Système nerveux

Pour étudier comment le stress rend certaines souris vulnérables à l'anxiété, un lot est immobilisé jusqu'à deux heures par jour pendant six jours, à trente jours de vie puis une seconde fois à l'âge adulte. 1 696 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses du cerveau. Un second volet porte sur la démence liée à l'âge, avec des injections dans l'abdomen, quotidiennes pendant deux semaines, puis des tests comportementaux que le porteur décrit comme sans douleur ni stress. Les souris dont le score dépasse 6 sur la grille d'évaluation sont sorties du protocole.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment le vieillissement et l’anxiété peuvent modifier le fonctionnement des cellules du cerveau, en particulier les neurones. L’anxiété touche près de 20% de la population française. Comprendre ses mécanismes au niveau cérébral est crucial pour améliorer son diagnostic et son traitement. De récentes études ont montré qu’un stress peut rendre certaines souris plus vulnérables à l’anxiété en modifiant l’activité de circuits cérébraux bien précis. Ce projet vise à comprendre la modification de ces circuits au niveau des cellules, de leur fonction et leur morphologie à l’origine de cette susceptibilité au cours du développement. Le projet s’intéresse aussi à la démence liée à l’âge, une autre maladie qui touche de plus en plus de personnes. Elle se traduit par des pertes de mémoire et des difficultés à penser clairement, causées notamment par la disparition progressive de neurones. Ces dommages sont en partie liés à un déséquilibre dans les mécanismes naturels de protection contre les agressions chimiques dans le cerveau. Une molécule importante pour ces défenses est produite naturellement dans le cerveau. Lorsqu’elle est dégradée, elle forme des petites molécules appelées dipeptides, qui jouent un rôle dans la communication entre les neurones. En cas de démence, ces dipeptides semblent s’accumuler, ce qui pourrait favoriser l’apparition des troubles. En mesurant la quantité de ces dipeptides et leurs effets sur le cerveau, le projet espère identifier des signes précoces de la maladie et mieux comprendre comment ces déséquilibres contribuent aux symptômes.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une étape essentielle dans la compréhension des circuits neuronaux responsables du contrôle de l'anxiété liée au stress et à la démence liée à l'âge, ainsi que des mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement de la susceptibilité ou de la résilience face aux troubles psychiatriques. Les découvertes qui en découleront pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches de prédiction et de traitement des maladies psychiatriques, bénéficiant ainsi à la société humaine.

Procédures

Pour la partie du projet liée à l'anxiété, un lot d'animaux va subir un protocole de stress consistant en des stress psychologiques par contention d'une durée maximale de 2h par jour pendant 6 jours et cela deux fois dans leur vie, pendant l'enfance et au stade de jeune adulte. A la fin de chaque période de stress des prélèvements de feces seront réalisés en laissant l'animal produire naturellement ces excrétas qui seront collectés. Un autre lot d'animaux subira les mêmes procédures que citées ci-dessus mais sans stress de contention effectué, ce sera notre lot contrôle. La plupart des animaux auront leur comportement testé à travers divers tests de comportement non invasifs. Ces tests durent chacun une dizaine de minutes et ne dépassent jamais 1 test par jour et 3 tests par semaine. Ils seront espacés de cinquante jours. Pour le projet lié à la démence, les animaux seront soumis à des injections dans l’abdomen de substances testées. Deux types de traitement seront réalisés : un traitement aigu, avec une seule injection (une injection dure au maximum 10 secondes), et un traitement chronique, avec une injection par jour pendant deux semaines. Les souris recevront soit une injection contenant les substances testées, soit une injection témoin. Par la suite, des tests comportementaux non invasifs seront réalisés afin de tester l’effet des substances sur l’apprentissage et la mémoire. Ces tests sont non invasifs et sont basés sur le comportement naturel des animaux à observer ou retrouver un lieu dans un environnement inconnu. Ils seront espacés d’au moins 24 heures pour limiter la fatigue des animaux et les biais expérimentaux. A la fin de l’expérience, des analyses des tissus neuronaux seront réalisées. Elles permettront de mieux comprendre l’effet des substances testées sur le fonctionnement des cellules nerveuses.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables seront principalement liés au stress provoqué par des contentions physiques. Ce type de stress de contention n'entraine pas de douleur mais provoque un stress psychologique. Les tests de comportement seront non invasifs et sans douleur, basés sur la tendance naturelle des animaux à explorer ou éviter une zone anxiogène sans contrainte. Les fécès seront prélevés. Les nuisances prévues dans le second axe sont limitées à des injections de degré léger (10 secondes), qui ne provoquent qu’une gêne passagère comparable à une piqûre. Les tests comportementaux réalisés sont non invasifs et n’induisent pas de stress pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre des études moléculaires, d’activité électrique et histologiques post-mortem du cerveau.

Remplacement

Notre projet repose sur différentes approches telles que l’étude du comportement et l’étude du développement et de la plasticité du système nerveux. Nous voulons comprendre le développement et les fonctions des systèmes de contrôle des émotions. Actuellement, il n’y a pas de méthode substitutive qui pourrait remplacer le recours à l’animal dans nos travaux.

Réduction

Notre plan expérimental est conçu de telle manière que les premières expériences réalisées permettront d’optimiser les conditions des expériences suivantes et de réduire, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires à leur mise en œuvre. Le nombre d'animaux par groupe a été évalué statistiquement, ce qui permet d'avoir une bonne estimation des effectifs suffisants pour l'obtention de données statistiquement fiables tout en s'assurant d'une utilisation des animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en œuvre durant la durée du projet. Le contenu de l’expérience intègre les impératifs éthiques, les modalités d’hébergement, d’enrichissement du milieu, de prévention de toute douleur, inconfort, stress, détresse chez l’animal. Les animaux seront placés en cage de maximum 5 individus avec maisonnette en carton plus du coton afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé à l’expérimentation animale et aux connaissances spécialisées dans les procédures décrites. Les animaux seront sous surveillance quotidienne et pesés toutes les semaines. Enfin nous utiliserons une grille détaillant l'état des animaux pour s'assurer qu'ils ne souffrent pas afin de leur fournir les meilleurs soins le cas échéant. Les animaux manifestant au moins un des points limites ( critère prédéfini utilisé dans l’expérimentation animale pour interrompre ou modifier une procédure expérimentale afin d’éviter ou de limiter la souffrance, la douleur ou la détresse inutile chez l’animal) identifiés ou un score supérieur à 6 (grille) seront systématiquement sorti du protocole.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car ressemblant à l'homme concernant les mécanismes à l’œuvre dans le développement et les fonctions des systèmes de contrôle des émotions. Enfin, il existe des tests du comportement chez la souris permettant d'identifier des symptômes psychiatriques se manifestant de la même manière chez l'homme. Nous avons une très bonne connaissance des caractéristiques biologiques des souris par les travaux scientifiques et techniques publiés. La souris constitue un excellent modèle pour l’étude du fonctionnement du cerveau surtout concernant les circuits neuronaux qui contrôlent les émotions car ils sont similaires à ceux du cerveau humain, en particulier pour l’anxiété et la démence. Pour toutes ces raisons, ce choix d’espèce constitue un excellent modèle pour nos études. Dans le cadre des troubles anxieux, le stress de contention précoce commencera lorsque les animaux auront 30 jours. Les stades d'études moléculaires et histologiques sont justifiés par le fait que nous étudions les effets du stress de contention pendant la période où la aprtie du cerveau responsable du contrôle des émotions continue de maturer. Les paramètres biologiques seront donc étudiés après le premier stress de contention mais aussi après un second stress de contention à l'age adulte qui provoquera l’apparition de symptômes d’anxiété chez les animaux ayant subis les deux stress de contention. Les tests de comportement permettant de contrôler les niveaux d'anxiété seront réalisés sur des animaux adultes. Concernant la démence, les injections de substances se feront sur trois périodes vie : Jeune (1 mois), adulte (6 mois) et âgée (12 mois). Ces périodes sont justifiés par le vieillissement naturel et l’installation progressive de la démence avec l’âge. L’étude sur des souris jeune est essentielle pour identifier à quel stade les substances testées commencent à s’accumuler et comment elles peuvent avoir un impact sur l'apparition des troubles cognitifs

Jusqu'à cinq chocs électriques par séance, une séance de trente minutes par jour pendant neuf jours: 2 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi cinq injections dans l'abdomen, un gavage cinq jours sur sept pendant dix semaines, et passent des séries de quatre tests cognitifs, certaines étant isolées en cage pour la mesure de leur rythme circadien. Le porteur qualifie ces chocs de désagréables mais non douloureux, et écrit par ailleurs que l'usage d'analgésiques centraux est à proscrire pour des raisons scientifiques. Toutes sont tuées et leurs cerveaux prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires et moléculaires.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de cinq gènes d’intérêts dans le fonctionnement normal et pathologique des cellules immunitaires du cerveau. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière et jouent des rôles critiques à la fois dans son fonctionnement en conditions physiologiques et pathologiques. Les études récentes ont permis d’établir que la population de cellules immunitaires du cerveau est hétérogène et existe sous une grande diversité d’états microgliaux. Comment ces différents états sont contrôlés et quels sont leurs rôles dans le fonctionnement physiologique et pathologique du cerveau reste encore à déterminer. Notre équipe s’intéresse à plusieurs gènes qui de par leur localisation et/ou leur fonction dans d’autres cellules immunitaires sont susceptibles de jouer un rôle clé dans le contrôle de ces différents états microgliaux. L’objectif final du projet est donc de comprendre, dans différents contextes physiologiques et pathologiques (en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer), le rôle de ces cibles dans le fonctionnement des cellules microgliales. Pour ce faire, nous utiliserons une combinaison de lignées murines permettant de modifier l’expression de ces gènes spécifiquement dans les cellules immunitaires du cerveau. In fine, ce projet permettra de valider l’intérêt thérapeutique des gènes cibles dans les différents contextes envisagés. L'ajout d'une intervention (gavage) nécessite une deuxième modification du projet initiale sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

MODIFICATION: 1. Déchiffrer le rôle de gènes d’intérêt exprimés dans des cellules immunitaires dans le fonctionnement physiologique et physiopathologique des cellules immunitaires du cerveau (en particulier dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer) 2. Valider l’intérêt thérapeutique de ces cibles pour le développement de stratégies thérapeutiques, notamment dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer 3. Valider l'efficacité d'un traitement pharmaceutique, une molécule ciblant les cellules immunitaires, contre le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

MODIFICATION: Les interventions prévues dans le cadre de ce projet sont : des injections dans l’abdomen (5 injections, à raison d’une injection par jour, sur 5 jours, durée d’une injection environ 10 sec) ; administration d'une substrance pharmacologique par gavage 5j/7 pendant 10 semaines, durée de la manipulation environ 30sec; l’enchainement de tests pour évaluer le comportement cognitif des animaux (au maximum 1 série de 4 tests de 3 min (soit 12 min/animal/jour) chacun par jour, 5j par semaine sur 2 semaines ; chacun des tests étant non-invasif et reposant sur la propension des rongeurs à explorer leur environnement) ; un test basé sur l’évitement d’un choc électrique désagréable mais non douloureux (au maximum les animaux peuvent recevoir 5 petits chocs électriques par session, 1 session de 30 min par jour sur 9 jours). L’étude de l’effet de l’impact de la pathologie et/ou des gènes d’intérêt sur l’activité circadienne requiert l’emploi de tests impliquant des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement isolé temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l'étude.

Impact sur les animaux

MODIFICATION: Les effets indésirables découlant des interventions sont les suivants : Douleurs et stress léger de piqure d’aiguille dans le péritoine ; Stress et inconfort de l'introduction de la sonde de gavage; Stress léger et inconfort de certains tests de comportement. Isolement temporaire pour l’évaluation de l’activité circadienne.

Devenir

L'ensemble des animaux contribuant à ce projet sera mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires et/ou moléculaires.

Remplacement

Les cellules immunitaires du cerveau sont, par nature, des cellules ultra-sensibles à leur environnement. Pour comprendre leur rôle dans le fonctionnement physiologique ou physiopathologique du système nerveux central, il est nécessaire de les étudier dans un environnement aussi proche que possible des conditions natives. Dans ce contexte, les données récentes de la littérature indiquent que les morphologies, les fonctions ou encore le répertoire de gènes exprimés par les lignées cellulaires microgliales ou même les cultures primaires de microglies diffèrent substantiellement de ceux exprimés par les microglies fraichement isolées à partir de cerveaux adultes. L’utilisation d’animaux vivants est donc requise. Par ailleurs, certains des rôles des cibles que nous cherchons à évaluer (i.e. effets sur comportement cognitif, en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer) ne peuvent être réalisées que sur animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 2250) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent. Par ailleurs, nous avons défini des stratégies de croisement de manière à limiter au maximum la production d’animaux qui ne seraient pas utiles pour l’expérimentation. Il est bien établi qu’il existe un important dymorphisme sexuel dans la biologie des cellules immunitaires du cerveau, les études seront donc réalisées à la fois chez le mâle et la femelle. Par ailleurs, la maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative. Nos données antérieures et celles de la littérature indiquent que les cellules immunitaires du cerveau pourraient jouer des rôles fonctionnels différents en début et en fin de pathologie, les effets des cibles d’intérêts seront donc évalués à deux stades différents, au stade précoce et à un stade plus tardif. Dans la mesure du possible, nous réaliserons l'expérimentation comportementale, et les analyses post-mortem sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel permettant de déterminer le nombre d’animaux statistiquement requis en fonction des effets escomptés.

Raffinement

Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera effectué régulièrement. Des points limites spécifiques ont été définis (perte de poids continue et excessive (évaluée de manière visuelle); prostration ; poils ébouriffés, arrêt d’alimentation, etc.) et le raffinement s’appliquera pour une prise en charge adaptée des animaux. Pour les scores les plus importants, cette prise en charge pourra conduire à l’euthanasie de l’animal. En cas de blessures (notamment à la suite de bagarres entre animaux), des analgésiques d’application locale pourront être utilisés. Cependant, notre projet se référant à l’étude de processus neuroinflammatoires, l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques centraux (hors procédure d’euthanasie) est à proscrire pour des raisons scientifiques. La présence d'une roue d'activité pour mesurer la rythmicité circadienne constitue un enrichissement très apprécié des souris. Ce test nécessite de travailler avec un seul animal par cage, mais les contacts visuels et olfactifs sont maintenus entre animaux de cages voisines.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le mieux adapté pour étudier les effets des modifications génétiques sur le comportement, les tissus, les cellules et les molécules des cellules immuitaires du cerveau. L'utilisation de la recombinase Cre pour contrôler ces modifications génétiques est particulièrement intéressante. C'est pourquoi les modèles murins, en particulier dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, sont privilégiés. Ces avancées permettent de respecter au mieux les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Refinement). Nous utiliserons des animaux adultes à différents âges en fonction des sous-objectifs du projet : 2-3 mois pour les études en conditions physiologiques ; 4 et 8 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début précoce; 9 et 12 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début tardif.

Nourries pendant seize à vingt-quatre semaines avec un régime destiné à leur provoquer obésité, foie gras et inflammation hépatique, une partie des souris reçoit en plus deux injections par semaine pendant douze semaines pour induire une fibrose du foie. 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du sang, du foie, du tissu adipeux et du nerf sciatique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un gavage quotidien pendant douze à vingt-quatre semaines, des jeûnes de six heures suivis de six prélèvements sanguins en deux heures, et le porteur décrit une neuropathie allant jusqu'à la perte de la sensibilité. L'objectif est de tester un médicament déjà développé pour limiter l'accumulation d'un lipide, sans que les trois analyses neurologiques annoncées soient nommées.

Objectifs

La neuropathie diabétique est une complication fréquente du diabète qui touche environ 40 pourcents des patients. Elle provoque une perte de sensation, en particulier dans les pieds, ce qui peut entraîner des blessures et, dans les cas graves, des amputations. Actuellement, il n'existe pas de traitement permettant de restaurer la sensibilité perdue. En plus du diabète, d'autres facteurs comme l'obésité et le syndrome métabolique peuvent aussi causer des atteintes nerveuses similaires. Des recherches ont montré qu'un certain type de graisse pourrait jouer un rôle important dans ces dommages nerveux. Un médicament a été développé pour limiter l'accumulation de ces lipides. Ce projet de recherche veut tester si le traitement employé pour limiter cette graisse particulière pourrait aussi être utile contre la neuropathie diabétique en réduisant la synthèse de ces dérivés lipidiques et en protégeant les nerfs. Si cela fonctionne, cela pourrait ouvrir une nouvelle piste de traitement pour améliorer la qualité de vie des patients diabétiques.

Bénéfices attendus

La neuropathie liée au diabète peut entraîner de graves complications, comme des plaies aux pieds pouvant aller jusqu’à l’amputation. En France, environ 8 000 amputations par an sont dues à cette maladie. Ce projet de recherche s’intéresse à certains lipides et à leur rôle potentiel dans ces atteintes nerveuses. Un médicament agit justement sur la synthèse de ces mdérivés lipidiques. L’idée serait d’explorer s’il pourrait aussi aider les patients diabétiques en réduisant le risque de complications graves, comme les amputations.

Procédures

Les animaux seront nourris avec des régimes spéciaux (régime induisant une obésité, un foie gras, une inflammation hépatique (animal vigil, en continu pendant 16 à 24 semaines ) ou un traitement injectable pour induire une fibrose hépatique (animal vigil, 2 fois par semaine pendant 12 semaines, 1 minute). Pour les animaux recevant le traitement ou un placebo, un gavage par jour sera réalisé pendant 12 à 24 semaines sur animal vigil, 1 min. Des explorations métaboliques seront réalisées pour explorer la sévérité du diabète (animal vigil, 2 fois car un pour le test de tolérance à l'insuline et un pour le test de tolérance au glucose), 6 prélèvements de sang de faible volume au total sur une période de 2h, après une mise à jeun de 6h) ainsi que des analyses neurologiques (2 tests sur animal vigil (2 et 10 min respectivement et 1 test sous anesthésie, 30min; chaque test étant espacé de 2 jours, 10 minutes). En fin de projet, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) risque de réduction de la prise alimentaire lié à la néophobie des souris au changement de régime, 2) la maladie hépatique induite par régimes spéciaux ou par injection bihebdomaire intrapéritoneale d'un traitement (douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille) et ses conséquences métaboliques avec insulinorésistance provoquant un diabète (polyurie-polydipsie) et une obésité et les conséquences sur le nerf (neuropathie périphérique avec troubles de la sensibilité ou perte de la sensibilité) 3) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie 4) le stress et la douleur légère lié à la manipulation et la contention durant les tests métaboliques (tests de tolérance à l'insuline et test de tolérance au glucose) 5) le stress et la douleur légère de courte durée liée au prélévement de sang lors des tests métaboliques et durant les tests de sensibilité et de conduction nerveuse. 6) risque de perte de poids, d’hémorragie lié au prélèvement et risque d’hypoglycémie ainsi que la mise à jeun de 6h avec sensation de faim pour les tests métaboliques. 7) irritation oesophagienne liée au gavage quotidien du médicament testé

Devenir

A la fin de la période de maintien des animaux, les souris seront euthanasiées afin de prélever les tissus d’intérêt (sang, tissus adipeux, foie et nerf sciatique) en vue d’analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de comprendre l’influence du métabolisme lipidique en cas de MASLD (maladie métabolique du foie) sur la neuropathie périphérique. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude est calculé pour avoir des résultats statistiquement fiables. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Le nombre total d’animaux sera de 960 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. En cas d'obésité avec difficulté à se mouvoir, la nourriture sera déposée en fond de cage. Le change de la cage augmenté si necessaire pour s'adapter à la diurèse induite par le diabète et permettre aux souris de rester au sec. Les souris sous régime ou traitement fibrotique seront surveillées quotidiennement. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Les points limites sont évalués par un personnel compétent.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques d’obésité et de diabète ont été validés chez la souris. De plus sa physiologie est connue et il est bien décrit qu'un régime obésogène et/ou diabétogène est capable d'induire une insulinorésistance quelques semaines après le régime. Dans les protocoles, les souris seront mises en conditions expérimentales à partir de l'âge de 6-8 semaines afin que le métabolisme des animaux soit stabilisé.

Jusqu'à six chirurgies d'implants de huit heures chacune et jusqu'à neuf ouvertures de volets osseux dans le crâne: 8 macaques, quatre à longue queue et quatre rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils travaillent en chaise de contention cinq à sept fois par semaine, lors de séances allant jusqu'à cinq heures, un contrôle de l'eau servant de levier de motivation puisque la récompense hydrique constitue une partie de leur apport journalier. Le porteur veut comprendre comment le cerveau des macaques perçoit les visages, le statut de dominance et les liens sociaux entre congénères. Sept des huit macaques resteront en utilisation continue, un sera tué pour l'étude post-mortem de son cerveau.

Objectifs

Le cerveau des primates, des humains comme des singes, leur permet de vivre en société, ce qui participe à la survie de leur espèce. Notre cerveau de primate est notamment adapté pour la perception des individus et pour l’analyse de leurs comportements. Or la cognition sociale est la première à être touchée dans de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, et nous ne connaissons pas exactement l’origine de ces problèmes, notamment du fait de notre connaissance insuffisante des mécanismes cérébraux qui nous permettent de percevoir et de comprendre les autres. L’objectif de ce projet est de comprendre par quels mécanismes le cerveau des primates non-humains leur permet de percevoir et comprendre leur groupe social. Nous savons par exemple, que les singes, tout comme les humains, possèdent dans leur cerveau des régions spécialisées pour la perception des visages par rapport à d’autres objets visuels. Cependant nous ne savons pas 1/ par quels mécanismes biologiques, les neurones –c’est-à-dire les cellules de ces régions cérébrales– codent les caractéristiques sociales des individus (comme leur genre, leur statut de dominance, leurs liens d’amitié) 2/ comment les neurones associent une même caractéristique sociale perçue par différentes modalités sensorielles 3/ s’il existe des régions cérébrales spécifiques aux odeurs sociales et au toucher social, deux modalités très importantes depuis le plus jeune âge pour percevoir les autres. Par ailleurs, les primates sont des spécialistes pour l’analyse des comportements de leurs congénères et possèdent des régions cérébrales spécifiques pour l’analyse des interactions sociales. Cependant, nous ne savons pas par quels mécanismes les neurones extraient des informations sur les individus à partir d’observation d’actions. Dans ce projet, nous proposons de répondre à ces questions majeures pour les neurosciences, la psychologie sociale ou encore la biologie évolutive en utilisant des techniques d’étude du cerveau à plusieurs niveaux combinant des méthodes exploratoires d’imagerie du cerveau afin d’identifier les régions cérébrales responsables de ces processus sociaux, à des méthodes fines d’enregistrement de l’activité des neurones et de manipulations moléculaires, avec l'objectif à long terme de fournir aux neurosciences cliniques de nouvelles hypothèses pour comprendre comment ces mécanismes peuvent être perturbés dans les maladies psychiatriques ou neurologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront d’abord de mieux comprendre la représentation du réseau social, des interactions sociales et des individus dans le cerveau avec une précision et une compréhension au niveau des mécanismes neuronaux jamais atteintes jusque-là. Les perturbations temporaires des régions du cerveau identifiées par imagerie par résonance magnétique (IRM) pourraient permettre de s’approcher au plus près des tableaux cliniques humains et donc fournir aux neurosciences cliniques de nouvelles hypothèses pour comprendre comment les mécanismes sociaux sont perturbés dans les maladies psychiatriques et neurologiques. Ainsi ce projet pourrait permettre d’établir un modèle animal pour la compréhension des troubles sociaux qui impactent les patients présentant des troubles neurologiques ou psychiatriques. Il s’agira également potentiellement de découvrir de nouvelles régions cérébrales sur la perception des odeurs et du toucher social, et d’obtenir une comparaison du cerveau social des singes et du cerveau social humain et donc de comprendre les mécanismes conservés au cours de l’évolution et ceux qui sont spécifiques à notre espèce et à l’espèce des macaques rhésus.

Procédures

Tous les animaux sont habitués aux différents dispositifs et au personnel pour limiter tout stress. Ils seront entrainés à la réalisation de tâches comportementales (5-7 fois/semaine, 20min-4h/session). Le bon positionnement dans la chaise pourra s’accompagner d’un faible sédatif (sur environ 10séances si nécessaire). Les animaux réaliseront des IRM sous anesthésie (4h, 1-2sessions/mois avant 4ans puis 6fois/an). Ils auront 3 chirurgies d’implants minimum (mise en place d’un implant de maintien de la tête, de chambres d’enregistrement, d’électrodes d’enregistrement) et 6 maximum s’il est nécessaire de réparer, retirer ou remettre un implant (durée: 8h maximum/chirurgie sous anesthésie générale). Ils auront 2 interventions d’ouvertures de volets osseux ciblés minimum et 9 maximum s’il est nécessaire d’ajouter ou d’agrandir les volets existants (durée: 5h maximum/intervention sous anesthésie générale). Les chambres d’enregistrement sont entretenues 2 fois/semaine minimum (durée 60min). Les animaux vigiles participeront à des enregistrements de l’activité cérébrale par IRM et par électrophysiologie pendant qu’ils réaliseront des tâches comportementales (durée 5h maximum, 5-7 fois/semaine). Pour favoriser la motivation des animaux pendant les tâches comportementales, ils seront récompensés à l’aide d’une récompense hydrique qui constituera une partie de leur apport journalier en liquide. Un retour progressif à un apport à volonté est effectué au moins 2 fois une semaine chaque année. Une surveillance quotidienne est réalisée afin de garantir un bon état d’hydratation et une bonne santé, vérifiée par des analyses sanguines 2 fois/an (prise de sang de 4min). Chaque IRM s’accompagnera d’une injection intraveineuse d'un agent de contraste (durée 2min). Cet agent sera ensuite éliminé par deux composés (1 administration intramusculaire/jour de 30s, et 2 administrations orales/jour de 3min). Des analyses sanguines seront réalisées pour suivre le retour aux valeurs de référence (environ 4 prises de sang à la fin des séquences de plusieurs IRM, durée 4min). Des molécules seront administrées pour moduler l’activité cérébrale par inhalation (60 administrations maximum par animal de 20min), ou par la nourriture (60 administrations maximum/animal), ou par injection intraveineuse (60 administrations maximum/animal de 4min), ou dans le cerveau (60 administrations maximum/animal de 50min). Un des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure.

Impact sur les animaux

L’animal pourrait ressentir une gêne ou des douleurs après les différentes chirurgies (pose de l’implant de tête, des chambres d’enregistrements ou des électrodes à demeure). Il y a également la gêne liée à la présence de ce matériel à demeure. Les risques liés à l’anesthésie (notamment hypothermie, sécheresse oculaire, dépression cardio-respiratoire) peuvent survenir. Il existe des risques d'infection sur les implants de tête, sur les électrodes implantées et lors de l'introduction des électrodes amovibles pour les enregistrements. Les risques de perte d’implant peuvent survenir suite à un rejet du matériel biocompatible provoquant chez certains animaux une réponse inflammatoire chronique et un rejet du matériel chirurgical. L’animal pourrait ressentir un stress/contrainte lors des séances d'électrophysiologie, d’imagerie, de tests ou d’entrainement pendant lesquelles il est positionné en chaise de contention ou maintenu par l’implant de tête. Le stress de l’hébergement en captivité peut être présent. Le contrôle hydrique peut induire un stress pour l’animal, une sensation de soif, de la déshydratation ou une perte de poids. Les risques liés aux agents pharmacologiques existent, lies à la tolérance/réaction individuelle aux molécules utilisées ainsi qu’à la capacité de la récupération propre à chaque animal, pouvant induire par exemple une réaction allergique, une accumulation dans les tissus, un mauvais fonctionnement du foie ou des reins. L’animal pourrait ressentir une gêne ou une douleur de courte durée au point d’injection lors des injections et prélèvements en intraveineuses, ou en intramusculaire.

Devenir

7 des 8 animaux seront en utilisation continue pour poursuivre l’acquisition de données sur ce sujet de recherche afin de privilégier l’utilisation d’un animal déjà entrainé par rapport à un animal naïf (réduction du nombre d’animaux). Cette utilisation continue se fera en accord avec l’équipe vétérinaire et dépendra de l’état de bien-être des animaux. 1 animal sera euthanasié pour l’étude post-mortem de son cerveau.

Remplacement

Avec les technologies actuelles, le présent projet ne peut être abordée qu'avec l’utilisation d’animaux. Nous ne pouvons pas utiliser de lignées cellulaires ou tissus, car ils ne présentent pas de processus perceptifs ou cognitifs. Les modèles informatiques du cerveau, ne permettent pas de comprendre, sans données empiriques préalables, quels algorithmes sont effectivement utilisés dans le cerveau réel en action. D’autre part, les études non invasives chez des sujets humains en bonne santé ne permettent pas d’enregistrer des signaux avec une résolution temporelle et spatiale suffisante pour étudier les mécanismes neuronaux. Le travail chez les patients humains est également limité, car pour des raisons éthiques, les enregistrements électrophysiologiques quand ils ont lieux ne peuvent pas cibler des régions d’intérêt scientifique mais uniquement des régions d’intérêt clinique. Il est donc impossible d’acquérir une compréhension mécanistique de la cognition sociale chez l’humain, les cultures cellulaires ou les cultures de tissus. Contrairement à d’autres animaux (ex. rongeurs/oiseaux), les fonctions cérébrales et l’anatomie des systèmes sensoriels des primates non humains (PNH) sont organisées autour de la modalité visuelle et sont ainsi homologues à l’Homme. Ces homologies concernent les systèmes neuraux et les stratégies cognitives et sociaux-cognitives des PNH, y compris certaines interactions sociales dont seuls les primates sont capables, ce qui n’est pas retrouvé dans d’autres modèles (ex. oiseaux/rongeurs). Comme nous comparerons nos résultats avec ceux observés chez l’humain, ce modèle est déterminant et le plus pertinent pour mener ce projet grâce à cette proximité.

Réduction

Les normes de publication, notre expérience, et les analyses statistiques indiquent que les données doivent être obtenues chez 6-8 animaux pour les expériences comportementales, 4-6 animaux pour l'imagerie, 2-3 animaux pour l’électrophysiologie, les neuromodulations, afin d'obtenir des données robustes et interprétables. L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) est sans doute la technique la plus efficace pour réduire le nombre d'animaux en fournissant des connaissances sur les régions cérébrales pertinentes à étudier ensuite par électrophysiologie. Sans cette connaissance, les enregistrements devraient être effectués dans tout le cerveau et pourraient nécessiter jusqu'à 10 fois plus d’animaux pour enregistrer dans toutes les régions possibles. De plus, l’utilisation d’agent de contraste lors des IRM fonctionnelles permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d’acquisitions. Ainsi nous utiliserons 8 macaques dans notre projet, ces 8 animaux participeront aux tâches comportementales, puis seront répartis par groupe de 4 à l’IRMf et par groupe de 2 à l’électrophysiologie avec/sans perturbations de l'activité cérébrale. Ce point répond également à la nécessité d'obtenir plus d'informations à partir du même nombre d'animaux et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. Nous privilégierons de répéter nos enregistrements sur un même animal afin d’utiliser le plus faible nombre d’animaux possible. Nous utiliserons les tests statistiques adaptés pour analyser les données récoltées.

Raffinement

L’état de bien-être de l’animal est primordial et s’il y a une anomalie des mesures seront prises pour aider à le restaurer. Les animaux sont observés quotidiennement tout au long du projet et des points limites ont été établis pour assurer une prise de décision rapide et efficace pour s’assurer que le bien-être de l’animal est préservé. L’hébergement en groupe social, dans une animalerie aux paramètres surveillés quotidiennement (lumière, température, hygrométrie), ainsi que l’enrichissement et une alimentation adaptée sont mis en place pour stimuler les animaux et leur permettre d’exprimer leurs comportements naturels. L’entraînement régulier par renforcement positif permettra d’instaurer une routine limitant les contentions et le stress lors des manipulations et des tâches demandées. Le contrôle hydrique sera adapté à la demande de chaque animal en ayant intégré les particularités individuelles. Les chirurgies et IRM anesthésiées sont réalisées sous anesthésie générale avec la mise en place d’anti-douleurs adaptés (avant, pendant et après ; une réévaluation avec le vétérinaire est disponible si besoin). Lors des anesthésies, une surveillance des constances physiologiques (rythmes cardiaque et respiratoire, température…) est toujours mise en place et la température est maintenue. Le dispositif implanté sera le plus adapté possible pour le confort de l’animal et limiter la gêne. Il sera posé dans des règles strictes d’asepsie. Le post-opératoire sera surveillé avec une aide à l’alimentation pour faciliter la récupération, des enrichissements et une taille de la cage adaptée pour stimuler l’animal et faciliter les déplacements. La récupération complète est vérifiée avant la poursuite du projet.

Choix des espèces

Les singes Macaca mulatta, Macaca fascicularis (PNH) présentent des similitudes cognitives aux humains. Particulièrement, dans le domaine social : les macaques observent longuement leurs congénères ; sont socialement polyvalents ; leur environnement social, comme les sociétés humaines, comprend de nombreux paramètres qui nécessitent une extraction calculée des informations. Nous étudierons leurs connaissances des comportements sociaux complexes de leurs congénères, y compris d'un éventail d'interactions sociales dont seuls les primates sont capables. Leurs fonctions cérébrales et l’anatomie de leurs systèmes sensoriels sont organisées autour de la modalité visuelle et sont ainsi homologues à l’Homme. Comme nous comparerons nos résultats avec ceux observés chez l’humain, le modèle PNH est déterminant et le plus pertinent pour mener ce projet. Nous utiliserons des animaux adultes ou jeunes adultes (plus de 2ans), déjà sevré, car leur cerveau est à un stade mature nécessaire à nos recherches.

Une grille de cotation de la douleur fixe le seuil au-delà duquel un rat sera mis à mort avant terme. 80 rats porteurs d'une mutation analogue à celle de la maladie de Huntington vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit une neurochirurgie d'environ une heure pour implanter des électrodes non amovibles, puis des enregistrements de douze à quarante-huit heures deux fois par mois pendant dix mois, des stimulations sonores mensuelles, et vit seul en cage pendant neuf mois avec un accès à la nourriture contrôlé. L'objet déclaré est de trouver des marqueurs électriques cérébraux transposables entre le rat et le patient, pour servir de test dans la mise au point de médicaments.

Objectifs

Les patients atteints de la maladie de Huntington, souffrent, en plus des symptômes moteurs et d'une altération de certaines capacités intellectuelles, de troubles du cycle veille-sommeil, ces perturbations du sommeil pouvant déjà être présentes au stade précoce (présence de symptômes avant-coureurs) de la pathologie. L'électroencéphalographie (EE) représente un outil de choix lors des tests précliniques en raison de son caractère transposable entre le rat et l’Homme car les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères ce qui permet donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Un modèle de rat porteur d’une mutation analogue à celle identifiée chez les patients atteints de la pathologie est disponible et a été caractérisé d’un point de vue comportemental. Il présente des troubles moteurs proches de ceux décrits chez l’Homme. Il est donc pertinent d’explorer les autres caractéristiques de la maladie décrites chez le patient afin de confirmer la pertinence de ce modèle dans l’étude de la maladie et la recherche de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans ce projet, nous étudierons donc les phases de veille-sommeil et les oscillations cérébrales spontanées et évoquées dans un modèle de la maladie de Huntington.

Bénéfices attendus

La découverte et l’optimisation de nouveaux médicaments nécessite d’identifier des signes de la maladie dans le cerveau et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ils doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des rats modélisant la maladie de Huntington et chercherons à mettre en évidence des marqueurs de la maladie qui pourront par la suite être applicables à l’Homme et permettre de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront tous soumis à des enregistrements longs (12 à 48 heures) qui seront réalisés sur l’animal éveillé de façon bimensuelle avec un intervalle minimum d’une semaine, sur une durée de 10 mois maximum. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal éveillé une fois par mois (durée de quelques heures) sur une durée de 10 mois maximum (entre l’âge de 6 mois et de 15mois). Les stimulations sonores intermittentes dureront au maximum 2h. Les animaux sont hébergés de façon individuelle sur la totalité du projet à partir de la chirurgie (9 mois maximum). L’accès à la nourriture est contrôlé pendant la totalité du projet à l’exception des 2 semaines suivant la chirurgie.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux. Après implantation des électrodes, les animaux seront hébergés en cages individuelles, avec un contact social réduit (plusieurs semaines) ce qui peut engendrer du stress. Des troubles de la démarche et de la coordination sont décrits dans la littérature sur cette lignée.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électriques du cerveau qui ne sont pas amovibles. De plus, des analyses des tissus cérébraux sont nécessaires pour compléter la caractérisation du modèle et vérifier le positionnement des électrodes les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle étudie des mécanismes physiopathologiques complexes, comme le sommeil, qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou informatique).

Réduction

Les études sur le long terme présentent un avantage significatif en permettant à chaque animal de servir de contrôle pour lui-même, réduisant considérablement le nombre d'animaux nécessaires par groupe. Cette approche méthodologique nous a permis de déterminer le nombre d'animaux de manière à minimiser celui-ci, tout en veillant à préserver la validité scientifique et la fiabilité des résultats des expériences menées. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à nos études, les protocoles combineront un ensemble de recueil de mesures permettant de faire un suivi et d’obtenir plusieurs informations chez le même rat.

Raffinement

Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Les rats qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Les animaux seront regroupés dans une grande enceinte lors d’une session hebdomadaire afin de favoriser les contacts. Le projet prévoit des recueils des mesures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins post-opératoires comprenant une évaluation clinique quotidienne, des antidouleurs et des anti-inflammatoires. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. De plus, nous appliquerons des actes expérimentaux les moins invasifs possibles aux rats testés comme le choix d’une anesthésie gazeuse (par rapport à une injection). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La prise en compte de ces points permettra de juger du bien-être et d'éviter l'inconfort des animaux au cours de l'expérimentation de manière à garantir la qualité des résultats. Les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable.

Choix des espèces

Nous utiliserons une lignée de rats dont la mutation est similaire à celle présente chez les patients de la maladie de Huntington. Le choix de l’espèce est donc directement lié à cette similarité : la mutation de ce même gène chez l’homme et le rat induit en effet des troubles similaires dans les deux espèces. Les animaux sont manipulés au minimum à l’âge de 6 mois puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 15 mois maximum. A ce stade, le cerveau est mature et présente des caractéristiques intéressantes pour reproduire les troubles observés chez le patient humain.