Système nerveux

La restriction alimentaire imposée aux rats ne doit pas leur faire perdre plus de 15 % de leur poids, seuil au-delà duquel le porteur rétablit l'accès à la nourriture. 1 920 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter dans la veine jugulaire posé en trente minutes, des injections intracérébrales et une fibre optique implantée en une heure et demie, et les femelles subissent un prélèvement vaginal quotidien pendant sept jours. Le projet cherche à savoir si la progestérone protège de la rechute à la cocaïne, un bénéfice thérapeutique pour l'humain que le porteur situe explicitement à long terme.

Objectifs

Les objectifs de ce protocole sont triples : - Premièrement, tester l’effet des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne - Deuxièmement, étudier comment l’activité des neurones d'une partie du cerveau, appelée insula, est modulée par les hormones sexuelles lors de la rechute à la cocaïne - Troisièmement, étudier si la manipulation de l’activité des neurones de cette partie du cerveau influence la rechute à la cocaïne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier le rôle des neurones d'une partie du cerveaux (insula) dans l’effet protecteur des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne chez les rats mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement basé sur les hormones sexuelles qui sont déjà des molécules pharmacologiques approuvées par l’ANSM (Agence Nationale de la Santé et du Médicament).

Procédures

Les animaux subiront deux types d’intervention chirurgicales, la pose d’un cathéter dans la veine jugulaire qui durera 30 minutes et des injections intracérébrales ainsi qu’une implantation de fibre optique (durée 1h30) quand nécessaire pour enregistrer d’activité des neurones. Enfin, chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi pendant 7 jours par un prélèvement vaginal (durée 10 secondes) quotidien. Les males seront manipulés de la même façon sans prélèvement pour éviter tous biais expérimentaux.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut engendrer des douleurs post-opératoires au niveau des sites d’incision, l’injection, ou d’implantation de matériel (crâne, cou, abdomen). La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors des premières sessions, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent un poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivité des animaux qui disparaît 1 heure après la fin de la prise de drogue. La littérature ne montre pas de stress lié à la prise de cocaïne et il n’y a pas de syndrome de sevrage (tremblement, perte de poids) dans les modèles animaux de prise de cocaïne. La restriction alimentaire engendre une perte de poids de l’animal qui sera contrôlée quotidiennement par l’expérimentateur. Cette restriction ne devrait pas engendrer plus de 15% de perte de poids par rapport au poids initial, si la perte de poids dépasse 15% alors l’animal aura accès immédiatement à la nourriture ad libitum et ne subira pas d’autre privation tant qu’ils n’auront pas repris leur poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous avons utilisé un logiciel statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure en prenant en compte la quantité de conditions expérimentales pour chacune d’elle. Nous utiliserons ainsi 1920 animaux sur cinq ans.

Raffinement

Hébergement en cages collectives pour limiter le stress de l’isolement. Réduction au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour raisons expérimentales (dérogation 4.5). Les cages seront enrichies en nid cotonné et bois. Avant chirurgie et après anesthésie, un antalgique sera administré en sous-cutané (s.c.) afin d’éviter la souffrance opératoire. Un anesthésiant local en crème sera appliqué (en plus de l’anesthésie à l’isoflurane) 10 min avant l’incision. La chirurgie sera effectuée en conditions stériles. Si infection, le vétérinaire mettra en place un traitement antibiotique approprié. Après chirurgie, l’expérimentateur suivra quotidiennement l’animal (alimentation, qualité du poil, locomotion) et le pèsera 4 jours jusqu’à stabilisation. Du baume cicatrisant sera appliqué sur les sites d’incision si mauvaise cicatrisation. Si douleur post-opératoire : Points limites, critères d’arrêt : Stade 1 : Normal. Si perte de poids jusqu’à 10% du poids initial une injection s.c. de saline sera réalisée et de la nourriture humidifiée sera au sol. Stade 2 : Perte de poids persistante 24h post chirurgie avec signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Injection s.c. d’antalgique et de saline et nourriture humidifiée au sol. Stade 3 : Perte de poids qui persiste 48h avec signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Injection s.c d’antalgique, de saline, et intrapéritonéale de glucose 5% et nourriture humidifiée au sol. Une seconde injection d’antalgique et de saline pourront être réalisées à 72h si pas d’amélioration. L’animal sera euthanasié si état prolongé au-delà de 72h sans amélioration. Stade 4 : Etat de l’animal ne pouvant être pris en charge par médication et engendrant de la souffrance, ou état non amélioré voire dégradé au-delà de 72h même avec prise en charge. Euthanasie immédiate par décapitation ou exsanguination si animal a réalisé des tests comportementaux nécessitant le prélèvement du cerveau pour analyses histologiques. Dans les deux, injection s.c. d’antalgique puis i.p. d’euthanasiant avant sacrifice. Afin que la restriction alimentaire impacte au minimum le bien-être, si perte de plus de 15% du poids initial (mesuré pendant 3j avant début de restriction), accès immédiat à la nourriture ad libitum sans privation tant que les rats n’auront pas repris leur poids initial. Le poids des animaux sera suivi durant les 5j d’acquisition.

Choix des espèces

Les rats sont un modèle largement utilisé pour l’étude des neurones impliquées dans les troubles de la consommation de drogues. L’administration de cocaïne est utilisée depuis de nombreuses années et largement décrit dans la littérature, et l’injection d’hormones sexuelles est une manipulation facile à conduire. De plus, les régions cérébrales d’intérêt de notre étude possèdent la même structure chez le rat que chez l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de travailler sur des neurones des aires cérébrales ciblées matures. Les procédures chirurgicales seront réalisées chez des animaux âgés de 10 semaines.

Pour amener sur le marché une association d'un antidépresseur et d'un activateur de transporteur du chlore contre les douleurs neuropathiques, 1 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un diabète de type 1 leur est provoqué par une injection de streptozotocine, avec l'hyperglycémie et ses conséquences, soif et miction excessives, faim permanente, et une mortalité de 10 % que le porteur intègre d'avance dans son calcul d'effectif. Suivent des gavages quotidiens pendant sept jours, une goutte de sang prélevée à la queue tous les trois jours, et des tests de sensibilité mécanique par filaments et de sensibilité thermique décrits comme produisant un stimulus douloureux. L'équipe indique avoir déjà validé cette combinaison chez la souris sur un autre modèle de douleur, par ligature du nerf sciatique, et attend de la nouvelle série qu'elle "pourrait apporter une vraie alternative" aux patients diabétiques.

Objectifs

Les douleurs neuropathiques sont secondaires à une atteinte du système nerveux (central ou périphérique), c’est‐à‐dire touchant le cerveau, la moelle épinière ou les nerfs. Le besoin médical est fort dans la prise en charge des douleurs neuropathiques. L’approche thérapeutique proposée se base principalement sur l’administration en première intention de certains antiépileptiques et de certains antidépresseurs. Néanmoins, ces traitements ne sont pas efficaces pour l’ensemble des patients, ainsi les patients atteints de neuropathie diabétique sont pour la plus grande majorité dans une impasse thérapeutique et voient leur qualité de vie considérablement altérée. Le projet vise donc à amener sur le marché un nouveau traitement pour soulager les douleurs neuropathiques pour lesquelles les traitements existants présentent une efficacité très modeste et occasionnent des effets secondaires importants. Cette combinaison médicamenteuse a déjà été validée par notre équipe de recherche chez le modèle neuropathique périphérique de souris qui consiste en une ligature du nerf sciatique. Il est basé sur l’association d’un antidepresseur particulier déjà utilisée chez le patient souffrant de douleur (inhibiteur sélectif permettant l'augmentation de l'effet de la sérotonine) avec une autre molécule favorisant le transport du chlore. Cette combinaison sera administrée par voie orale chez un modèle préclinique de neuropathie diabétique chez la souris.

Bénéfices attendus

Nous avons déjà montré chez la souris atteinte de douleur neuropathique périphérique que le traitement constitué de deux molécules: un antidépresseur et un activateur des transporteurs au chlore est efficace sur les symptômes de douleur évoqués ainsi que sur l’état de bien‐être général des souris. L'objectif de cette étude est que ce traitement pourrait apporter une vraie alternative aux thérapeutiques actuelles pour un effet synergique et de longue durée limitant le nombre de prise médicamenteuse sur les types de douleurs neuropathiques comme celles induites chez le patient diabétique.

Procédures

Pour l’étude aigue, les animaux recevront : -une seule injection intrapéritonéale d’un antibiotique afin d'induire un diabète (30s) sur animal vigile. -des prélèvements sanguins (petite incision au niveau de la queue) tous les 3 jours. - des tests de sensibilité mécanique et thermique avant la mise en place du modèle et 3, 6, 9, 12 et 15 jours après l'injection. Les animaux sont testés avec les différents filaments sur les 2 pattes arrières et le comportement dure environ 10 min. Une fois le seuil d’hypersensibilité (due à l’injection de STZ) atteint, les animaux sont testés 1h30, 24h et 48h après le gavage oral lors du protocole aigu. - un seul gavage afin de donner le traitement puis tests comportementaux 1h30, 24h et 48h après celui-ci. Pour l’étude chronique, les animaux recevront : - Injection intrapéritonéale de STZ : 1 seule injection, durée 30 sec, animal vigile - Comportement : tests de douleurs mecaniques et thermiques tous les 3 jours pendant 10 min par test jusqu'à obtention du modèle puis 1h30 après le gavage, tous les jours pendant 7 jours. - Gavage : 1 fois par jour pendant 7 jours consécutifs - Prélèvement sanguin : une goutte de sang prélevée au noveau de la queue de l’animal tous les 3 jours.

Impact sur les animaux

Le modèle de la souris rendue diabétique par la streptozocine reproduit un diabète de type 1 et les symptômes habituels de douleur évoquée. L'hyperglycémie sera accompagnée d’une polydipsie, d’une polyurie et d’une polyphagie. Les animaux seront gavés, il est donc important de bien surveiller les signes cliniques de l’animal suite à l’exécution du gavage (détresse respiratoire, reflux). La glycémie sera relevée quotidiennement en prélevant une goutte de sang au niveau de la queue de l'animal. Les différents tests utilisés sont des tests produisant un stilmulus douloureux, les animaux subiront donc des effets douloureux.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de l'expérimentation

Remplacement

Seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent aux questions scientifiques posées par notre étude. Le recours donc au modèle animal « souris » est indispensable pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et des mesures de la glycémie. De plus, si la perception de la douleur n’est plus remise en doute chez les organismes vertébrés, elle est sujet à débat chez les invertébrés, par exemple chez les insectes ou le nematode.

Réduction

Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique. Ainsi, un nombre d’animaux par traitement a été fixé (1) en se référant à des publications du domaine, (2) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d’intérêt et (3) en prenant en compte une mortalité possible de 10% due à l'injection de streptozotocine. Nous évaluons donc 14 souris par traitement et par sexe. La streptozotocine pouvant induire une mortalité de 10%, nous utilserons 15 souris par traitement et par sexe.

Raffinement

Les souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (3 à 5 souris par cage), cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment aux contentions et injections). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésie et analgésique permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent.

Choix des espèces

La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau neuronal a de fortes ressemblances avec celui de l'homme. De plus, l'utilisation de souris permettra d'analyser nos résultats en se basant sur les données de la littérature de façon plus pertinente. Les souris utilisées seront des souris adultes de 2 à 6 mois. Cet âge constitue une période de stabilité durant laquelle on considère que le développement est achevé et les effets liés au vieillissement est minimum.

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids sur plusieurs pesées consécutives sont mises à mort, tout comme celles qui développent un comportement stéréotypé. Ces points limites encadrent l'utilisation de 180 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, 70 par exsanguination pour des études sur tranches de cerveau et 110 pour prélever des synaptosomes sur tissu frais. Chaque animal subit une chirurgie d'environ une heure sous anesthésie, avec un risque de douleur aiguë pendant la récupération et une perte de poids attendue. Le projet porte sur le rôle d'une protéine dans les stades précoces de la maladie de Parkinson et de la démence à corps de Lewy, et le porteur écrit qu'il "pourrait" ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques, tout en affirmant qu'il n'existe "aucune alternative" à l'utilisation d'animaux.

Objectifs

La maladie de Parkinson et la démence à corps de Lewy sont des conditions neurodégénératives connues sous le nom de syncléinopathies. Ces maladies se caractérisent par une accumulation anormale d'une protéine appelée alpha-synucléiine dans le cerveau. Ce projet vise à explorer les stades précoces de ces maladies afin de trouver de nouvelles cibles de traitement et d'améliorer la compréhension de leur progression. Les syncléinopathies se développent lentement, commençant par des stades subtils, presque sans symptômes. Pendant cette période, des changements significatifs se produisent à des niveaux cellulaire et moléculaire. L'alpha-synucléiine, principalement trouvée au niveau de la présynapse (une partie des cellules nerveuses), est suspectée de jouer un rôle dans la préparation des vésicules synaptiques pour la libération de neurotransmetteurs, bien que sa fonction exacte demeure floue. La perte de synapses (connexions entre les cellules nerveuses) et le dysfonctionnement synaptique sont des signes précoces de ces maladies. Ce projet se concentrera sur ces changements précoces, car ils sont étroitement liés aux problèmes de mémoire et au déclin cognitif.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle de l'eEF1A aux stades précoces des syncléinopathies a un potentiel important pour de nombreux patients souffrant de la maladie de Parkinson, entre autres. eEF1A (Facteur d'Élongation 1A des eucaryotes) est une protéine essentielle impliquée dans la synthèse des protéines (traduction) dans les cellules. Elle fait partie des mécanismes qui permettent aux ribosomes, les usines de fabrication de protéines des cellules, de transformer les informations génétiques en protéines.En 2018, on estimait à 9,1 millions le nombre de personnes de plus de 60 ans vivant avec une démence dans les États membres de l'UE, contre 5,9 millions en 2000. Environ 10 millions de personnes dans le monde (dont 1,2 million en Europe) souffrent de la maladie de Parkinson, et ce chiffre devrait atteindre 13 millions d'ici 2040. Ce projet pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes précoces causant la maladie et ouvrir de nouvelles voies pour des approches thérapeutiques innovantes. Les syncléinopathies représentent un fardeau important pour les systèmes sociaux. L'identification de voies clés impliquées dans les premiers stades de la pathologie conduira indirectement au développement de soins appropriés, ce qui allégera une partie de la charge pesant sur nos systèmes sociaux.

Procédures

180 animaux vont subir ce dispositif chirurgical: il faut procéder à une chirurgie sur animal anesthésié qui dure environ 1h avec utilisation d'antalgique. 70 seront prélevés après exsanguination pour les études sur tranches et 110 seront prélevés après euthanasie pour les études des synaptosomes sur tissus frais

Impact sur les animaux

1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie (pris en charge avec des analgésiques), 2/ un risque de perte de poids lié à la récupération post-chirurgie (pris en charge par une nourriture enrichie et gel hydrique)

Devenir

Euthanasie pour des etudes moleculaires et histologiques

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement.Il n’y a donc aucunealternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux et leurs interactions sont modifiées dans ces préparations.

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par une approche statistique.

Raffinement

A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux naîtront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter leurs points limites (week-ends, vacances et jours fériés inclus) : poids (pesés quotidienne), si plusieurs pertes de poids consécutives, avec une perte >20% par rapport à la pesée de référence à raison d’une pesée par jour, les animaux seront sacrifiés. Si l’animal présente un comportement stéréotypé ou à des comportements anormaux (Agressivité, cachexie, stéréotypie, prostration) il sera dans un premier temps isolé et surveillé. En premier lieu ajout d’enrichissement adapté comme une roue d’activité et des bâtons et en deuxième lieu l’animal est sacrifié si pas d’amélioration après 48h. Les animaux seront sacrifiés, dès les premiers signes neurologiques détectés (tremblements, problème de mobilité)

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 à 12 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.

Une craniotomie de deux heures permet d'injecter un virus dans le cerveau puis d'y implanter une puce et une fibre optique, après une biopsie de la queue le jour de la naissance. 2 158 souris vont être utilisées, toutes tuées sous anesthésie profonde pour que leur cerveau soit analysé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte des mutations censées reproduire le retard mental, l'autisme ou la schizophrénie, une autre est exposée au THC ou au CBD avant la naissance ou juste après, l'objet étant de suivre l'activité de leurs réseaux de neurones pendant qu'elles se comportent, fibre au crâne. Le porteur annonce des tests des fonctions sociales, cognitives et émotionnelles répartis sur dix jours, dont il donne les durées à la minute sans nommer un seul de ces tests, et décrit les démangeaisons provoquées par les sutures du crâne comme un effet indésirable attendu.

Objectifs

Notre projet concerne l’étude des changements de l'organisation fonctionnelle des réseaux neuronaux dans des modèles murins de maladies neuropsychiatriques (retard mental, autisme et schizophrénie) et l’élucidation des mécanismes cellulaires de plasticité sous-jacents à cette réorganisation. La compréhension de ces mécanismes et de leur impact sur les comportements implique l'utilisation de modèles murins mutants qui reproduisent les altérations observées chez les patients souffrant de ces maladies et des modèles d’exposition in utéro ou néonatale aux cannabinoïdes qui sont les substances illicites (THC) ou légales (CBD) les plus utilisées par les femmes enceintes. Le projet incorporera l’utilisation d’animaux des deux sexes étant donné l’existence de différences sexuelles en ce qui concerne la vulnérabilité et la prévalence des troubles neuropsychiatriques et l’utilisation de cannabinoïdes à différentes périodes de la vie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'apporter une preuve de concept de l'importance des facteurs génétiques et environnementaux dans l’émergence des maladies neuropsychiatriques. Il permettra de comprendre les mécanismes par lesquels les déficiences génétiques et les atteintes environnementales interagissent avec le sexe pour provoquer des changements durables et persistants de l’activité des réseaux neuronaux et du comportement. Les résultats issus de ce projet auront donc un fort impact en science fondamentale et dans le monde académique. Son caractère multidisciplinaire permettra des avancées significatives dans la compréhension de la santé mentale. A plus long terme, il serait envisageable de mener des études translationnelles pour relier les résultats des modèles animaux aux populations humaines.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront amenés à subir plusieurs types d'intervention : a) une biopsie caudale (quelques secondes), b) une chirurgie d'injection de virus et d’implantation (2 heures), c) des tests de leur comportement afin d'analyser leurs fonctions sociale, cognitives et émotionnelles (à 4 âges différents selon la série suivante : Jour 1 à 3 : jour et nuit, Jour 6 : 20min, Jour 7 : 5 min, Jour 8 et 9 : 15 et 10 min, Jour 10 : 8 min). A la dernière étape du protocole expérimental, le cerveau sera prélevé post-mortem après une chirurgie terminale sous anesthésie pour analyser l’expression de différentes protéines dans les tissus.

Impact sur les animaux

Dans le cas d’animaux subissant l’ensemble d’une procédure, l’ensemble des nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être résumés selon les points suivants : - douleur légère de courte durée générée par la biopsie caudale - les douleurs post-opératoires lors du réveil post-chirurgical (craniotomie, implantation de la puce et de la fibre). Ces douleurs sont minorées par les soins post-opératoires et l’administration d’antalgiques. - le risque infectieux lié à l’intervention chirurgicale demeure extrêmement faible, car les chirurgies sont réalisées dans le strict respect des règles d’asepsie. - les démangeaisons pouvant être provoquées par les sutures de la peau du crâne - l’inconfort des animaux reliées à la fibre pendant le comportement.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels des défauts génétiques et les atteintes environnementales interagissent avec le sexe pour provoquer des changements durables et persistants dans l’activité des réseaux neuronaux et leur impact sur les comportements sociaux. Par conséquent, l'utilisation de modèles in vitro n'est pas applicable pour ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés : - un même animal sera utilisé plusieurs fois pour différents tests au sein d’une même procédure et de façon longitudinale lorsque cela est possible. - nous déterminerons le nombre minimal d'animaux nécessaires pour atteindre une puissance statistique satisfaisante en utilisant préférentiellement les tests permettant de comparer deux groupes non-pairés ou plusieurs groupes de facteurs. - nous raffinerons nos pratiques d’élevage afin d’obtenir uniquement les génotypes d’intérêt. Il est essentiel de souligner que tous les animaux générés seront d’intérêt pour le projet, génotypes et sexes, et seront donc tous inclus dans les expériences.

Raffinement

Nous utilisons plusieurs stratégies de raffinement à différentes étapes des procédures. Stabulation : Dans les cages d’hébergement, les souris bénéficient d’enrichissement pour diminuer l’ennui, l’anxiété et favoriser le bien être : dômes cartonnés, ou tunnels en carton et/ mini-rouleaux de papier foisonnant. Outre l’enrichissement de l’environnement, cela permet de favoriser la nidification, de réduire l‘ennui, et d’augmenter le sentiment de sécurité. Suivant l’âge des animaux, la surface impartie dans la cage sera adaptée. Chirurgie : Chaque intervention invasive est effectuée sous analgésie et anesthésie. Lors de la chirurgie, les canules sont descendues et remontées très doucement pour réduire le traumatisme tissulaire. Les constantes biologiques et souffrance des animaux sont particulièrement surveillées dans les heures et jours suivant les interventions invasives afin de leur donner les soins post-opératoires nécessaires. Le personnel a reçu toutes les habilitations nécessaires, notamment pour améliorer le bien-être des animaux (manipulation, enrichissement), reconnaitre les signes éventuels d'inconfort ou de souffrance, et pratiquer les gestes adaptés en fonction de la situation (administration d’analgésiques, d’antalgiques ou euthanasie si l’animal n’est pas soulagé par les médications). Tests comportementaux : pour limiter le stress, les souris sont familiarisées avec la salle d'expérimentation, et sont manipulées par le même expérimentateur. La température de la salle d'expérimentation et de la chambre d’enregistrement sont maintenues constantes. Pendant l’enregistrement du comportement dans l’arène LMT, les souris ont eau et nourriture ad libitum. Les souris bénéficient d’enrichissement comprenant deux maisons et un tunnel en polycarbonate et de plusieurs cylindres de coton pour stimuler l’activité naturelle et diminuer l’ennui et le stress et faciliter la thermorégulation de l’animal et favoriser son bien-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent pour nos études car il présente une organisation des réseaux cérébraux et des réponses comportementales similaires à celles trouvés chez l’Humain. La souris est un modèle couramment utilisé en neurosciences, ce qui rend nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Il existe également de très nombreux modèles de souris génétiquement modifiés qui reproduisent de manière très fidèle les pathologies neuropsychiatriques humaines. Une partie de nos expériences impose l’utilisation de souris modélisant le retard mental, l’autisme et de la schizophrénie. L’aspect neurodéveloppemental de notre projet, centré sur l’étude de l’activité des réseaux neuronaux et des comportements tout au long de la vie, nécessite l’utilisation de souris à différents stades postnataux : du stade périnatal jusqu’au stade adulte, ainsi que des animaux âgés.

Le ventre de souris gestantes est ouvert sous anesthésie pour injecter un gène humain dans le cerveau de leurs fœtus, suivi d'une électroporation de moins de quinze minutes. 910 souris vont être utilisées, mères, fœtus et nouveau-nés confondus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par une chirurgie terminale destinée à prélever le cerveau. L'objet est de savoir si treize gènes propres à l'espèce humaine modifient la forme et les connexions des neurones du cervelet, un protocole d'organoïdes cérébelleux humains existant depuis cette année mais restant, selon le porteur, à optimiser. Chez les mères, il décrit des douleurs après l'opération, une infection possible de la plaie et une rupture des points de suture qui constituerait un point limite, chez les fœtus une rare interruption de gestation, et chez les souriceaux une simple "gêne légère et momentanée".

Objectifs

L’espèce humaine présente des caractéristiques cognitives supérieures qui ont été en partie liées à l’évolution du cortex cérébral. Mais l’implication des autres régions du cerveau, comme le cervelet, reste largement inexplorée malgré son association avec les fonctions cognitives supérieures (comme le langage) et les troubles cognitifs (comme l’autisme et la dyslexie). De plus, le cervelet humain présente des caractéristiques divergentes par rapport à d’autres espèces, aux niveaux anatomique, fonctionnel et comportemental, dont les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents sont inconnus. Les mécanismes moléculaires qui participent à l’évolution des neurones et circuits neuronaux reposent en partie sur des gènes dupliqués spécifiquement humains (absents des génomes d’autres espèces) ou des gènes spécifiquement exprimés chez l’humain (expression absente chez les autres espèces). Le rôle de cette étude est d’étudier l’effet de ces innovations moléculaires sur le développement des neurones et circuits du cervelet. Nous avons une liste de 13 gènes candidats basés sur des données publiques d'expression de gènes au cours du développement dans le cervelet humain et non chez la souris et l’opossum. Pour étudier un effet fonctionnel de ces gènes, nous devons faire des expériences de gain-de-fonction dans un cervelet de Mammifère, c'est-à-dire exprimer artificiellement un gène humain pour mimer son action . Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous phylogénétiquement (=dans l'arbre des espèces animales). De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les objectifs de cette études sont : 1) d’étudier, parmi les gènes d’intérêts, lesquels sont suffisants chez la souris pour altérer la morphologie des neurones du cervelet, leur connectivité neuronale ainsi que sur la vitesse de maturation des neurones, 2) d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents pour les 3 gènes candidats dont l’effet sera le plus flagrant.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les effets de gènes spécifiquement humains dans le développement du cervelet de Mammifère. Cela permettra d’ouvrir un nouveau champ de l’évolution du système nerveux humain, en dehors du cortex cérébral. A plus long terme, les résultats pourraient mettre en évidence une sensibilité propre à notre espèce à certains troubles cognitifs (spectre autistique), moteurs (ataxie cérébelleuse) ou encore la dyslexie. Ils pourraient aussi ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques pour ces troubles.

Procédures

Procédure 1: laparotomie sous anesthésie générale de la mère suivie d'injection ventriculaire cérébrale sur foetus suivie d'une électroporation (

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sur les animaux sont : - chez la mère : de rares problèmes post-opératoires comme des douleurs (associées à une perte de poids ou un état de prostration), l’infection de la plaie, ou une rupture des points de suture, qui constituraient un point limite. - chez le fœtus : une rare interruption de la gestation. - chez le souriceau : une gène légère et momentanée au point d'injection.

Devenir

Tous les animaux seront utilisés pour les procédures décrites.

Remplacement

Une première alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait l’utilisation d’une autre espèce de Vertébré tel que le poisson zèbre, qui possède également un cervelet. Cependant l’organisation et le développement du cervelet chez les Vertébrés non-Mammifères sont trop divergentes comparé aux Mammifères pour pouvoir interpréter nos expériences de gain de fonction. Une autre option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait la culture in vitro de cellules souches de souris ou humaines, suivie d’une différentiation en organoïde cérébelleux. C’est une approche qui va être établie en parallèle dans notre laboratoire, pour laquelle un protocole existe depuis cette année pour les cellules humaines mais qui reste à être optimisé. En effet, ce type de culture ne permet pas à ce jour de récapituler l’ensemble des aspects anatomiques observés dans un cervelet in vivo (connectivité neuronale). De plus, ces approches ne permettent pas d’étudier des réseaux neuronaux dans un cervelet qui est intégré à un organisme in vivo, avec des stimulations sensorielles et un contrôle moteur, qui sont clefs dans la maturation neuronale cérébelleuse. De plus, ces approches in vitro manquent d'une composante critique que sont les fibres grimpantes qui proviennent d’une autre région du tronc cérébral, l’olive inférieure.

Réduction

Ce projet nécessitera au maximum 910 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. Dans nos différentes approches, nous voulons connaître l'effets de gènes humains sur le développement des neurones. Nous commencerons pour chaque gène candidat par 2 portées. Pour les gènes montrant des résultats flagrant, nous reproduirons nos résultats pour les confirmer et les consolider statistiquement. Cette approche permet de ne pas utiliser le nombre maximal de portées pour les gènes sans effet sur le développement neuronal (résultat négatif). Pour diminuer le nombre d'animaux, nous epxrimerons à chaque fois le gène di'intérêt dans la moitié des animaux de la portée, et une condition contrôle dans l'autre moitié. Ainsi, le nombre d’animaux a été estimé au plus juste de façon à répondre aux exigences pratiques et statistiques. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, avec un nombre maximal de 5 individus par cage, dans un environnement enrichi. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages quotidien. Soins spécifiques apportés à la mère gestante pendant la chirurgie : stéréllisation du champ opératoire, analgésie sous-cutanée et anesthésie locale avant l’opération suivies par une anesthésie par inhalation. Des analgésiques sont administrés en sous-cutané les jours qui suivent l'opération et la mère gestante est hébergée seule dans une cage enrichie jusqu'à la mise bas. La température des animaux est gardée constante grâce à un tapis chauffant jusqu’au réveil. La mère gestante ne retourne sur son portoir qu’une fois réveillé. Un suivi post-opératoire rapproché est effectué pendant les premières heures suivant l'opération puis le lendemain. Soins spécifiques apportés aux souriceaux pendant leur injection : le souriceau est anesthésié. puis est réchauffé avant de retrouver sa mère. Précautions pour l'injection intraventriculaire du foetus ou souriceau : une micropipette ultra mince est utilisée pour l’injection. Chaque procédure se termine par une chirurgie terminale sous anesthésie en vue du prélèvement du cerveau.

Choix des espèces

Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous phylogénétiquement. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les animaux seront utilisés au stade embryonnaire et aux stades postnatals, aux étapes critiques du développement des neurones et des circuits.