Système nerveux

336 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement histologique. Chacune reçoit un implant posé au cours d'une chirurgie d'une heure, la moitié recevant en plus une injection de virus directement dans le cerveau, avant d'être maintenue la tête fixée pendant trois heures d'anesthésie. Les tests de mémoire durent environ une heure et encadrent l'anesthésie, deux jours avant et jusqu'à trois jours après, l'objectif étant de relier les tracés d'électroencéphalogramme aux activités neuronales profondes du cortex et du thalamus pour mieux piloter l'anesthésie humaine. Le porteur reconnaît que certains aspects de la mémoire spatiale peuvent être altérés, et écrit ignorer ces troubles dont la caractérisation est justement l'objet du projet. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des dynamiques cérébrales et de leurs conséquences comportementales ne peut se faire que sur des animaux.

Objectifs

Chez l’humain, l’électroencéphalogramme (EEG) est actuellement le meilleur moyen utilisé pour suivre et piloter l’état de l’anesthésie des patients qui subissent une chirurgie ou une endoscopie en milieu hospitalier et pour lesquels une grande variabilité de réponse à l'anesthésie existe selon l'âge, le sexe et la condition physique. La lecture des marqueurs EEG pour le pilotage peut être ambigüe si une grille de lecture des marqueurs EEG n'est pas associée, pouvant conduire ainsi à un surdosage ou sousdosage. De plus, il est parfois difficile de prévenir sans les identifier certains des marqueurs EEG associés à des troubles cognitifs post-opératoires et de comprendre d'où ces troubles peuvent venir. Pour surmonter ces inconvénients de l'anesthésie clinique et comprendre les changements de plasticité cérébrale à l'origine des troubles cognitifs, ce projet vise à caractériser les activités neuronales sous-jacentes des marqueurs EEG au cours des différentes phases de l’anesthésie générale : induction, maintenance et réveil et mesurer si une plasticité s'opère pendant ces états anesthésiés selon la profondeur de ceux-ci. Cette caractérisation indiquera quelles structures sont impliquées dans les marqueurs EEG et expliquera les transitions entres les états cérébraux de l'anesthésie. Ces transitions pourront ainsi être mieux prédites et maitrisées par le dosage de l'anesthésique en amont de l'avènement des états non souhaitables de l'anesthésie. Le projet s'effectuera chez la souris afin d'enregsitrer les neurones de structures profondes du cortex et du thalamus notamment impliqués dans les marqueurs EEG les plus caractéristiques. En tant que mammifère la souris a essentiellement la même structure cérébrale ainsi que la même architecture temporelle de l'EEG que l'humain en réponse à l'anesthésie. L’enregistrement de l’activité des neurones en même temps que l’EEG visera à mieux comprendre le caractère prédictif de certains états sur le comportement et la plasticité et de prévoir des troubles cognitifs post-anesthésie. L'utilisation d'animaux transgéniques dans ce projet permettra d'induire des stimulations optogénétiques qui sont essentielles pour mesurer les changements de force de la connectivité dans le réseau et donc la plasticité induite par l'anesthésie. L’application médicale du projet est de prévenir de façon personnalisée les causes des troubles cognitifs observés chez certains patients subissant une anesthésie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux de l’anesthésie et d’altération de la mémoire par celle-ci. Nous nous intéresserons en particulier au réseau thalamo-cortical et à l’hippocampe, des structures qui chez l’homme jouent un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée lors de troubles post-anesthétiques réalisés en conditions hospitalière. À ce titre, l'amélioration des méthodes du pilotage de l'anesthésie a déjà été entamée dans le cadre de la collaboration (hôpital-entreprise-laboratoire) financée par ce projet. Le projet permettra d'encore mieux prédire les états non désirables de l’anesthésie mais aussi de remédier aux troubles cognitifs induits par celle-ci. Le projet aura des bénéfices pour la recherche médicale, pour les connaissances sur la plasticité cérébrale et des conséquences de l’anesthésie chez les personnes fragiles notamment ayant des dégénérescences cérébrales.

Procédures

Ce projet utilisera 336 souris. Les animaux seront implantés (durée d'intervention : 1h) au préalable de toute tâche comportementale ou enregistrement afin de pouvoir enregistrer leur activité cérébrale (EEG et neuronale) au cours du processus d’anesthésie. La moitié sera aussi préalablement injectée d’un virus de façon intracérébrale, de façon à pouvoir stimuler certaines populations neuronales. Pendant l’anesthésie (durée totale prévue 3h) les souris seront maintenues en tête fixée ce qui est un protocole classique pour l’étude électrophysiologique en conditions vigile et anesthésiée. Des tests comportementaux (durée de test environ 1 heure) où la souris doit explorer son environnement motivée ou non par l'obtention d'une récompense, permettront de mesurer ses capacités de mémoire (à court terme et long terme, un test de chaque type) avant et après la phase anesthésiée. Ces tests durent une heure environ de 2 jours avant l'anesthésie et jusqu'à 3 jours après l'anesthésie.

Impact sur les animaux

Certains animaux, qui subissent une chirurgie longue (pour la pose de l'implant), peuvent souffrir d'effets indésirables comme l'hypothermie, la déshydratation et les douleurs post-opératoires. De plus les anesthésies longues et trop profondes sont le sujet de notre étude pour savoir si l'anesthésie peut avoir un impact sur les performances cognitives à long terme. Il est donc possible que comme indiqué chez l'humain que certains aspects de mémoire spatiale soient altérés. Cependant nous ignorons ces troubles et le but est de les caractériser.

Devenir

À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique.

Remplacement

Certains mécanismes cellulaires et moléculaires de l'anesthésie peuvent être abordés in vitro. Certaines propriétés computationnelles de réseaux de neurones peuvent être testées sous forme de simulation numérique. Mais in fine, l’étude des dynamiques cérébrales au cours de l’anesthésie et ses conséquences comportementales nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire. Elle ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel. Une partie des mécanismes de plasticité sera testé in vitro dans un projet séparé afin d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents des observations de plasticité observés in vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer >100 neurones simultanément ou sur plusieurs sites au travers du cortex, l’hippocampe et le thalamus, ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal. Les études utilisant ce type d’approches permettent de publier avec des résultats statistiquement significatifs une vingtaine d’animaux. Nous utiliserons les mêmes animaux pour tester les performances cognitives (test de mémoire spécifique) et les expériences de mesures de plasticité afin de diminuer le nombre d’animaux.

Raffinement

Après les chirurgies, les souris seront surveillées et les points limites évalués quotidiennement pendant une semaine afin de déceler des signes de douleur sur la base de la grille d'évaluation de la douleur validée pour éviter toute souffrance des animaux. Les soins post-opératoires incluront des traitements antibiotiques, analgésiques, ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Nos expériences s'effectueront sur des animaux soit anesthésiés pour les besoins de l’expérience, soit vigiles, en tête fixée afin d’optimiser les conditions d’enregistrement des transitions entre l’état d’éveil et l’état éveillé. Ils peuvent s’alimenter et se nettoyer librement la face avec leurs pattes. L'ajustement des électrodes est indolore et ne nécessite pas d’opération particulière lorsque l’animal est tête fixée. Les animaux peuvent être hébergés par deux afin de favoriser les échanges sociaux.

Choix des espèces

Le rongeur est l’espèce standard pour toutes les études des bases neurophysiologiques de la mémoire. Ce sont les modèles pour lesquels les outils expérimentaux sont les plus développés. De plus les souris sont faciles à habituer dans un système de contention nécessaire pour le protocole expérimental utilisé. Nous utiliserons des adultes (à partir de 3 mois jusqu'à 14 mois) de façon à mesurer si les effets de l’anesthétique sont semblables selon l'age. En effet chez l’humain la sensibilité est plus élevée chez les patiens agés. Sur chaque groupe de 12 animaux, 3 tranches d'âge seront sélectionnés : 3 à 6 mois, 7 à 12 mois et 13 à 15 mois afin de mesurer et corréler l'effet de l'âge avec les effets de l'anesthésie.

Un accident vasculaire cérébral provoqué par une chirurgie de 45 minutes, puis jusqu'à quinze jours de test de mémoire quotidien sous restriction alimentaire et en cage individuelle : 340 souris passent par là, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont pesées chaque jour pour ajuster leur ration, l'appât alimentaire servant à les faire circuler dans un dispositif dont le RNT ne donne pas le nom. Le porteur écrit pourtant que la méthode retenue ne s'accompagne pas de symptômes majeurs et qu'elle limite la souffrance animale, moins de 3 % des souris ayant montré des signes de souffrance dans ses études précédentes. Toutes sont tuées par perfusion intracardiaque sous anesthésie, pour des analyses post-mortem du cerveau.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont une cause majeure de déficits moteurs à long-terme et de déficits cognitifs. Certains symptômes se manifestent tardivement et ne sont pas forcément liés à la région initialement lésée, suggérant qu’un AVC dans une région spécifique peut aussi causer des modifications dans d’autres régions du cerveau. Des altérations dans des régions directement connectées à la zone lésée ont déjà été corrélées à l’apparition de troubles tardifs. Cependant, les régions associées aux fonctions impactées (les fonctions de mémoire par exemple) ne sont pas toujours directement connectées à la région lésée. Une bonne compréhension des mécanismes qui sous-tendent les troubles de mémoire se manifestant tardivement après l’AVC est donc nécessaire pour le développement de stratégies permettant d’éviter leur survenue. Nous émettons donc l’hypothèse que des modifications pourraient donc ne pas se restreindre aux régions connectées à la zone lésée primaire mais s’étendre spatialement et temporellement dans le cerveau. Dans cette étude, nous voulons induire un AVC limité à une région précise du cerveau d’un modèle de souris afin d’étudier l’impact de la lésion dans d’autres régions cérébrales associées aux toubles de mémoires et pas directement connectées à la zone lésée. Grâce à ce modèle, nous étudierons les déficits de mémoire ainsi que leurs décours temporel. De plus, si notre hypothèse est confirmée, nous pourrons corréler ces éventuels troubles aux mécanismes étudiés dans des zones non-connectées qui pourraient sous-tendre leur apparition.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider notre modèle animal d’AVC pour l’étude des mécanismes sous-tendant les troubles de mémoire qui se manifestent tardivement après un AVC, même quand la région initialement lésée n’est pas impliquée dans la mémoire. Nous émettons l’hypothèse que l’altération de mécanismes cellulaires associés à la mémoire pourrait être présente dans des régions non directement connectées à la zone lésée. Si notre hypothèse est confirmée, le modèle pourrait être utilisé pour comprendre les mécanismes sous-jacents les troubles de mémoire qui apparaissent tardivement après l’AVC. Cette compréhension pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique, et mettre en lumière, à terme, de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir certains troubles cognitifs après un AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie peu invasive pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes). Un test comportemental sera ensuite réalisé. Pendant la phase d’habituation (2 jours), le test dure entre 2 et 10 minutes et il est répété jusqu’à 3 fois par jour. Ensuite, la durée moyenne du test est de 20-30 minutes (répété une fois par jour jusqu’à stabilisation de la courbe d’apprentissage, jusqu’à un maximum de 15 jours). Enfin, ils seront soumis à une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale (20 minutes). Tous les animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

La méthode utilisée induit un infarctus cortical limité et ne s’accompagne typiquement pas des symptômes majeurs, rendant le modèle facilement utilisable tout en limitant la souffrance animale. Cependant, suite à l’induction de l’AVC, une perte de poids pourrait être observée. Un effet de stress pendant le test comportemental et pendant l’hébergement entre les répétitions de tests pourrait survenir.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort et des analyses complémentaires post-mortem seront effectuées.

Remplacement

Il n’existe pas encore, à ce jour, de modèle alternatif (cultures cellulaires, organoïde) à l’induction d’AVC chez la souris suffisant pour reproduire les mécanismes complexes présents dans la pathologie humaine, impliquant notamment des structures sophistiquées comme la vascularisation cérébrale. La méthode que nous utilisons est cependant la méthode actuelle connue la moins invasive, permettant l’induction controlée et reproductible d’un AVC limité à une zone d’intérêt. Il n’existe pas non plus actuellement de méthode alternative permettant de remplacer les animaux dans les expériences de comportement, impliquant l’intéraction complexe de différentes structures et systèmes cérébraux

Réduction

Le nombre de souris a été évalué sur la base de travaux précédents, en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (au cours de la chirurgie, pendant les tests de mémoire). Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux. Le test comportemental choisi peut être répété sans altérer les résultats. Cela permet une étude longitudinale, et donc une réduction des animaux. Deux tailles de lésions d’AVC seront testées en même temps pour réduire le nombre d’animaux contrôles (n’ayant pas subi d’AVC) pour chaque lot d’animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour comparer les résultats des expériences.

Raffinement

Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la durée du projet. Les animaux sont dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être et observés quotidiennement. Jusqu’à l’expérience de comportement, ils seront placés dans des cages collectives avec un enrichment renforcé par l’ajout d’un tube en carton, au nombre de 4-5 par cage. L’accès à la nourriture et à l’eau est sans restriction et un changement de litière est effectué chaque semaine. Dans des études précédentes, le nombre d’animaux qui ont montré des signes de souffrance dû à l’induction de l’AVC était très limité (moins de 3%). Le test comportemental nécessite une légère restriction alimentaire afin de motiver les animaux à se diriger vers la récompense alimentaire, qui seront donc hébergés individuellement avant le début du test, afin de stabiliser progressivement leurs poids. Pour cela les animaux sont pesés quotidiennement et la quantité quotidienne de nourriture est adaptée. En cas de perte plus importante, la ration alimentaire est augmentée, et si nécessaire de la nourriture en poudre est ajoutée. Les cages sont collées les unes aux autres pour augmenter les intéractions sociales. Dans les deux protocoles, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable.

Choix des espèces

Le modèle envisagé a déjà été induit chez la souris. Sa reproductibilité et le fait de pouvoir induire l'AVC dans une zone confinée du cerveau en font le modèle d’AVC le plus adapté à ce jour selon la littérature pour tester notre hypothèse. Des phénomènes de déconnexion de zones avec des connexions directes à la zone de l’AVC ont déjà été établis dans ce modèle, ainsi que des modifications de l’activité neuronale dans des zones éloignées et sans connexions directes. Ce modèle nous permettra de réaliser des tests comportementaux afin de mettre en évidence des troubles de mémoire après l’AVC. L’âge des souris a été choisi pour étudier les conséquences d’un AVC sur une tâche de mémoire chez un animal adulte.

Un implant crânien posé au cours d'une chirurgie de quatre à six heures, puis une cinquantaine de séances d'enregistrement de trois heures en moyenne, trois à cinq fois par semaine, sur un animal éveillé et maintenu en contention : c'est ce que subissent 60 furets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour les motiver, le porteur les place en contrôle hydrique du dimanche après-midi au vendredi, soit 120 heures par semaine, avec une pause de dix jours tous les deux mois. L'objet déclaré est l'étude de la perception auditive et visuelle active, avec une retombée annoncée sur la conception des prothèses auditives. L'implant est retiré au terme d'une seconde chirurgie de trois heures pour permettre une réhabilitation, sans que le RNT nomme les organismes chargés de les accueillir ni ne précise en quoi consiste la tâche comportementale imposée.

Objectifs

Percevoir dans des situations réalistes est un processus actif qui mobilise les facultés perceptives et cognitives, conférant aux stimuli du sens et de la pertinence. Grâce à l'écoute et à la vision, les humains et les autres animaux naviguent à travers des scènes sensorielles complexes, séparent des sources mélangées, désambiguïsent des messages et évaluent leur pertinence comportementale. Ces prouesses remarquables sont actuellement au-delà de notre compréhension et dépassent de loin les capacités des systèmes d'ingénierie audio et vidéo les plus sophistiqués. L'objectif du projet est d'étudier expérimentalement la perception auditive et visuelle dans une situation active les processus sensoriels adaptatifs et cognitifs interagissent. Notre objectif est d'intégrer la fonction cognitive comme faisant partie intégrante du traitement sensoriel, ce qui se prête à une investigation neurophysiologique. Plus précisément, nous allons explorer le postulat que la perception active est médiée par un processus d'adaptation rapide au niveau du neurone mais aussi des populations de neurones dans leur ensemble ; ce phénomène est ici appelé plasticité rapide.

Bénéfices attendus

Le projet s'appuie sur les travaux du chercheur en charge du protocole réalisés lors de la dernière décennie sur la neurophysiologie du codage des sons dans le cerveau et la modélisation de ces phénomènes. En nous appuyant sur des techniques de pointe (électrophysiologie et neuroimagerie) et plusieurs innovations méthodologiques (reconstruction de stimulus à partir d'enregistrements de neurones à grande échelle chez les animaux réalisant une tâche de comportement, décodage de l'activité corticale), nous visons à une meilleure compréhension du codage de la nature et de la localisation des sons par le cerveau, ainsi que de l’influence de l’attention sur ce codage. Ce projet permettra de caractériser de manière plus fine les mécanismes neuronaux impliqués dans la perception auditive et l'attention. À terme, ces connaissances contribueront à l'amélioration de la conception des prothèses auditives pour les populations malentendantes, en surmontant certaines des limitations conceptuelles actuelles dans le traitement du signal auditif.

Procédures

POSE D’IMPLANT. Tous les animaux sont équipés d'un implant crânien lors d'une première chirurgie qui se fait sous anesthésie et analgésie (durée 4-6h). Cet implant permet ensuite de réaliser des enregistrements neuraux en électrophysiologie ou en neuroimagerie fonctionnelle par ultrasons (procédures répétées autour d'une cinquantaine de fois en moyenne chez animal vigile, entre 3 et 5 fois par semaine, durée moyenne d'enregistrement 3h). A la fin de la période d’enregistrement, l'implant crânien sera retiré lors d'une chirurgie sous anesthésie et analgésie (durée 3h) pour permettre une réhabilitation après un temps de récupération adapté. SUIVI POST-OPÉRATOIRE. Lors du suivi postopératoire, l'animal est en hébergement individuel maximum 48h en infirmerie (cage d’hébergement séparé qui permet de maintenir le contact visuel, olfactif et auditif avec les autres animaux, le personnel et la routine de l’animalerie) afin de s’assurer que d’autres furets ne s’accaparent les aliments mous mis à disposition ainsi que pour pouvoir observer si la prise de nourriture est faite. ENTRAÎNEMENT SOUS CONDITIONNEMENT APPÉTITIF. Les furets en entraînement sont placés en contrôle hydrique à partir de dimanche après-midi après pesée jusqu’au vendredi (120h, soit 5j soit 0.7 semaine). Une pause de 10 jours est ménagée tous les 2 mois.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale induit une présence de douleur post-opératoire sur les 2-3 jours post-op. Le suivi postopératoire entraîne un hébergement en isolation sur maximum 48h (cage d’infirmerie individuel qui permet de maintenir le contact visuel, olfactif et auditif avec les autres animaux, le personnel et la routine de l’animalerie) afin de s’assurer que d’autres furets ne s’accaparent les aliments mous mis à disposition ainsi que pour pouvoir observer si la prise de nourriture est faite. Les enregistrements neuraux se font chez l'animal en situation de contention sur une durée

Devenir

Nous retirons l'implant crânien des 60 furets à la fin de l'expérimentation afin qu'ils puissent être réhabilités par des organismes compétents.

Remplacement

Afin de pouvoir comprendre le traitement de l'information sensoriel dans les cortex auditifs, visuels et frontaux, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux vivants pour pouvoir enregistrer l'activité neurale, que ce soit de neurones uniques en électrophysiologie ou les flux hémodynamiques en imagerie large-champ. Ce type d'enregistrement n'est pas réalisable chez des êtres humains. Par ailleurs, le furet constitue un animal modèle nécessaire à la compréhension de la perception auditive dans un contexte de prise de décision. En effet, il est capable d'apprendre des tâches complexes et de percevoir des sons dans une gamme auditive similaire à celle de l'être humain. Son cerveau à cortex plissé permet aussi d'étudier le rôle fonctionnel des plis corticaux, ce qui n'est pas possible chez le rongeur ou primate à cortex licencéphale.

Réduction

Le type d'expérimentation que nous réalisons permet de réaliser de nombreux enregistrements sur un nombre réduit d'animaux. Le nombre total d'animaux est de 60 furets pour les 5 axes expérimentaux du projet, avec 12 animaux au maximum pour chacun des 5 axes expérimentaux. Les effets seront quantifiés par des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies en jouets et tunnels divers et régulièrement mis tous ensemble dans une aire de jeu. Durant les week-ends, les animaux ne doivent pas effectuer de tâche comportementale. Leur état de santé est suivi en permanence, en collaboration avec un vétérinaire. Le comportement est motivé par un contrôle hydrique, raison pour laquelle nous avons établi des points limites et suivons au plus près le poids des animaux ainsi que les marqueurs de bien-être (poids, état global, comportement...). Le protocole de chirurgie inclut l’administration d’anti-inflammatoire et d’anti-douleur en pré- et post-opératoire. Sur le plan expérimental, un effort constant nous pousse vers la pose de systèmes d'enregistrements chroniques chez les animaux pour obtenir des sessions d'enregistrements plus courtes. Enfin nous explantons les animaux à la fin de l'expérimentation, afin de les réhabiliter.

Choix des espèces

Les furets apprennent rapidement une tâche ; ils ont par ailleurs une large gamme auditive, similaire à celle de l'homme. Leur cerveau est assez grand pour utiliser des électrodes avec 200 contacts. De plus leur cortex est convolué ; ces plis corticaux ne sont pas présents chez le rongeur à l’inverse de nombreux primates. Le furet permet d’étudier un putatif rôle fonctionnel de ces plis. Les individus femelles sont préférés en raison de leur petite taille. Les animaux entrent en procédure à partir de 5 mois (jeune adulte, quand le développement du cerveau est terminé).

Isolées en cage individuelle pendant sept semaines avec un accès intermittent à un biberon d'alcool, 200 souris subissent ensuite deux prélèvements sanguins sous anesthésie et un examen IRM de deux heures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le projet cherche à cartographier les modifications de connectivité cérébrale associées à la consommation massive et rapide d'alcool. Le porteur qualifie cette consommation de "volontaire et non forcée", tout en décrivant un isolement de sept semaines imposé par le protocole, une déshydratation possible et un état d'anxiété ou de dépression à l'arrêt de l'alcool.

Objectifs

Selon les estimations de l’OMS, la consommation excessive d’alcool entraîne environ 3 millions de morts par an (5% de la mortalité dans le monde). D’après le manuel de diagnostic et de statistique des troubles mentaux, le trouble d’usage de l’alcool est défini comme un « schéma problématique de consommation d’alcool entraînant une détresse importante au point de vu clinique ». Il a été montré que les troubles liés à la consommation excessive d’alcool sont de nature hétérogène. De plus, il existe différents types de troubles d’usage de l’alcool avec des bases neurobiologiques spécifiques. Parmi les différents types de troubles de l’usage de l’alcool, nous nous intéresserons à la consommation massive et rapide d’alcool, encore appelée binge drinking. Le binge drinking est défini comme un mode de consommation d’alcool suffisant pour générer une quantité d’alcool dans le sang de plus de 80 mg en une période de temps de 2 heures. Ce type de consommation d’alcool est particulièrement répandu chez les adolescents, et sa prévalence augmente chez les femmes. De plus, il est clairement démontré que l’alcoolisme sévère touche différemment les femmes et les hommes. De ce fait, il est important de caractériser la connectivité et l’impact neurobiologique de ce type de consommation d’alcool (binge drinking) pour comprendre les conséquences de ce mode de consommation d’alcool au niveau cérébral. Ce projet a pour objectif d’identifier les altérations de la connectivité cérébrale liées au trouble de l’usage de l’alcool, dans le cas d’une consommation de type binge drinking. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques et de prévention.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude devraient aider à mieux comprendre les altérations de la connectivité cérébrale qui tendent le développement d’un profil de consommation excessif et rapide d’alcool. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques et de prévention.

Procédures

Les animaux seront soumis à: 1) un protocole d'accès volontaire et intermittant à un biberon d'alcool pendant 7 semaines 2) deux prélèvements sanguins séparés de plusieurs semaines et réalisés sous anesthésie 3) un examen IRM sous anesthésie incluant: une séquence d'IRM fonctionnelle de 16 min, une séquence d'IRM anatomique de 10 min, et une séquence d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures) 4) un test comportemental pendant 5 min. Les souris seront également hébergées individuellement durant toute la durée du protocole, soit 7 semaines.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale est basée sur une consommation volontaire et non forcée de l’alcool sur une courte période. Les souris peuvent cependant présenter un état de déshydratation suite à la consommation excessive d’alcool. Ce protocole exige par ailleurs que les souris soient isolées ce qui peut induire un stress chez les animaux, les souris peuvent également être dans un état d’anxiété et/ou de dépression dû à l’arrêt de consommation d’alcool. Le prélèvement sanguin peut entraîner : une perte de poids corporel, des hémorragies sous-cutanées et un œdème. Le test comportemental peut générer du stress en raison de l'isolement des souris pour la réalisation du test.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements d'organes d'intérêt.

Remplacement

Le modèle animal est pour le moment le seul modèle qui permet d’étudier dans son ensemble les phénomènes complexes mis en œuvre dans l'addiction à l'alcool au niveau cérébral à l'échelle du connectome. En effet ces atteintes sont multifactorielles, nécessitant un grand nombre d’acteurs, et toutes les conditions ne sont pas reproductibles fidèlement dans un modèle de culture cellulaire. L'alcoolisme est une pathologie hétérogène qui implique une grande variabilité des profils symptomatiques. L'étude chez l'animal permet un suivi au cours du temps et un contrôle de l'historique de consommation incluant différents paramètres. Il n'est pas non plus possible de réaliser des prélèvements tissulaires chez l'humain.

Réduction

Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaire afin d'assurer l'efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables en fonction des expériences réalisées. Ainsi, le nombre d'animaux a été déterminé par une analyse de puissance statistique et sur la base de nos études antérieures sur l'addiction à l'alcool. En raison de la forte variabilité des phénotypes de consommation d’alcool, 50 souris seront nécessaires par groupe pour effectuer nos analyses conduisant à un total de 200 animaux.

Raffinement

Le stress potentiellement engendré par la pratique expérimentale sera limité au maximum. A leur arrivée à l’animalerie, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement de 2 semaines. Dans chaque cage d'hébergement, l'environnement sera enrichi par : 1- des lanières de papier permettant l’édification du nid afin de stimuler l’activité naturelle et diminuer le stress. 2- deux cylindres de coton pour l’édification du nid. 3- un morceau de bois pour que les souris usent leurs dents. 4- un tube pour fournir un abri. Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d’une anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. Les yeux des animaux seront protégés du dessèchement grâce à l’application d’un gel de protection. Un tapis chauffant permettra le maintient des animaux à une température physiologique. La température et la respiration seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Les animaux seront habitués aux procédures comportementales préalablement à la réalisation des expériences. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris de fond génétique C57BL/6. Cette souche est la plus utilisée dans l'étude du comportement lié à l'alcool et c'est également celle que nous avons utilisée dans nos études précédentes. Des informations standardisées sur sa génétique et son comportement sont connues. Des modèles de souris génétiquement modifiées présentant une sensibilité accrue à l’alcool que nous pourrions utiliser à l’avenir sont également disponibles, qui n'existent pas chez d'autres espèces. Nous utiliserons des animaux agés de 8 semaines. Le binge drinking chez les adultes entraine des effets chroniques, des coûts pour la santé et la société. Il s'agit ici d'étudier des effets de la consommation excessive sur un cerveau pleinement développé.

Une hypothermie maintenue trois à cinq heures pour 84 souris, une chirurgie d'injection directe dans le cerveau pour 360 autres, des injections intraveineuses répétées pour 876 : 1 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort quatorze ou soixante jours après le traitement. Une partie porte des mutations modèles de la maladie d'Alzheimer, avec déficit moteur, perte de mémoire spatiale, anxiété, anomalies de posture et difficultés à s'alimenter. Le projet teste des fragments d'anticorps censés faire passer des oligonucléotides à travers la barrière qui protège le cerveau. Le porteur annonce des tests comportementaux sans dire lesquels, et se réserve "le droit de ne pas divulguer le nom des gènes ciblés".

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) reste la cause la plus fréquente de démence. La thérapie génique basée sur les oligonucléotides a montré un grand potentiel thérapeutique car elle peut réguler potentiellement n'importe quel gène spécifiquement ciblé. Cependant, plus de 98% des médicaments développés pour des applications cérébrales ne parviennent pas à traverser la barrière hématoencéphalique (la barrière qui protège le cerveau des agents toxiques véhiculés par le sang), ce qui entrave leur application en clinique. Notre équipe et son partenaire biotechnologique ont développé des "vecteurs", basés sur des fragments d’anticorps, qui facilitent le transport de produits biologiques à travers la barrière hématoencéphalique. Nous faisons l’hypothèse que notre construction fragment d'anticorps pourrait être utilisée pour transporter efficacement des oligonucléotides dans le tissus cérébral et réguler des facteurs de risque pertinents de la MA. Pour évaluer cette hypothèse, nous avons conçu et testé in vitro plusieurs oligonucléotides ciblant des facteurs de risque génétiques connus, associés à la physiopathologie de la MA. Le premier objectif de notre projet est de tester l'efficacité des oligonucléotides chez la souris de type sauvage après injection directe dans le cerveau. Le second objectif du projet est de sélectionner de nouvelles constructions de fragments d'anticorps, conçues pour améliorer les caractéristiques de franchissement de la barrière hématoencéphalique des fragments d’anticorps. Ces deux premiers objectifs nous aideront à sélectionner les oligonucléotides les plus actifs en termes de régulation génique et le fragment le plus efficace en termes de franchissement de la barrière hématoencéphalique in vivo. Le conjugué fragment d’anticorps - oligonucléotide représentera notre médicament final. Par conséquent, le troisième objectif du projet sera de tester l'efficacité de nos nanomédicaments à réguler efficacement l’expression des gènes cibles, d’abord chez les souris sauvages après administration systémique (injection intraveineuse, IV). Enfin, notre quatrième objectif sera de tester nos nanomédicaments sur des souris modèle de la MA afin de vérifier i) leur efficacité dans la réduction des lésions neurodégénératives et ii) dans l'amélioration des fonctions cognitives, en comparaison avec nos placebo.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mettre au point une nouvelle famille de médicaments à base d'oligonucléotides présentant des caractéristiques de distribution efficaces dans le cerveau et destinés à la régulation de facteurs de risque génétiques impliqués dans la physiopathologie de la MA. Plus précisément, ce projet validera in vivo nos nanomédicaments dont l'efficacité et l'innocuité ont déjà été testées in vitro. Nous répondrons à trois questions scientifiques principales : 1) nos nouvelles constructions fragment d'anticorps 2.0 peuvent-elles délivrer encore plus efficacement des oligonucléotides dans le cerveau que le fragment 1.0 déjà disponible; 2) nos oligonucléotides peuvent-ils réguler l'expression des facteurs de risque génétiques liés à la MA ; 3) l'inhibition des gènes ciblés améliorera-t-elle les fonctions cognitives dans les modèles de la MA. À ce jour, il n'existe aucune alternative in vitro capable de reproduire la complexité d'un système vivant, c'est pourquoi les études sur des modèles de souris restent une étape cruciale et inévitable dans le développement de thérapies dédiées au cerveau. En outre, les études précliniques sur des modèles murins de la MA restent le principal moyen prédictif pour étudier l'efficacité d'un nouveau médicament contre la MA, avant de passer aux phases cliniques. Par conséquent, les animaux restent les seuls modèles permettant d’évaluer nos hypothèses, de réaliser nos objectifs, de répondre à nos questions et de développer de nouvelles thérapies pour la MA. Dans le cadre de ce projet, nous sélectionnerons les nanomédicaments à base d'oligonucléotides qui ont un effet thérapeutique intéressant. A plus long terme, ces nanomédicaments seront produits à plus grande échelle pour validation dans des études cliniques. Par conséquent, notre projet devrait accélérer le développement de thérapies innovantes pour la MA, sachant qu’il n’existe à ce jour aucun médicament efficace contre la MA. En outre, grâce à la modularité de notre technologie, nos études ouvriront la voie à la recherche d'un plus grand nombre de facteurs génétiques impliqués dans d'autres troubles neurologiques (par exemple, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques, les encéphalopathies, etc), élargissant ainsi encore l'impact scientifique de ce projet.

Procédures

Tous les animaux ayant reçu une injection dans le cerveau, soit 360 souris vont subir : - une chirurgie en vue d'injection des oligonucléotides directement dans le cerveau d'une durée de 30 minutes- des prélèvements de sang intermédiaires répartis sur la durée totale de la cinétique (maximum x3, séparés de 24h à 72h) qui seront réalisés sur animaux vigiles en contention à partir de l'extrémité de la queue, la durée d'un prélèvement n'excédera pas 5 minutes. Tous les animaux seront mis à mort 14 jours après injection dans le cerveau. Lors de l'induction de l'hypothermie, tous les animaux soit 84 souris vont subir une contention dans un dispositif dédié, des injections intraveineuses et l'induction d'une hypothermie. L'état d'hypothermie peut durer de 3 à 5 heures. Tous les animaux seront perfusés et mis à mort 14 jours après injection intraveineuse. Les animaux ayant reçu une injection intraveineuse, soit 876 souris, vont subir une contention dans un dispositif dédié, des injection intraveineuses, des prélèvements de sang intermédiaires répartis sur la durée totale de la cinétique (maximum x3, séparés de 24h à 72h) qui seront réalisés seront sur animaux vigiles en contention à partir de l'extrémité caudale et des tests comportementaux, ces manipulations peuvent durer une dizaine de minutes par animal. Tous les animaux seront perfusés et mis à mort à 60 jours après injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables susceptibles d'entraîner du stress et/ou de l'angoisse sont les suivants : la chirurgie pour l'injection ICV est susceptible d'entraîner de la douleur, la contention lors des multiples prises de température rectale (prise discontinue sur 5h maximum), des différents prélèvements de sang au niveau de la queue et lors des injections intraveineuses peut générer du stress et /ou de l'angoisse. L'induction de l'hypothermie peut provoquer inconfort jusqu’au retour à la température normale. Les anesthésies (par injection ou par inhalation) et les tests comportementaux sont susceptibles de générer du stress. Les souris modèle de la maladie d’Alzheimer sont censés présenter une perte neuronale et une perte des fonctions cognitives et motrices avec l’âge. Pour tous les modèles les phénotypes typiques sont un déficit moteur, un déficit de la mémoire spatiale, de l'anxiété, des anomalies posturales, des difficultés d'alimentation, et une mauvaise reconnaissance des objets nouveaux. Tous ces phénotypes sont plus graves chez les animaux homozygotes que chez les hétérozygotes, c'est pourquoi nous n'utiliserons que des souris hétérozygotes.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour procéder à l’évaluation de l’efficacité de l’inhibition génique de nos médicaments, par des tests biochimiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

Des études in vitro ont montré que nos nanomédicaments inhibent les gènes sélectionnés et sont adsorbés par les cellules neurales grâce aux fragments d’anticorps. En outre, des études de toxicité in vitro ont prouvé que les médicaments testés sont sûrs et n'induisent pas de réactions indésirables dans les cellules. Ces études in vitro nous ont permis de réduire le nombre de médicaments sélectionnés et d’identifier les meilleurs candidats pour chaque gène ciblé, avec un potentiel d'application clinique. Cependant, les études in vitro ne prennent pas en compte les paramètres physiologiques complexes. Pour faire face à cette limite des études in vitro, nous prévoyons de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, en l'occurrence la souris, qui est le premier modèle animal disponible relativement proche de l'homme et largement utilisé pour l'étude in vivo des mécanismes physiologiques et des nouvelles thérapies développées. À l'heure actuelle, il n'existe pas de système prédictif in vitro, de modèle à base d'organoïdes ou de modèles bioinformatiques capables de fournir toutes les réponses aux enjeux pharmacocinétiques, pharmacodynamiques, toxicité et effets secondaires. En ce qui concerne le développement de nouvelles thérapies pour la maladie d'Alzheimer, les études précliniques sur des modèles de souris transgéniques dédiés restent la principale approche prédictive pour étudier leur efficacité, avant de passer à la phase clinique. Par conséquent, à notre connaissance, les animaux sont le seul modèle qui pourrait nous permettre de tester nos médicaments.

Réduction

Notre étude sera structurée et bénéficiera d’une analyse statistique appropriée pour réduire le nombre d'animaux nécessaires. Plus précisément, la taille de l'échantillon pour chaque objectif a été calculée sur la base d'une analyse de puissance. Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=12 (6 mâles +6 femelles), à raison de maximum 15 groupes par étude. Nos données préliminaires ont montré une distribution homogène des oligonucléotides dans toutes les régions du cerveau lors de l’administration dans le cerveau. Par conséquent, pour réduire le nombre total d'animaux le cerveau sera divisé en deux hémisphères et chacun d'eux sera utilisé pour une évaluation différente. Par exemple, pour la localisation de l'ARN, la moitié du cerveau sera utilisé pour les approches de RNAscope (pour évaluer la distribution des ARNm cibles) et l'autre moitié pour les approches de siRNA scope (pour évaluer la distribution des siRNAs). De même, la moitié du cerveau pourra être utilisé pour la quantification de l'expression génique et l'autre moitié pour les analyses biochimiques. Cela nous permettra de réduire de moitié le nombre d’animaux.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont hébergés en zone d'élevage de l'animalerie entre 4 à 5 souris par cage enrichies par des dômes en carton. Les souris seront transférées dans la zone expérimentale 7 jours avant toute expérimentation. - La chirurgie se fera sous analgésie suivi d'une anesthésie. Une fois l'animal anesthésié, il est placé sur un tapis chauffant. Les yeux sont protégés par un gel protecteur oculaire. Avant incision de la peau du crâne, une infiltration d’anesthésique local est appliquée. Une analgésie post-opératoire est établie pour réduire au minimum la douleur pendant les heures et les jours qui suivent la chirurgie. Préalablement aux injections intraveineuses, les souris sont habituées au dispositif de contention et lors de l'induction de l'hypothermie, nous veillerons à ce que la température ne descende pas en deçà de 30°C. - Après chaque prélèvement sanguin, une compresse est appliquée sur le bout de la queue pour arrêter le saignement. Préalablement aux tests comportementaux, les animaux sont manipulés régulièrement pour les habituer aux environnements des différents tests et à l'expérimentateur. Tout au long des 3 procédures, les animaux sont quotidiennement surveillés et pesés 3 fois par semaine. Une grille d'évaluation est appliquée. Notre réaction dépendra du score constaté. Quant au phénotype dommageable des souris modèles de la maladie d’Alzheimer, les souris seront mises à mort dès l'apparition des signes évidents de troubles nerveux fonctionnels.

Choix des espèces

À l’heure actuelle, à défaut d’alternatives, le modèle rongeur, ici la souris, reste le modèle le plus accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de celle de l’homme. Par sa petite taille, la souris est intéressante pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). La MA est un trouble neurologique multifactoriel qui implique différents mécanismes à l'origine de la maladie. De plus, les principaux modèles animaux expérimentaux de la MA sont des souris transgéniques. Nous nous réservons le droit de ne pas divulguer le nom des gènes ciblés. Pour les procédures sur les souris sauvages, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes » ayant en moyenne de 7 à 12 semaines. A cet âge, on limite ainsi les variations interindividuelles qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l’expression de certaines protéines. Les procédures sur les souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer seront effectuées sur deux 2 tranches d'âge : 1) les jeunes animaux (1 à 3 mois) qui ne présentent qu'un dépôt faible/initial d'espèces toxiques Aβ et Tau (stade précoce) ; 2) les souris âgées (6 à 8 mois) qui se caractérisent par un dépôt élevé et diffus d'espèces toxiques Aβ et Tau dans toutes les régions du cerveau (stade avancé).

100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués par perfusion intracardiaque à l'issue. Chacun subit une chirurgie stéréotaxique de 45 à 90 minutes pour recevoir des vecteurs viraux dans le cerveau, et 90 d'entre eux portent ensuite un plot d'enregistrement de 5 à 10 grammes fixé sur le crâne, ce qui impose un hébergement individuel pendant environ six mois. Ils sont maintenus en restriction alimentaire pour qu'ils cherchent leur nourriture dans une arène, deux sessions par jour, pendant des mois selon la qualité du signal électrophysiologique. L'équipe compte utiliser les mêmes rats comme leurs propres témoins, avec et sans stimulation laser, une réduction du nombre d'animaux qui selon elle "n'augmente que marginalement les désagréments".

Objectifs

L’objectif principal est de comprendre comment l’activité des cellules dites ‘directionnelles’ est générée à partir des informations vestibulaires périphériques . Les cellules directionnelles sont des neurones présents dans le thalamus antérieur mais également dans d’autres structures corticales, qui s’activent lorsque la tête du rat pointe vers une direction précise. Ces cellules permettent à l’animal de s’orienter dans son environnement. Leur activité, particulièrement dans le thalamus, est sous le contrôle des informations provenant du système vestibulaire périphérique dans l'oreille interne. Ces informations vestibulaires sont vehiculées aux cellules directionnelles par deux structures du tronc cérébral: le noyaux supragénual et le noyau tegmental dorsal. Ces noyaux représentent le circuit responsable de la genèse des signaux directionnels thalamiques puisque la lésion de chacun de ces noyaux provoque une disparition de la modulation directionnelle des cellules directionnelles. Toutefois, leur rôle spécifique n’est pas connu. En parallèle de ces noyaux, la subdivision vestibulaire du cervelet (communément appelé vestibulo-cervelet) pourrait contribuer également à l'activité directionnelle puisque son activité pourrait générer un signal de vitesse de rotation de la tête centré sur le référentiel externe gravitationnel. L’objectif de notre projet est d’étudier le rôle exact des différentes composantes de ce circuit sur le contrôle des cellules directionnelles thalamiques. Pour cela nous allons réaliser des enregistrements électrophysiologiques de ces cellules chez des rats en comportement. Puis nous allons effectuer des perturbations de l'activité des structures cérébrales précitées, nous permettant de tester le rôle nécessaire et/ou suffisant de leur fonctionnement pour l’expression à la fois du comportement et de l’activité des cellules directionnelles. Ces trois approches (comportement, enregistrements et perturbations) forment une triade permettant de proposer des schémas interprétatifs solides sur la genèse des signaux directionnels, pouvant potentiellement aboutir à une vision d’ensemble de la contribution des signaux vestibulaires à la capacité de s'orientater dans l'espace.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à expliquer comment les signaux vestibulaires sont véhiculés aux structures cérébrales dont l'activité est nécessaire pour s'orienter correctement dans l'espace. Ceci permettra de mieux comprendre la nature et l'origine des déficits d'orientation spatiale et de mémoire qui sont générallement observés chez des patients ayant des atteintes du système vestibulaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux interventions principales: une procédure chirurgicale et une procédure comportementale couplée à l'enregistrement neuronal. La procédure chirurgicale a une durée comprise entre 45 et 90 minutes environ, en fonction de la présence ou absence de l'étape d'implantation du plot d'enregistrement. Pour la procédure comportementale, les animaux sont d'abord maintenus doucement par l'experimentateur pour permettre le brachement du cable d'enregistrement sur le plot. Cette étape a une durée de 30-60 secondes. Afin de minimiser le stress des animaux, ils sont habitués à cette legère contention avant et après la chirurgie, au cours des séances quotidiennes de manipulation. Puis ils sont introduit dans le dispositif comportemental. Chaque session comportementale a une dure de 20-30 minutes, durant lequel le rat doit explorer une arène ou une plateforme circulaire à la recherche de nourriture, à raison de 2 sessions par jour. Cette procédure peut perdurer pendant des mois, en fonction de la qualité du signal électrophysiologique.

Impact sur les animaux

Nuisance attendues : - la chirurgie stéréotaxique, sous anesthésie générale profonde, d'une durée comprise entre 45 et 90 minutes, entraîne une lésion et du stress. Cette chirurgie permet d’injecter les vecteurs viraux dans les structures cibles (N=100, tous les rats) et d’implanter les électrodes dans le thalamus antérieur (N=90 rats). 90 rats seront soumis à l’enregistrement de l’activité neuronale au cours de deux tests comportementaux (chacun ayant une durée de 30 minutes maximum) qui seront effectués 1 fois par jour (avec un délai de 2 heures environs entre les deux tests). - le plot d'enregistrement implanté en chronique entraîne une gêne modérée de par son encombrement et son poids (5-10 g), et impose un hébergement individuel pour préserver sa fonctionnalité. Il y a donc une restriction des interactions sociales durant environ 6 mois. De plus, Il y a donc un isolement social, et un protocole de contrôle alimentaire ayant pour but de motiver les animaux à l'obtention de récompenses alimentaires, et qui entraîne une faim modérée, qui est satisfaite lors des séances comportementales. - la manipulation pour le branchement du câble d'enregistrement nécessite une légère contention de l'animal pendant quelques secondes uniquement. - en fin d'expérimentation, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque, sous anesthésie et analgésie adaptée.

Devenir

A la fin des expériences tous les animaux seront mis à mort. Cette décision découle des objectifs de l'expérimentation, à savoir la réalisation des contrôles histologiques pour vérifier la bonne expression des opsines dans les strcutures cérébrales cible et la correcte implantation des électrodes. Elle est donc prise par les responsables du projet en accord avec la Structure du Bien Etre Animale (SBEA) de l'institut de recherche.

Remplacement

La nature même des expériences ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elles reposent sur l'étude du comportement des rats, ce qui ne peut pas être realisé à partir de modèles in vitro ou des modèles artificiels (basés sur des simulations sur ordinateur). Du fait du caractère invasif des procédures (injections intra-cérébrales virales, implantation d'électrodes) elles ne peuvent pas non plus être conduites chez l'humain.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux utilisés reflète la recherche d’un juste équilibre entre la nécessité de répliquer les observations pour obtenir des résultats statistiquement valables (les phénomènes étudiés pouvant présenter une variabilité interindividuelle importante, notamment dans l’étude du comportement) et celle de réduire la taille des effectifs. Pour cela nous allons utiliser une stratégie qui consiste en l’utilisation des mêmes animaux pour analyser les effets à la fois comportementaux et neuronaux des inhibitions optogénétiques. Les rats seront ainsi leur propre témoin en comparant les résultats obtenus durant les périodes avec et sans stimulation laser. Cette stratégie présente un réel bénéfice en terme de réduction du nombre d’animaux et en terme de pertinence scientifique et statistique tout en n’augmentant que marginalement les désagréments pour les animaux. Le nombre d’animaux ici présenté a été estimé sur la base de nos expériences antérieures à la fois sur le comportement et l'enregistrement de l'activité neuronale, et sur un test de puissance statistique permettant de reduire au maximum le nombre d'animaux tout en ayant suffisamment de données pour une inférence statistique valide.

Raffinement

Les animaux sont habitués à la manipulation et à la salle d’expérimentation pendant 10 jours avant le début du protocole expérimental afin de diminuer leur stress. La chirurgie stéréotaxique pour effectuer les injections intra-cérébrales couplées aux implantations d’électrodes est optimisée pour réduire la durée de l’opération (environ 45-90 min). La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire est administré en début d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni de stress après réveil de l’anesthésie gazeuse. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique adaptée est mise en place pour déterminer les points limites adaptés et mettre en place des actions

Choix des espèces

La majorité des études portant sur la caractérisation des cellules directionnelles ont été réalisés chez le rat. De plus, notre travail s’inscrit dans la continuité d’études antérieures (publiées et en cours d’analyse) réalisées chez la même espèce. On pourra ainsi se baser sur des connaissances bien établies pour poursuivre ce projet et ainsi éviter de multiplier les expériences et l'utilisation d'un grand nombre d'animaux. Les animaux seront testés à l'âge adulte. A cette âge les réseaux neuronaux sont suffisament matures et l'activité des cellules directionnelles bien stable. Peu d'études se sont intéressés à la caractérisation des propriétés des cellules directionnelles au cours du développement, alors que la grande majorité des travaux publiés ont été effectués chez des rats adultes. Ceci nous permet de se réferer à un grand nombre de données connues, reduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaire pour réaliser notre projet.

Le crâne aminci et une canule posée au contact des méninges, 80 rats reçoivent des agents déclencheurs de migraine puis subissent des tests de sensibilité douloureuse de la face, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La chirurgie dure 45 minutes, après quoi chaque rat est isolé pour protéger le dispositif implanté, et tous sont tués à l'issue d'enregistrements menés sous anesthésie sans réveil. Le projet vise à obtenir des dépressions corticales spontanées chez le rat vigile, en comparant un groupe au crâne aminci et un groupe au crâne intact. Le porteur range la douleur induite par le modèle parmi les nuisances du projet, tout en présentant le test de sensibilité faciale comme limité puisque le rat est libre de ses mouvements et peut se soustraire à la stimulation.

Objectifs

Jusqu’à présent, l’obtention de la dépression corticale (CSD, activation massive des neurones puis inhibition de ces derniers) en recherche préclinique nécessite l’injection de chlorure de potassium (KCl). Le KCl va déclencher une activation suivie d’une inhibition des neurones similaire à celle qui se produit dans le cerveau lors d'une crise de migraine avec aura (phénomène neurologique où le patient perd une partie de son champ visuel). Cependant, notre objectif serait d’obtenir des CSD spontanées après une sensibilisation du cortex, comme c’est le cas chez les migraineux. Des collègues ont mis en évidence que l’amincissement de l’os crânial provoquait des activations semblables à celles que l’on voit lors des CSD. Dans ce projet, nous voulons mettre au point un modèle d'enregistrement de CSD chez le rat vigile en comparant le modèle où on crée une sensibilisation en amincissant l’os crânial vs un modèle où l’os n’a pas été aminci.

Bénéfices attendus

A moyen terme, ce projet a pour but d’améliorer les outils existants dans la recherche pré-clinique pour étudier la physiopathologie de la migraine avec aura. Si nous arrivons à identifier de nouveaux acteurs ainsi que leurs rôles, cela nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, ces études peuvent aider à développer de nouveaux traitements pour soulager les patients souffrant de migraine avec aura.

Procédures

Les interventions dans ce projet sont prévues sur une durée maximale de 3 semaines. 1/ Injections intrapéritonéales afin d'induire l’anesthésie pour la chirurgie. 2/ Réalisation d'une chirurgie (durée 45min). 3/ injection d'agents migraineux sur les méninges à travers la canule sous anesthésie générale brève à l’isoflurane. 4/ Le test de sensibilité cutanée sur la face du rat.

Impact sur les animaux

Les nuisances identifiées pour le bien-être des animaux sont : la chirurgie (implantation des canules, amincissement de l’os) qui provoque une douleur post-opératoire, la sensibilité douloureuse liée au modèle de migraine la séparation des animaux après la chirurgie.

Devenir

Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par par des enregistrements chez l’animal anesthésié sans réveil : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi dans chaque lot, nous aurons 10 animaux. Notre expérience nous a appris que nous avions environ 20% de pertes d’animaux à cause de la chirurgie, de la perte des canules ou encore des canules qui pourraient se boucher ou encore la perte du signal de courants corticaux, ou des vis d'enregistrement. A cela s’ajoute l’effet discriminant lors du test de sensibilité de la face et de la réponse électrique des neurones entre les différents groupes. Une fois l’expérience chez l’animal vigile terminée, nous réaliserons des enregistrements chez l’animal anesthésié pour obtenir plus de données et éviter un nouveau groupe d’animaux.

Raffinement

Les nuisances identifiées sur le bien-être des animaux sont : la douleur engendrée par les chirurgies, la douleur engendrée dans le cadre du modèle, et la séparation des animaux après la mise en place de la canule sur les méninges. Afin de réduire la douleur de la chirurgie, un traitement antalgique sera donné pendant 3 jours. La cornée est protégée pendant la chirurgie. Par ailleurs, la chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, les animaux sont placés sur une couverture chauffante pendant tout le temps de la chirurgie. Le zone d'incision est désinfectée avec une solution antiseptique et elle sera la plus petite possible. La chirurgie est réalisée par une personne expérimentée pour qu’elle dure le moins de temps possible. Nous veillons à ce qu’il n’y ait aucune hémorragie à la fin de la chirurgie. Les animaux sont gardés dans la pièce de chirurgie en observation jusqu'à leur réveil complet. Concernant la douleur générée par le test de sensibilité de la face, nous en limitons la durée et l’intensité au minimum et l’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les animaux seront ensuite observés tous les jours par l’expérimentateur. Ils seront pesés tous les jours, leur vitalité sera vérifiée (déplacement, alimentation, état général, comportement douloureux). Avant chirurgie, les animaux sont hébergés dans des conditions standard. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher avant la chirurgie. Après l’implantation de la canule, les animaux auront un hébergement individuel afin de protéger les dispositifs expérimentaux. Les rouleaux seront remplacés (protection des dispositifs expérimentaux) par des feuilles de sopalin blanc et des lanières de papier kraft pour permettre aux animaux de faire un nid. Au cours de l'expérimentation, les animaux seront observés tous les jours pour déterminer la présence ou non d’un ou plusieurs points limites adaptés à notre expérimentation. Selon notre arbre décisionnel, nos points limites seront considérés comme les critères d’arrêt des souffrances des animaux et entraineront la mise à mort de l’animal après une sédation.

Choix des espèces

Le rat de souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 7-12 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.

Exposées à la lumière bleue neuf heures par jour pendant quatorze jours, 192 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Elles passent deux séances d'imagerie ultrasonore fonctionnelle de deux heures chacune sous anesthésie générale, dont le porteur attend une chute de température et une baisse des fréquences cardiaque et respiratoire. L'objet déclaré est de comprendre par quels circuits la lumière bleue devient un message douloureux dans la photophobie, symptôme fréquent de la migraine et du syndrome de l'œil sec. Le porteur note que les souris fuient la lumière bleue, comportement qu'il rapporte à un stress, et espère identifier à terme de potentielles cibles thérapeutiques.

Objectifs

La photophobie, une perturbation sensorielle douloureuse provoquée par la lumière, est un symptôme courant des troubles neurologiques et ophtalmologiques. La photophobie est hétérogène et varie d'une personne à l'autre ; une partie de l'hétérogénéité provient des différents troubles qui manifestent ce symptôme. On soupçonne aujourd'hui que l'exposition chronique à la lumière (surtout celle proche des bandes spectrales bleue/violet) pourrait avoir un rôle délétère dans l'épidémiologie et l'évolution des symptômes de la photophobie. En effet, de nombreux patients se plaignent d'une sensibilité accrue à ce type de lumière lorsqu'ils travaillent sur des écrans et/ou dans des lieux éclairés par une lumière artificielle (dans la plupart des cas, il s'agit de tubes fluorescents et/ou de LED). Le fait qu'aujourd'hui ces lumières artificielles nous entourent presque partout a aggravé la situation clinique de ces patients. Des cellules spécialisées sensibles à la lumière ont été identifiés dans la rétine et pourraient expliquer la raison d'être de la photophobie chez les personnes aveugles. Bien que cette découverte semble faire progresser la compréhension du mécanisme de la photophobie, la manière dont la lumière fonctionne en tant que stimulus de la douleur reste incompris. Ce projet a pour but de mettre en évidence l'impact spécifique de la lumière bleue au niveau cérébral, ce qui a été peu exploré jusqu'à présent. A cette fin, nous enregistrerons l’activité hémodynamique dans différentes régions du cerveau suite à des stimulations lumineuses à différentes longueurs d’onde, chez des animaux avant et après le développement d’une photophobie induite par une exposition à la lumière bleue ainsi que chez des animaux contrôles ayant été exposés de façon chronique à une lumière jaune et des animaux naïfs n’ayant pas été exposés.

Bénéfices attendus

La photophobie est un symptôme courant des troubles neurologiques (ex : migraine, 1 à 2 pour cent de la population générale) et ophtalmologiques (ex : syndrome de l’œil sec, 15 à 20 pour cent de la population âgée de plus de 65 ans). Elle se caractérise par une hypersensibilité à la lumière qui provoque alors des céphalées et des vives douleurs dans les yeux. Un exposition chronique à la lumière bleue (écrans, LEDs) induit une photophobie. Ce projet a pour but d’élucider par quels mécanismes la lumière bleue induit un message douloureux dans le cas d’une photophobie. Puisqu’il y a peu de données disponibles, une première étape est de mettre en évidence les régions cérébrales en lien avec la vision et la douleur activées par une stimulation lumineuse dans un modèle de photophobie ainsi que la plasticité cérébrale dans la photophobie. Pour ce faire, nous disposons d’un modèle murin de photophobie induite par la lumière bleue que nous comparerons à un modèle contrôle (exposition à la lumière jaune). En mettant en évidence les différentes régions cérébrales impliquées dans la photophobie ainsi que la plasticité cérébrale inadaptée qui se développe, nous espérons ainsi pouvoir non seulement mieux comprendre et décrire ce phénomène pathologique mais également identifier de potentielles voies à visée thérapeutique pour la prise en charge de la photophobie.

Procédures

Dans le cadre de ce projet les animaux seront exposés à différentes conditions de lumière (jaune ou bleue), 9h par jour durant 14 jours. L’ensemble des animaux auront deux sessions d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui dureront chacune 2h par animal et qui se feront sous anesthésie générale. La totalité des tests réalisés durant l’imagerie sera effectuée sous anesthésie générale. Cette procédure comprend une euthanasie qui sera réalisée selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie.

Impact sur les animaux

Lors de l’exposition à la lumière bleue, les souris adoptent un comportement de fuite/soustraction face à la lumière bleue reflétant un stress. Lors de l’imagerie, l’anesthésie prolongée des animaux pourrait induire des effets indésirables sur les constantes vitales de l’animal : chute de température, baisse des fréquences cardiaque et respiratoire.

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants se justifie par la nécessité de mettre en évidence des circuits neuronaux complexes impliqués dans la douleur cornéenne et qui impliquent l’ensemble de l’encéphale. Le modèle que nous utilisons ne peut pas être remplacé par une approche alternative in-vitro car la douleur cornéenne chronique est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier. Une approche intégrative sur l’animal entier reste incontournable. Notre projet de recherche porte sur l’étude de réseaux neuronaux complexes présents dans un cerveau entier. Bien que ces questions soient posées pour aider à une meilleure compréhension des pathologies humaines et l’amélioration de leur traitement, une première étape nécessite l’utilisation de rongeurs.

Réduction

Nous utiliserons au maximum 192 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité d’animaux et de groupes tout en procédant à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. La taille des effectifs a été estimée grâce à un calcul de puissance. Nous procéderons à une étude longitudinale : chaque animal sera suivi dans le temps et sera son propre contrôle.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 4 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 22 Degrés Celsius et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour/12h nuit. Le taux d’humidité des cages est contrôlé (55 pour cent). Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d’euthanasier l’animal en dernier recours. Afin de minimiser le stress et la variabilité lors du test comportemental, les animaux suivront une session d’habituation au test durant 5 jours avant le début de l’exposition à la lumière bleue ou jaune. L’animal aura libre accès à l’ensemble du complexe dans une période de 5 minutes, c’est-à-dire les deux compartiments (illuminé ou sombre) et le couloir central reliant les deux compartiments. Pour l’imagerie, aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes (couverture thermostatée et suivi des fréquences cardiaque et respiratoire).

Choix des espèces

Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès éventuellement à tous les outils génétiques requis. Ce projet de recherche portant sur la photophobie nécessite d’utiliser des animaux adultes, âgés de plus de 6 semaines dont les circuits neuronaux sont établis puisque ce projet porte sur l’identification de modifications dysfonctionnelles de ces réseaux. Stade de développement à l’arrivée à l’animalerie : souris mâles et femelles d’une souche commerciale couramment utilisée adultes de 7 semaines.