Système nerveux

Quand l'injection d'insuline fait tomber leur glycémie sous 40 mg/dL, les souris reçoivent du glucose pour les remonter. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après seize semaines d'exposition à une privation intermittente d'oxygène pour prélever leurs organes. Elles sont habituées progressivement au tube de contention servant aux mesures de pression artérielle, transportées entre trois établissements distincts, et certaines portent un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Le porteur écrit que dix animaux par groupe suffisent pour ses analyses métaboliques et que cinq suffisent pour la télémétrie, sans détailler comment ces effectifs aboutissent aux 390 souris déclarées pour ce volet.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines : 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent trois séries de tests de stimulation à l'insuline, au glucagon, à l'adrénaline ou à la dexaméthasone, trois électrocardiogrammes et trois échographies sous anesthésie, quarante-huit heures en cage de mesure des échanges gazeux, et des mesures de pression artérielle en tube de contention. Le protocole, réparti sur trois établissements voisins entre lesquels les animaux sont transportés, prévoit aussi soixante-dix chirurgies de trente minutes pour implanter un émetteur de télémétrie, suivies de quatorze jours de surveillance. La thérapie espérée contre les dérèglements métaboliques de l'apnée du sommeil reste énoncée au conditionnel, quand la privation d'oxygène, elle, court sur quatre mois.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

7 624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés reçoivent une injection sous-cutanée dans leur première semaine de vie, les adultes et les femelles gestantes un gavage de tamoxifène, et une chirurgie terminale sous anesthésie peut être pratiquée dès le septième jour après la naissance pour vider le cerveau de son sang. Le porteur reconnaît que le gavage des femelles gestantes peut provoquer des mises bas prématurées ou difficiles et affecter les embryons, et que les souris du modèle Alzheimer développent à partir de neuf mois pertes de mémoire, apathie et comportements sociaux anormaux. Il affirme que ces phénomènes "ne peuvent pas du tout être modélisés in vitro ou in silico" du fait de la complexité des interactions avec l'"organisme entier", sans indiquer comment un calcul de puissance aboutit à 7 624 animaux.

Objectifs

​​La maturation du cerveau comprenant les processus de myélinisation, différenciation des neurones et mise en place des circuits cérébraux implique des processus complexes et des populations spécifiques de cellules liées au développement. Au cours des 10 dernières années, une grande diversité de cellules a été décrite par différentes techniques de bilogie moléculaire à haut débit et a mis en lumière une sous population de microglie spécifique qui joue un rôle clé pendant le développement pré- et post-natal. Cette microglie partage des caractéristiques communes avec la microglie spécifique de maladie présente dans les maladies neurodégénératives comme Alzheimer (AD). Cependant, le degré de similitude/divergence de ces états, le fait qu'ils agissent via des voies communes pour exercer des fonctions protectrices dans des contextes différents et le fait qu'ils soient transitoires ou liés à l'ontogénèse restent largement à élucider. Pour mieux comprendre le rôle des macrophages cérébraux, dans les pathologies telles qu'Alzheimer, nous utiliserons des approches génétiques et pharmacologiques afin de perturber les microglies et leurs fonctions au cours du développement embryonnaire et post-natal.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale a pour objectif de déchiffrer les dynamiques cellulaires de macrophages cérébraux, leur induction et leurs rôle dans les cerveaux en developpement et dans les cerveaux en vieillissement et neurodégénératifs. En étudiant avec des techniques et modèles murins innovants ces cellules à plusieurs stades : pré-natal, post-natal et adulte, nous pourrons apporter une vision cinétique et comparer les états des cellules de microglie jeunes et pathologiques. L’étude des deux sexes en parallèle permettra de donner des indications sur le caractère sexe spécifique. Les états et les fonctions des macrophages cérébraux sont généralement étudiés en parallèle, soit au cours du développement, soit dans les maladies neurodégénératives. Ce projet vise ainsi à mettre en place un pont entre ces périodes et comparer les rôles fonctionnels des cellules de microglie jeunes et pathologiques et notamment des deux principaux facteurs qu'ils produisent, afin d'identifier les facteurs et les voies qui induisent ces états et le lien ontogénétique potentiel entre eux. In fine, cela permettra d’ouvrir la voie à à des stratégies thérapeutiques très innovantes des maladies neurodégénératives telles qu’Alzheimer en exploitant les propriétés neuroprotectrices de la microglie.

Procédures

Les animaux vigiles recevront une injection sous-cutanée lorsqu'ils sont en première semaine de vie ou un gavage à l'âge adulte (pour les mères gestantes afin d'observer l'effet sur les embryons et pour les souris de 2 et 12 mois). En fonction de leur stade et de l'analyse prévue, les animaux seront soumis à une analgésie suivie d'une anesthésie et enfin euthanasiés afin de prélever le cerveau. Uniquement en cas de besoin, une chirurgie terminale sera réalisée sur les animaux à partir de 7 jours post-natals, toujours sous l'effet de l'anesthésie générale avec analgésie, pour éliminer les cellules sanguines du cerveau.

Impact sur les animaux

La molécule administrée par gavage aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et les nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire un stress pendant la contention, et une gêne légère et transitoire. Le modèle murin d’Alzheimer utilisé dans cette étude développant des comportements ressemblant à la maladie d’Alzheimer humaine, les symptômes peuvent nuire au bien-être global de l’animal. Ces souris développent des comportements de perte de mémoire, apathie et comportements sociaux aberrants à partir de 9 mois liés à la perte neuronale dans certaines zones du cerveaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever le cerveau et effectuer les analyses requises par le projet.

Remplacement

​L’étude des population microgliales au cours du développement et de la neurodégénérescence, de leur spécificité et de leur trajectoires nécessite l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance de l’activité cellulaire, comme la synthèse ou la dégradation de protéines. Il est important de maintenir l’activité de l’organisme et des mécanismes physiologiques dans un état dynamique (c'est à dire en mouvement et fonctionnel) dans le cadre d’une étude temporelle. Ces phénomènes ne peuvent pas du tout être modélisés in vitro ou in silico, du fait de la complexité des interactions des cellules étudiées avec l'organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique afin de garantir une robustesse des résultats tout en limitant l’utilisation d’animaux. Pour une analyse comparative multi-groupes (effet du modèle, Alzheimer, sexe, temps d'intêret), nous avons ainsi calculé et optimisé le nombres d'animaux nécessaires. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques telles que l'analyse de variance.

Raffinement

L'enrichissement sera augmenté pour les animaux vieillissants. Pour faciliter l'alimentation en cas de besoin, du Dietgel sera utilisé. Les manipulations (contention, gavage au tamoxifène, prélèvements, perfusion) seront effectuées par des personnes formées et compétentes. Les méthodes d'analgésie et d'anesthésie des animaux permettront de diminuer toute souffrance ou détresse liées aux manipulations. Des mesures de surveillance quotidienne sont mise en place par des personnes compétentes et formées. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions invasives seront faites sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des fonctions biologiques et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et organique. Elles sont également utilisées pour créer des modèles d’étude des pathologies humaines. La proximité génétique avec l’homme, combinée à la disponibilité d’un grand nombre de lignées génétiquement modifiées, fait du modèle murin un choix idéal pour répondre à nos questions scientifiques. Le court cycle de reproduction et la petite taille des souris facilitent leur maintien, tout en conservant une espèce relativement proche de l’homme en termes de développement. De plus, la période de gestation courte et le nombre important d’embryons permettent de générer un nombre suffisant d’animaux pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de parents. Ce choix stratégique garantit une compréhension globale des processus allant de la formation fœtale à la maturation et au maintien des circuits dans des contextes normaux et pathologiques​.

À un ou deux jours de vie, des souriceaux sont séparés de leur mère jusqu'à dix minutes pour recevoir une injection, un geste qui peut les faire saigner. Une partie d'entre eux est tuée à neuf jours pour enregistrer l'activité de leurs neurones, les autres subissent à vingt-trois jours un prélèvement de queue pour génotypage et la pose d'une puce sous la peau, puis huit tests comportementaux entre trente et quarante-quatre jours mesurant l'anxiété, les comportements répétitifs et la mémoire. 558 souris vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie portant les mutations observées chez des enfants atteints de troubles neurodéveloppementaux graves, les autres utilisées comme témoins. Le cerveau est prélevé sur chacune après sa mise à mort.

Objectifs

Les canaux sodiques (protéines qui transportent des ions sodium) sont essentiels pour les activités électriques des neurones, base du fonctionnement du cerveau. De nombreuses mutations de canaux sodium causent des "Troubles tardifs neurodéveloppementaux graves de l’enfance", apparaissant entre 3 mois et quelques années. Des études fonctionnelles des mutations humaines ont proposé que les mutations induisent une réduction de la fonction d'un canal sodique particulier (50% de diminution d'activité). Un nouveau mécanisme pathologique pour les mutations causant des "Troubles tardifs neurodéveloppementaux graves de l’enfance" a été montré : elles diminuent la fonction des canaux mutés, mais il y a aussi un effet d'inhibition des canaux mutés sur les canaux non mutés (dominance négative). Cela entraîne une réduction de l'activité des canaux anormalement supérieure à 50 %. Il n’existe pas de traitement efficace pour ces troubles. Aucun médicament activateur de l'activité de canaux sodiques n’est disponible. Dans ce projet, nous testerons une nouvelle molécule qui bloque l'inhibition des canaux mutés sur les non mutés. L'effet attendu est que cette molécule puisse restaurer la fonction des canaux sodiques, améliorer le fonctionnement des neurones et donc atténuer les troubles observés sur les animaux. Nous utilisons des souris porteuses des mêmes mutations génétiques que celles observées chez les enfants atteints. Des enregistrements sur neurones permettent d'étudier en détail l'activité des canaux sodiques présents dans les neurones. Plusieurs tests comportementaux permettent de mesurer les troubles induits par la mutation (anxiété, comportement répétitif, mémoire, interaction sociale, …). Nous allons par conséquent injecter les animaux avec la molécule décrite ci-dessus et étudierons ensuite les conséquences sur l'activité électrique des neurones et sur le comportement. En cas de succès, ce serait la première molécule améliorant l'activité de ce type de canal et utilisable comme médicament. Cette stratégie serait aussi applicable à d'autres maladies dont le mécanisme est dû à un effet de dominance négative.

Bénéfices attendus

Nos résultats peuvent fournir des informations importantes sur les mécanismes des troubles neurodéveloppementaux en général, et notre stratégie thérapeutique pourrait également être utilisés pour des études sur d’autres pathologies impliquant des dominances négatives. Les maladies liées aux canaux sodiques qui nous intéressent sont considérées comme des maladies orphelines pour lesquelles aucune solution thérapeutique satisfaisante n’est disponible. Ici, nous avons défini une stratégie qui peut aider à réduire l’impact sévère de ces mutations sur les caractéristiques du système nerveux central. Il est important de souligner que l’utilisation d’une molécule bloquant la dominance négative d’un canal muté sur un canal non muté peut avoir la capacité de traiter des dysfonctionnements de canaux indépendamment de la nature de la mutation génétique et peut représenter une solution uniforme pour un ensemble de symptômes et de patients divers.

Procédures

Tous les animaux âgés de 1 ou 2 jours subiront une injection (15 sec environ). Dans une procédure, les animaux subiront à l'âge de 23 jours un prélèvement sur la queue pour génotypage (2 sec) et la pose d'une puce nécessaire à un test (5 sec) puis 8 tests comportementaux (durées allant de 6 à 40 min, âge 30-44 jours) afin de mesurer leur niveau d'anxiété, d'éventuels comportements répétitifs, leur mémoire.

Impact sur les animaux

Dans toutes les procédures, l'injection peut induire un saignement et nécessite une séparation maternelle pendant un maximum de 10 minutes, cela peut induire un stress léger pour la mère et le petit. Dans toutes les procédures les prélèvements pour génotypage peuvent provoquer un saignement. Dans une procédure l'implantation sous-cutanée d’une puce, peuvent induire une légère douleur passagère et une gêne. Un test comportemental peut induire un stress léger.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélever le cerveau.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences sur des cellules exprimant les canaux sodium mutés d'intérêt et démontré les effets du peptide d’intérêt. Les modèles animaux sont maintenant essentiels pour ce projet car ils permettront d’étudier les effets du peptide appliqué sur un organisme entier et faire preuve de concept pour une utilisation thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser a été calculé par une analyse de puissance statistique. Nous utiliserons les souris mâles et femelles et les souris mutantes et non-mutantes de chaque portée, soit la quasi-totalité des animaux sauf pour une procédure ou la fenêtre d'âge utilisable est très restreinte d'ou l'utilisation de 1 à 3 souriceaux par portée (cela concerne 28+7=29 portées au maximum et 10 au minimum).

Raffinement

Une fois sevrés, les animaux seront élevés dans un environnement enrichi : avec matériau de nidification, buchette en bois et igloo en polycarbonate offrant un abri sombre. Les animaux seront régulièrement manipulés pour réduire le stress dû à la présence d’un humain et une grille d'observation sera utilisée pour évaluer les points limites et apporter les réponses adéquates, dont l'injection d'un antalgique en cas de douleur. Des périodes d’habituation seront réalisées pour diminuer le stress provoqué par les appareils.

Choix des espèces

La souris permet un élevage rapide avec une période de gestation de 21 jours et un sevrage également après 21 jours. Nous avons fait la caractérisation phénotypique des 2 lignées, par conséquent nous connaissons bien ce modèle et les résultats attendus lors des tests comportementaux. Pour toutes les procédures, les souriceaux seront injectés à 1 ou 2 jours afin d’agir dès la synthèse des protéines canal. Une procédure nécessite de mettre à mort les animaux à 9 jours pour pouvoir enregistrer l'activité des neurones. L'autre procédure commence après le sevrage (23 jours) et les tests comportementaux entre 30 et 44 jours car après les problèmes comportementaux observés sont moins marqués.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une restriction alimentaire de trois à six semaines, la pose de canules cérébrales ou d'une pompe osmotique sous la peau lors d'une chirurgie de 45 minutes à une heure, huit injections directement dans le cerveau et des prélèvements de sang à la queue deux à trois fois par semaine. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi l'anorexie mentale persiste chez les patientes, en affamant des souris jusqu'à reproduire leur état de dénutrition. Un amendement ajoute des souris supplémentaires pour "confirmer et valider" des résultats déjà obtenus, et le porteur écrit que des explorations comportementales complexes sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro.

Objectifs

L’anorexie mentale est un trouble des conduites alimentaires qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique et à une détérioration de la santé physique et mentale. Elle a le taux de mortalité le plus élevé de tous les troubles psychiatriques et il n’existe, à ce jour, aucun traitement pharmacologique efficace. D’autre part, les taux de rechute sont importants (>40%) et la pathologieévolue souvent de façon chronique. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’anorexie mentale et son évolution est donc essentielle et représente un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet, mené dans un modèle murin qui mime l’état de dénutrition des patientes, est de déterminer le rôle de facteurs sanguins qui sont dérégulés au cours de la dénutrition chronique, dans la persistance et l’aggravation des symptômes de l’anorexie et qui pourraient expliquer la chronicité de cette pathologie. AMENDEMENT 1: Ajout de souris supplémentaires pour confirmer et valider nos résultats et modification d'une étape du projet pour inclure l'implantation d'une mini-pompe sous la peau qui permet l'administration en continue des molécules mimant les facteurs sanguins dérégulés dans la pathologie humaine et ainsi éviter des administrations répétées.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous évaluerons comment un modèle murin innovant, rassemblant des facteurs de risque environnementaux de la maladie, peut apporter des éléments de compréhension des mécanismes mis en jeu dans les anomalies du comportement alimentaire dans l’anorexie mentale.

Procédures

Pose de canules cérébrales et/ou pompe osmotique sous anesthésie générale et analgésie: 1 fois, durée environ 45 minutes à 1 heure. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure de la glycémie: 2 à 3 fois par semaine en cours de restriction alimentaire, durée 5 secondes. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure des marqueurs métaboliques : 1 fois au cours de la procédure, durée 60 secondes. Injections pharmacologiques croisées souscutanées: 8 injections, durée 5 secondes. Injections pharmacologiques croisées intra-cérébrales: 8 injections, durée 5 minutes. Durée de la restriction alimentaire : 3 à 6 semaines.

Impact sur les animaux

Le protocole de restriction alimentaire entraine une perte de poids et une baisse de la glycémie. Les prélèvements sanguins à la queue peuvent provoquer une irritation locale et un stress. L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. Une douleur peut également être associée aux injections d’analgésique et à l’acte chirurgical.

Devenir

Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau afin de permettre des analyses biochimiques ou moléculaires de biomarqueurs en post-mortem dans les différentes structures cérébrales.

Remplacement

Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition, comportement alimentaire, activité motrice) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a permis de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. Les résultats obtenus sont analysés avec des tests statistiques adaptés à chaque procédure. L’utilisation d’un protocole de pharmacologie qui permet de tester l'effet de différents traitements chez le même animal permet de réduire de façon importante le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement par un personnel compétent pour vérifier leur état physique et comportemental et leur poids est mesuré au moins 3 fois par semaine au cours de la restriction alimentaire. Pour réduire le stress lié à l’isolement ponctuel pour la mesure individuelle du comportement alimentaire, les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi en cages ouvertes permettant de sentir et entendre leurs congénères. La chirurgie est effectuée sous analgésie et anesthésie générale. D’autre part, des grilles de points limites gradés et un arbre décisionnel adaptés à chaque procédure sont mis en place. En fonction des observations faites, des mesures sont prises, à savoir soit des soins quand ceux-ci peuvent être mis en place, soit l’arrêt de l’expérience.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire et des comportements motivés permettant l’étude d’altération du système de la récompense. Les régulations mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études comparatives entre les observations faites chez la souris et certains aspects de la pathologie humaine. L’anorexie mentale fait partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets adolescents et jeunes adultes. Dans ce projet, les procédures sont initiées aux stades équivalents chez la souris.

6 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les actes expérimentaux déclarés tiennent en peu de choses : un gavage unique de trente secondes et, pour certaines, une prise de sang sous anesthésie. L'essentiel de ce que subissent ces souris vient de leur génome, trois lignées modélisant la maladie d'Alzheimer qui développent à partir de neuf mois pertes de mémoire, apathie, déclin cognitif, comportements sociaux altérés et troubles moteurs dont l'ataxie, observés jusqu'à douze mois. Le porteur annonce l'identification à terme de cibles thérapeutiques applicables à l'humain, quand l'objet immédiat reste de décrire la cinétique d'infiltration des macrophages cérébraux.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier l'hétérogénéité des macrophages cérébraux dans les maladies neurodégénératives. Dans les 10 dernières années une grande diversité de cellulaire a été décrite dans les cerveaux neurodégénératifs grâce à des technique de haute résolution permettant de faire des analyses dans chaque type de cellules. Des macrophages particuliers associés aux plaques amyloïde beta dans la maladie d'Alzheimer ont été identifiés. Parmi ces cellules, une partie est dérivée de microglies embryonnaires et l'autre de monocytes circulants. Le développement de ces macrophages est donc un facteur déterminant leur diversité. Avec le vieillissement et les maladies neurodégénératives, des monocytes infiltrent le cerveau et se différencient en cellules ressemblant à des microglies , ce sont des macrophages inflammatoires associés à la maladie. Des premières expériences semblent montrer que ces programmes et dynamiques varient en fonction du sexe. Or la maladie d’Alzheimer est elle-même grandement corrélée au sexe. L'objectif de ce projet est de caractériser en détail les dynamiques d'infiltration de cellules dans des modèles murins mâles et femelles de vieillissement et maladies neurodégénératives, en particulier la maladie d'Alzheimer, et de comparer ces cellules aux cellules dérivées de macrophages embryonnaires. Cela permettra de donner une nouvelle compréhension des facteurs cellulaires inflammatoires influençant l’établissement de la maladie d’Alzheimer et comment ceux-ci varient en fonction du sexe.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche a pour objectif de déchiffrer les dynamiques cellulaires de macrophages cérébraux dans les cerveaux en vieillissement et neurodégénératifs. En étudiant avec des techniques et modèles murins innovants ces cellules à plusieurs temps de vieillissement, nous pourrons obtenir une cinétique de la neuro-inflammation et de l’infiltration cellulaire. La maladie d’Alzheimer concerne en majorité le sexe féminin. L’étude des deux sexes en parallèle permettra de donner des indications sur les caractères influençant ce déséquilibre . Cela permettra à terme d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques pouvant être appliquées à l’Homme.

Procédures

Des procédures incluront un gavage unique (durée 30 secondes), sur animaux vigiles. Des prises de sang uniques seront faites sur certains animaux sous anesthésie générale (durée 1-2 minutes).

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues lors de cette étude proviennent des trois modèles murins Alzheimer utilisés dans cette étude. Ceux-ci développent des comportements ressemblant à la maladie d’Alzheimer humaine qui peuvent nuire au confort global de l’animal. Ces souris peuvent développer des comportements tels que l'altération de la mémoire, apathie, déclin cognitif, comportements sociaux aberrants à partir de 9 mois liés à la perte neuronale dans certaines zones du cerveaux et des troubles moteurs dont l'ataxie. Des nuisances sont également attendues lors de la manipulation des animaux, notamment un stress et un inconfort de courte durée lors de la contention de l'animal, du gavage qui entraîne un inconfort léger et temporaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Pour étudier les dynamiques cellulaires complexes intervenant dans le cerveau neurodégénératifs, les modèles in vitro de culture cellulaires ne font pas intervenir suffisamment de types cellulaires. Les modèles de cérébroïdes et organes sur puces en développement reproduisent uniquement le cerveau embryonnaire mais pas encore le cerveau en vieillissement qui a des dynamiques plus complexes. L’étude de mécanismes au niveau cérébral et sanguin dans le contexte de maladies neurodégénératives requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une activité cellulaire complète. De plus, comme ce projet vise à étudier les dynamiques d’infiltration, un contexte physiologique global est nécessaire avec une génération de monocytes dans la moelle et un passage à travers une barrière hémato-encéphalique. Il est donc important de conserver l’activité de l’organisme et des mécanismes physiologiques dans un état dynamique (c'est à dire en mouvement et fonctionnel) dans le cadre d’une étude temporelle.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique afin de garantir une robustesse des résultats tout en limitant l’utilisation d’animaux. Pour une analyse comparative multi-groupes (effet du modèle Alzheimer, sexe, temps d'intêret), nous avons calculé et optimisé le nombres d'animaux nécessairesavec un calcul de puissance, basé sur les observations passées au laboratoire. Ce design expérimental permet d’atteindre une puissance statistique suffisante tout en respectant les principes éthiques de la réduction animale. Le caractère des expérimentations (études sur les cerveaux) ne permet malheureusement pas de suivre un animal. La mise en place des procédures finales sera réalisée en fonction des résultats obtenus dans les premières procédures

Raffinement

Les cages sont enrichies avec du matériel de nidification, maisons en cartons, bâtonnets. L'enrichissement pourra être augmenté pour les animaux vieillissants. Pour faciliter l'alimentation en cas de besoin, du u aliment adapté énergétique et facile à consommer sera utilisé. Les manipulations (contention, gavage, prélèvements) seront effectuées par des personnes formées et compétentes. Les méthodes d'analgésie et d'anesthésie des animaux permettront de diminuer toute souffrance ou détresse liées aux manipulations. Des mesures de surveillance quotidienne sont mise en place par des personnes compétentes et formées.Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles expérimentaux largement utilisés dans la recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'humain, leur taille modeste et leur cycle de vie relativement court, ce qui permet d'étudier les effets de traitements et de pathologies sur plusieurs générations. Des modèles ont été choisis pour cette étude en raison de leur pertinence dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer et leur complémentarité. Ces modèles murins ciblent différents gènes associés à la pathologie et reproduisent des aspects clés de la pathologie, notamment les dépôts de plaques amyloïdes et les déficits cognitifs, permettant d'étudier les mécanismes sous-jacents de la maladie à différents stades de son développement. L'utilisation de trois stades de développement (3, 6, 9 et 12 mois) permet d'examiner l'évolution progressive de la pathologie, en ciblant des périodes spécifiques du développement de la maladie : l'apparition initiale des symptômes, leur progression intermédiaire, et les stades avancés.