Système nerveux

Deux chirurgies, l'une d'une heure, l'autre d'une heure quarante-cinq, séparées d'au moins cinq jours, implantent des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au thorax et une canule nasale. Viennent ensuite des sessions d'enregistrement en contention allant jusqu'à trois heures par jour pendant sept jours, et pour une partie des 128 souris un entraînement quotidien à une tâche auditive qui peut se prolonger plusieurs mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent des substances qui augmentent l'anxiété ou la sensation de panique, et subissent de brefs stimuli aversifs, goût amer ou jet d'air. À la fin, chaque souris est opérée sans réveil pour le prélèvement de son cerveau, destiné à l'analyse histologique.

Objectifs

La perception, implicite ou explicite, que nous avons de l’état de notre corps repose sur un sens, appelé interoception. Ce sens participe à réguler nos états affectifs (émotionnels ou motivationnels) et donc affecte les décisions que nous prenons. En conséquence, une dérégulation de cette perception peut être liée à des maladies psychiatriques. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’interoception sont mal connues. Nous ne savons pas par exemple quelle région de notre cerveau représente notre fréquence cardiaque ou respiratoire et avec quelle précision. L’objectif de ce projet est d’une part d’étudier comment le cerveau représente ces informations. D’autre part, nous testerons si cette représentation est modifiée dans des conditions liées à l’anxiété ou les crises de panique. Pour ce faire nous administrerons des agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie qui augmentent ou diminuent respectivement le niveau d’anxiété ou de panique de l’animal. Finalement, nous évaluerons ci cette représentation est modifiée pendant la prise de décision. Pendant ces expériences, le nombre d’animaux nécessaire et le nombre de sessions d’enregistrement seront réduits grâce à l’utilisation de systèmes d’enregistrement de point permettant d’acquérir une grande quantité de données en peu de sessions. De plus, nous raffinerons le protocole en utilisant des traitement anesthésiques et analgésiques adaptés, administrés selon des points limites clairement établis à l’avance et évalués à l’aide de grilles d’évaluation. Nous développerons et calibrerons des méthodes d’enregistrement non-invasifs pour la respiration qui pourront aussi être utile pour la communauté plus largement. A chaque étape, puisque nous enregistrons non seulement le comportement de l’animal mais aussi son état corporel, nous disposerons d’un suivi fin et en temps réel de son état. Ce projet permettra de mieux comprendre notre capacité à percevoir notre corps et contribueront, à plus long terme, à la meilleure compréhension de la participation de notre corps aux états affectifs et à établir comment cette perception intéroceptive peut être dérégulée.

Bénéfices attendus

Il existe de nombreuses hypothèses suggérant que notre corps influence notre état émotionnel et donc les décisions que nous prenons. Ceci découle en partie de l’expérience subjective du lien très fort entre notre état émotionnel et notre corps mais également de mesures en laboratoire qui ont montré que l’état de notre corps et comment nous le percevons varie avec nos émotions. De plus lorsque cette perception du corps dérégulée, des troubles psychiatriques peuvent résulter. Celles-ci peuvent être liées à une intéroception de précision réduite (autisme, trouble du déficit de l’attention) ou hypersensible (anxiété, syndrome de l’intestin irritable). Cependant les zones cérébrales qui sous-tendent cette perception et comment elle est modifiée dans des états émotionnels normaux et pathologiques reste mal connu. Ce projet permettra d’identifier des mécanismes par lesquels le cerveau représente ce que nous percevons de notre corps (par exemple : quelle est notre fréquence cardiaque ? quelle est notre fréquence respiratoire ?). En particulier nous pourrons identifier où dans le cerveau ces informations sont représentées et avec quelles précision. De plus nous testerons si la façon dont notre cerveau représente notre corps est modifié dans deux conditions : d’une part dans des états liés aux crises de panique ou l’anxiété (grâce à l’utilisation d’agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie) et d’autre part lors de la prise de décisions difficiles suscitant des émotions. Une retombée concrète du projet sera de mieux connaître quelles régions corticales encodent l’état de notre corps. Ceci peut permettre de cibler plus efficacement les études de neuro-imagerie chez l’humain qui étudient ces déficits intéroceptifs. De plus, ces mesurer l’impact d’agents pharmacologiques utilisés dans le cas de maladies psychiatriques sur la représentation neuronale de l’état corporel. Ceci permettra d’évaluer si ces agents agissent directement sur la perception du corps, permettant de préciser leurs mécanismes d’action.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies pendant lesquelles nous implantons des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au niveau du thorax et une canule nasale. Les chirurgies durent respectivement 1h et 1h45 maximum et sont séparées d’au moins 5 jours ou plus pour que l’animal récupère un état ‘normal’ d’après notre grille d’évaluation. Tous les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement allant jusqu’à 3h par jour pendant un maximum de 7 jours. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux sont également entraînés dans une tâche auditive pendant une à deux heures par jour sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. A la fin des procédures, les animaux subissent une chirurgie sans réveil pour prélévement du cerveau.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal, surtout lors des premières sessions d’habituation. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques liés à l’anxiété ou les crises de panique. Parmi ces agents, 2 ont tendance à diminuer soit l’anxieté soit la sensation de panique . Les 2 autres ont tendence à augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Dans ce cas, nous utilisons des doses calibrées pour que l’augmentation du stress dure au maximum quelques heures. Pendant le protocole, l’animal sera soumis à de brefs stimuli légèrement aversifs (goût amer ou jet d’air) qui pourront engendrer une gêne.MODIFICATION: [Les animaux sont hébérgés à plusieurs mais en cas de dégradation des implants par les congéneres les animaux peuvent être co-hébérgés dans une cage commune avec séparateur, ce qui peut engendrer un stress dû au changement de conditions.]

Devenir

A la fin de chaque procédure, l’animal est mis à mort afin de réaliser l'analyse histologique du cerveau.

Remplacement

Le projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’interoception à l’état affectif, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue une tâche sensorielle. Finalement, chez l’animal anesthésié, l’encodage neuronal est profondément modifié et le système cardio-respiratoire dans un état très ralenti, totalement différent de l’éveil. D’éventuels résultats obtenus sous anesthésie seraient donc très difficiles à généraliser.

Réduction

Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement électrophysiologies et somatique qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaire pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Nous avons un protocole adapté à cette diminution : - L’utilisation d’électrodes implantées « en aigu » permet d’enregistrer à un endroit différent chaque jour et donc de couvrir efficacement une grande zone anatomique - Nous utiliserons des électrodes qui contiennent un grand nombres de sites d’enregistrement. Ceci augmente l’efficacité de la récolte de données.

Raffinement

MODIFICATION [Hébérgement : Les animaux sont hébergés dans des cages enrichis (dôme, coton) et si possible (pas de conflit ou dégradation de l'implant) à plusieurs.] Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Pendant la chirurgie, l’état de l’animal est suivi à intervalles réguliers pour adapter le niveau d’isoflurane. De plus un analgésique systémique et une analgésique locale sont administrées avant et après l’intervention. En post-opératoire, les animaux reçoivent une analgésie supplémentaire ajouté dans l’eau de boisson ou Dietgel pendant 5 jours) et les animaux sont suivis quotidiennement. Manipulations : Les animaux seront d’abord habitués à la manipulation manuelle nécessaire pour les transporter jusqu’à l’environnement de l’expérience. Toute manipulation par la queue sera évitée. Contention en tête fixée : L’animal est habitué en augmentant progressivement les durées. De plus, il est placé sur une roue où nous avons observé des comportements divers (sommeil, course, toilettage) dans des proportions similaires à un animal libre de ces. A chaque session la respiration, l’activité cardiaque et la température sont enregistrés et le comportement de l’animal suivi par vidéo. La mesure de toutes ces variables permettra, en temps réel, de surveiller très finement l’état de l’animal. Développement de procédures raffinées : Pendant ce projet nous enregistrons la respiration avec une canule intranasale, ce qui nécessite une chirurgie invasive. Nous essayerons de raffiner ce protocole en mettant en œuvre des mesures non-invasives de la respiration : soit avec un capteur externe de pression soit par suivi vidéo en caméra thermique des narines de l’animal. La canule intranasale étant la méthode de référence donnant les informations les plus précises, nous devons d’abord calibrer les autres méthodes contre celles-ci avant d’éventuellement utiliser ces nouvelles approches moins invasives. Utilisation de statistiques adaptées : Les analyses statistiques utilisées dans cette étude seront basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux. Puisque nos méthodes permettent d’enregistrer un grand nombre de neurones par session et par animal, ceci permet d’acquérir une grande puissance statistique avec peu d’individus. Nous utiliserons des statistiques paramétriques et appariées.

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles (pas de poumons, pas de flux d’air nasal ou buccal pour les premiers, non-homéothermes pour les seconds). La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement (donc avec peu d’animaux et dans un temps d’expérience réduit) de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal (implantation aigue d’électrodes multi-sites). De plus, des développements ultérieurs de cet axe de recherche nécessiteront l’utilisation d’outils de manipulation qui reposent sur notre excellente connaissance génétique de la souris. Finalement, l’équipe possède une grande expertise dans la chirurgie et le comportement chez la souris, ce savoir-faire assure une application de qualité des procédures. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

La souris sylvestre est un rongeur nocturne dont la reproduction varie avec la durée du jour, ce qui vaut à cette espèce d'être retenue pour un projet sur la pollution lumineuse. 312 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux groupes sont exposés sept semaines durant à des LED allumées la nuit, avec une prise de sang par semaine sur souris consciente, soit sept prélèvements par individu. Une partie des cerveaux sera prélevée pour des études ultérieures, et le porteur annonce que les corps des souris surnuméraires et de celles n'ayant subi que des prises de sang seront congelés puis mis à disposition des enseignants et des responsables d'animalerie de l'université pour des travaux pratiques d'anatomie comparée.

Objectifs

Chez tous les organismes, dont les mammifères, c’est l’horloge biologique interne qui contrôle les rythmes de nombreuses fonctions (sommeil, reproduction, etc.) selon un cycle d’environ 24 heures. Cette horloge est principalement synchronisée par l’alternance naturelle du jour et de la nuit grâce à la lumière, qui influence notamment la production de mélatonine, une hormone impliquée dans le rythme veille-sommeil. Lorsque l’environnement nocturne est éclairé artificiellement, comme avec l’éclairage public, ce signal naturel peut être perturbé. Cette pollution lumineuse risque alors de dérégler l’horloge biologique et d’avoir des conséquences sur la santé et le fonctionnement de l’organisme. Dans ce contexte, le projet a pour objectif de reproduire une exposition à la pollution lumineuse pendant la nuit (LAN) chez un mammifère nocturne particulièrement sensible à la durée du jour et de la nuit, la souris Sylvestre, en s’appuyant sur des protocoles expérimentaux réalisés en conditions contrôlées. Plus précisément, il vise à explorer les conséquences d’une exposition nocturne à deux types de lumières LED, l’une majoritairement utilisée dans l'éclairage public nocturne, qui stimule fortement les mécanismes contrôlant l’horloge biologique, et l’autre émettant dans une gamme de longueur d’onde plus élevée, qui pourrait être moins perturbatrice. Le projet a pour objectifs d’évaluer l’impact de la LAN sur : 1) les régions du cerveau qui contrôlent la reproduction ; 2) la production d’hormones liées à la reproduction. Les analyses seront réalisées sur des individus mâles et femelles de la génération F0 exposés ou non, ainsi que chez des individus mâles et femelles de la génération F1 afin de voir si les effets peuvent se transmettre à la génération suivante. Les résultats obtenus contribueront à une meilleure compréhension des effets de la pollution lumineuse et permettront d'élaborer des stratégies d’éclairage respectueuses de la biodiversité pour une meilleure gestion environnementale de la pollution lumineuse.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de 4 ordres principaux. 1/ Les résultats obtenus contribueront à mieux informer les décideurs sur les conséquences écologiques de la pollution lumineuse. En effet, les pouvoirs publics pourront s’appuyer sur les données scientifiques précises obtenues à l’issue de ce projet pour établir des recommandations visant à limiter l’exposition aux LED. Ces recommandations pourraient inclure une meilleure régulation de l’usage des LED en fonction de leur spectre lumineux, en privilégiant des spectres moins perturbateurs pour la biodiversité. 2/ Les mécanismes moléculaires et les systèmes neuroendocriniens sous-jacents au fonctionnement de l’horloge circadienne sont communs à une vaste majorité de vertébrés. Les résultats obtenus à l’issue de ce projet seront donc susceptibles de concerner d'autres taxons et participeront à la compréhension du rôle de la lumière artificielle la nuit dans la contribution au déclin ou à l'extinction des populations d'espèces. 3/ Au-delà des aspects applicatifs et réglementaires, ce projet aura également un impact sociétal en sensibilisant le grand public aux effets des LED sur la biodiversité. 4/ Ce projet contribuera également à élargir nos connaissances sur les effets de la LAN sur la santé humaine, en particulier sur les rythmes circadiens et les régulations neuroendocriniennes. Les données scientifiques issues de ce projet pourront fournir des éléments contribuant au reclassement de la pollution lumineuse nocturne comme un agent physique à effet perturbateur endocrinien.

Procédures

Deux groupes de souris seront exposées à un traitement luminaux nocturne chacun durant 7 semaines. Les souris auront 1 prise de sang par semaine pendant 7 semaines, soit 7 prélèvements/souris (vigile) au total. Chaque prélèvement dure entre 30 secondes et 1 minute.

Impact sur les animaux

Les potentiels effets indésirables attendus sont les suivants : - Une exposition à des traitements lumineux nocturnes peut entrainer des perturbations comportementales et physiologiques, ce qui constitue l’objet de notre étude ; - Une douleur transitoire hebdomadaire suite à l’introduction de l’aiguille lors des prélèvements de sang ; - Un stress aigu de quelques dizaines de secondes n’induisant pas d’effet à long terme peut être généré dû à la manipulation des animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort et pour une partie d’entre eux les cerveaux seront prélevés pour des études ultérieures. Nous congelerons des animaux surnuméraires ainsi que ceux n’ayant subit que des prises de sang et les mettrons à disposition des enseignants chercheurs ainsi des responsables d'animalerie de l’Université pour des TP d'anatomie comparée sur cadavres.

Remplacement

A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou in silico) ne peut être utilisée pour ce projet qui étudie l’effet d’une exposition à la LAN sur les systèmes neuroendocriniens. Il est donc impératif d’utiliser l’animal entier pour en comprendre les effets et étudier les mécanismes altérés.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé de façon à obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Afin de limiter le nombre de naissances et d'éviter la production d'animaux surnuméraires, une gestion rigoureuse des accouplements sera mise en place en adoptant une stratégie d'accouplements discontinus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe sociaux (3 à 5 souris par cage) en présence de plusieurs enrichissements (abris cartonnés avec matériel de nidification et jouets en bois) avec un accès à la nourriture et boisson ad libitum. La surveillance des souris sera accrue lors de leur première semaine d'exposition à la lumière artificielle nocturne. Suite à la prise de sang hebdomadaire, l’animal sera placé dans une cage sans congénère pour récupération et jusqu’à l’arrêt complet du saignement (1-2 min). Un petit morceau de cookie lui sera donné en récompense. Il sera ensuite replacé avec ses congénères. Une grille de score d'évaluation du comportement des souris sera mise en place afin d'identifier précocement d'éventuels points limites adaptés. Un arbre décisionnel guidera la décision de retrait des animaux du protocole lorsque les critères prédéfinis seront atteints afin d'interrompre toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nos recherches portent sur les effets d’une exposition à la lumière artificielle nocturne sur les systèmes neuroendocriniens contrôlant la fonction de reproduction chez les mammifères nocturnes. La souris Sylvestre est un excellent modèle animal de référence puisqu’elle est photosensible et présente des variations saisonnières de ses fonctions de reproduction, physiologiques et comportementales. Ces caractéristiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Nous utiliserons des animaux mâles et des femelles adultes qui seront âgés de 6 à 16 semaines au début des expériences.

Une puce implantée sous la peau après incision, une pompe posée sous la peau ou dans la cavité abdominale pour cinq semaines de traitement continu, puis jusqu'à seize heures de tests par souris réparties sur quatre semaines : 2 784 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des crises d'épilepsie leur sont provoquées et leur sensibilité à la douleur est mesurée, deux points dont le porteur indique qu'ils entraînent un inconfort supérieur à celui des autres tests. L'objet déclaré est d'évaluer cinq médicaments déjà autorisés pour d'autres maladies neurologiques et de chercher des mécanismes communs à deux troubles du neurodéveloppement. Les tests restent désignés par leurs catégories, sociaux, moteurs, de mémoire et stéréotypés, sans qu'aucun dispositif soit nommé, et l'effectif tomberait à 864 souris si deux mesures de réduction s'appliquaient, écart que le résumé laisse sans commentaire.

Objectifs

Les troubles du neurodéveloppement liés à des anomalies de la communication entre les neurones du cerveau touchent environ 1% de la population mondiale. Ils sont fréquemment associés à des formes d’autisme, des déficits intellectuels et moteurs, ainsi qu’à de l’anxiété, de l’épilepsie et à des altérations des sensations, notamment de la perception de la douleur. À ce jour, ces troubles ne disposent encore que de peu ou pas de médicaments efficaces. Dans le cadre d’un projet financé par le programme Européen sur les maladies rares (ERDERA) réunissant quatre associations de patients et cinq équipes de recherche, ces travaux, dans leur ensemble, visent à mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces troubles, à identifier des marqueurs biologiques et à évaluer le potentiel de repositionnement de candidats médicaments dans des modèles murins. Comme ces troubles pourraient partager certains mécanismes communs, le premier objectif de cette étude est de les identifier en étudiant le comportement et le fonctionnement de ces neurones dans deux modèles murins de ces troubles. Le second objectif du projet consiste à évaluer cinq médicaments déjà approuvés pour d’autres maladies neurologiques (repositionnement) afin de déterminer s’ils pourraient également être bénéfiques pour ces deux troubles. Leur efficacité sera étudiée dans ces deux modèles murins en analysant leurs effets sur les anomalies comportementales et sur le fonctionnement neuronal. Les résultats de cette étude, intégrés au projet européen dans son ensemble, permettraient d’envisager un transfert vers la clinique et les patients à court terme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer les connaissances sur les troubles du neurodéveloppement liés à des anomalies de la communication entre les neurones du cerveau. Cette étude contribuera à mieux comprendre les mécanismes communs à l’origine de ces maladies et évaluera le potentiel de médicaments déjà utilisés pour d’autres maladies. Dans leur ensemble, ces travaux permettront d’accélérer le développement de médicaments pour les patients concernés par ces troubles.

Procédures

Les souris anesthésiées seront implantées avec une puce d’identification par radiofréquence à l’aide d’une petite incision (une seule fois, 5 minutes par animal). Cette puce permettra d’identifier chaque animal et de suivre ses interactions avec les autres souris lors des tests de comportement. Si un des médicaments ne peut pas être donné oralement dans l’eau de boisson ou la nourriture, une pompe placée sous la peau pourra également être utilisée pour administrer certains traitements de façon continue pendant cinq semaines (en même temps que les puces). Si aucune de ces voies n’est possible, une intervention chirurgicale sera réalisée pour placer la pompe dans la cavité abdominale. Les souris seront évaluées sur leurs comportementaux sociaux, moteurs, de mémoire et stéréotypés et leur sensibilité à la douleur et leur prédisposition aux crises d’épilepsie (maximum 60 minutes par jour sur 4 semaines, soit un total de 16 heures par animal).

Impact sur les animaux

La manipulation des souris, et les tests comportementaux peuvent entraîner un léger stress temporaire chez l’animal. Leur sensibilité à la douleur et leur prédisposition à l’épilepsie peuvent entraîner un inconfort modéré, supérieur à celui associé aux autres tests comportementaux. L'implantation des puces et des pompes peut provoquer une légère douleur minorée par l'administration d'antalgiques. Des crises d’épilepsie seront induites, ce qui pourrait entraîner une diminution de leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour réaliser des prélèvements de différents tissus (sang et cerveau) et faire des analyses moléculaires.

Remplacement

Les médicaments seront d’abord testés sur des cellules en laboratoire. Seuls les 5 plus prometteurs seront évalués dans cette étude chez la souris. Il n’existe pas de méthode alternative pour les expériences de comportement et tester des médicaments, car elle nécessite un organisme vivant entier, depuis l’injection, leur passage dans le cerveau jusqu’à l’observation de leurs effets in vivo.

Réduction

Le nombre de 2784 animaux a été optimisé pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Si aucun effet sexe n’est observé lors de la caractérisation des modèles, le nombre de souris sera réduit de moitié pour l’évaluation des effets des médicaments. De plus, si la dose la plus faible d’un médicament permet d’obtenir des résultats satisfaisants, la dose plus élevée ne sera pas testée. Si ces deux mesures de réduction peuvent être appliquées, le nombre total d’animaux nécessaires sera limité à 864.

Raffinement

L’environnement des souris est enrichi et renouvelé régulièrement pour optimiser le maintien de leur chaleur corporelle et de leur bien-être. Les tests de comportement seront réalisés dans une pièce calme et faiblement éclairée, et seront les plus brefs possibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, les animaux seront habitués à cette pièce et au contact des expérimentateurs, mais également pour vérifier leur état de santé. Les caractéristiques génétiques des souris et les croisements utilisés ont été adaptés afin de limiter l’apparition de signes indésirables pouvant affecter leur bien-être. Les souris soumises à une incision pour injecter des puces d’identification ou les pompes libérant le médicament seront traitées avec des antidouleurs jusqu’à leur rétablissement pour limiter leur douleur et, comme pour tout changement chez un animal, feront l’objet d’une surveillance renforcée. Des points limites adaptés à chaque procédure ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont de petits animaux sociaux, et dont les comportements sont proches de ceux de l’homme. Elles constituent ainsi un modèle pertinent pour étudier les troubles du neurodéveloppement qui ont un impact important sur la qualité de vie des personnes atteintes. Les études seront réalisées chez des souris adultes âgées de deux mois, ayant un cerveau mature, qui recevront les traitements avec ces médicaments un mois ou une semaine avant l’évaluation de leurs comportements.

2 464 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de 15 à 20 minutes applique du chlorure de fer ou d'aluminium sur l'artère cérébrale moyenne pour provoquer un accident vasculaire cérébral, suivie de la pose d'un cathéter dans la veine caudale et de cinq passages en IRM 7T sous anesthésie jusqu'à J14, avant une laparo-thoracotomie donnant accès au cœur pour une ponction cardiaque. Le porteur annonce une "batterie de test comportementaux indolores" répétée à huit reprises, trois tests par animal, sans préciser lesquels. Les molécules viennent de partenaires industriels et passeront en essais cliniques en cas de résultats encourageants, "avec pour objectif la mise sur le marché dans les années à venir", quand l'occlusion artérielle et la ponction cardiaque terminale sont programmées pour l'ensemble des souris.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi riches en fibrine, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les 2464 animaux de cette demande d’autorisation de projet seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête pour appliquer une solution de chlorure de fer ou de chlorure d'aluminium au niveau de l’artère cérébrale moyenne (ACM) pour aboutir à l’occlusion de l’ACM. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux indolores visant à tester les déficits et la récupération sensorimotrice au cours du temps, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme, les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Aucun test comportemental n’est voué à induire volontairement un stress ou une angoisse chez les souris. Les expérimentateurs sont formés et habitués à ce genre d’évaluations fonctionnelles, et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celles-ci (limitation du bruit et des vibrations, manipulation des animaux avec soin, vérification des points limites, etc..). Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux expérimentations et validations réalisées in vitro par les partenaires industriels. Actuellement, il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Au sein de chaque cage, les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : kraft, dôme en carton + brique aspen ainsi qu’accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront également régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Ils seront systématiquement pesés le jour de la chirurgie et le lendemain.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs comme les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable car elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats avec ceux obtenus dans notre laboratoire et ailleurs, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 45g. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponibles dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

Jusqu'à dix séances de tests comportementaux, que le porteur qualifie de non invasifs, évaluent la sociabilité, l'anxiété et la mémoire de souris vigiles. 4 080 souris sont utilisées sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à 18 administrations de composés, une chirurgie intracérébrale de 45 minutes au plus pour certaines, et des prises de sang. Ces mêmes tests sont ensuite décrits comme une source de stress modéré, liée à "la douleur ressentie au niveau des pattes lors des stimulations nociceptives désagréables". Toutes sont mises à mort pour prélever le cerveau, y compris celles retirées de l'étude après trois jours de douleur manifeste, qui pourront servir à des mises au point de protocoles d'analyse.

Objectifs

Notre cerveau contient des cellules appelées microglies. On peut les comparer à des « gardiennes » du cerveau : elles aident les neurones (les cellules qui transmettent les informations dans le cerveau) à bien se connecter entre eux pendant la croissance, et elles interviennent aussi quand le cerveau doit se défendre, par exemple en cas d'inflammation. Ce projet a pour but de mieux comprendre comment ces cellules fonctionnent, et quel rôle elles jouent dans le comportement. Des recherches, chez l'animal et chez l'humain, montrent que lorsque les microglies fonctionnent mal, cela pourrait favoriser l'apparition de certains troubles, comme la dépression, l'anxiété, ou l'autisme. Ces cellules semblent aussi jouer un rôle dans la mémoire et dans des maladies comme Alzheimer, ainsi que dans d'autres maladies du cerveau comme la sclérose en plaques. Il est donc important de comprendre comment ces cellules sont contrôlées, et quels sont les éléments, dans leur fonctionnement interne, qui influencent la façon dont le cerveau se construit et s'adapte. Ce projet comporte deux parties. La première partie cherche à comprendre comment la sérotonine, une substance produite par le cerveau qui sert à transmettre des messages entre les cellules, agit sur les microglies pendant les premières semaines de vie, et quelles conséquences cela peut avoir plus tard, à l'âge adulte. Nous regarderons l'effet sur le comportement habituel (par exemple la sociabilité, l'anxiété, la mémoire) et sur la réponse du cerveau face à une inflammation. Pour cela, nous utiliserons des médicaments qui agissent sur la sérotonine, comme certains antidépresseurs bien connus. La seconde partie cherche à comprendre le rôle de certains éléments internes aux microglies, déjà repérés lors d'études précédentes. Pour cela, nous modifierons leur fonctionnement uniquement dans ces cellules, chez des souris, puis nous observerons les conséquences, à la fois sur les microglies elles-mêmes et sur le comportement, en conditions normales et lors d'une inflammation. Ces expériences seront réalisées chez des animaux jeunes et chez des animaux adultes, afin de voir si les effets sont différents selon l'âge. Ce projet vise donc à mieux comprendre comment les microglies et la sérotonine agissent ensemble pour le bon fonctionnement du cerveau, afin, à terme, de mieux comprendre l'origine de certaines maladies psychiatriques humaines.

Bénéfices attendus

La microglie est un acteur essentiel du développement et du fonctionnement du système nerveux central, notamment par son implication dans la mise en place, la maturation et la plasticité des circuits neuronaux. Des altérations précoces de ses fonctions peuvent entraîner des perturbations durables de l’organisation de ces circuits, susceptibles de contribuer à l’apparition de troubles du neurodéveloppement. Par ailleurs, plusieurs gènes associés à des pathologies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer, sont majoritairement exprimés dans la microglie et interviennent également au cours du développement cérébral, suggérant l’existence de liens entre altérations précoces et vulnérabilité ultérieure. Le présent projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation de la microglie, en particulier en lien avec la signalisation sérotoninergique. Les données obtenues permettront de préciser le rôle de cette interaction dans la formation et le fonctionnement des circuits neuronaux, ainsi que dans la réponse à des stimuli inflammatoires. À court terme, ce projet contribuera à l’acquisition de connaissances fondamentales sur les déterminants moléculaires et fonctionnels de l’activité microgliale au cours du développement et à l’âge adulte. À plus long terme, ces résultats pourraient favoriser l’identification de nouvelles cibles d’intérêt pour la compréhension, la prévention et la prise en charge de pathologies neurodéveloppementales, psychiatriques et neurodégénératives. Enfin, le développement et l’utilisation d’approches innovantes, telles que les nanoparticules lipidiques pour la modulation ciblée de l’expression génique dans la microglie, pourraient à terme permettre de limiter le recours à des modèles génétiques complexes, contribuant ainsi à une réduction du nombre d’animaux utilisés en expérimentation.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des administrations de composés pharmaceutiques par différentes voies (injection ou administration orale), de manière ponctuelle ou répétée selon les groupes expérimentaux. Une injection par jour est réalisée sur des animaux vigiles. Le protocole peut comporter jusqu’à 18 administrations successives réparties sur plusieurs semaines. Chaque injection ne dure que quelques secondes. Certains animaux participeront à des tests comportementaux non invasifs (10 au maximum) permettant d’évaluer leur sociabilité, leur anxiété, leur mémoire. Ces évaluations sont réalisées sur des animaux vigiles et chaque séance dure environ 15 minutes. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale afin d’administrer un composé dans une région précise du cerveau. Cette intervention, réalisée sous anesthésie générale et analgésie-anesthésie locale de la zone concernée par la chirurgie, dure au maximum 45 minutes. Une prise de sang pourra également être réalisée chez certains animaux, soit vigiles lorsqu’il s’agit d’étudier la réaction à un stimulus inflammatoire, soit anesthésiés profondément quand le prélèvement est réalisé en fin d’étude. Les prélèvements durent moins d’une minute. À l’issue des procédures expérimentales, des euthanasies par une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale profonde et analgésie seront réalisées afin de permettre les analyses scientifiques nécessaires à l’étude.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont : lors des injections, une douleur de courte durée ; lors de l’administration du composé pharmacologique par voie orale, un stress lié à la contention de l’animal et un risque mineur de fausse route ; lors des prélèvements de sang, un risque d’hémorragie si l’animal a un problème de coagulation ; lors des anesthésie générales et analgésies, un risque de détresse respiratoire du fait de l’injection des anesthésiants et analgésiques ; pendant et après la chirurgie, un risque de douleur liée à l’acte d’incision et d’injection. Par ailleurs, les tâches comportementales génèrent un stress modéré, du fait d’un nouvel environnement et de la douleur ressentie au niveau des pattes lors des stimulations nociceptives désagréables).

Devenir

À l'issue des différentes étapes du projet, l'ensemble des animaux utilisés sera euthanasié. Cette étape est nécessaire pour permettre les analyses qui constituent le cœur de notre étude. En effet, pour comprendre comment la sérotonine agit sur la microglie, ou comment certains gènes influencent le fonctionnement de ces cellules, il est indispensable d'examiner directement le cerveau des animaux. Ces analyses portent notamment sur l'observation des cellules microgliales elles-mêmes (leur nombre, leur forme, leur état d'activation), sur l'expression de gènes spécifiques dans le tissu cérébral, ou encore sur la structure des connexions entre neurones. Ce type d'examen nécessite de prélever le cerveau, ce qui implique l'euthanasie préalable de l'animal. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative permettant d'obtenir ces informations chez l'animal vivant : les techniques d'imagerie actuelles ne permettent pas d'observer les microglies avec la précision cellulaire et moléculaire requise pour ce projet. Le prélèvement du tissu cérébral post-mortem reste donc l'unique moyen d'accéder à ces données. Par ailleurs, les animaux étant étudiés à différents âges (de la période néonatale à l'âge adulte) afin de distinguer les effets sur le développement du cerveau de ceux observés chez l'animal mature, chaque groupe d'animaux ne peut être analysé qu'à un stade donné : un même animal ne peut donc pas servir de son propre témoin à plusieurs âges, ce qui justifie également le nombre d'animaux prévus dans le projet. L'euthanasie sera pratiquée selon des méthodes conformes à la réglementation en vigueur, choisies pour limiter au maximum toute douleur ou détresse chez l'animal.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les modifications des cellules microgliales induites par un apprentissage, une mémorisation (de l’association contexte ou stimulation). En préparation et en parallèle de ce projet sur l’animal éveillé, nous faisons des expériences sur des cultures primaires de cellules, pour des mises au point ou pour tester des hypothèses. Cependant, l’apprentissage et la mémorisation, de l’association contexte ou stimulation (et donc « peur »), comme le test pour déterminer le niveau de mémorisation de cette association, reposent sur le comportement de l’animal, qui doit être éveillé et pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (vue, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types de cellules, dont neurones et microglie, dont on ne peut modéliser fidèlement les interactions ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment la microglie participe aux processus mnésiques. De plus, il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère afin d’obtenir des résultats transposables à l'Homme car les structures cérébrales impliquées et étudiées (ex : l’hippocampe) ne sont pas présentes chez les invertébrés. La souris représente un modèle de choix car le fonctionnement du cerveau et les tests comportementaux que nous allons utiliser sont bien caractérisés. L’autre avantage du modèle souris est qu’il existe des lignées transgéniques permettent de modifier les cellules microgliales pour étudier leur rôle, en invalidant ou en exprimant des gènes spécifiquement dans ces cellules.

Réduction

Afin de déterminer le nombre minimal d’animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles, une analyse statistique utilisant des tests de puissance a été effectuée. D’une manière générale, nous estimons qu’avec notre type d’expériences où nous comparons différents génotypes, il faut au moins 12 animaux de chaque sexe (soit 24 animaux) par condition expérimentale et/ou génotype pour avoir une puissance statistique correcte. De plus, nous devons prévoir des animaux pour ajuster les protocoles, car même si les expériences ont déjà été réalisées au laboratoire précédemment, il est important de refaire des expériences test pour que les nouveaux expérimentateurs amenés à faire l’expérience se familiarisent avec les différentes étapes. Cela permet que les expériences avec les animaux d’intérêt se déroulent bien et soient fiables, donc au total cela limite les répétitions et le nombre d’animaux utilisés. En tout nous estimons l’utilisation de 4080 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximum et ils disposent dans chaque cage d’un à deux enrichissements de nidification. Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) la douleur et ou le stress. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation (cf points limites ci-dessous). Les administrations et prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. En ce qui concerne la chirurgie sans réveil, afin de réduire les nuisances, les animaux seront injectés avec l’anesthétique et l’analgésique dans une pièce séparée, et apportés dans la salle juste pour la chirurgie, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement conformément aux règlementations, et de manière particulièrement rapprochée après les administrations, les tests comportementaux, et les prélèvements de sang. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien (posture, aspect du pelage, poids corporel, avant et après intervention), de sorte à administrer un traitement adapté si besoin (nourriture plus appétante, enrichissement, injection de solution saline et ou glucosée), et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste (dégradation de l’état du pelage, manque d’intérêt pour la nourriture, posture anormale), ou blessure, persistant 3 jours, les animaux seront euthanasiés par une chirurgie sans réveil. Ils ne seront alors pas forcément utilisés pour l’étude en elle-même mais pourront être utilisés pour des mises au point expérimentales (optimisation des protocoles d’analyse des cerveaux).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle pour ce projet en raison des grandes similarités entre son cerveau et celui de l'humain, notamment dans le fonctionnement de la microglie et du système sérotoninergique. Les mécanismes que nous cherchons à comprendre – comment ces cellules et cette molécule influencent le développement du cerveau et le comportement – sont largement conservés entre la souris et l'humain, ce qui rend cette espèce particulièrement pertinente pour notre étude. Un autre atout majeur de la souris est la possibilité de modifier précisément son patrimoine génétique. Grâce à des techniques bien établies chez cette espèce, il est possible d'agir sur un gène donné uniquement dans certaines cellules – ici, la microglie – et à un moment précis du développement. Cette précision est essentielle pour notre projet : elle nous permet d'étudier le rôle d'un gène spécifiquement dans le cerveau, sans perturber son fonctionnement dans le reste de l'organisme, ce qui limiterait les effets indésirables et compliquerait l'interprétation des résultats. Aucun autre modèle expérimental ne permet aujourd'hui d'étudier le cerveau avec un tel niveau de précision. Les interventions seront réalisées à différents âges, depuis les premières semaines de vie jusqu'à l'âge adulte. Ce choix est directement lié à notre objectif scientifique : la microglie et la sérotonine jouent des rôles différents selon le stade de développement du cerveau, et seule une comparaison entre plusieurs âges permet de distinguer les effets propres à la maturation cérébrale de ceux observés chez l'animal adulte déjà formé. Enfin, la souris est une espèce dont les besoins physiologiques et comportementaux sont bien connus, ce qui permet d'adapter au mieux les conditions d'élevage et d'expérimentation afin de limiter autant que possible toute douleur, souffrance ou inconfort durant les procédures.

Toutes mises à mort en fin de procédure pour prélever leur cerveau, 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cette version révisée du projet relevant l'effectif. Privées d'abri et de matériel de nid à partir de huit semaines et pendant six à dix semaines, elles reçoivent selon les groupes une hormone de stress dans l'eau de boisson, deux gavages qui exposent à une blessure de l'œsophage, des injections et un antidépresseur, avant une chirurgie sans réveil. Une partie d'entre elles passe des tests comportementaux mesurant l'anxiété, la dépression, l'activité générale et l'anhédonie, de cinq minutes à vingt-quatre heures, jusqu'à deux par jour et parfois répétés à trois semaines d'intervalle, sans que le porteur nomme ces tests. Il écrit que le stress ainsi produit est "nécessaire pour révéler les effets anxiolytiques et antidépresseurs des composés".

Objectifs

La dépression et l’anxiété sont les troubles psychiatriques les plus fréquents. Les traitements appartiennent à la famille des inhibiteurs sélectifs de la recapture de sérotonine (ISRS), mais leur efficacité est variable et 1/3 des personnes traitées y sont insensibles pour des raisons encore inconnues. Les ISRS augmentent les concentrations de sérotonine ce qui provoque une diminution de l’anxiété et une augmentation de la neurogenèse adulte chez la souris. Cette neurogenèse adulte est diminuée dans les modèles murins de dépression et elle est nécessaire pour permettre les effets anxiolytiques des ISRS. Les cellules immunitaires du cerveau (microglie) sont impliquées dans la régulation de la neuro-inflammation. Elles peuvent adopter un phénotype pro-inflammatoire en situation de stress ou un phénotype anti-inflammatoire qui favorise la neurogenèse adulte. Toutefois, une persistance de l’état pro-inflammatoire peut se produire, qui pourrait contribuer à la pathophysiologie de la dépression. Corrélativement, il a été montré que des ISRS peuvent réduire l’activation pro-inflammatoire de la microglie, suggérant une régulation de ces cellules par la sérotonine. Ce lien entre neuro-inflammation et dépression oriente la recherche vers des traitements ciblant la microglie et l’inflammation cérébrale, en particulier pour les patients résistants aux antidépresseurs classiques. La modulation de la microglie, sans supprimer son activité essentielle dans l’immunité, pourrait représenter une stratégie pour améliorer les symptômes de la maladie. Dans ce cadre, nous nous intéresserons à des récepteurs de la sérotonine, exprimés par la microglie afin de déterminer s’ils sont nécessaires aux effets des ISRS sur l’anxiété et la neurogenèse adulte. Le cas échéant, nous étudierons les modifications à l’échelle transcriptomique, induites par le traitement antidépresseur selon que l’expression de ces récepteurs est bloquée ou non dans la microglie. MODIFICATION : Les effets chroniques des antidépresseurs ne sont observables que sur des animaux stressés. Pour générer un stress, notre projet teste déjà un protocole de retrait des enrichissements des cages. Nous sollicitons une modification de projet pour ajouter un groupe témoin à ce protocole, tester une seconde méthode de stress, valider ces protocoles dans des tests comportementaux, et évaluer d’autres antidépresseurs. Ceci va augmenter le nombre de souris dans le projet.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre le rôle de la microglie, et de sa régulation par la sérotonine, dans les effets des antidépresseurs qui modulent les niveaux de sérotonine dans le cerveau. Cette étude permettra de mieux comprendre comment la sérotonine, un neurotransmetteur clé dans la régulation de l’humeur, influence la microglie, et donc d’apporter de nouvelles connaissances sur les interactions neurones - cellules immunitaires dans le cerveau. Elle pourrait également permettre d’identifier, de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dépression, notamment pour les patients qui présentent des résistances aux traitements pharmacologiques classiques.

Procédures

Différentes interventions sont réalisées sur des animaux adultes vigiles (conscients) : - deux gavages oraux à 48h d’intervalle d’un composé pharmacologique pour bloquer l’expression d’un gène dans un type cellulaire spécifique sur des animaux de 4 à 6 semaines L’acte dure moins de 30 secondes. - MODIFICATION : induction d’un stress modéré par le retrait de l’enrichissement des cages (absence d’abri et de matériel pour faire un nid), associé ou non à l’ajout d’une hormone de stress dans le biberon pour une durée totale de 8 à 10 semaines - MODIFICATION : un traitement chronique dans le biberon (antidépresseur, 6 à 8 semaines), ou un traitement aigu via 1 injection intrapéritonéale (antidépresseur, ou anxiolytique). MODIFICATION : Un prélèvement sanguin sur animal vigile sera également réalisé, qui dure une minute. Une partie des animaux effectuera soit un seul, soit plusieurs tests comportementaux (MODIFICATION) : des tests mesurant l’anxiété ou la dépression (entre 5 et 30 min dans des cages inconnues), l’activité générale (de 30 min dans une cage inconnue à 2h dans la cage d’hébergement), l’anhédonie (sur 24h dans la cage d’hébergement). Les tests seront réalisés à raison de 2 maximum par jour avec un intervalle minimum de 2h, et certains seront répétés 2 fois à 3 semaines d’intervalle. L’autre partie des animaux recevra soit une seule injection intrapéritonéale d’un marqueur de division cellulaire (geste durant moins de 20 secondes), soit 2 injections à 2h d’intervalle en alternant les côtés de l’animal pour limiter les douleurs répétées au même site d’injection. Enfin, une chirurgie sans réveil sous anesthésie générale et analgésie sera réalisée en fin de procédures, pendant laquelle un second prélèvement sanguin sera réalisé (MODIFICATION). Ce geste dure moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’hébergement sans enrichissement environnemental, MODIFICATION associé ou non à l’administration d’une hormone de stress dans l’eau de boisson MODIFICATION, va provoquer un stress modéré, nécessaire pour révéler les effets anxiolytiques et antidépresseurs des composés pharmacologiques, qui sont donnés en médecine humaine. MODIFICATION : Les tests comportementaux vont provoquer un stress léger à modéré. Lors de l’administration d’un composé pharmacologique par gavage, il y a un stress lié à la contention de l’animal, un risque de blessure au niveau de l’œsophage lors de l’insertion de la sonde de gavage, et un risque mineur de “fausse route”. Le traitement pharmacologique dans l’eau de boisson peut entraîner une baisse de la consommation hydrique. MODIFICATION : Le prélèvement de sang induit une douleur légère et transitoire à l’endroit de la piqûre. L’injection IP peut générer une douleur légère et transitoire au point d’injection, avec un risque de péritonite si l’acte est répété. L'anesthésie peut induire dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire voire un arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Nous devons euthanasier les animaux à l’issue de la procédure pour pouvoir prélever leurs organes (ici, le cerveau) et réaliser des analyses qui sont nécessaires à la compréhension des mécanismes de plasticité cérébrale et du lien entre microglie et effets des antidépresseurs et anxiolytiques.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les modifications des cellules microgliales, induites par un traitement antidépresseur, sur la neurogenèse adulte et sur le comportement. De manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, leur remplacement par une approche cellulaire est toujours privilégié, comme des cultures primaires de neurones lorsque la question scientifique posée le permet. Nous pourrions envisager de mettre en place des cultures in vitro composées de microglies (cellules immunitaires du cerveau), de neurones sérotoninergiques et de cellules souches neurales (cellules peuvent donner naissance à des nouveaux neurones), afin d’observer l’effet des antidépresseurs sur ces différents types cellulaires, mais cette méthode ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre cellules et des circuits impliqués dans les effets des antidépresseurs, surtout au stade adulte. Par ailleurs, l’anxiété est un état qui se mesure par le comportement d’un animal éveillé, qui doit pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (odorat, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir, via les hormones de stress, plusieurs types de cellules, dont neurones et microglie, mais on ne peut modéliser fidèlement les interactions ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment la microglie participe aux effets des antidépresseurs de type ISRS.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats reproductibles. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des tests statistiques adéquats afin de comparer nos différents groupes de génotypes et de traitement. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes. Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet est de 3520 (MODIFICATION) sur la durée totale du projet.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Dans nos expériences, les enrichissements seront retirés à l’âge de 8 semaines (MODIFICATION) et ce pendant une durée de 6 à 10 semaines selon la procédure (MODIFICATION), pour générer un stress permettant d’obtenir un effet antidépresseur ou anxiolytique des composés pharmacologiques qui font l’objet de notre étude. Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum la douleur et/ou le stress en termes de durée et d’intensité. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation (cf points limites ci-dessous). Les administrations sont effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. (MODIFICATION) Concernant les traitements chroniques (hormone de stress, antidépresseur), nous avons pris l’initiative d’administrer notre traitement dans l’eau de boisson (prise hydrique volontaire de l’animal), au lieu de l’injecter par voie intra-péritonéale, ce qui diminue considérablement la manipulation des animaux et évite les actes douloureux. Concernant la perfusion intracardiaque, les animaux sont injectés avec l'anesthésique et l’analgésique dans une pièce séparée de la salle de perfusion, et apportés dans la salle juste pour la perfusion, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement conformément aux réglementations, et de manière rapprochée pendant le déroulement de la procédure. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien (posture, aspect du pelage, poids corporel, avant/après intervention), de sorte à administrer un traitement adapté si besoin (nourriture plus appétante, injection de solution saline et/ou glucosée), et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste ou blessure, persistant 3 jours, les animaux seront euthanasiés pour être utilisés dans les mises au point.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent pour nos études car en tant que mammifère, son système nerveux présente des homologies importantes avec l’homme. En effet, l’organisation des structures cérébrales et des différentes voies qui les connectent sont similaires entre ces 2 espèces. Les voies sérotoninergiques ainsi que les récepteurs à la sérotonine, sont bien décrites chez la souris, et comparables avec ceux décrits chez l’homme. La souris adulte est le modèle standard pour l’évaluation des effets neurobiologiques des antidépresseurs de type ISRS et les paradigmes comportementaux sont validés. Utiliser la souris est essentiel pour garantir la comparabilité et la reproductibilité avec des études effectuées précédemment. De plus, il existe dans cette espèce des lignées modifiées génétiquement, qui permettent d’étudier le rôle de certains gènes et de certaines cellules de manière précise. On peut en effet invalider des gènes précis spécifiquement dans un type cellulaire donné et à un stade ou âge donné. Dans notre étude, les animaux auront un développement normal, puis nous induirons à l’âge de 4 semaines, l’invalidation d’un gène spécifiquement dans la microglie. Cela nous permet d’élever les animaux dans un état où les modifications génétiques sont silencieuses, sans effet, jusqu’au moment de l’expérience. Les animaux seront ensuite traités à partir de 10 semaines avec un antidépresseur, classiquement donné en médecine humaine pour soigner les troubles dépressifs et anxieux.