Système nerveux

3 060 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux administrations orales espacées de 48 heures, subit un conditionnement par la peur de sept minutes puis une réexposition de cinq minutes, donne deux à trois prélèvements de sang à l'état vigile et finit par une chirurgie sans réveil pour prélèvement du cerveau. Les retombées annoncées pour le stress post-traumatique et la maladie d'Alzheimer sont renvoyées au long terme, l'objet immédiat restant de décrire le rôle des cellules gliales dans la mémorisation. Les souris qui atteignent un point limite sont tuées et servent alors, selon le porteur, à des mises au point expérimentales.

Objectifs

La mémorisation et l’apprentissage reposent sur la "plasticité" des circuits neuronaux, c’est-à-dire la capacité à remodeler, réorganiser, les connexions entre les neurones. Cette plasticité est importante au quotidien, voire pour la survie. En effet, reconnaître des contextes dans lesquels on s’est senti précédemment menacé permet d’avoir un comportement adapté si on y est réexposé. Un défaut de cette mémoire entraîne un risque de s’exposer à des situations dangereuses, mais un excès peut conduire à une anxiété disproportionnée dans un contexte ne ressemblant qu’approximativement à celui où l’on a été en danger (c’est le stress post-traumatique). Inversement, la capacité à mémoriser est altérée dans certaines maladies comme celle d’Alzheimer. Il est donc important de connaître les facteurs régulant la plasticité des circuits neuronaux, afin de comprendre pourquoi elle est perturbée dans des situations pathologiques, et d’imaginer comment le prévenir ou y remédier. L’objectif de ce projet est d’étudier, chez la souris, de nouveaux mécanismes permettant la plasticité et donc la mémorisation. Le rôle des neurones dans la mémoire est bien établi, mais d’autres cellules du cerveau, les cellules gliales, pourraient favoriser la plasticité neuronale, c’est-à-dire les remaniements des connexions qui permettent de mémoriser un événement, une situation. L’hypothèse au cœur de ce projet est que lors de l’apprentissage, les propriétés des cellules gliales changent, ce qui a un impact sur leur interaction avec les neurones et favorise la mémoire. Pour tester cette hypothèse, nous avons besoin d’étudier les modifications des cellules gliales lors de la formation de la mémoire, chez des animaux normaux, et chez des animaux dans lesquels ces cellules gliales sont altérées.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à étudier les mécanismes de la mémoire. Voici les retombées possibles : 1) Nous étudierons comment on mémorise une situation de danger, parfois excessivement. C’est un modèle pour étudier le trouble de stress post-traumatique (TSPT), qui est reconnu comme un problème de santé mentale par les psychiatres. Le TSPT peut toucher des personnes ayant connu des traumatismes dans l’enfance, des catastrophes naturelles, ou des situations violentes et/ou très anxiogènes (la moitié des personnes témoins ou endeuillées par les attentats de 2015 ont présenté un TSPT dans les mois qui ont suivi). Certaines professions (pompiers, soignants, militaires) sont particulièrement à risque à cause d’expositions fréquentes à des situations dramatiques. Les manifestations sont diverses : peur intense, pensées intrusives, hypervigilance... Non pris charge, cela perturbe fortement la qualité de vie des personnes, perturbe leur travail, diminue leur insertion sociale, et peut conduire à des idées suicidaires dans les cas extrêmes. Ce modèle permet aussi d’étudier les processus de mémorisation en général. Les résultats que nous obtiendrons pourront donc aussi servir à long terme pour la recherche sur les troubles de la mémoire dans la maladie d’Alzheimer, qui atteint 1 personne de plus de 75 ans sur 6 en France. 2) Nos expériences vont apporter de nouvelles connaissances sur le rôle des certaines cellules et molécules, qui sont ciblées par des médicaments (anti-dépresseurs, neuroleptiques, psychostimulants…). Nos résultats pourraient donc aussi permettre, à long terme, de mieux comprendre les effets positifs ou indésirables de ces médicaments sur la mémoire, et donc d’améliorer, pour les êtres humains, leur prescription et leur utilisation.

Procédures

Dans ce projet, les animaux doivent recevoir un composé pharmacologique, par voie orale, en 2 prises espacées de 48h. Chaque administration sur animal vigile dure moins de 30 secondes. Au minimum 4 semaines plus tard, les animaux vont être soumis à un test de mémoire. Cela nécessite une phase d’apprentissage qui dure 7 minutes, suivie quelques heures ou jours plus tard (selon les lots), d’une phase de test pendant 5 minutes. Par ailleurs, pour vérifier le niveau de stress chez les animaux, nous devons doser dans le sang des marqueurs comme la corticostérone. Pour ce faire, nous devons prélever quelques gouttes de sang sur les animaux vigiles. Le geste dure moins d’une minute. Les animaux seront prélevés 2 ou 3 fois selon les lots, et les prélèvements sont espacés d’une semaine au minimum. A la fin de l’expérience, une chirurgie sans réveil sous anesthésie et analgésie est réalisée. Ce geste dure moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un composé pharmacologique par voie orale, il y a un stress lié à la contention de l’animal, un risque de blessure de l’animal au niveau de l’œsophage lors des gavages, et un risque mineur de « fausse route ». Pour le test de mémoire, on réalise un conditionnement par la peur, qui génère donc un stress modéré. Ensuite, on réexpose l’animal au même environnement, ce qui induit une anxiété qui se manifeste par une immobilité, et que l’on quantifie pour déterminer le niveau de mémorisation. Lors des prélèvements de sang, il y a un risque d’hématome ou d’hémorragie si l’animal a un problème de coagulation. Lors de l’anesthésie/analgésie, il y a un risque de détresse respiratoire, comme effet secondaire possible des produits employés comme la kétamine.

Devenir

Nous devons euthanasier les animaux à l’issue de la procédure pour pouvoir prélever leurs organes (ici, le cerveau) et réaliser des analyses qui sont nécessaires à la compréhension des mécanismes de mémorisation.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les modifications des cellules gliales lors d’un apprentissage. En préparation et en parallèle de ce projet sur l’animal éveillé, nous faisons des expériences sur des cultures primaires de cellules, pour des mises au point ou pour tester des hypothèses. Cependant, l’apprentissage et la mémorisation, comme le test pour déterminer le niveau de mémorisation, reposent sur le comportement de l’animal, qui doit être éveillé et pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (vue, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types de cellules, ce qu’on ne peut pas modéliser fidèlement ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment les processus de mémorisation. De plus, il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère afin d’obtenir des résultats transposables à l'Homme car les structures cérébrales impliquées et étudiées (ex : l’hippocampe) ne sont pas présentes chez les invertébrés. La souris représente un modèle de choix car le fonctionnement du cerveau et les tests comportementaux que nous allons utiliser sont bien caractérisés. L’autre avantage du modèle souris est qu’il existe des lignées génétiquement modifiées qui permettent d’invalider ou d’exprimer des gènes pour étudier leur rôle.

Réduction

Afin de déterminer le nombre minimal d’animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles, une analyse statistique a été effectuée et a permis d’estimer qu’il faut prévoir une douzaine d’animaux de chaque sexe (soit 24 animaux) par groupe expérimental. Si l’on réduit trop le nombre d’animaux, on perd en « puissance statistique », c’est-à-dire qu’on risque de ne pas pouvoir détecter des différences, et de conclure par erreur à une absence d’effets. De plus, nous devons prévoir des animaux pour ajuster les protocoles, car même si les expériences ont déjà été réalisées au laboratoire précédemment, il est important de refaire des expériences test pour que les nouveaux expérimentateurs amenés à faire l’expérience se familiarisent avec les différentes étapes. Cela permet que les expériences avec les animaux d’intérêt se déroulent au mieux et que les résultats soient fiables, donc au total cela limite les répétitions et le nombre d’animaux utilisés. En tout nous estimons l’utilisation de 3060 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les conditions sont conformes à la réglementation pour l’espèce concernés (température constante entre 20 et 24 degrés avec un éclairage circadien, hébergement en groupes sociaux de 5 individus maximum et présence dans chaque cage d’un à deux enrichissements de nidification). Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) la douleur et/ou le stress. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation. Les administrations et prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. En ce qui concerne la perfusion intracardiaque, afin de réduire les nuisances, les animaux seront injectés avec l’anesthétique et l’analgésique dans une pièce séparée de la salle de perfusion, et apportés dans la salle juste pour la perfusion, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement conformément aux règlementations, et de manière particulièrement rapprochée après les administrations, les tests comportementaux, et les prélèvements de sang. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien, de sorte à administrer un traitement adapté si besoin, et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste ou blessure les animaux seront euthanasiés par une chirurgie sans réveil. Ils ne seront alors pas forcément utilisés pour l’étude en elle-même mais pourront être utilisés pour des mises au point expérimentales.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle de choix pour les études sur le cerveau et la mémoire car en tant que mammifère son système nerveux a des similarités importantes avec l’homme. De plus, elles peuvent apprendre des tâches complexes, et on peut analyser leur comportement finement. Cette espèce est bien connue comme modèle pour étudier la mémoire. De plus, il existe dans cette espèce des lignées modifiées génétiquement, qui permettent d’étudier le rôle de certains gènes et de certaines cellules de manière précise. On peut en effet invalider, muter, des gènes particuliers dans des cellules précises, et à des stades de développement particuliers. Dans notre étude, pour étudier la mémoire, nous étudierons des animaux dont le développement aura été normal, mais dans lesquels on aura induit des modifications à l’âge adulte (4 semaines après la naissance au moins). Cela nous permet d’élever les animaux dans un état où les modifications génétiques sont silencieuses, sans effet, jusqu’au moment de l’expérience.

Aucune souris n'est gardée vivante à l'issue, les procédures subies étant jugées incompatibles avec toute conservation. 382 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de trente minutes sous anesthésie générale pour recevoir une injection dans le cerveau, puis vit cinq à neuf semaines avant les analyses. Le porteur ramène les atteintes attendues à une douleur et une perte de poids survenant "dans des cas très rares", et conclut que l'étude in vivo est "indispensable" parce que les cultures cellulaires ne reproduisent pas les interactions entre neurones et astrocytes.

Objectifs

Depuis maintenant plusieurs décennies, de nombreuses études indiquent que l’astrocyte joue un rôle clé au cours de la communication neuronale aussi appelée transmission synaptique. En effet, cette cellule gliale détecte l’information transmise au niveau de la synapse (zone de communication entre deux neurones) et en retour régule la communication neurone-neurone via la libération de transmetteurs. Récemment, de nombreux papiers révèlent également la présence au niveau astrocytaire de molécules d’adhésion cellulaire, qui étaient jusqu’à présent considérées comme étant des molécules uniquement neuronales. L'expression astrocytaire des molécules d'adhésion pourrait expliquer comment les astrocytes forment des interactions étroites avec leurs partenaires synaptiques, et exercent des fonctions importantes, notamment la régulation de l’activité synaptique. Afin d’aller plus loin dans la compréhension du transfert d’information dans l’hippocampe, une région cérébrale jouant un rôle clef dans la mémoire, il est donc nécessaire de déterminer si les molécules d'adhésion astrocytaires interviennent dans la régulation de la transmission synaptique, la plasticité synaptique à long terme, ainsi que la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la mémoire et l’apprentissage. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 2 : - Chirurgie sous anesthésie générale pour injections intra-cérébrale (30 min), - Euthanasie après anesthésie profonde (instantanée).

Impact sur les animaux

Suite aux différentes procédures, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir dans des cas très rares.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

Travaillant sur les interactions des cellules neuronales et astrocytaires, il est impossible de recourir à des modèles bioinformatiques ou à des cellules en culture. L’étude in vivo est donc indispensable. De plus, la souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la mémoire. Nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles. Si au cours du projet nous observons que les résultats sont similaires entre les mâles et les femelles, nous poolerons les données obtenues ce qui permettra de REDUIRE de moitié le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dispositions d’hébergement : Pour chacune des études, les animaux seront placés dans des cages enrichies, au nombre de 4-5 par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle de lumière inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière effectué chaque semaine. Dispositions visant à réduire la douleur : Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, nous administrerons immédiatement un antalgique. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris. La souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Les diverses études seront réalisées 5 à 9 semaines après les injections intracérébrales. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 12 à 20 semaines.

3 075 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois injections dans l'œil et une lésion du nerf optique, au cours de chirurgies de cinq minutes. Toutes sont tuées pour que leurs tissus soient analysés, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît que ces gestes peuvent enflammer l'œil ou l'endommager, et décrit en deux phrases l'ensemble des atteintes attendues. L'effectif de 3 075 animaux n'est rattaché à aucun calcul dans le RNT, qui mentionne seulement "l'utilisation de tests statistiques optimaux".

Objectifs

Les maladies du système nerveux représentent un défi sociétal majeur. En effet, le glaucome par exemple concerne plus de 10 millions de patients dans le monde. Cette maladie entraine la dégénération du nerf optique, le seul lien entre l’œil et le cerveau ce qui induit une perte définitive de la vue. Une voie de guérison consiste à protéger les neurones de la mort et à faire repousser le nerf optique pour reformer le circuit qui traite l’information visuelle. Ce projet a pour but de comprendre l’impact de l’expression génique dans les cellules sur la neuroprotection et la régénération. Nous allons manipuler chez l’adulte l’expression de ces protéines pour induire la régénération et permettre le retour visuel.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques permettant la neuroprotection et/ou la régénération du système visuel pour combattre des maladies comme le glaucome où il faut de nouveau connecter l’œil au cerveau.

Procédures

Les souris peuvent subir jusqu'a 3 injections dans l’œil et une lésion du nerf optique. Les chirurgies durent 5 min.

Impact sur les animaux

- L’injection intraoculaire peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil -La lésion du nerf optique chez les souris adultes peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil

Devenir

les souris sont mises à mort car notre projet nécessite de récupérer les tissus pour des analyses histologiques.

Remplacement

Pour atteindre nos objectifs, les expériences sur les souris sont essentielles et non remplaçables car i) les conséquences d’une lésion du système nerveux chez la souris sont les mêmes que chez l’humain, et ii) les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents types de cellules qui ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Le modèle souris est reconnu pour la recherche sur la régénération du système nerveux central. Il est à noter que tous les candidats d'intérèts seront seront étudiés d’abord sur des cultures cellulaires.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - tester les candidats identifiés in vitro sur des cultures cellulaires. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Seuls les candidats les plus pertinents in vitro seront utilisées chez la souris.

Raffinement

Les interventions sur l’œil sont des chirurgies et seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris recevront une injection d’un médicament antidouleur et antiinflammatoire adapté avant et apres l’opération . Après chaque anesthésie, les souris seront placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil.

Choix des espèces

La régénération du système nerveux est un phénomènes multifactoriels qui permettent la formation d’un circuit neuronal. La modélisation de ces processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les voies moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in vivo pertinent grâce à une grande similitude anatomique avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles tels que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les questions scientifiques que nous nous posons. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris dont le système nerveux est mature. Nous voulons étudier les mécanismes de régénérescence dans le système nerveux central adulte pour être le plus proche possible des lésions chez l’homme.

Tuées à la fin du protocole pour vérifier au microscope la position des électrodes implantées dans leur cerveau, 455 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies, la seconde durant de deux à quatre heures et demie, puis des séances d'enregistrement en contention pouvant atteindre trois heures par jour pendant une semaine. Une partie d'entre elles reçoit jusqu'à sept administrations de molécules anxiogènes ou panicogènes utilisées en psychiatrie, pendant que leur rythme respiratoire est manipulé, ce que le porteur décrit comme une physiologie inhabituelle source de stress. L'effectif tient en partie à un choix de méthode assumé dans le RNT, où la puissance statistique repose sur le nombre de neurones enregistrés plutôt que sur le nombre d'animaux.

Objectifs

La perception que nous avons de notre rythme respiratoire peut réguler nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant, le rythme respiratoire est lié à d’autres variables, comme l’activité physique, rendant difficile son analyse spécifique et limitant nos connaissances sur les mécanismes neuronaux de la perception respiratoire. Ce projet, réalisé chez la souris, a 4 objectifs (1) Développement d’une méthode de manipulation du rythme respiratoire pour pouvoir étudier spécifiquement la perception de la respiration. (2) Mesurer comment le cerveau représente l’information respiratoire. Pendant les stimulations respiratoires, nous enregistrerons chez la souris de grandes populations de neurones. Ces mesures permettront de relier l’activité neuronale aux stimulations respiratoires. (3) Evaluer le rôle du cortex dans l’utilisation de l’information respiratoire. Nous nous intéressons au cortex car les études chez l’humain ont mis en évidence son implication dans les dérégulations de la percéption du corps liée à l’anxiété. Nous effectuerons 3 tâches permettant de mesurer différents aspects de l’impact de la respiration : la perception respiratoire, l’effet de la respiration sur la prise de risque et sur l’apprentissage respectivement. (4) Evaluer l’impact de molécules utilises en psychiatrie dans l’utilisation de l’information respiratoire. Dans les trois même tâches que (3), nous évaluerons si 4 agents pharmacologiques impliqués dans l’anxiété ou la panique modifient l’impact du rythme respiratoire sur le comportement de l’animal. Ces objectifs contribueront, à plus long terme, à une meilleure compréhension de l’impact de la respiration sur les émotions et certaines maladies psychiatriques.

Bénéfices attendus

La perception que nous avons de l’état de notre corps, et en particulier notre respiration, repose sur un sens, appelé intéroception. Ce sens nous permet de répondre aux besoins de notre corps (repos, alimentation, régulation cardio-vasculaire…) mais participe aussi à nos prises de décision et à nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’intéroception sont mal connues. Le bénéfice principal de ce projet est d’établir un modèle animal de la perception intéroceptive respiratoire ce qui permettra d’adresser trois questions importantes sans réponse à l’heure actuelle : - Quelle est la précision de la perception intéroceptive respiratoire en comparaison avec les autres sens (audition) ? - Comment la respiration influence-t-il le comportement émotionnel et il y a-t-il un lien avec les maladies psychiatriques? - Quelles zones cérébrales sont fonctionnellement impliquées dans la perception respiratoire ? L’impact du contrôle de la respiration est très variables entre individus. Avoir un modèle animal de cette perception permettra donc d’une part d’identifier les bases neuronales pour mieux comprendre et contrôler la variabilité chez l’humain et de tester des hypothèses mécanistiques.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies. La première chirurgie dure 1heure, la deuxième entre 2 et 4h30. Les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement chez l’animal éveillé allant jusqu’à 3h pendant un maximum de 7 jours avec maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux feront également des tâches comportementales d’une à trois heures sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. Il y a au maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant les sessions d’enregistrement, certains animaux reçoivent l’administration d’un agent pharmacologique utilisé en psychiatrie (anxiogène, anxiolytique, panicolytique ou panicogène). Nous effectuons au plus une administration par jour chaque session étant espacée d’au moins 12h. Il y aura au maximum 7 administrations par animal.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques qui pourraient augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Pendant le projet, nous allons modifier le rythme respiratoire ce qui pourrait imposer une physiologie inhabituelle pour l’animal et donc un stress et réaliser des tests comportementaux qui peuvent induire une gêne aux animaux.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour pouvoir effectuer l’analyse histologique sur le cerveau afin de vérifier la position des électrodes implantées.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible d’utiliser des neurones en culture ou tout autre modèle in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’activité respiratoire à l’état émotionnel et la prise de décision, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue des tâches de décision.

Réduction

Utilisation de méthodes à haut rendement : Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement de l’activité éléctrique du cerveau et de leurs variables corporelles qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaires pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Utilisation de statistiques adaptées : Dans cette étude, beaucoup de statistiques sont basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux ce qui permet d’acquérir une grande puissance statistique car les neurones sont enregistrés par centaines. Pour les tests qui nécessitent de comparer des groupes d’animaux, nous calculons la taille des cohortes basé sur ce qui est attendu d’après la littérature pour ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaires. Dès que possible, les expériences sont conçues pour effectuer des tests appariés (chaque animal est son propre contrôle) ce qui diminue la variabilité dans nos groupes et diminue donc le nombre d’animaux. Nous utilisons de méthodes accélérant l’apprentissage des tâches que nous avons montré efficace et qui permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des mesures comportementales.

Raffinement

Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Hébérgement : Les animaux sont hébergés à plusieurs dans des cages enrichis (dôme, coton). Ils sont suivis quotidiennement par le personnel de l'animalerie et après chirurgie par l'expérimentateur grâce à la grille de suivis. Les animaux sont habitués progressivement à la manipulation. Points limites : Pour le suivi postchirurgical, une grille d’évaluation permet de donner un score de l’animal et donc d’implémenter des points limites gradués. Pendant les expériences comportementales l’observation du comportement de la physiologie de l’animal permettent d’implémenter des points limites gradués liés à l’inconfort de l’animal. Nous utilisons également les doses minimales d’agents pharmacologiques pour avoir l’effet escompté afin d’éviter des effets secondaires

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles. La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal. De plus, la stratégie expérimentale nécessite l’utilisation de lignées transgénique (ayant une modification génétique qui nous permet de cibler des sous-types cellulaires) qui n’existent que chez la souris. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

Une injection dans le vitré ou sous la rétine, parfois répétée trente jours plus tard, puis une imagerie de l'œil sous anesthésie et jusqu'à deux électrorétinogrammes de moins d'une heure : 2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une opacification possible de la cornée et des saignements dans l'œil quand un vaisseau est touché. Il s'agit de tester une thérapie génique neuroprotectrice contre les dégénérescences de la rétine, avec un taux de réussite d'injection annoncé entre 50 et 75 %, les souris mal injectées étant tuées sur place encore sous anesthésie. L'effectif de 2 000 souris sur cinq ans est présenté comme "ajustable" sans autre justification, et les tests comportementaux censés mesurer la vision ne sont pas nommés.

Objectifs

Certaines maladies des yeux provoquent la mort progressive des cellules sensibles à la lumière (appelées photorécepteurs) dans la rétine, ce qui entraîne une perte de la vision. Ces maladies, comme les rétinites pigmentaires, le glaucome ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), touchent des millions de personnes dans le monde. Leur fréquence augmente avec l’âge, et il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour la plupart d’entre elles. Notre projet vise à développer une nouvelle approche pour protéger les cellules de la rétine avant qu’elles ne meurent. Cette stratégie est dite "neuroprotectrice" : elle ne vise pas à remplacer les cellules perdues, mais à préserver celles qui sont encore vivantes. L’avantage est qu’elle pourrait s’appliquer à un grand nombre de patients, quel que soit le type exact de mutation génétique ou la cause précise de la maladie. Pour cela, nous utilisons une technique appelée thérapie génique. Elle consiste à introduire dans l’œil, grâce à un virus inoffensif (appelé AAV, pour adeno-associated virus), un gène protecteur qui aide les cellules à survivre. Ce gène a été identifié comme capable d’activer des mécanismes naturels de survie dans les cellules de la rétine. Le but de ce projet est de tester cette thérapie dans plusieurs modèles expérimentaux de maladies de la rétine, et de comprendre comment elle agit au niveau cellulaire.

Bénéfices attendus

Il existe peu de traitements pour les maladies de la rétine, et la plupart ne sont efficaces que pour certains patients selon leur mutation génétique. Notre projet vise à développer une thérapie génique applicable à un large nombre de cas, quel que soit le type de mutation. En testant cette approche dans plusieurs modèles, nous espérons poser les bases d’un futur traitement plus universel, avec à terme un développement clinique possible pour les patients.

Procédures

Une partie des animaux du projet recevrons une injection intravitréenne durant max 5 minutes et un certain nombre de ces animaux recevront une deuxième injection intravitréenne 30 jours plus tard. Une autre partie des animaux du projet recevrons une injection sous rétinienne durant 5 minutes max et un certain nombre de ces animaux recevront une injection intrapéritonéale 1 mois plus tard. Tous les animaux injectés subissent une imagerie de leurs yeux tant qu’ils sont toujours sous anesthésie pour vérifier la qualité des injections (10 minutes). Certains animaux subiront un Electroretinogramme (ERG) 2 fois à des âges différents sous anesthésie générale et locale pour une durée inférieure à 1h. Des tests comportementaux pour tester la vision seront également réalisé sur une partie des animaux vigiles. Ces tests durent entre 10 et 30 minutes et seront réalisés deux fois à quelques mois d’intervalle.

Impact sur les animaux

Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Les animaux peuvent présenter des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection si un vaisseau est accidentellement touché ce qui est rare.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront euthanasiés à la fin des procédures auxquelles ils sont associés ; leurs rétines permettront des analyses aux échelles tissulaires, cellulaires et moléculaires. Grâce à cette méthode, nous pourrons caractériser l’ensemble des effets du traitement sans augmenter le nombre d’animaux utilisés

Remplacement

Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Enfin, les modèles animaux permettent d’étudier les réactions comportementales et électrophysiologiques au traitement, qui seront des informations cruciales pour poursuivre ultérieurement vers un essai clinique. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter un niveau d’information suffisant. L’existence de lignées de souris atteintes de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. De nombreux mutants comme la souris rd10 présentent des mécanismes moléculaires de dégénérescence similaires à ceux observés chez les patients humains. Travailler in vivo permettra de valider nos vecteurs, les modèles in vitro ne permettant pas d’observer la réponse des cellules dans leur environnement réel. Les techniques qui seront effectuées sont peu invasives et couramment utilisées en recherche ophtalmologique.

Réduction

Notre étude se déroule sur 5 ans, et comprend l’analyse de plusieurs modèles et vecteurs thérapeutiques. Ceci est important pour vérifier que notre stratégie thérapeutique va cibler le plus grand nombre de patients ainsi que pour comprendre le mécanisme d’action. Nous indiquons ici environ 2000 souris sur 5 ans pour réaliser toutes les expérimentations que nous pensons nécessaire, mais cela sera ajustable. Si un nombre d’individus correctement injectés pour obtenir les résultats statistiques souhaités est atteint nous arrêterons les injections. Le criblage in vitro des différentes isoformes ex vivo par milieu conditionné devrait permettre d’identifier rapidement au moins une isoforme d’intérêt. Le but est d’obtenir 15 à 20 yeux traités, en fonction des expérimentations. et pour chaque vecteur. Le taux de réussite d’injection (large détachement rétinien sans fuite de liquide dans le vitrée) pouvant varier entre 50% et 75%, nous prévoyons donc plus d’animaux que nécessaire. Nous ne garderons que les animaux correctement injectés dans au moins un œil. Les autres seront sacrifiés à la fin de l’injection, encore sous anesthésie. Chaque œil pouvant être analysé séparément, le nombre d’animaux est réduit. Nous commencerons par établir la dose de vecteurs à injecter sur les temps courts. Nous comparerons ensuite l’efficacité de nos différents produits de thérapie génique, pour ne réaliser les procédures chez ce modèle qu’avec celui sélectionné à la dose efficace. Les animaux subiront divers tests détaillés dans les procédures ci-après, très peu invasifs et quasiment indolores. Grâce à nos équipements, nous pourrons réaliser nos expériences à différents temps sur les mêmes animaux. Des tests statistiques seront réalisés. Finalement, si nous nous apercevons que le traitement n’est plus efficace à partir d’un certain temps, les temps restants supérieurs ne seront pas réalisés.

Raffinement

Durant l’injection dans l’oeil, une anesthésie locale sera effectuée. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur due à l’injection dans l’oeil, les animaux recevront de manière préventive un analgésique, par injection sous-cutanée à la suite de l’opération. Que ce soit durant l’élevage ou pendant les procédures, les animaux seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire.

Choix des espèces

L’existence de lignées de souris atteintes de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. De nombreux modeles murins de dégénérescence rétinienne sont des mutants spontanés apparus dans les colonies d’élevage au cours du temps. Le modèle murin de retinite pigmentaire utilisé correspond aux pathologies humaines d’intérêts pour notre étude, avec une mutation sur un gène conduisant à une dégénérescence des photorécepteurs. Travailler in vivo permettra de valider l’efficacité de nos vecteurs. Les modèles in vitro comme les organoïdes rétiniens ne permettent pas d’observer la réponse des cellules dans leur environnement réel (interaction avec l’épithélium pigmentaire rétinien, absence de vascularisation et de cellules immunitaires). De plus, les modèles murins sont nécessaires afin de tester l’efficacité du traitement en mesurant des réponses comportementales et électrophysiologiques. Les résultats précliniques in vivo sont également nécessaire d’un point de vue règlementaire si nous voulons conduire ce produit jusqu’à un essai clinique. Les techniques qui seront effectuées sont peu invasives et couramment utilisées en ophtalmologie chez l’homme. En ce qui concerne l’âge des animaux utilisés il est déterminé par l’âge d’apparition de la maladie et sur le fait que chez la souris les paupières s’ouvrent 14 jours après la naissance quand la rétine a fini de se développer. A ce stade l’œil a une taille correcte permettant l’injection des doses nécessaires.