Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Circuits neuronaux des apprentissages de haut niveau chez le Rat
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Une injection dans le cerveau au cours d'une opération pouvant durer deux heures, une canule fixée au crâne, une fibre optique branchée sur la tête pendant des séances d'une heure : 696 rats passent par là, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 624 d'entre eux, tous tués pour que leur cerveau soit prélevé. La majorité subit en plus un rationnement alimentaire pouvant durer douze semaines. Le projet cherche à cartographier les circuits cérébraux des apprentissages complexes, avec la schizophrénie et les addictions citées comme horizon translationnel. Le porteur écrit que maintenir les rats entre 90 et 95 % de leur poids "impacte très peu leur bien-être", tout en présentant cette faim comme ce qui garantit leur motivation à travailler pour la nourriture.
Objectifs
Ce projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent les apprentissages de haut niveau chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de plusieurs régions connues pour être impliquées dans ces apprentissages mais dont le rôle précis n’est pas connu. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre les différentes régions impliquées en utilisant des produits permettant de les visualiser (traceurs). Ensuite nous inactiverons certaines structures pendant les tests d’apprentissage afin de mieux comprendre leur rôle.
Bénéfices attendus
Ce projet de Neurosciences permettra de comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux dans les processus d’apprentissage. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où des dysfonctionnements dans ces circuits ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions)
Procédures
Dans ce projet, les rats subiront une seule intervention chirurgicale pour une injection intracérébrale et certains seront implantés avec une petite canule fixée au crâne. Cette intervention durera maximum 2h. Pour certains de ces rats, une source lumineuse (fibre optique) sera attachée à leur tête pendant la tâche comportementale, ce geste durera quelques secondes et le rat restera connecté tout le long de la séance qui dure 1h. La majorité des rats recevront également un entraînement comportemental, qui nécessite une restriction alimentaire légère pour une durée maximale de 12 semaines.
Impact sur les animaux
Deux points de vigilance sont à noter. Le premier concerne la chirurgie. Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Le second concerne les procédures comportementales. Le stress de manipulation, lorsque l’on place les rats dans les cages opérantes ainsi que celui de contention pour les injections i.p. (juste avant la tâche) est faible puisqu’il est limité par l’habituation et par le côté appétitif de la tâche. Durant la tâche comportementale, les animaux seront mis en rationnement alimentaire léger pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial, ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours des tâches comportementales (environ 5g par jour).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le cerveau pour les études tissulaires
Remplacement
Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives complexes ne peuvent, par définition, s’étudier que chez les organismes entiers. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale
Réduction
Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables lors de l'utilisation des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les rats sont hébergés dans des cages collectives avec un milieu enrichi (un tunnel, matériel de nidation, et un bâton à ronger), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière. Pour les procédures chirurgicales, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites généraux et des points limites gradés spécifiques aux procédures ont été déterminés, associés à des actions conservatoires de prise en charge de la douleur et de l’inconfort. Les animaux seront inspectés une fois par jour par l’expérimentateur durant 5 jours consécutifs à l’opération chirurgicale. Une grille de scorage a été mise en place pour adapter le suivi post opératoire et prendre en charge tout inconfort ou douleur des animaux. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une constance dans les coordonnées stéréotaxiques.
Circuits préfrontaux de l’adaptation comportementale chez le Rat
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 052 rats vont être utilisés, tous tués pour prélèvement du cerveau, 908 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacun passant par une chirurgie crânienne d'environ une heure trente et jusqu'à douze semaines de restriction alimentaire. Une canule est fixée sur le crâne pour injecter dans le cerveau, et une fibre optique est attachée à la tête de certains pendant la tâche comportementale. Le rationnement les maintient à 90 ou 95 % de leur poids, ce que le porteur décrit comme une "légère sensation de faim garantissant la motivation" à obtenir la récompense. Ce que le projet promet en retour reste indirect, comprendre des réseaux de la prise de décision, avec des indications jugées précieuses pour la schizophrénie et les addictions, sans qu'aucune application soit avancée.
Objectifs
Ce projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent une prise de décision adaptée chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de plusieurs régions connues pour être impliquées dans la prise de décision mais dont le rôle précis n’est pas connu. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre les différentes régions impliquées en utilisant des produits permettant de les visualiser (traceurs). Ensuite nous inactiverons certaines structures pendant le comportement de prise de décision afin de mieux comprendre leur rôle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre le fonctionnement de certains réseaux neuronaux de la prise de décision. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où ces dysfonctionnements ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions)
Procédures
Dans ce projet, les rats subiront une intervention chirurgicale pour une injection intracérébrale et seront implantés avec une petite canule fixée au crâne. Cette chirurgie durera environ 1h30. Pour certains de ces rats, une source lumineuse (fibre optique) sera attachée à leur tête pendant la tâche comportementale. La majorité des rats recevront également un entraînement comportemental, qui nécessite une restriction alimentaire légère pour une durée maximale de 12 semaines.
Impact sur les animaux
Deux points de vigilance sont à noter. Le premier concerne la chirurgie. Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Le second concerne les procédures comportementales. Durant la tâche comportementale, les animaux seront mis en rationnement alimentaire léger pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial, ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours des tâches comportementales (environ 5g par jour).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le cerveau pour les études tissulaires.
Remplacement
Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives complexes ne peuvent, par définition, s’étudier que chez les organismes entiers. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables lors de l'utilisation des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les rats sont hébergés dans des cages collectives avec un milieu enrichi (un tunnel, matériel de nidation, et un bâton à ronger), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière. Pour les procédures chirurgicales, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites généraux et des points limites gradés spécifiques aux procédures ont été déterminés, associés à des actions conservatoires de prise en charge de la douleur et de l’inconfort. Les animaux seront inspectés une fois par jour par l’expérimentateur durant 5 jours consécutifs à l’opération chirurgicale. Une grille de scorage a été mise en place pour adapter le suivi post opératoire et prendre en charge tout inconfort ou douleur des animaux. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une constance dans les coordonnées stéréotaxiques. Pour la procédure 5 les animaux seront plus jeunes : 45 jours
Biodistribution de resvératrol marqué à l’oxygène
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
440 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés, et 165 d'entre elles subiront dix gavages étalés sur douze jours quand d'autres n'en subiront qu'un seul. Chaque gavage dure moins d'une minute et peut irriter l'œsophage au point de faire perdre du poids à l'animal. L'objet est de savoir où va le resvératrol une fois ingéré et comment l'organisme le transforme, le porteur affirmant devoir travailler sur un "organisme entier". Le bénéfice qu'il annonce reste méthodologique et conditionnel, la technique de marquage "pourrait être appliquée à d'autres composés".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de savoir dans quels organes se retrouve un composé dont les propriétés de neuroprotection ont déjà été démontrées une fois qu’il a été ingéré par l’animal. Ce projet nous permettra aussi de comprendre comment ce composé est dégradé, transformé par l’organisme et comment il agit ce qui, à ce jour, n’est pas complètement identifié.
Bénéfices attendus
Le développement de la nouvelle méthode de marquage associée à l’imagerie que nous proposons permettrait de déterminer la nature et la localisation du resvératrol et de ses métabolites. Cette méthode pourrait être appliqué à d’autres composés.
Procédures
Gavage sur animal vigile : 165 souris, 1 fois. Gavage sur animal vigile : 55 souris, 1 fois par jour sur 2 jours. Gavage sur animal vigile : 55 souris, 1 fois par jour sur 5 jours, pause de 2 jours, puis 1 nouveau gavage. Gavage sur animal vigile : 165 souris, 1 fois par jour sur 5 jours, pause de 2 jours, puis 1 fois par jour sur 5 jours. Un gavage dure moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Possible perte de poids liée à une irritation de l’œsophage à cause du gavage. Stress lié à la contention au moment du gavage.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car nous souhaitons ensuite analyser les organes prélevés.
Remplacement
Les composés seront vérifiés et validés avant d’être administrés aux animaux. Cependant nous souhaitons connaitre le comportement des composés une fois ingéré par l'animal (où va-t-il ? dégradation ?), pour cela nous devons travailler sur un organisme entier.
Réduction
Seuls les composés validés in vitro seront testés. Si les résultats obtenus avec les premiers composés testés ne sont pas concluants, nous n'irons pas plus loin. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de faire des analyses qui nous permettront de mieux comprendre le mécanisme d’action des molécules.
Raffinement
Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs en suivant des critères bien définis. En cas de souffrance des mesures conservatoires seront mises en place pour soulager l'animal. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors il sera euthanasié. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont déjà été réalisés avec ce composé. Afin d’avoir un point de comparaison et positionner la méthode que nous avons développer nous travaillerons dans les mêmes conditions que nos prédécesseurs. Pour cela nous utiliserons la souris à l’âge adulte de 8 semaines. A cet âge les souris ont une taille raisonnable qui facilite leur manipulation diminuant ainsi le stress lié à leur manipulation.
Mise au point de techniques d’imagerie et de spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire in vivo chez le rongeur sain
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Rats : 50
Trois à quatre séances d'IRM de deux heures chacune, sous anesthésie gazeuse, avec injection d'un produit de contraste : 50 souris et 50 rats en bonne santé passent par ce protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le projet ne porte sur aucune maladie, il sert à mettre au point des séquences d'imagerie, et le porteur annonce comme retombée de "faire progresser les recherches de nos partenaires et de nos clients". Il décrit cette imagerie comme non invasive, indolore et sans nuisance attendue, tout en programmant la mise à mort de chaque animal. Le seuil qui la déclenche n'a rien de médical : les rats sont tués quand ils atteignent 500 grammes et les souris 45 grammes, poids au-delà desquels ils ne rentrent plus dans l'appareil disponible en routine.
Objectifs
Un modèle animal permet d’étudier dans des conditions contrôlées de laboratoire les causes, les processus et les traitements éventuels d’une pathologie. Il doit présenter des similitudes avec la pathologie humaine correspondante en termes de symptômes et de mécanismes physiopathologiques. Une grande partie des connaissances en biochimie, physiologie ou pharmacologie ont été acquises grâce à l’étude des modèles animaux. Dans ce contexte, l’imagerie et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) sont des techniques d’investigation non irradiantes, non invasives, n’entrainant pas de douleur ou de souffrance chez l’animal anesthésié. L’application de ces méthodes in vivo chez le petit animal permet la caractérisation et la compréhension de modèles de pathologies, tant d’un point de vue anatomique que fonctionnel. Elle permet également la validation préclinique de nouvelles molécules à visée thérapeutique et l’étude des mécanismes d’action de médicaments actuellement utilisés. Le premier avantage de l’imagerie RMN in vivo est la possibilité de suivre des phénomènes biologiques complexes chez un animal au décours de sa pathologie et donc d’utiliser moins d’animaux que lors d’approches in vivo invasives. Le second avantage de l’imagerie RMN in vivo tient au fait que les technologies utilisées (aimants RMN, produits de contraste) sont identiques à celles utilisées chez l’Homme, permettant ainsi une recherche biomédicale translationnelle. Or la mise au point de cette approche nécessite régulièrement de nouvelles séquences d’acquisition et méthodologies qui doivent être développées, évaluées et optimisées sur des animaux avant d’être applicables dans des projets de recherche. Ainsi les objectifs principaux du projet mené sur des rongeurs sont : • d’optimiser les paramètres d’acquisition de séquences existantes afin de les adapter au mieux au modèle biologique et à ses spécificités ; • de développer et mettre au point de nouvelles techniques d’imagerie et de spectroscopie RMN.
Bénéfices attendus
Le développement et la validation de nouvelles méthodes en imagerie et spectroscopie RMN contribuent à faire progresser les recherches de nos partenaires et de nos clients
Procédures
L’examen RMN est effectué sur un équipement dédié aux investigations chez le rongeurs sous anesthésie . Les animaux sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Nous estimons que 3-4 examens RMN sous anesthésie seront réalisés sur un animal au cours du projet, avec un intervalle minimum d'une semaine entre 2 anesthésies.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles liées à l'injection d'un produit de contraste (réduites car l'injection est effectuée sous anesthésie). Aucune nuisance liée à l'imagerie in vivo n'est attendue.
Devenir
Les animaux seront utilisés pour plusieurs examens IRM, ils seront mis à mort lorsqu'ils auront atteint un poids de 500 G pour les rats et 45 G pour les souris (poids limite compatible avec nos équipements RMN disponibles en routine).
Remplacement
Avant d’être appliqués dans le cadre de pathologies d’intérêt, les développements méthodologiques et instrumentaux dédiés à l’imagerie in vivo du petit animal doivent être validés in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux: - dans la mesure du possible, un maximum d’étapes nécessaires au développement méthodologique et instrumental sera réalisé sur fantôme ; - les animaux ayant subi une anesthésie gazeuse seront utilisés pour plusieurs examens RMN. Chaque examen sera espacé d’au moins 1 semaine. Un animal pourra être évalué plusieurs fois jusqu’à ce qu’il ait atteint un poids de 500g pour les rats et 45g pour les souris, poids limites compatibles avec les équipements RMN disponibles en routine. Aucune analyse statistique n’est envisagée en routine pour les validations des développements méthodologiques. Cette validation sera appréciée par la capacité à répondre à la question posée et la reproductibilité de la méthode sera évaluée chez 3-5 animaux.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une période suffisante lors de leur arrivée. Ils seront hébergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress, dans une pièce thermorégulée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois par semaine. Il faut considérer que les animaux seront habitués à être manipulés par l’expérimentateur et observés quotidiennement, ce qui permet de déceler des signaux de stress, de douleur ou d'inconfort. L’IRM est non invasive et effectuée sous anesthésie et suivi physiologique continu : installation de l'animal dans un berceau dédié avec suivi en continu de la température corporelle (utilisation d’un système de chauffage intégré dans le berceau dont la température est contrôlée et adaptée en fonction de la température de l’animal) ; monitoring de la fréquence respiratoire pendant toute la procédure (ce qui permet d'adapter la profondeur d'anesthésie). Ce monitoring permet de déceler un problème (fréquence respiratoire irrégulière et en baisse, température en baisse malgré le chauffage), ainsi l'acquisition peut être interrompue avant l'atteinte des points limites définis pour l'imagerie, l'anesthésie arrêtée et l'animal réveillé sous surveillance de l'expérimentateur.
Choix des espèces
Un modèle animal permet d’étudier dans des conditions contrôlées de laboratoire les causes, les processus et les traitements éventuels d’une pathologie. Il doit présenter des similitudes avec la pathologie humaine correspondante en termes de symptômes, de mécanismes physiopathologiques et/ou de traitements. Le rat et la souris sont très souvent utilisés comme modèle. Les modèles rongeur de pathologies sont obtenus par des méthodes physiques, chimiques et pharmacologiques ou par sélection de lignées spécifiques. De nombreux modèles génétiquement modifiés ont également été obtenus par ajout ou retrait de gènes (souris knock-in ou knock-out). Finaliser le développement et/ou la mise au point les méthodes RMN in vivo chez l’animal permettra de réaliser les expérimentations dans des conditions similaires aux futures études. Travailler chez le rat ou la souris offre la possibilité de confronter nos résultats avec une littérature abondante. Au début des expérimentations, les rats et les souris sont utilisés au stade de jeune adulte avec des poids de 200-250 g et 16-20g, respectivement. Au vu du caractère non invasif de la RMN, les animaux anesthésiés pourront être utilisés plusieurs fois et serviront à la validation de plusieurs procédures. Cependant, pour des contraintes matérielles (optimisées pour des rats d’un poids < 500 g et des souris d’un poids < 45 g) et pour nous affranchir des biais dus à des changements dans le métabolisme qui se développeraient plus tard dans la vie de l’animal, les rats seront utilisés jusqu’à ce qu’ils atteignent un poids de 500g et les souris un poids de 40-45g. Avant l'atteinte de ces poids limites, nous estimons à 3-4 anesthésies à l’isoflurane par animal avec un intervalle d’au moins 1 semaine entre chaque évaluation.
Elevage et maintien d’une lignée murine à phénotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Poinçonnage des phalanges puis amputation de l'extrémité de la queue, à dix jours de vie et à quelques secondes d'intervalle : 375 souris nées porteuses d'une mutation de la sclérose latérale amyotrophique passent par là, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 347 d'entre elles et sévère pour 28. Ces 28 souris deviendront paralysées d'un ou plusieurs membres vers 110 jours et vivront entre 130 et 150 jours. Il s'agit de croiser deux lignées existantes pour obtenir un modèle où certaines zones du cerveau se voient en imagerie. Le porteur écrit que tous les animaux seront gardés en vie à la fin de la procédure, puis détaille le contraire : 84 souris partent vers une autre animalerie, les 291 restantes sont exploitées pour l'élevage et tuées à 100 jours au plus tard.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), également appelée maladie de Charcot, provoque chez les patients atteints une atrophie musculaire et/ou des contractions musculaires involontaires. A ce jour, il n'existe aucun traitement qui guérit de la SLA, ils prolongent uniquement le temps de vie du patient. L'objectif du projet est de créer une lignée de souris atteinte de la SLA avec des marqueurs du cerveau visibles au colorant en imagerie afin d’explorer les altérations observées aux stades précoces de la maladie et de découvrir de nouveaux marqueurs de cette maladie. Nous produirons donc cette nouvelle lignée de souris en croisant 2 autres lignées existantes : la lignée présentant les symptomes de la maladie et une lignée permettant de marquer des zones du cerveau au colorant. Ce croisement permettra d'étudier un modèle de la maladie avec des zones du cerveau observable en imagerie à trois stades de développement précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier des altérations au niveau de plusieurs zones du cerveau à un stade précoce de la SLA et de voir à quel stade de la maladie ces altérations apparaissent et à quel niveau. Ces résultats pourraient permettre de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement de la SLA.
Procédures
375 souris seront porteuses de la maladie à leur naissance mais seulement 28 développeront certainement les premiers symptômes de la maladie. Elles deviennent paralysées d'un ou plusieurs membres vers 110 jours et ont une durée de vie d'environ 130 à 150 jours. Ces animaux devront être identifiés par tatouage et prélevé à la queue à 10 jours pour vérifier la présence de la maladie. L'identification et le prélèvement sont réalisés sur l'animal vigile, composées de deux actes techniques invasifs : - Le tatouage par poinçonnage des phalanges et/ou des coussinets : réalisé une fois, durée d'une minute maximum - La biopsie de queue qui consiste en l’amputation de l’extrémité de la queue : réalisée une fois, durée de 3 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Les souris seront porteuses de la maladie à leur naissance. Ces animaux vont présenter des altérations motrices : ils deviennent paralysés d'un ou plusieurs membres à partir de 110 jours. Les mâles atteints de la maladie sont plus agressifs que la moyenne. Une procédure de génotypage et d'identification est nécessaire pour connaitre le génotype des animaux produits. L'identification est réalisée par tatouage des phalanges, et le génotypage par biopsie de queue. Chacun de ces actes à lui seul n'induit pas de douleur, mais le cumul des 2 actes de manière très rapprochée (quelques secondes d'intervalle) peut induire un inconfort léger et transitoire pour l'animal âgé de 10 jours.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de la procédure (sauf ceux présentant des points limites). 84 animaux seront transférés dans une autre animalerie pour observer les altérations dans le cerveau : 28 animaux à 40 jours, 28 à 70 jours et 28 à 110 jours. Le reste des animaux (291 animaux) seront utilisés pour l'élevage et mis à mort par la suite à 100 jours maximum.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris car ce projet repose sur l’évolution de la maladie (SLA), à des stades pré-symptomatiques. Les mécanismes de cette maladie ne sont pas encore suffissamment connus pour permettre d'autres modelisations.
Réduction
Les plans d'élevage sont prévus au plus précis afin de ne pas surproduire d'animaux. La majorité des animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteur. De plus, le nombre d'animaux optimal utilisé pour chaque lot a été déterminé à l'aide de test statistiques. Ce nombre a été réduit au minimum afin de pouvoir produire suffissamment pour l'expérimentation tout en pouvant obtenir des résultats exploitables, et comparable avec des travaux antérieurs.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages collectives. Les identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié, stérile, permettant de limiter les infections et d’effectuer un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle calme loin des autres animaux afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les animaux sont remis en présence de leur mère dans des cages collectives enrichies : maison rouge, nid, baton à ronger. Le personnel effectue un contrôle visuel des animaux identifiés et génotypés dans l’heure qui suit la réalisation des gestes, le lendemain puis quotidiennement. Les mâles atteints de la maladie sont connus pour être agressifs envers leurs congénères, nous les hébergerons donc par 3 maximum au lieu de 4 avec un bâton à ronger chacun. Des critères pour évaluer la souffrance des animaux sont mis en place au sein de l'animalerie. Une grille de critères a été établie spécifiquement pour les signes cliniques de la SLA à partir de 3 mois.
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. Le choix de l'espèce est lié au fait que le modèle de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) n'existe que chez la souris, tout comme le modèle permettant le marquage de différentes zones du cerveau. Afin d'observer les caractéristiques des altérations précoces au sein de la SLA, des animaux vont être utilisés à différents stades de développement : - entre 35 et 45 jours - entre 65 et 75 jours - entre 100 et 110 jours : apparition des premiers symptômes.
Etude de l’expression d’un gène impliqué dans la régulation de l’autophagie après induction d’une inflammation
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection unique de composé pro-inflammatoire, dès le huitième jour de vie pour une partie d'entre elles, ce qui suppose de les séparer de leur mère, et certaines subissent une chirurgie sous anesthésie sans jamais se réveiller. État fébrile passager, hypothermie légère et baisse de mobilité sont attendus. Le lien annoncé avec les troubles du spectre autistique reste lointain, le porteur renvoyant à de futurs tests précliniques l'évaluation de molécules modulant l'autophagie, et il affirme sur le remplacement que l'étude du comportement "ne peut se faire autrement" qu'in vivo.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions les conséquences d’une stimulation inflammatoire auquel l’individu serait exposé dans les premières semaines de vie, par la mise en place d’un protocole pro-inflammatoire classiquement décrit dans la littérature. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autres l’expression d’un gène impliqué dans la régulation de l’autophagie et de l’inflammation. Notre projet est complémentaire du travail en cours et permettra d’obtenir des données originales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale (les troubles du spectre autistique concernent 1 enfant sur 36 aux USA en 2020, 1/44 en 2018, 1/69 en 2012). A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Une injection unique de composé pro-inflammatoire (durée du geste d’environ 10 secondes). Une chirurgie sans réveil (sous anesthésie et analgésie) de moins de 5 minutes sera réalisée sur une partie des animaux du projet.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress et de légère hypothermie sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, la réalisation de contention, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. L’injection de l’agent inflammatoire est classiquement utilisée pour induire un état inflammatoire, au-delà de la légère douleur provoquée par l’aiguille. Elle est donc susceptible d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Une détresse respiratoire et une hypothermie sont possibles lors de l’anesthésie liée à la chirurgie sans réveil.
Devenir
L’ensemble des 864 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt pour traitement par biologie molécule ou histologie.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie combiné à une perturbation inflammatoire précoce, sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 864 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés plusieurs fois par semaine et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les paramètres environnementaux contrôlés comprennent une humidité de 50 plus ou moins 20 pour cent, une température constante (20-24 degrés celsius). L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification (Sizzle square et/ou coton) et d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue pendant 12h, à l’aide d’une grille de suivi Si l’état général de l’animal atteint les points limites (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés immédiatement. Le stress induit par la séparation au moment de l’injection des animaux au 8ème ou 20ème jour de vie est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation avec la mère. Les données de la littérature indiquent que l’injection intrapéritonéale de molécules pro-inflammatoires n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les animaux seront particulièrement observés après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la réponse inflammatoire précoce sur l’expression du gène et sur d’autres marqueurs inflammatoires. Plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (injection à 8 jours de vie), jeune (injection à 20 jours de vie), adolescent (injection à 34 jours de vie) et adulte (injection à 89 jours de vie).
Identifier les gènes responsables de la dégradation ou de la réparation du neurone et du muscle
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
5 040 poissons-zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués puis conservés à -80 degrés pour analyses. Les interventions ont lieu sur des larves de 48 à 72 heures : lésion du cartilage de la mâchoire, de la moelle épinière ou de la nageoire caudale, ou injection de cellules, sous anesthésie et en moins de quinze minutes. Le porteur annonce une récupération complète en cinq à six jours grâce aux capacités de régénération de l'espèce, et prévoit la mise à mort des larves trop affectées par l'intervention, le suivi allant jusqu'à trente jours pour les gènes dont la suppression tue précocement. Il présente cet usage de larves comme un moyen de "remplacer l'utilisation de modèles mammifères, en ligne directe avec les recommandations des 3R", alors que le projet en mobilise 5 040.
Objectifs
Le projet global vise à identifier les zones de notre ADN responsables des maladies génétiques qui contrôlent la locomotion. Nous cherchons notamment à découvrir les mécanismes qui poussent un tissu à dégénérer, ou qui au contraire, permettent sa réparation (c’est-à-dire sa régénération). Pour ce faire, nous supprimerons chez le poisson-zèbre, les gènes qui sont mutés chez des patients atteints de maladies neuromusculaires. Nous observerons alors comment l'absence de ces gènes peut impact les neurones, les muscles et les cartilages du poisson. Objectif 1: Découvrir les zones de l'ADN impliquées dans les maladies du système nerveux et musculaire. Objectif 2: Déterminer l'impact de ces gènes sur les mécanismes de réparation de tissus (régénération). Objectif 3: Tester des molécules potentiellement thérapeutiques sur ces modèles pour identifier de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre les gènes qui assurent le fonctionnement de nos neurones et de nos muscles, et plus généralement, de l’appareil locomoteur. Notre étude permettra surtout de mettre en avant les processus qui ont lieu au cœur de nos cellules, en regardant les compartiments qui sont à l'intérieur même de nos neurones ou de nos myocytes. Enfin, l'identification de nouveaux agents thérapeutiques permettra de mettre en place de nouveaux traitement pour les maladies qui affectent la capacités des patients à se déplacer.
Procédures
Les larves de 48 et 72heures post-fertilisations seront soumises à des injections cellulaires ou à des lésions des tissus locomoteurs (lésion du cartilage, de la moelle épinière ou de la nageoire caudale). Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes et sera effectuée sous anesthésie totale. Les procédures de lésion pourraient engendrer un défaut de locomotion transitoire qui perdurera de 2 à 3 jours avant réparation des tissus. Etant donnée les capacités régénératrices du poisson-zèbre, une récupération totale est observée entre 5 et 6 jours post-fertilisation. Au stade où la larve acquiert un comportement de chasse et de prise alimentaire, la locomotion de l’animal n’est donc plus altérée. Les différentes interventions seront effectuées sous anesthésie et les larves trop affectées par l’intervention sont mises à mort.
Impact sur les animaux
En mimant certaines pathologies humaines, la suppression ou la surexpression de nos gènes d’intérêt pourrait mener à la diminution de la locomotion de la larve, comme décrit chez les patients. Les différents modèles utilisés dans ce projet (mutants ou transgéniques), ne seront conservés au-delà de 6 jour post-fertilisation que si la prise alimentaire de l’animal n’est pas compromise. Toute apparition de point limite entrainera la mise à mort du poisson. La lésion de la moelle épinière et de la nageoire à 3 jours post-fertilisation pourraient entraîner une réduction transitoire de la locomotion chez la larve. Ce défaut ne devrait pas dépasser 6 jours post-fertilisation étant donnée les capacités de réparation tissulaire existant chez le poisson-zèbre. La lésion de la mâchoire quant à elle, ne devrait pas affecter la prise alimentaire de la larve au-delà de 6jours post-fertilisation.
Devenir
Afin de réduire au maximum le nombre de poissons utilisés dans notre étude, chaque procédure prendra fin avec la mise à mort de l'animal puis le stockage des tissus à -80°c pour des analyses ultérieures. Ceci permettra d'utiliser une même larve pour les procédures in vivo puis pour les analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
Afin de décrypter les pathologies qui affectent le système locomoteur, il est important d’utiliser un modèle qui modélise à la fois les systèmes nerveux, musculaires et cartilagineux, tout en reproduisant les interactions complexent qui les lient. Des modèles cellulaires seront utilisés autant que possible dans notre étude, mais nous seront contraints de faire appel à des modèles animaux pour prendre en compte l’appareil locomoteur dans son ensemble. Dans ce cadre, le modèle du Danio rerio représente la meilleure stratégie. L’utilisation de la larve de poisson-zèbre permet de remplacer l’utilisation de modèles mammifères, en ligne directe avec les recommandations des 3R. La caractérisation des nouveaux modèles de pathologies humaines proposée dans notre étude représente autant de nouveaux outils pour comprendre les désordres génétiques sans recourir aux modèles rongeurs.
Réduction
En travaillant sur le meilleur design possible pour notre étude, nous avons pu faire en sorte que chaque animal participe à plusieurs parties du protocole, via des approches non-invasives. Ainsi, nous pouvons, à partir d’une même larve, assurer le suivi de la morphologie globale de l’animal, l’analyse microscopique de ses tissus, le suivi locomoteur, puis l’étude biochimique après euthanasie des individus. Ceci permet de réduire drastiquement le nombre de larves utilisées dans le projet global.
Raffinement
Lors de notre étude, chaque procédure sera effectuée sous anesthésie, avant un retour rapide dans les conditions d'élevage. Après chaque intervention, un suivi quotidien des animaux sera effectué tout au long de l’étude. Les nourrissages manuels assurés chaque jour permettront une observation régulière de chaque individu tout au long des procédures pour détecter une altération de la nage ou de la prise alimentaire. La mise en place de points de contrôle et de critères d’arrêt bien définis permettra d’assurer le maintien des animaux dans les meilleures conditions.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre donne accès à de nombreuses procédures non-invasives pour suivre les structures locomotrices chez l’embryon et la larve (à la fois d’un point de vue anatomique et fonctionnel). De plus, le modèle est totalement adapté aux études thérapeutiques, aux suivis microscopiques et aux approches génétiques décrits dans le projet. En outre, l’utilisation du poisson-zèbre, notamment à l’état larvaire, permet de remplacer l’utilisation de modèles mammifères. Enfin, de par sa transparence et son développement externe, le poisson-zèbre représente un modèle unique pour visualiser ce qui se passe au cœur de nos cellules, pour explorer des processus impossibles à voir chez d'autres modèles. Pour l’étude de l’appareil locomoteur, les animaux seront étudiés entre 24 heures post-fertilisation et 6 jours post-fertilisation. Ceci permet de prendre en compte la totalité du développement de la mandibule et des structures neuromusculaires, et de considérer le temps nécessaire à leur régénération. Pour les gènes présentant une potentielle létalité développementale, le suivi sera prolongé jusqu’à 30 jours, stade auquel la plus part des défauts génétiques conduisent à la mort prématurée de la larve.
Effet de la Température sur les capacités de Navigation et l’activité Cérébrale chez la seiche
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pêchées au casier au moment où elles se rapprochent des côtes pour pondre et entrer en sénescence, 180 seiches communes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 45 d'entre elles et sévère pour les 135 autres. La chirurgie consiste à implanter des électrodes dans le cerveau et à fixer sur le dos, au-dessus de l'os de seiche, un boîtier étanche d'enregistrement, sous anesthésie par balnéation et analgésie locale. Trois groupes de quinze animaux servent à mettre au point la technique, dont quinze maintenus vigiles pendant deux heures d'enregistrement. Soixante seiches équipées et soixante sans dispositif passent ensuite une tâche d'apprentissage en labyrinthe en T à 12, 18 ou 24 degrés, avec des enregistrements de douze heures par jour un jour sur deux. Les seiches porteuses d'électrodes sont tuées pour repérer l'emplacement exact des implants, celles restées sans appareil pouvant réintégrer l'élevage selon le porteur, qui juge le recours à des animaux vivants "indispensable" pour relier activité cérébrale et navigation.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer les effets de changements de température de l’eau sur le fonctionnement cérébral et les capacités de navigation de la seiche commune (Sepia officinalis). Des perturbations environnementales, à l’image des changements de température, peuvent modifier le fonctionnement cérébral des animaux marins. Cela peut engendrer une diminution de flexibilité comportementale et in fine du taux de survie des espèces impactées. La seiche commune, comme de nombreux autres mollusques céphalopodes, présente des capacités cognitives complexes et une diversité comportementale importante dont dépendent leur survie. Cependant il n’existe à ce jour aucun moyen d’étudier le fonctionnement cérébral in vivo au cours de diverses tâches comportementales. L’objectif de ce projet est donc d’adapter chez la seiche un système d’enregistrement cérébral ayant déjà été utilisé chez le poulpe (céphalopode également) afin d’évaluer la fluctuation de l’activité cérébrale en fonction de la température de l’eau dans laquelle elles évoluent (successivement 12°C, 18°C et 24°C). Il sera alors possible de mesurer l’activité cérébrale au cours d’une tâche de navigation spatiale à de telles températures chez des seiches équipées de ce système.
Bénéfices attendus
Les seiches sont des animaux d'intérêt économique, écologique et scientifique majeurs. Elles représentent en effet une partie importante des stocks de pêche en France, font partie intégrante des écosystèmes marins et sont au centre de nombreuses études en cognition animale et neurobiologie. Comme de nombreuses autres espèces marines, leur survie est en grande partie dépendante de leur flexibilité comportementale. Celle-ci découle d’un fonctionnement cérébral pouvant être sensible à des changements environnementaux. Notre étude vise d’une partà mieux cerner l’impact que peuvent avoir les changements de températures sur les capacités cognitives des seiches et d’autre part de savoir comment l’activité cérébrale associée peut en être modifiée. Associés, ces objectifs permettraient sur le long terme de faire de la seiche un modèle d’étude émergent contribuant à mesurer les effets des pressions anthropiques sur les espèces marines à plus large échelle. Plus globalement ils pallieraient la difficulté actuelle à tisser des liens directs entre conditions environnementales, modification du fonctionnement cérébral et des comportements, en particulier chez des espèces marines.
Procédures
Une mise au point de la technique d’enregistrement d’ondes cérébrales sera faite chez un premier groupe d’animaux anesthésiés à l’aide d’électrodes cérébrales reliées à un amplificateur. L’installation de ces électrodes est faite chez un premier groupe 15 d’animaux sous anesthésie et l’enregistrement dure 40 minutes chez l’animal maintenu en anesthésie continue. Une seconde étape de mise au point de ce protocole sera réalisée cette fois chez 15 animaux vigiles sur deux heures d’enregistrement. Une fois les ajustements de protocole réalisés, un nouveau groupe de 15 animaux sera équipé d’un système d’enregistrement d'électroencéphalographie (EEG) miniature et sans fil appelé neurologger. Celui-ci est contenu dans un boitier étanche fixé sur le dos de l’animal relié à des électrodes d’enregistrement placées au niveau du cerveau. Ces interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie en une fois. Les animaux ainsi équipés évolueront librement dans un bac d’eau de mer à 18°C pendant trois jours puis à 12°C, 18°C ou 24°C pendant les trois jours suivants. Les enregistrements dureront 12h par jour, un jour sur deux. Il sera alors possible de comparer les enregistrements EEG à ces différentes températures. Enfin, le dernier objectif consiste à évaluer les compétences de navigation spatiale à différentes températures. Pour cela deux groupes d’animaux seront constitués, l’un composé d’animaux équipés du neurologger (60 seiches), l’autre non équipé (60 seiches). Les deux groupes seront soumis à une tâche d’apprentissage spatial dans un labyrinthe en T à 18°C durant trois jours. Une tâche de rappel sera réalisée à l’issue de cet apprentissage à l’une des trois températures suivantes (20 animaux par température et par groupe) : 12°C, 18°C ou 24°C.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être attendues sur les seiches suite à l’implantation des électrodes au niveau du cerveau et du neurologger sur leur dos (coquille interne appelée communément os de seiche). Cette chirurgie sera faite sous anesthésie induite préalablement par balnéation. Cette induction est considérée comme étant effective lorsque les critères comportementaux suivants sont observés : perte de mouvements, pâlissement du manteau, perte de réaction suite à une stimulation mécanique (pincement au niveau de la nageoire), diminution d’adhérence des ventouses. Cette anesthésie induite sera accompagnée d'une analgésie locale. Cette chirurgie pourra néanmoins occasionner une gêne temporaire dans les heures suivant l’implantation liées à la cicatrisation des zones d’implants (au niveau de la peau recouvrant le cartilage protégeant le cerveau et au niveau de la peau recouvrant la coquille). Les dimensions (poids et taille) du neurologger seront adaptées à la taille de l’animal de façon à ne pas gêner ses déplacements. Néanmoins les fils reliant les électrodes d’enregistrement (au niveau de la tête) au boitier étanche contenant le neurologger (au niveau du dos) peuvent occasionner une légère gêne lors de certains mouvements de la tête. Ce point sera particulièrement surveillé lors de la mise au point des techniques d’enregistrement afin de limiter au maximum cette gêne (adaptation de la rigidité et longueur des fils). De plus, le boitier étanche dans lequel se trouvera le neurologger sera amovible. Aussi les températures choisies pour étudier l’effet de leur changement se trouve dans les gammes de températures proches des conditions naturelles donc n’occasionneront pas de stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux impliqués, à l’exception des animaux ne portant pas de dispositif d’enregistrement EEG, seront mis à mort à la fin des derniers enregistrements de chaque procédure, sans délai. Cela permettra de prélever leur cerveau afin de retracer la localisation précise des électrodes utilisées pour les enregistrements.
Remplacement
Le point central de ce projet est de pouvoir mesurer les effets de l’activité cérébrale chez des seiches libres de leurs mouvements, lors de la réalisation d’une tâche de navigation (enregistrements pendant les phases d’apprentissage et de rappel). Il en est de même pour étudier l’effet de changements de température sur la cognition spatiale. Le recours à des animaux vivants est donc indispensable.
Réduction
La mise au point du système d’enregistrement consistera à adapter un protocole de chirurgie pour l’implantation des électrodes au niveau du cerveau et de l’appareil sur le dos des seiches. Il conviendra donc de réaliser ces ajustements de protocole dans un premier temps sur des seiches mortes (pêchées au chalut et achetées à la criée). Les seiches de deux ans utilisées par la suite seront pêchées au casier, après qu’elles se soient rapprochées des côtes pour pondre et entrer en sénescence. Par conséquent le prélèvement de ces animaux n’induit pas de perturbation au niveau de leur population. Concernant les protocoles, des tâches comportementales non invasives seront réalisées chez des animaux ne portant pas d’appareil d'enregistrement afin de constater au préalable l’effet de la température de l’eau sur le comportement “de base” (locomotion, prédation, phases d’activité et de repos) mais aussi sur les capacités de navigation. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés en conditions avec enregistrements (i.e chez qui les étapes d’anesthésie, de chirurgie et de mise à mort seront appliquées) sera réduit et chaque animal ayant fait tests comportementaux pourra réintégrer la structure d’élevage. Les analyses statistiques a posteriori seront faites à l’aide de tests non paramétriques conçus pour des échantillons de faible effectif.
Raffinement
La capture des animaux dans la nature sera faite par du personnel habilité, à l’aide de relevés de casiers en pleine mer. Par ailleurs, les animaux seront hébergés dans des infrastructures adaptées à cette espèce. Les seiches sont des animaux non sociaux et des interactions agonistes peuvent avoir lieu entre les individus évoluant dans le même bac lors de la période de reproduction. Il est donc préférable d’isoler les individus dans des bacs d’élevage pourvus d’enrichissements (plantes artificielles et abri). Les étapes de chirurgie seront toutes précédées d’une phase d’anesthésie adaptée, prolongée jusqu’à la fin des interventions. Une fois l’anesthésie effective, les animaux seront placés sur un support de chirurgie équipé d’un système de circulation d’eau et de solution anesthésiante au niveau de leurs branchies et un film plastique sera placé sur leur dos pour maintenir l’humidité au niveau de leur manteau. La hauteur d’eau sera ajustée pour maintenir la tête et le dos des animaux émergés et permettre les actes chirurgicaux. Une injection de solution analgésiante sera également réalisée localement au niveau des zones d’incision dorsale et de la tête. De manière à n’avoir recours qu’à une seule étape d’anesthésie générale et limiter le nombre de manipulations des animaux, l’implantation des électrodes et du boîtier contenant le neurologger, le cas échéant, se fera au cours de la même procédure. Après la chirurgie, les animaux équipés seront replacés dans leur bac d’élevage et surveillés pendant 48h afin de prévenir toute manifestation de souffrance ou de stress. L’emplacement, les dimensions et le poids du boîtier et du neurologger qu’il contient seront choisis de manière à ne pas limiter les mouvements naturels de l’animal suite à l’implantation.
Choix des espèces
La seiche commune (Sepia officinalis), est une espèce modèle bien étudiée en neuroéthologie. Son anatomie cérébrale, ses capacités cognitives et comportements complexes sont largement démontrés. Il s’agit d’une espèce évoluant dans un milieu fortement soumis aux pressions anthropiques dont font partie les changements de température aquatique. La mise au point d’un système d’enregistrement d’ondes cérébrales au cours d’une tâche comportementale chez cette espèce représente deux intérêts majeurs : mesurer l’impact de changements de conditions environnementales sur des capacités cognitives essentielles à la survie de l’espèce et bénéficier d’un outil permettant plus généralement d’explorer le bon fonctionnement cérébral. De plus, comme chez d’autres espèces de mollusques céphalopodes utilisés dans la recherche, plusieurs critères visuels (patterns liés aux chromatophores, présence ou non de lésions) et comportementaux (comportements de prédation, flottaison, mouvements désordonnés, propulsions, jets d’encre excessifs) sont utilisés chez la seiche commune pour attester de son état physiologique (bien-être, souffrance, stress). Les animaux utilisés seront des seiches adultes âgées de un ou deux ans, de taille assez importante pour faciliter les étapes de chirurgie et dont le développement cognitif (mémoire) est mature. Les individus ayant déjà pondu (en fin de vie) seront privilégiés.
TUSHI imaging pour comprendre le rôle des cellules microgliales dans le développement de l’obésité
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une perfusion intracardiaque de trois minutes sous anesthésie profonde, précédée d'une ouverture du thorax : c'est le seul acte que la rubrique des procédures décrit pour les 96 souris de ce projet, classées en souffrance légère et toutes tuées. Leur cerveau est prélevé pour être découpé en tranches et imagé au microscope, afin de caractériser la forme et la mobilité des cellules microgliales de l'hypothalamus. La moitié des animaux passe à huit semaines à un régime riche en graisses, élément qui n'apparaît pas dans la description des procédures mais dans la justification du choix de l'espèce. Le porteur mentionne aussi l'usage d'un appareil de stéréotaxie et un stress lié à l'injection, sans préciser quelle injection est pratiquée ni à quel moment.
Objectifs
Afin d'envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l'obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux comprendre les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Les neurones du groupe de l'hypothalamus (partie assurant un double rôle de contrôle des sécrétions hormonales et de contrôle de l'activité du système nerveux végétatif tel que les organes viscéraux) sont sensibles aux signaux de la périphérie qui les informent du statut énergétique de l'organisme. La consommation d'un régime riche en graisses et en calories (HFD: High Fat Diet) entraîne une neuroinflammation (inflammation des neurones) dans l'hypothalamus. La microglie, une population de cellules immunitaires dans le cerveau, est également connue pour être impliquée dans la régulation du poids corporel. En effet, elles participent à la neuroinflammation dans l'hypothalamus suite à un régime HFD. Leur activation varie en fonction de la période d'exposition au régime HFD (entre les premiers jours et plusieurs semaines). Des publications récentes ont montré que la limitation de l'activation de la microglie en réponse à l'HFD limite la neuroinflammation. Cependant, les recherches sur la dynamique morphologique microgliale (vitesse des processus, etc.) à l'état de base chez des souris exposées au HFD pendant une période aiguë sont encore insuffisantes. Dans ce projet, nous visons à clarifier le rôle de la microglie dans le développement de l'inflammation hypothalamique en réponse à un régime alimentaire riche en calories et à caractériser les changements dans la microglie ainsi que son effet sur la dynamique de l'interaction microglie-neurone. Pour cette étude, nous utiliserons une approche génétique (utilisation d'animaux transgéniques), une technique de microscopie récemment développée et l'emploierons sur des tranches de cerveau frais de l'hypothalamus dérivées de souris nourries au HFD pour quantifier la morphologie microgliale, les vaisseaux sanguins, etc.
Bénéfices attendus
Les informations obtenues grâce à ce projet nous permettront de mieux comprendre le rôle de la microglie de l'hypothalamus dans le développement de l'obésité et les caractéristiques morphologiques de la microglie.
Procédures
La réalisation d'une perfusion intarcardiaque sur animal anesthésié sera induite durant 3 minutes
Impact sur les animaux
L'effet indésirable attendu sur les animaux est le stress durant l'injection. Après l'induction la souris sera anesthésiée et endormie (en vérifiant la profondeur d'anesthésie sur l'animal grâce à l'abscence de réflexe, vérifié par pression sur les pattes arrières).
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées afin de récupérer le cerveau et réaliser des tranches pour être imagées au microscope
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour l'étude du système nerveux des vertébrés, qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. L'objectif de ce projet étant de caractériser la réponse microgliale à l'HFD par microscope dans les conditions les plus naturelles possibles. Cette étude ne peut être réalisée de manière pertinente avec des modèles informatiques (in silico) ou sur des micro-organismes, organes ou cellules hors de leur contexte naturel (in vitro). Le microscope sera dans un premier temps validé par l'imagerie de très petites particules fluorescentes (nanoparticules) afin d'avoir les bons réglages au niveau du microscope et ainsi utiliser moins de souris. Cependant, ces échantillons ne permettent pas réellement de reproduire tous les paramètres optiques observés dans les échantillons biologiques.
Réduction
La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes et la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé grâce à des outils statistiques par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.
Raffinement
A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naîtront dans notre animalerie dans un haut niveau sanitaire, logés dans des cages collectives, garnis de litière leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouille et d'enrichissement avec une régulation de la température et de l'humidité. Leur prise en charge est confiée à un personnel qualifié et expert. Ils surveillent tous les animaux quotidiennement et l'expérimentateur dispose d'une solide expérience pour la procédure proposée. Nous avons défini différents points permettant de meilleurs conditions tout au long de l'étude : 1) Les animaux arriveront dans la salle d'hébergement à l'âge de 3 semaines et seront habitués pendant 1 semaine. Cette période d'accoutumance réduira le stress des animaux en réponse à l'expérimentateur. 2) Pour supprimer le stress et la douleur liés à la thoracotomie pendant la perfusion intracardiaque, les souris recevront une dose profonde d’anesthésiques par injection intrapéritonéale. Ces doses induisent une perte de conscience rapide et une anesthésie profonde. Nous vérifierons l’efficacité de l’anesthésie par la méthode du pincement du coussinet plantaire avant de commencer l’incision des tissus. Cette procédure sera effectuée par un personnel formé et compétent, ce qui garantira la précision et limitera le stress de l’animal avant la perte de conscience.. 3) L'enrichissement des cages consiste en des carrés de cellulose pour la nidification, un tunnel en carton pour la cachette et des bâtons de bois pour le rongement. 4) Des critères d'évaluation précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères concernent l'apparence, le changement de poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect des plaies (le cas échéant). Des mesures conservatrices sont prévues pour chaque critère, afin de gérer rapidement tout changement dans l'état de l'animal comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Lorsqu'un critère précoce est atteint, nous demanderons l'avis d'un vétérinaire afin d'envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec la poursuite de la participation de l'animal à l'étude. En cas d'échec ou d'atteinte d'un critère terminal, l'animal sera retiré de l'étude et sacrifié, afin d'éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le metabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. La souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Toutes les souris de cette étude seront adultes A l'âge de 8 semaines, la moitié des souris sera nourrie au HFD, tandis que l'autre moitié sera nourrie au régime standard. Cet âge est celui où la croissance du crâne est considérée comme achevée, ce qui nous permet d'utiliser l'appareil de stéréotaxie et d'utiliser les coordonnées stéréotaxiques des atlas de référence habituels. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le controle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modele prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l'inflammation des neurones de l'hypothalamus induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme.
Autophagie et Cellules endothéliales : études préliminaires de l’utilisation de Virus Adéno Associés (AAV) spécifiques des cellules endothéliales pour caractériser l’autophagie endothéliale dans un modèle murin d’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
30 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyses immunohistochimiques. Elles subissent la pose d'un cathéter caudal, puis une craniotomie de soixante-dix minutes qui suppose de dissocier le muscle masséter pour atteindre l'artère cérébrale moyenne et provoquer un accident vasculaire cérébral, avant une imagerie par résonance magnétique quatre ou vingt-quatre heures plus tard. Il s'agit d'une étude préliminaire, destinée à vérifier qu'un virus adéno-associé permet de visualiser l'autophagie dans les cellules des vaisseaux cérébraux, le porteur avançant qu'une telle mise au point limiterait ensuite l'utilisation d'animaux transgéniques. Sur le remplacement, il écrit que les techniques sans animaux ne sont "pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information" et retient la souris comme le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l'espèce.
Objectifs
Ce projet vise à caractériser les processus autophagiques mis en place par les cellules endothéliales lors d’un stress induit lors d’un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique. Cette étude est une étude préliminaire afin d’évaluer la faisabilité de l’utilisation de Virus Adéno Associés (AAV) pour permettre la transduction des cellules endothéliales in vivo et ainsi visualiser les flux autophagiques dans les cellules endothéliales à la suite d’un modèle d’AVC ischémique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'autophagie endothéliale lors des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. De plus, la validation de l'utilisation de Virus Adéno Associés (AAV) pour transduire les cellules endothéliales in vivo permettre de développer de futurs outils pour monitorer l'autophagie et ainsi limiter l'utilisation d'animaux transgéniques
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal d'une durée de 15 minutes et un chirurgie permettant l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 4h ou 24h après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale pour une durée totale de 14 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient des douleurs postopératoires après l’induction de l’AVC ischémique, notamment dû à la dissociation du muscle masséter pour procéder à la craniotomie. Les animaux sont susceptibles de perdent de la masse corporelle et de ressentir un stress après les anesthésies et l'induction du modèle d’AVC.
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (30 animaux) seront mis à mort. Les tissus récupérés seront necessaires pour les futures analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 30 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Différents points limites ont été mis en place, évaluables à tout moment après l’injection d’AAV, ou évaluables après la chirurgie. De fait, nous veillerons à l’absence de signe de douleur extérieure, d’une respiration laborieuse, de roulements et de convulsions. Nous veillerons également à l'absence de toutes complications chirurgicales inattendues. Pour les animaux mis à mort à 24h post chirurgie, nous veillerons à ce que leur poids ne diminue pas de plus de 15% sur cette période. Nous veillerons à ce que l’animal réagisse correctement après la fin de l’anesthésie générale. 6h après la chirurgie nous effectuerons un rappel de buprénorphine (0.1mg/kg). Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l'issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est contrôlée et adaptée au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence pour l’étude de l’autophagie et de l’ischémie cérébrale. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les AVC ischemiques. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ceci se justifie par le fait que les AVC touchent principalement les adultes. De plus, les études antérieures sur les AVC concernent également des modèles murins adultes.
Étude du rôle de récepteurs spécifiques dans le traitement de l’information par les cellules cérébrales dans le modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune pouvant enchaîner jusqu'à vingt séances d'habituation puis trente-deux séances d'enregistrement d'une heure trente, tête immobilisée, et vivre en cage avec une plaque métallique fixée sur le crâne. L'implantation se fait sous anesthésie générale, après une injection dans une zone du cerveau, et le porteur indique que le dispositif peut gêner l'animal par son encombrement et limiter son comportement habituel. Toutes sont tuées, une partie pour les analyses post-mortem et les autres parce que leur modification génétique interdit de les réutiliser. L'objet immédiat est de comprendre comment des récepteurs NMDA participent au traitement de l'information visuelle, alors que les retombées annoncées, de nouvelles pistes contre la schizophrénie, l'autisme, la dépression ou la douleur chronique, sont renvoyées au long terme.
Objectifs
Notre projet de recherche vise à comprendre comment le cerveau traite les informations visuelles. Nous étudions des récepteurs spéciaux dans le cerveau, appelés récepteurs NMDA, qui jouent un rôle crucial dans le traitement de l'information par les cellules cérébrales. Notre hypothèse est que les différences dans le fonctionnement et le nombre de ces récepteurs sur divers types de neurones, en particulier les interneurones, influencent grandement la façon dont notre cerveau traite ce que nous voyons. Nous pensons que ces variations sont essentielles au bon fonctionnement de nos réseaux cérébraux et à notre capacité à percevoir et comprendre le monde visuel qui nous entoure. Cette recherche pourrait nous aider à mieux comprendre certains problèmes de vision et potentiellement ouvrir de nouvelles pistes pour les traiter.
Bénéfices attendus
Les maladies du cerveau ont des répercussions majeures sur la santé des individus, leur autonomie, leur éducation, leur emploi, leur mobilité et leurs relations personnelles, ce qui représente un lourd fardeau social et économique. Il est d'une importance fondamentale de comprendre les propriétés de base qui régissent la force, le dynamisme, l'étendue spatiale, la localisation anatomique et les composants moléculaires des connexions synaptiques entre des types de neurones spécifiques formant un réseau neuronal dans des états normaux et pathologiques. Plus précisément, nous pensons que le dysfonctionnement du néocortex est à l'origine de déficiences cognitives et de troubles tels que la schizophrénie, l'autisme, la dépression, ou encore de symptômes de douleur chronique. Cependant, nous ne comprenons pas encore comment les circuits du cortex fonctionnent normalement ni comment ils se dérèglent dans ces troubles. Nous espérons que ces études nous permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces troubles. Grâce à l'utilisation d’animaux génétiquement modifiés, nous serons en mesure de cibler des types de cellules et des réseaux spécifiques afin de fournir un cadre physiopathologique permettant de comprendre les maladies du cerveau et à long terme améliorer nos connaissances dans ce domaine afin d’améliorer également la prise en charge des patients.
Procédures
Un petit prélèvement du bout de la queue sera fait sur une partie des jeunes animaux vigiles (1 fois, moins d’1min). Durant une procédure chirurgicale menée sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée, une partie des animaux recevra une injection dans une zone du cerveau (1 fois, durée 45minutes maximum). Une autre partie des animaux aura en plus de l’injection une implantation d’un dispositif sur leur tête lors de la même procédure chirurgicale, toujours sous anesthésie générale et analgésie adaptée (1 fois, durée 1h maximum). Ils seront ensuite habitués au dispositif expérimental pendant 5 jours, avec 1 à 2 sessions quotidiennes en commençant par quelques minutes et en augmentant progressivement jusqu'à 1h30 maximum . L’habituation pourra être prolongée d’1 semaine si nécessaire, soit 20 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Puis pour une partie de ces animaux des enregistrements quotidiens de 1h30 sont effectués, sur animal vigile, pendant 4 jours consécutifs, pendant 3 mois avec 1 semaine de repos entre chaque période d’enregistrements de 2 semaines, soit 32 sessions maximum par animal avec 1h30 maximum par session. Pour l’autre partie, un protocole d'enregistrement similaire sera mis en œuvre mais précédé d’une courte anesthésie générale pour implanter un dispositif d’enregistrement cérébral (60 minutes, une fois). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, avec une partie d’entre eux euthanasiée lors d’une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptée (sans réveil, durée 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress dû aux manipulations et contentions nécessaires au cours du projet. L'implantation d'une plaque métallique sur la tête des animaux pour l'imagerie biphotonique nécessite une procédure chirurgicale qui pourra générer une douleur et un inconfort pendant quelques jours ainsi qu’un risque d’infection. Une telle procédure implique une anesthésie générale qui entrainera une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardio-respiratoire. De plus, après l'implantation de la plaque métallique, l'animal devra vivre dans la cage avec cette plaque métallique sur la tête, ce qui peut provoquer une gêne due à l’encombrement et limiter son comportement habituel. Afin d'imager l'animal sous un éclairage à deux photons et réaliser des enregistrements neurophysiologiques, les animaux seront éveillés mais leur tête sera immobilisée, ce qui limitera les mouvements de la tête et génèrera un stress pour les animaux. Pour connaitre le patrimoine génétique des animaux nous prélèverons un petit fragment de la queue pouvant générer une brève et légère douleur.
Devenir
À la fin des procédures, une partie des animaux sera euthanasiée afin de réaliser des analyses post-mortem et les autres seront euthanasiés car il ne pourront pas être réutilisés en raison de leur modification génétique.
Remplacement
Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car l'objectif est de découvrir le fonctionnement de zones spécifiques dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique global comporte une composante alternative à l’expérimentation animale: l’analyse de modèles in silico (création d’un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale). Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnel de certaines cellules cérébrales spécifiques.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (5160) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal : les animaux recevront des injections virales et l’imagerie simultanément afin de maximiser les mesures longitudinales multiples sur le même animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. En outre, notre expertise dans l'entraînement des animaux à être fixées par la tête dans l'installation d'imagerie réduira également la variabilité et, dans une large mesure, les nombres globaux nécessaires pour obtenir une signification statistique dans les cohortes. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et qu’il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur la plateforme ebrains.eu (la plateforme de partage de données neuroscientifiques financées par l’U.E.) ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.
Raffinement
Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout au maximum l’impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Les animaux auront à manger et à boire à volonté. Ils seront observés quotidiennement. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, en accord avec la structure chargée du bien-être animal. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera le plus petit possible et réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide). Nous vérifierons ensuite la bonne reprise en charge des petits par leur mère. Toutes les interventions chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale et des analgésiques seront administrés avant et après les interventions pour limiter la douleur. Un soutien nutritionnel et hydrique ainsi qu’une surveillance étroite seront mis en place à la suite des chirurgies pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les propriétés de base des microcircuits de cellules du cerveau chez la souris sont similaires à celles des autres mammifères, y compris l'homme, ce qui rend les résultats obtenus avec un tel modèle éventuellement transposables à la médecine humaine. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de cellules spécifiques que nous étudions. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Le développement du cerveau chez la souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Dans ce projet, nous prévoyons d'étudier les mécanismes cellulaires aux stades précoces et tardifs du développement. C'est pourquoi nous prévoyons d'utiliser des animaux pour certaines procédures dès leur naissance et pour d'autres jusqu'à plusieurs mois. Les animaux reproducteurs seront mis en accouplement à partir de l’âge de 2 mois environ jusqu’à l’âge de 12 mois maximum. Dans le cadre de notre étude, nous prévoyons de déterminer le patrimoine génétique des animaux avec un petit prélèvement de l’extrémité de la queue à l’âge de 7 à 10 jours.
Rôles de protéines associées à la neuroinflammation dans les traumatismes de la moelle épinière [EU 2/2]
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux souches de souris génétiquement modifiées pour ne pas exprimer une protéine du système nerveux central fournissent les 192 animaux de ce projet, utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. La moitié subit une hémisection de la moelle épinière sous anesthésie, opération de trente minutes qui paralyse une patte arrière, altère le contrôle du sphincter urinaire et peut provoquer des escarres. Les tests sont détaillés : activité motrice spontanée pendant huit minutes, marche et coordination pendant dix minutes, force d'agrippement, qualité du nid sur vingt-quatre heures, temps de toilettage et latence à rejoindre la nourriture, répétés jusqu'à six semaines après la lésion. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus destinés aux analyses histologiques, les animaux utilisés étant les surnuméraires issus des croisements menés pour un autre projet.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs chroniques. Bien que les lésions de la moelle épinière touchent des personnes relativement jeunes (moyenne d’âge à 40 ans), le nombre de patients plus âgés est en nette croissance dans les pays industrialisés. L’étude de cette pathologie représente un enjeu majeur. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une lésion de la moelle épinière. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une lésion de la moelle épinière. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle à la transmission des informations depuis le cerveau au reste du corps ainsi que du corps vers le cerveau. Les cellules immunitaires du système nerveux central jouent un rôle prépondérant dans les réponses neuroinflammatoires suite à une lésion de la moelle épinière. Nous voulons étudier si l’absence d’expression de protéines spécifiques qui sont modulées après lésion de la moelle épinière et associées à la neuroinflammation favorise une meilleure récupération. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement permettant de soigner les patients. Développer des travaux visant à favoriser la récupération après lésion de la moelle épinière représente donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Nous cherchons à caractériser les conséquences de l’absence d’expression de deux protéines spécifiquement dans un type de cellule du système nerveux au niveau de la moelle épinière dans un contexte pathologique tant sur le plan cellulaire et tissulaire que comportemental. Nous obtiendrons des informations importantes sur le rôle de ces protéines qui restent méconnues à ce jour dans les lésions de la moelle épinière lors de la mise en place et le maintien de l’inflammation. Cette étude permettra de déterminer précisément leur importance après lésion moelle épinière chez les deux sexes et d’envisager des stratégies appropriés pour une approche visant à développer des thérapies adaptées.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux recevront des injections quotidiennes (moins d’1 minute) en intra-péritonéal durant 5 jours à l’âge de 5-8 semaines sur le site 1 . Les animaux seront transférés du site 1 vers le site 2 selon la réglementation et avis du vétérinaire. Sur le site 2, les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale et analgésie (30 min ; n=96). Les animaux seront évalués au niveau comportemental pour déterminer les fonctions motrices et évaluer l’anxiété avant et après lésion de la moelle épinière. L’évaluation comportementale analysera l’activité motrice spontanée durant 8 minutes, la marche et la coordination des animaux durant 10 minutes et la force d’agrippement des animaux (2 minutes par animal par session). Les manipulations peuvent engendrer un stress léger. Les tests seront faits 7 jours et 24 heures avant la lésion, puis à J3, J5, J7, J10 et J14 postopératoire puis 1 fois par semaine jusque 6 semaines post-opératoires. Les comportements de type anxieux seront évalués par des tests qui évaluent la qualité du nid fait par un animal durant 24 heures, le temps de toilettage durant 5 minutes, et le temps que met l’animal à aller au contact de la nourriture durant 5 minutes. Ces tests seront effectués deux fois, au début et à la fin de la procédure. Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes post-mortem.
Impact sur les animaux
Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée. Les injections quotidiennes en intra-péritonéal peuvent induire un stress pour l’animal. Le transport et le changement de site peut induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion de la moelle épinière (hémisection). Une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré après une hémisection, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Suite à la chirurgie les animaux sont observés quant au développement de signes légers relatifs à la détérioration de l’état de santé de l’animal. 24-48hrs suivant la lésion, les animaux peuvent présenter des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de dominance peuvent être observés. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Devenir
A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques et cellulaires.
Remplacement
Pour éviter l'expérimentation animale, on encourage l'utilisation de cultures de cellules nerveuses. Cependant, ces cultures ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des organismes vivants. Les modèles animaux de traumatisme de la moelle épinière sont actuellement considérés comme la méthode la plus adaptée pour étudier cette pathologie, car ils reproduisent de manière fidèle les différents aspects pertinents chez l'humain. Ces modèles permettront d'explorer les changements provoqués par l'absence d’expression de 2 protéines du système nerveux de manière spécifique dans un type de cellule et faciliteront l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. L'utilisation d'animaux est nécessaire à cette étape préclinique et demeure cruciale pour envisager des applications cliniques.
Réduction
Les animaux sont utilisés pour plusieurs analyses, les deux sexes sont utilisés. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire. Nous avons également calculé le nombre d'animaux avec un logiciel de biostatistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant des effectifs pertinents pour répondre à notre hypothèse biologique. Ces animaux sont générés et aussi utilisés dans le cadre d’une autre demande de projet et nous utiliserons les animaux surnuméraires issus des croisements effectués sur le site 1. De plus, cela évitera de développer cette lignée en doublon dans l'animalerie du site 2.
Raffinement
Les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 2,7km). Puis période d’acclimatation pour les animaux d’une période de 7 jours sur le site d’accueil. Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants et d'analgésiques adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées. Afin de réduire la souffrance : soins quotidiens spécifiques. L'absence de signes anormaux sera vérifié 2 fois par jour après la lésion. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les lésions de la moelle épinière, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Ces 2 souches de souris génétiquement modifiées n’expriment pas une protéine du système nerveux central dans un type de cellules associé à la neuroinflammation. Cela en fait donc des modèles de choix pour déterminer les conséquences de l’absence de ces protéine après une lésion médullaire sur l’inflammation. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 6 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée non seulement plus importants mais surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique.