieurs stades le naissance jusque chez l'adulte et prendra en compte le sexe de l'animal. Le projet nécessite l'utilisation de 340 animaux sur 5 ans.
Bénéfices attendus
Aucune étude à ce jour n'a étudié l'importance des ROS astrocytaires sur le développement du système nerveux central. Or les mitochondries jouent un rôle important dans le métabolisme des cellules et permettent leur bon développement. Cette étude permettra d'identifier de nouvelles cibles spécifiques de ces mitochondries astrocytaires et ainsi apporter de nouvelles connaissances sur le développement cérébral et vasculaire.
Procédures
Deux interventions seront utilisées dans ce projet. 1) Injection chez des nouveaux-nés de 1, 2 et 3 jours ou au 4ème jour après la naissance en fonction du modèle utilisé. L'injection dure 1 minute au maximum (temps d'injection et délai avant de retirer l'aiguille pour que la solution ne sorte pas). Elle est sans douleur et ne nécessite pas d'anesthésie. Nombre d'animaux concernés : 340 animaux. 2) Injection à différents temps de développement après la naissance sous anesthésie générale pour visualiser le système vasculaire. Les animaux seront ensuite immédiatement mis à mort sous anesthésie générale. Nombre d'animaux concernés : 180 animaux. Le temps de procédure comprend à la fois l'induction (analgésie et anesthésie), l’injection et la mise à mort, cette procédure n'excède pas 45 minutes.
Impact sur les animaux
Certains lots de souris subiront une injection pouvant entraîner une lègère irritation au point d'injection. Les lignées d'animaux sont déjà existantes et n'induit pas de changement de phénotype.
Devenir
Les animaux utilisés pour les différentes étude (histologiques, cytométrie en flux et biochimique) seront mis à mort afin de préléver les cerveaux et de faire nos analyses.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. De plus l’existence de lignées génétiquement modifiées adaptées à cette étude est uniquement chez la souris. Il n’existe pas d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 5) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. Ces points évaluent le bien-être des animaux en se basant sur leur apparence physique, leur mobilité, la prise alimentaire et la présence de nid. Une note de 0 à 3 est attribuée pour chaque critère et le score total permet d’établir un plan d’action pour maintenir/rétablir le bien-être de l’animal. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance à l’animal. Une observation particulière des animaux les jours suivants une intervention sera réalisée. La manipulation des nouveau-nés sera minimisée afin d'éviter tout rejet par la mère.
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'Homme. Leur génome est entièrement caractérisé, ce qui permet la création de lignées génétiquement modifiées spécialement adaptées pour l’étude de nos questions biologiques. De tels modèles n’existent pas chez d’autres espèces. Les animaux seront utilisés à 4 ou 5 stades de développement post-natals : 5 jours, 10 jours, 15 jours, 30 jours et 60 jours après la naissance. Ces stades correspondent à des moments clés du développement cérébral et en particulier des astrocytes et de leurs interactions avec les vaisseaux sanguins.
Analyse de la fonction musculaire : étude pré-clinique des effets de produits alimentaires ou de molécules pharmacologiques sur le modèle de la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages ou des injections sous-cutanées, intrapéritonéales ou intramusculaires jusqu'à sept jours par semaine pendant quatre semaines, et un prélèvement sanguin sous anesthésie tous les quinze jours. Le porteur annonce des tests moteurs et comportementaux susceptibles de provoquer un stress léger à modéré et une fatigue passagère, sans préciser lesquels. L'objet réel du projet reste l'évaluation préclinique de quinze produits en cinq ans pour l'industrie agroalimentaire ou pharmaceutique, un passage chez la souris que le porteur qualifie d'"indispensable" pour mesurer les effets sur "l'ensemble de l'organisme".
Objectifs
Les muscles squelettiques assurent de nombreuses fonctions au sein de l’organisme. Aussi, leurs altérations peuvent avoir des répercussions sur la fonction motrice et la qualité de vie des patients. L’industrie du secteur agroalimentaire ou pharmacologique s’oriente vers le développement de produits qui visent à diminuer les états de fatigue ou de faiblesse musculaire. Notre équipe développe un ensemble d’approches expérimentales afin d’évaluer au niveau pré-clinique l’efficacité de nouveaux produits, alimentaire ou pharmacologique, pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. Ainsi, nous envisageons de tester 15 produits en 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à évaluer les effets d’approches thérapeutiques innovantes sur la fonction musculaire chez la souris, dans un objectif de transfert vers des populations humaines souffrant de troubles musculaires, notamment les patients atteints de pathologies neuromusculaires et les personnes âgées présentant une perte de la fonction musculaire. L'utilisation du modèle murin permettra également de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dégradation de la fonction musculaire. Les connaissances acquises contribueront à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à l'élaboration de stratégies innovantes pour préserver ou restaurer la masse et la fonction musculaire. À terme, les résultats obtenus pourront ainsi déboucher sur le développement de traitements efficaces, améliorant significativement la qualité de vie des patients concernés.
Procédures
(1) Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse - Fréquence maximale : 1 prélèvement tous les 15 jours ; durée : 5 min maximum (pous tous les animaux) (2) Gavage - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par gavage) (3) Injection sous-cutanée - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection sous-cutanée) (4) Injection intrapéritonéale - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection intrapéritonéale) (5) Iinjection intramusculaire sous anesthésie gazeuse : fréquence maximale : 5/7j sur une semaine, 1/7j sur 4 semaines ;- durée : 10 min maximum (pour les animaux traités par injection intramusculaire).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus aux modalités d’administration retenues ou aux prélèvements de sang réalisés au cours du protocole. Les nuisances attendues sur les animaux sont : (1) inflammation transitoire au niveau du site d’injection (2) fausse-route ou blessure du tractus digestif dans le cas d’administration par gavage (3) traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang (4) risque infectieux liés à la réalisation de gestes invasifs. Les tests moteurs et comportementaux peuvent induire un stress léger à modéré du fait de la manipulation des animaux et leur isolement temporaire, ainsi qu'un fatigue passagère du fait de la répétition des mesures.
Devenir
A la fin de la durée du traitement, les animaux seront euthanasiés. Plusieurs muscles squelettiques seront ensuite rapidement prélevés pour étudier leur fonctionnalité.
Remplacement
Dans le cadre d’évaluation préclinique d’une nouvelle approche thérapeutique, le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est limité autant que possible, tout en garantissant des résultats fiables. En raison de la variabilité attendue des réponses aux traitements testés, 15 souris par groupe ont été prévues. Ce nombre permet de détecter des différences significatives entre groupes tout en respectant le bien-être animal et en limitant le nombre d'animaux. Il est basé sur nos expériences passées, où des différences de 20 à 30 % entre groupes ont pu être observées avec ce type d’effectif. Plusieurs mesures sont mises en place pour limiter encore le nombre d’animaux : (1) Utilisation de produits déjà connus comme sûrs (2) Choix réfléchi des groupes de comparaison (3) Suivi répété des mêmes paramètres chez chaque animal (4) Réalisation de tests multiples sur les mêmes animaux, sans nuire à leur bien-être (5) Combinaison de tests in vivo et in vitro sur les mêmes animaux (6) Réutilisation des données de groupes témoins dans des expériences similaires (7) Mutualisation des données issues de groupes recevant un produit de référence.
Raffinement
Les nuisances ou effets indésirables attendus étants principalement dus aux modalités d’administration des produits à tester, des méthodes moins stressantes et moins invasives seront utilisées, tout en tenant compte des contraintes liées au composé à tester (solubilité, stabilité, dose/volume…), les objectifs de l’étude et la pharmacocinétique souhaitée : Liste des actions pour réduire la douleur et le stress des animaux liées au traitement : - Conditionnement positif des animaux à la manipulation/méthode d’administration - Utilisation préférentielle des voies orales volontaires (eau de boisson/alimentation) - Remplacement du gavage par la technique d'administration guidée par micropipette dès que possible - Remplacement des injections intrapéritonéales par des injections sous-cutanés, sans contention. Les méthodes utilisées pour étudier la fonction musculaire des animaux sont validées et non invasives, des périodes d’acclimatation et d’habituation sont systématiquement effectuées. Lors de la réalisation des tests, un renforcement positif par récompense est mis en place pour limiter le stress des animaux. Liste des actions pour réduire la douleur et souffrance des animaux liées aux tests d’exploration de la fonction musculaire - Choix de tests non invasifs pour analyse in vivo de la fonction musculaire, - Prélèvement de sang effectué sous anesthésie générale, - Observation quotidienne des animaux : définition de points d’arrêts anticipés pour identification des souris souffrantes (aspect et comportement général, poids…), exclusion du protocole et euthanasie des animaux ayant atteints ces points d’arrêt. Liste des actions pour réduire l’angoisse des animaux tout au long du protocole - condition d’hébergement selon réglementation, - réalisation des tests fonctionnels et prélèvements dans une salle d’expérimentation différente de la salle d’hébergement, - familiarisation des animaux avec dispositifs expérimentaux avant les essais, - renforcement positif : récompense de l’animale suite à la réalisation des essais, - un expérimentateur et un soigneur dédiés.
Choix des espèces
Le modèle animal est le seul permettant une évaluation de la fonction motrice dans sa globalité. Au stade préclinique, ce modèle permet également de voir non seulement les effets d’un composé sur le système ou une fonction d’intérêt mais également les effets sur l’ensemble de l’organisme. La souris est également un bon modèle pour ce type d’étude incluant de nombreux tests in vivo d’exploration fonctionnelle du fait de sa docilité et de son aptitude à effectuer les différents exercices. Aussi, sa longévité en fait un modèle de choix pour l’analyse des conséquences du vieillissement, modèle validé par des études antérieures. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté en fonction de la nature du projet : Souris de 5-6 semaines pour les souris adultes Souris âgées de de 18 à 24 mois d’âge, pour le modèle d’altération lié à l’âge avec une fonte importante de la masse musculaire (degrés d’atteinte en fonction de l’âge retenu).
Etudes d’un gène impliqué dans la génération et la disparition des neurones transitoires chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 140 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures allant de l'anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance modéré. L'essentiel se joue sur des souriceaux de sept à dix jours, coussinets des phalanges tatoués, bout de queue coupé, puis pour certains une chirurgie du cerveau sous anesthésie et analgésie profondes. Le bénéfice annoncé est d'étendre les connaissances sur le rôle des deux formes d'un gène dans l'apparition et la disparition des neurones transitoires, sans application thérapeutique évoquée. Le porteur justifie le chiffre de 4 140 par une seule phrase, l'emploi du minimum d'animaux déterminé par une approche statistique adaptée, sans donner ce calcul.
Objectifs
Le projet porte sur les neurones transitoires qui sont essentiels pour un développement correct du cerveau, ils permettent de coordonner la mise en place des circuits neuronaux. Le rôle d’un gène qui est fortement exprimé dans ces neurones, et qui peut s’exprimer sous deux formes, sera étudié. L'expression de ces deux formes alterne au cours du développement. Le projet vise ainsi à étudier les deux formes du gène afin de comprendre leur impact sur la génération des neurones, leur survie au cours du développement et sur la mort cellulaire après la naissance.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est d’étendre nos connaissances sur la physiologie des neurones transitoires ainsi que sur le rôle des deux conformations de notre gène d’intérêt dans le développement du cerveau
Procédures
Les souriceaux subiront un tatouage des coussinets des phalanges et une biopsie à la queue, ses actes seront réalisés avec une contention de l’animal de quelques secondes. Certains animaux subiront une injection intrapéritonéale pour anesthésie et analgésie profonde sous contention pendant quelques secondes suivie d'une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie profonde.
Impact sur les animaux
La biopsie à la queue et le tatouage des phalanges provoque une légère douleur de courte durée. Les injections de l’anesthésie peuvent induire une légère douleur de courte durée. Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses prévus dans le projet
Remplacement
Il s’agit d’études portant sur le développement et le fonctionnement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites que dans le contexte du mammifère. À ce jour, aucun modèle in vitro ne peut reproduire l’ensemble des étapes de son développement dans toute leur complexité, ni la richesse des interactions entre les nombreux types cellulaires qui y participent.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaire à l’obtention d’un résultat significatif déterminés par une approche statistique spécifique adaptée.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi avec accès illimité à l’eau et à la nourriture et sont gardés en groupe social. La souffrance des animaux sera réduite au maximum par l'utilisation d'anesthésie et analgésie adaptée. Pour toutes les expériences des points limites strictes adaptés ont été mis en place pour assurer le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de la similarité du cerveau entre les rongeurs et l’Homme. Pour le marquage et la biopsie, les souriceaux ont entre 7 et 10 jours, âge auquel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes. La chirurgie est menée sur des stades postnataux pour nous permettre de suivre la génération et la migration des neurones et d’observer leur disparition après la naissance et les conséquences éventuelles à long terme.