Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude des effets de la défaite sociale sur le sommeil et des mécanismes neuronaux sous jacents chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Choisies pour leur comportement territorial pleinement développé, des souris CD1 de neuf à quatorze semaines sont mises face à d'autres souris mâles, cinq minutes durant, pour leur infliger une défaite sociale. 1 275 souris vont être utilisées au total, dont 806 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies crâniennes sous anesthésie, l'une de deux heures et l'autre de quatre à six heures, l'implantation d'électrodes et de fibres optiques, cinq prélèvements de sang à la queue, puis des enregistrements de dix heures pendant son sommeil. Toutes sont tuées, pour prélever leur cerveau ou vérifier les sites d'injection.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre l’impact du stress sur le sommeil, en particulier le sommeil paradoxal, souvent perturbé dans les troubles psychiatriques comme le stress, l’anxiété et les troubles du stress post-traumatique. Nous utilisons un modèle de “défaite sociale” chez la souris, qui reproduit des symptômes similaires à ceux observés chez les humains souffrant d’anxiété. L’objectif est de déterminer comment ce stress affecte le sommeil en étudiant l’activité de cinq types de cellules cérébrales réparties dans des régions spécifiques du cerveau connues pour réguler le sommeil et le stress. Des techniques avancées seront utilisées pour observer et manipuler l’activité de ces cellules avant, pendant et après une situation de stress, afin de mieux comprendre leurs rôles dans les troubles du sommeil liés au stress.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à clarifier comment le stress perturbe le sommeil, en identifiant les cellules cérébrales impliquées. Ces connaissances sont cruciales pour développer de nouveaux traitements pour les troubles du sommeil et les maladies psychiatriques associées, telles que la dépression et le syndrome de stress post-traumatique. En comprenant mieux les mécanismes du sommeil, nous espérons améliorer la qualité de vie des personnes touchées par ces troubles.
Procédures
Les animaux seront soumis à quatre types d’interventions principales : prélèvements sanguins, chirurgies, et une procédure de stress psychosocial couplée à des enregistrements comportementaux et physiologiques. 1/ Prélèvements sanguins : Ces prélèvements rapides (moins de 5 minutes) se feront au niveau de la queue, trois fois au maximum sur une seule journée avant le stress, puis à deux moments précis après celui-ci (1 heure et 8 heures). Cette approche permet de suivre les réponses physiologiques au stress tout en minimisant les manipulations. 2/ Chirurgies : Deux interventions sous anesthésie générale sont prévues pour la majorité des animaux. La première est une intervention préparatoire d’environ 2 heures. La seconde, plus complexe, réalisée au moins 7 jours plus tard, dure entre 4 et 6 heures. 3/ Stress psychosocial : certains groupes d’animaux participeront à une session unique d’interaction sociale contrôlée pour induire un stress modéré. 4/ Enregistrements comportementaux et physiologiques : Après une phase d’habituation post-chirurgicale, des enregistrements de 10 heures seront réalisés, principalement durant le sommeil des souris. Ces enregistrements seront répétés après l’exposition au stress, sur une durée totale ne dépassant pas 10 semaines après la chirurgie. Enfin, tous les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues concernent l’implantation d’électrodes, de fibres optiques, et l’usage d’implants. Ces procédures, couramment pratiquées, ont démontré une excellente tolérance chez les animaux, sans inconfort significatif ni modifications comportementales. Cependant, certaines nuisances pourraient apparaître: - Court terme (0 à 24h après la chirurgie) : Les risques incluent les réactions à l’anesthésie, l’hypothermie, et les hémorragies, tous systématiquement gérés par nos procédures opératoires. - Moyen terme (1 à 7 jours) : Les risques sont liés à des infections locales du tissu cérébral ou à l’ischémie suite à l’implantation d’électrodes ou de fibres. Nos suivis montrent une tolérance élevée des implants et des électrodes, avec un risque très faible d’infection ou de lésion cérébrale. - Long terme (au-delà de 15 jours) : Bien que l'implantation puisse théoriquement induire des nuisances liées à la présence physique de l'implant, telles que des chocs ou des difficultés de mouvement, notre expérience montre que ces événements sont rares. L'isolement nécessaire à la protection des implants peut conduire à des répercussions émotionnelles. Cet isolement est géré avec des périodes d'interaction sociale sous supervision pour maintenir un équilibre social. Les implants sont conçus pour être légers et compacts. Cette conception minimise tout désagrément et assure que la liberté de mouvement des animaux reste intacte. L'usage de câbles connectant l'implant au matériel d'enregistrement, bien que potentiellement restrictif, est attentivement géré à travers une surveillance constante durant les sessions d'enregistrement. Cette approche permet d'ajuster le dispositif en temps réel pour éviter tout inconfort, assurant une acclimatation progressive des souris au système. Dans le cadre du protocole de défaite sociale, la souris testée peut être exposée à un risque de blessure lors de l’interaction avec une souris dominante. Cependant, une surveillance attentive pendant les 5 minutes d’exposition permet d’intervenir rapidement pour prévenir toute violence excessive, assurant ainsi la sécurité des souris. Nos méthodes éprouvées garantissent un contrôle efficace des interactions, ce qui permet de collecter des données fiables sur le comportement induit par le stress.
Devenir
À l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés, certains pour permettre la récupération des cerveaux en vue d’analyses histologiques, et d’autres pour vérifier avec précision les sites d’injection.
Remplacement
Notre objectif est d’étudier les mécanismes neuronaux responsables de l’adaptation des états de vigilance après un stress. Ces études ne peuvent pas, pour le moment, être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Les invertébrés, avec leur système nerveux simplifié, ne fournissent pas non plus un modèle adéquat pour notre étude. Nous examinons des réponses électrophysiologiques et des paramètres physiologiques essentiels, tels que la respiration et le rythme cardiaque, qui nécessitent un organisme complexe et proche physiologiquement de l’être humain pour des comparaisons pertinentes. Les comportements spécifiques, les cycles de sommeil, et l'existence de souris génétiquement modifiables font de ce modèle le plus adapté pour explorer l'impact du stress sur le sommeil. La souris est donc indispensable pour notre projet, étant le seul modèle qui satisfait à l'ensemble de ces exigences.
Réduction
Afin de minimiser l’utilisation d’animaux, nous améliorerons l’efficacité des différentes procédures chirurgicales et le suivi longitudinal des animaux. Nous couplerons également les différentes techniques à l’analyse électrophysiologique systématique. Cela nous permettra d’avoir des données complémentaires pour chaque souris. L’utilisation de différents sites d’implantation des électrodes nous permet de récolter un nombre conséquent de données par animal, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour répondre à différentes questions. Quand cela est possible scientifiquement, les animaux sont utilisés dans différentes conditions expérimentales (condition sans stress vs après stress) afin qu’ils soient son propre contrôle et ne pas doubler le nombre d’animaux. Le nombre d'animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir réaliser des tests statistiques à partir de nos résultats avec une puissance suffisante. Étant donné que nos résultats dépendent du taux de succès des expressions des constructions permises grâce aux injections virales, de la qualité des signaux recueillis par les électrodes implantées, de la bonne position des fibres et de la qualité des signaux fluorescent obtenues, nous nous attendons à un taux global de succès situé au alentour de 70%. Ce chiffre prend en compte l’implantation optimale des électrodes, le maintien de l’intégrité du connecteur et de la fenêtre crânienne et la variabilité des expériences comportementales. Actuellement, le comportement de défense de territoire, essentiel au protocole de défaite sociale, n'est pas clairement établi chez les femelles, nous conduisant à utiliser uniquement des souris mâles. Cette spécificité réduit davantage le nombre d'animaux nécessaires à notre étude.
Raffinement
- Une semaine avant la chirurgie, les animaux seront acclimatés pour réduire le stress. Une manipulation quotidienne sera réalisée pour les habituer aux interactions humaines. Leur environnement sera enrichi par du coton, un dôme et des tubes pour leur offrir un confort optimal. - Les interventions chirurgicales respecteront rigoureusement les normes d’anesthésie et d’analgésie. Une prise en charge spécifique de la douleur sera assurée pendant une semaine de convalescence, avec un suivi quotidien pour détecter et traiter tout signe de douleur post-opératoire. - Si une souris présente des signes de malaise ou un comportement anormal, une évaluation sera effectuée pour déterminer si des analgésiques ou, dans les cas graves, une euthanasie sont nécessaires. En cas d’infection, un traitement adapté sera administré. - Les implants utilisés sont conçus pour être légers et compacts, minimisant tout inconfort et préservant la liberté de mouvement des animaux. Pendant les sessions d’enregistrement, les câbles connectant l’implant au matériel sont surveillés en permanence, permettant des ajustements en temps réel pour éviter toute gêne et favoriser une acclimatation progressive des souris. - Dans le protocole de défaite sociale, les souris sont exposées à une souris dominante, ce qui peut présenter un risque de blessure. Pour limiter ce risque, la phase d’exposition directe est strictement limitée à 5 minutes, avec une surveillance constante pour prévenir toute violence excessive et garantir la sécurité des souris. Si une blessure survient malgré ces précautions, la souris sera immédiatement replacée dans sa cage, et la plaie désinfectée. La blessure sera surveillée, et un vétérinaire consulté en cas de cicatrisation difficile ou d’infection. - Les souris seront hébergées individuellement dans un environnement enrichi. Si des signes d’anxiété persistante ou d’inactivité sont observés, tels qu’une réduction de la mobilité, de l’apathie, un isolement comportemental ou une posture passive, un enrichissement supplémentaire sera ajouté (matériaux à ronger, sciure pour fouissage). Une manipulation humaine douce et régulière sera également effectuée. Si les symptômes persistent, des sessions d’interaction contrôlée seront organisées avec un congénère de même sexe et de la même fratrie.
Choix des espèces
Les rongeurs, en particulier les souris, sont privilégiés dans la recherche comportementale et physiologique, grâce à leur cognition complexe et leur similitude fonctionnelle avec les humains. La souris se distingue par sa capacité d'adaptation rapide, ce qui la rend particulièrement appropriée pour nos études. Cette espèce bénéficie également d'un vaste corpus de données électrophysiologiques préexistantes et d'un éventail étendu d'outils pharmacologiques et de modèles génétiques. Cette richesse de ressources facilite l'intégration avec les recherches antérieures et contribue à une réduction globale du nombre d'animaux nécessaires. De plus, les avancées en génétique de la souris permettent des manipulations ciblées des réseaux neuronaux, offrant des possibilités inégalées par d'autres modèles et essentielles pour approfondir notre compréhension des mécanismes en question. Les procédures chirurgicales seront réalisées chez des animaux de 6 à 8 semaines, âge où le développement du cerveau et du crâne est stabilisé, garantissant des coordonnées d’injection précises et cohérentes. Les enregistrements d’activité cérébrale se limiteront à 10 semaines après l’implantation des électrodes, soit jusqu’à 4 mois. Cette durée est essentielle pour préserver une qualité de signal constante et éviter les variations liées à l’usure des implants. De plus, cette limite prend en compte l’évolution de l’architecture du sommeil avec l’âge, ce qui pourrait altérer la comparabilité des données. Les souris de la lignée CD1 dominantes auront entre 9 et 14 semaines, âge où leur comportement social et territorial est pleinement développé. Cela garantit des interactions sociales standardisées et réduit les variations dues à l’immaturité ou à des changements physiologiques chez des animaux trop jeunes ou trop âgés.
Activité interaréale pendant l’apprentissage de la locomotion et de l’orientation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées une ou deux fois du crâne sous anesthésie, certaines subissant en plus une intervention de deux heures pour mesurer leur activité musculaire, 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse histologique du cerveau. Elles enchaînent ensuite une quinzaine de sessions d'enregistrement de trente à quarante minutes, jusqu'à deux par jour, la tête fixée et les mouvements limités. Le projet cherche à comprendre comment le cervelet et le cortex coordonnent la marche et l'orientation dans l'espace. Une partie des souris est hébergée seule pour protéger les implants, sans que le RNT précise combien ni pendant combien de temps, et aucun des tests comportementaux annoncés n'est nommé.
Objectifs
Dans ce projet, nous étudierons l'orientation spatiale et le contrôle moteur, ainsi que l'intégration multisensorielle et les transformations sensorimotrices nécessaires à ces processus. Nous étudierons comment le cerveau code et combine les informations provenant de sources internes et externes pour percevoir l'environnement, produire un sens de l'orientation et exécuter les réponses comportementales appropriées. Nous utilisons des approches expérimentales complémentaires à plusieurs niveaux chez les rongeurs, au niveau des cellules et des circuits in vivo. Avec nos expériences, nous voulons répondre aux questions suivantes: Comment l'activité cérébelleuse et l'interaction entre le cervelet et le cortex cérébral génèrent-elles une production motrice coordonnée et facilitent-elles l'orientation ? Comment l'activité neuronale se traduit-elle par une activation musculaire et, à son tour, par une production motrice ? Comment des sous-classes de neurones spécifiques contribuent-elles au contrôle moteur et à l'orientation ? Nous visons à étudier l'activité de la population neuronale liée aux schémas de marche spatiale et à l'orientation de la tête, révélant ainsi les mécanismes cérébraux du contrôle moteur, de la coordination, de la navigation spatiale, de la cognition et de l'apprentissage.
Bénéfices attendus
Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau de s'orienter dans l'environnement et d'effectuer des tâches motrices complexes. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’orienter et d’orchestrer le mouvement dans des conditions physiologiques. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs et à des déficits d'orientation.
Procédures
Dans cette étude, les souris participeront à l’une des trois approches expérimentales suivantes : Approche 1 : Étude de l’activité cérébrale pour comprendre le rôle du cervelet et de son interaction avec le cortex dans le contrôle des mouvements et l’orientation dans l’espace. Approche 2 : Enregistrement simultané de l’activité cérébrale et de l’activité musculaire pour explorer comment le cerveau contrôle les mouvements. Approche 3 : Analyse des liens de cause à effet entre l’activité cérébrale et les comportements des souris. Selon l’approche, les souris seront soumises à une ou deux interventions chirurgicales pour permettre la mesure optique ou électrique de l'activité neuronale. Ces interventions chirurgicales durent 1 heure. Quelques souris subissent une intervention chirurgicale pour mesurer l'activité musculaire qui dure 2 heures. Les souris participeront ensuite à environ 15 sessions de tests comportementaux pendant lesquelles leurs mouvements, leur activité cérébrale et, dans certains cas, leur activité musculaire ou leurs réponses optogénétiques seront mesurés. Chacun de ces enregistrements dure de 30 à 40 minutes, avec un maximum de deux par jour. Pour éviter que leurs congénères n’endommagent les dispositifs implantés, certaines souris seront hébergées individuellement après l’implantation. Pendant les enregistrements, les animaux seront placés de manière à limiter leurs mouvements pour garantir la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Les chirurgies prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 2 à 3 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. La fixation de la tête pendant l'exécution d'une tâche motrice complexe peut induire un état de stress chez l'animal. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement anormal indésirable. Pour éviter cette situation, chaque animal subira un protocole d'habitutation progressive sur une période de 2 à 3 jours comprenant une augmentation progressive du temps passé en situation de tête immobilisée.
Devenir
Le cerveau des 500 animaux est utilisé après le protocole expérimental pour effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
L'intégration des informations sensorimotrices pendant la navigation spatiale libre implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur et l'orientation, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant et libre de ses movements afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. : Il s’agit d’un projet de neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants chroniques. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de nombreuses sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques que nous appliquerons seront adaptés aux analyses.
Raffinement
Les animaux de l'étude optogénétique sont gardés dans des cages dans l'animalerie avec leurs congénères. Les animaux sous examen électrophysiologique doivent être hébergés seuls après l'étape d'implantation afin de protéger l'implant des dommages causés par les congénères. Les cages seront enrichies de roues de course et des rouleaux pour se cacher. Les souris seront maintenues avec eau et nourriture ad libitum. Leur état général sera surveillé de façon quotidienne pendant toute la durée du protocole. Pour éviter toute souffrance, tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance régulière de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative. En combinant souris transgénique et injections virales nous serons en mesure de mesurer l’impact fonctionnel d’une population neurale spécifique. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où leur activité motrice est arrivée à son niveau mature (>P30) et pendant les deux mois qui suivent. À cet âge, la locomotion est entièrement développée et les structures cérébrales impliquées dans la locomotion et l'orientation sont matures.
Etude des circuits de la résignation acquise chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génotypées entre six et huit jours de vie, les souris surnuméraires porteuses du génotype recherché sont transférées vers les projets d'autres équipes. Les 898 retenues ici subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, 286 en gravité sévère et 120 opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Chaque animal subit une chirurgie crânienne pouvant durer deux heures trente, puis trois jours de tests comportementaux dont deux séances de cinquante minutes, pour mesurer le rôle d'une région cérébrale dans un comportement de résignation, toutes étant tuées ensuite pour prélèvement de tissus. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne convient, la structure étudiée n'ayant été localisée à ce jour que chez les mammifères.
Objectifs
Il y a une quinzaine d’années, une nouvelle structure cérébrale a été identifiée. Cette région, en plus de ses connexions avec des zones cérébrales impliquées dans des pathologies psychiatriques, joue un rôle central dans la régulation des circuits cérébraux associés à la motricité et à la motivation. Elle est ainsi impliquée dans des pathologies telles que la maladie de Parkinson, l’addiction et la dépression. L’identification récente d’un marqueur spécifique pour cette région permet désormais de l’étudier de manière ciblée. Les objectifs de ce projet sont de tester le rôle de cette région et les conséquences dans sa modulation dans l’expression des symptômes dépressifs.
Bénéfices attendus
L'objectif premier de ce projet est fondamental et concerne la caractérisation du rôle d’une région cérébrale encore peu connue dans le développement et l’expression d’un comportement de résignation. Les données obtenues auront aussi un intérêt translationnel en psychiatrie, en ajoutant potentiellement une structure cérébrale clé à notre compréhension des mécanismes sous-tendant ce symptôme dans les troubles psychiatriques. À plus long terme, l’identification du rôle de cette structure pourrait permettre d’ouvrir vers la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, avec notamment la recherche de médicaments pouvant affecter son activité pour le soulagement de troubles psychiatriques.
Procédures
Les animaux subiront 1 chirurgie d’au maximum 2h30. Les animaux subiront une séance de test comportemental par jour sur 3 jours, deux de 50 minutes et une de 15 minutes.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut entraîner une inflammation locale transitoire au site d’incision (peau du crâne). Les expériences réalisées sont originaires de stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les réponses cérébrales et comportementales étudiées nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Les animaux surnuméraires possédant un génotype recherché sont réutilisés dans les projets d’autres équipes. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours (12 jours maximum), et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.
Biodistribution de resvératrol marqué à l’oxygène
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées pour que leurs organes soient prélevés et analysés, 440 souris adultes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles sont gavées à l'état vigile, une seule fois pour 165 d'entre elles, jusqu'à dix fois en douze jours pour 165 autres. Le gavage peut irriter l'œsophage et faire perdre du poids, et la contention qu'il exige est source de stress. L'objet est de suivre où va le resvératrol marqué à l'oxygène une fois ingéré, ce que le porteur affirme ne pouvoir faire que sur un "organisme entier".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de savoir dans quels organes se retrouve un composé dont les propriétés de neuroprotection ont déjà été démontrées une fois qu’il a été ingéré par l’animal. Ce projet nous permettra aussi de comprendre comment ce composé est dégradé, transformé par l’organisme et comment il agit ce qui, à ce jour, n’est pas complètement identifié.
Bénéfices attendus
Le développement de la nouvelle méthode de marquage associée à l’imagerie que nous proposons permettrait de déterminer la nature et la localisation du resvératrol et de ses métabolites. Cette méthode pourrait être appliqué à d’autres composés.
Procédures
Gavage sur animal vigile : 165 souris, 1 fois. Gavage sur animal vigile : 55 souris, 1 fois par jour sur 2 jours. Gavage sur animal vigile : 55 souris, 1 fois par jour sur 5 jours, pause de 2 jours, puis 1 nouveau gavage. Gavage sur animal vigile : 165 souris, 1 fois par jour sur 5 jours, pause de 2 jours, puis 1 fois par jour sur 5 jours. Un gavage dure moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Possible perte de poids liée à une irritation de l’œsophage à cause du gavage. Stress lié à la contention au moment du gavage.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car nous souhaitons ensuite analyser les organes prélevés.
Remplacement
Les composés seront vérifiés et validés avant d’être administrés aux animaux. Cependant nous souhaitons connaitre le comportement des composés une fois ingéré par l'animal (où va-t-il ? dégradation ?), pour cela nous devons travailler sur un organisme entier.
Réduction
Seuls les composés validés in vitro seront testés. Si les résultats obtenus avec les premiers composés testés ne sont pas concluants, nous n'irons pas plus loin. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de faire des analyses qui nous permettront de mieux comprendre le mécanisme d’action des molécules.
Raffinement
Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs en suivant des critères bien définis. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. En cas de souffrance des mesures conservatoires seront mises en place pour soulager l'animal. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors il sera euthanasié.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont déjà été réalisés avec ce composé. Afin d’avoir un point de comparaison et positionner la méthode que nous avons développer nous travaillerons dans les mêmes conditions que nos prédécesseurs. Pour cela nous utiliserons la souris à l’âge adulte de 8 semaines. A cet âge les souris ont une taille raisonnable qui facilite leur manipulation diminuant ainsi le stress lié à leur manipulation.
Effet des ions bromure sur l’hyperactivité striatale chez un modèle murin du syndrome de Rett
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour porter le syndrome de Rett, une maladie qui touche presque exclusivement des filles, 32 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie gazeuse et quatorze injections intrapéritonéales, une par jour pendant deux semaines, chacune précédée d'une contention. Le porteur affirme qu'aucune autre espèce ne peut être modifiée pour imiter cette maladie humaine, et qualifie l'imagerie de non invasive. Toutes seront tuées, au motif qu'un animal ayant reçu un traitement pharmacologique ne peut pas être reclassé.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie rare qui touche principalement les filles. Elle se manifeste par des problèmes moteurs (comme des difficultés à bouger) et des troubles du comportement, comme ceux qu'on observe dans l'autisme. Les enfants atteints perdent des compétences qu'ils avaient avant, comme marcher ou parler. Actuellement, il n'existe pas de traitement qui permet de soulager ces symptômes. L’objectif de ce projet est d’essayer de trouver un traitement pour améliorer la situation. Dans une étude précédente, nous avons remarqué que certaines zones du cerveau des souris modèles de la maladie étaient trop actives, ce qui pourrait expliquer certains symptômes. Nous avons aussi découvert que des ions bromures, pourraient réduire les troubles moteurs et du comportement dans ce modèle de la maladie. Le but de ce projet est de vérifier si ces ions peuvent ramener l’activité cérébrale de ces souris à la normale, en utilisant une technique d’imagerie qui permet de voir comment leur cerveau fonctionne.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de vérifier si un traitement avec des ions bromure peut aider à améliorer les problèmes moteurs et les symptômes autistiques des souris atteintes d’un modèle de la maladie de Rett. L’idée est aussi de voir si ce traitement pourrait ramener l’activité du cerveau des souris à un niveau normal. Cela nous aidera à mieux comprendre comment ces ions bromure agissent et s’ils peuvent devenir une solution pour améliorer les traitements contre cette maladie.
Procédures
Les animaux subiront deux séances d'imagerie d’une heure sous anesthésie gazeuse. Ils recevront également des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant deux semaines (14 injections au total). Chaque injection nécessitera une contention de l'animal pendant quelques secondes
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une administration quotidienne d'agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale. Bien que la probabilité soit faible, une inflammation au niveau du site d'injection ne peut être totalement exclue. La technique d'imagerie utilisée est non invasive, ne générant pas de stress particulier, à l'exception du stress causé par la contention et la manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, car il est impossible de reclasser des animaux ayant subi un traitement pharmacologique.
Remplacement
Pour mieux comprendre les causes de l’autisme et développer de nouveaux traitements, il est essentiel de disposer de modèles animaux que les scientifiques peuvent étudier. En examinant de près le comportement de ces animaux, nous pouvons vérifier s'ils représentent bien les caractéristiques de l'autisme. Cela nous aide également à tester l’efficacité de nouveaux traitements. L’évaluation des effets d’un traitement doit se faire principalement à travers le comportement des animaux, car il n’existe pas de test biologique permettant de diagnostiquer l’autisme. En effet, le diagnostic repose uniquement sur l’observation des comportements. C’est pourquoi nous devons étudier les animaux dans leur ensemble pour capturer toute la variété de leurs comportements.
Réduction
Nous utilisons des outils statistiques appropriés pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation des expériences
Raffinement
Nous mettons tout en œuvre pour que les animaux subissent le moins de stress ou d'inconfort possible tout au long de l’étude. Les souris sont logées en petits groupes, avec tout le nécessaire pour se sentir à l’aise, comme des matériaux pour faire leur nid. Elles sont également manipulées chaque jour pour les habituer à l'interaction avec les expérimentateurs. Pendant l'ensemble du protocole, nous suivons attentivement leur bien-être, en contrôlant leur poids et leur posture, et en surveillant des signes comme la perte de poils ou un dos voûté, pour nous assurer qu’elles ne souffrent pas. Lorsque nous testons de futurs médicaments, nous alternons les côtés pour les injections afin qu'elles soient le moins gênantes possible pour l'animal. Avant chaque expérience, les animaux sont doucement préparés pour les séances d’imagerie, avec une période d’habituation afin de réduire le stress. Lors des imageries, ils sont endormis sous anesthésie gazeuse et maintenus à une température constante grâce à un lit chauffant. Leur température corporelle et leur respiration sont surveillées en continu pour garantir leur confort. Enfin, pour évaluer de manière précise l'effet du traitement, chaque animal sera comparé à lui-même en mesurant son activité cérébrale avant et après le traitement.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux, ce qui nous permet d’étudier facilement les problèmes de relations sociales, un symptôme clé de l’autisme. Leur comportement très riche nous aide aussi à évaluer d’autres réactions qui peuvent être affectées par l’autisme. Les problèmes de comportement observés chez les souris utilisées pour modéliser l’autisme sont suffisamment clairs pour tester si notre modèle est correct et, si c’est le cas, pour voir si certains traitements peuvent avoir des effets positifs. À l’exception des souris, aucune autre espèce animale ne peut être génétiquement modifiée pour imiter cette maladie humaine. Nous utiliserons des souris adultes (âgées de 8 à 12 semaines), car à cet âge leur comportement est bien développé et les problèmes de comportement se sont stabilisés.
Production d’anticorps chez le lapin
- Production de routine
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
La quantité d'anticorps commandée par le client détermine le nombre de lapins engagés dans chaque expérimentation, à raison de deux lapins par immunogène. 1 050 lapins vont être utilisés sur la durée du projet, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour développer environ 500 anticorps destinés à la recherche. Chaque animal peut subir jusqu'à vingt-cinq injections intraveineuses, quinze injections intramusculaires, huit injections sous-cutanées, trois injections intradermiques d'une vingtaine de points chacune et dix prélèvements sanguins. Le porteur reconnaît l'existence de méthodes sans animaux comme le phage display, affirme qu'elles "n'apportent pas la même qualité d'anticorps", et indique tuer les lapins en fin de projet pour obtenir "le maximum de sérum".
Objectifs
Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Les anticorps seront utilisés principalement dans la recherche académique. Environ 500 nouveaux anti-corps seront développés.
Bénéfices attendus
Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenu grâces aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement.
Procédures
- Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 10 prélèvements. - Injection intraveineuse sur animaux vigile, environ 1 min, maximum 25 injections. - Injection en intradermique (une vingtaine de points environs par inejction), environ 3 minutes, maximum 3 injections. - Injection en sous cutané, environ 1 minutes, maximum 8 injections. - Injection en intramusculaire, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection en intraveineuse dans la veine marginale, environ 1 min, maximum 25 injections. -
Impact sur les animaux
La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une inflammation au niveau des sites d’injections peut être observée. Il peut y avoir une légère douleur à l’injection. De par notre expérience Nous ne nous attendons pas à d’autres nuisances, mais nous resterons vigilants à tous effets imprévus
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.
Remplacement
Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent (type phage display), ces approchent n’apportent pas la même qualité d’anticorps. La qualité de la banque naïve utilisée et la méthode de screening de cette banque de phages display ne permet pas d’obtenir de anticorps d’affinité suffisante. Pour palier partiellement à ce défaut, cela nécessite d’utiliser des banques dites « immunes » qui nécessitent d’immuniser le lapin et n’apporte aucun bénéfice en termes de remplacement. De plus ces technologies de développement d’anticorps monoclonaux chez le lapin ou la souris, ne sont pas encore complètement matures. Ils nécessitent un matériel particulier et des réactifs adaptés. Les chances de succès sont limitées comme le démonter le nombre d’anticorps en clinque issue de phage display qui reste marginal. Enfin l’obtention d’anticorps polyclonaux ne peux pas être remplacée par un mélange d’anticorps monoclonaux. Cette approche des anticorps multi clonaux ne permets pas non plus d’obtenir la même efficacité.
Réduction
Le nombre de lapins utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, mais est déterminé par la quantité d’anticorps attendue par le client. Nous obtenons environ 50 à 60ml de sérum au minimum par lapin, la majorité des projets nécessite plus 100ml. En effet, l’immuno purification par chromatographie d’affinité de ces sérums requiert un volume suffisamment pour obtenir quelques milligrammes d’anticorps c’est pourquoi nous utiliserons 2 lapins par immunogènes.
Raffinement
Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints alors, l’animal sera mis à mort pour éviter des souffrances.
Choix des espèces
Le lapin est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes (lapins âgés de 12 semaines minimum) car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.
Rôle de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans le contrôle de la prise alimentaire : étude chez la souris âgée et bénéfice d’une restriction calorique modérée et prolongée.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
240 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une restriction alimentaire de 20 % pendant quinze mois à partir de l'âge de six mois, et toutes passent de seize à vingt jours en hébergement individuel avant un gavage, une thoracotomie sous anesthésie profonde, un prélèvement total du sang et une perfusion de paraformaldéhyde. L'objet reste exploratoire, comprendre comment une réaction inflammatoire cérébrale qui suit un repas gras évolue avec l'âge. Le porteur écrit que la restriction alimentaire prolonge la durée de vie de plusieurs mois, et affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'équilibre énergétique de façon intégrée.
Objectifs
L’existence d’une réaction inflammatoire postprandiale (ou postprandial inflammatory reaction, PIR) est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. De même, les mécanismes biologiques sous-jacents induisant la PIR ne sont pas tous élucidés. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Récemment, il a été montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau chez la souris. La PIR cérébrale se caractérise notamment par une activation des cellules microgliales chez le jeune mâle adulte, sain, en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas et se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. Les mécanismes biologiques qui déclenchent la PIR cérébrale ne sont pas identifiés. Une hypothèse serait que les lipides nutritionnels qui se retrouvent dans la circulation générale après digestion et absorption soient capables d’activer directement les cellules microgliales de l’hypothalamus. Dans ce projet, nous allons étudier l’influence de l’âge sur la PIR cérébrale en l’analysant de manière comparée entre de jeunes adultes (2-3 mois) et des individus âgés (20-21 mois). En effet il a été montré que la régulation de la prise alimentaire se fait moins bien avec l’âge et que la réponse physiologique à un repas gras pourrait en être affectée. D’autre part, une restriction calorique modérée (20%) sur le long terme étant connue pour retarder le vieillissement, nous allons comparer l’installation de la PIR cérébrale chez des individus mâles âgés nourris ad libitum versus soumis à une restriction calorique modérée prolongée. Les résultats seront comparés aux données obtenues sur de jeunes mâles adultes. Au travers de différentes mesures, nous chercherons à établir des corrélations entre développement de la PIR cérébrale, comportement alimentaire, statut neuro-inflammatoire et compétences cognitives. PIR cérébrale et statut neuro-inflammatoire seront étudiés par histologie post mortem des cerveaux. Ce projet prévoit une étude sur 240 souris.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les déterminants biologiques de la PIR cérébrale chez la souris, et donneront des informations nouvelles sur l’impact des lipides nutritionnels sur le cerveau. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et permettra de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire qui surviennent lors du vieillissement.
Procédures
Les interventions auxquelles les animaux seront soumis sont : -1 gavage 1 à 3 heures avant la mise à mort (durée
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sont le stress et la douleur lors de la contention et du gavage, la douleur lors de l’injection intrapéritonéale d’anesthésique en point terminal pour tous les animaux, la douleur en point final lors de la thoracotomie ainsi que l’isolement de tous les animaux en fin de procédure, de 16 à 20 jours selon les procédures. La restriction alimentaire des animaux, même modérée, est source de stress à court terme. Elle est cependant bénéfique sur le long terme avec une courbe de poids stationnaire et une durée de vie prolongée de plusieurs mois.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à l’issue des deux procédures afin de prélever : - le sang en vue d’analyses biochimiques plasmatiques - le cerveau en vue d’analyses histologiques
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou par simulation informatique. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
La mise en place de conditions prandiales définies a été optimisée, standardisée et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Le nombre d’individu par lot (n=12) pour les analyses histologiques, biochimiques, et comportementales a été défini précédemment. Ces effectifs sont appropriés pour réaliser des tests de corrélation et des études statistiques comparatives suffisamment robustes. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux sur des effectifs réduits. Dans le détail, une fois les conditions d’application des analyses vérifiées (nombre d’individus par lot, tests de normalité, test d’égalité des variances) les analyses comparées des groupes expérimentaux deux à deux seront réalisées à l’aide de tests t de student en cas de normalité des données ou de tests de rang dans le cas contraire.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, deux semaines d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux avec la mise en place d’une grille de score, l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance, et de méthodes de mises à mort si nécessaire.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Pour l’influence de l’âge et le bénéfice de la restriction calorique, les expériences seront réalisées sur des souris (mâles) jeunes adultes (2-3 mois) et âgées (20-21 mois), afin de comparer les réponses cérébrales en fonction de l’âge.
Etude de la diversité moléculaire et fonctionnelle des interneurones cholinergiques du striatum et conséquence sur la micro-circuiterie striatale chez la souris saine et pathologique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie stéréotaxique de trente à soixante minutes pour injecter des composés directement dans le cerveau, puis pour une partie des animaux cinq heures d'enregistrement électrique sous anesthésie, procédure dont ils ne sortent pas vivants : 1 783 souris vont être utilisées, dont 194 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chez les souris rendues parkinsoniennes par destruction unilatérale des neurones dopaminergiques, le porteur attend chez environ 20 % d'entre elles une altération du comportement alimentaire et de la prise de boisson, avec perte de poids sévère. Le projet vise à montrer que ces interneurones du striatum forment des sous-populations distinctes, hypothèse qualifiée de "très innovante". Les tests censés évaluer les déficits moteurs tiennent en quinze minutes au maximum et ne sont jamais nommés.
Objectifs
Les dysfonctionnements des interneurones cholinergiques du striatum (CINs) sont impliqués dans un large éventail de troubles neurologiques et neuropsychiatriques qui représentent un fardeau social et économique élevé pour la population mondiale. Ces interneurones font partie d'un réseau impliqué dans les apprentissages sensorimoteurs. L'hypothèse principale de ce projet est que les CINs présentent une diversité moléculaire qui peut être liée à leur hétérogénéité fonctionnelle. Il s'agit d'un projet très innovant car les CINs ont jusqu'à présent été considérés comme une population homogène, excluant toute possibilité de diversité fonctionnelle. Plus précisément, nous voulons analyser les gènes exprimés par les CINs et, surtout, établir le lien entre ces gènes et les propriétés fonctionnelles évaluées à l’aide d’approches anatomiques, électrophysiologiques et d’imagerie chez la souris. Décrypter la diversité moléculaire des CINs nous permettra de mieux comprendre leur rôle dans les nombreuses pathologies impliquant ces interneurones, notamment dans la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Si l'on considère que le processus pathologique de la maladie de Parkinson affecte différemment des sous-populations spécifiques d’interneurones cholinergiques, les résultats de notre étude devraient permettre d'améliorer les stratégies thérapeutiques en ciblant sélectivement la/les sous-population(s) appropriée(s). Considérant que les interneurones sont impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques dont le coût sociétal dans la population européenne est considérable, nous espérons que mieux comprendre les mécanismes sous-tendant ces troubles neurologiques contribueront à en améliorer le traitement.
Procédures
- Une contention pour procéder à des injections intra-péritonéales et sous-cutanées. - La plupart des souris subiront une chirurgie stéréotaxique permettant l’injection intracérébrale de composés sous anesthésie générale et avec une analgésie appropriée. La chirurgie proprement dite dure entre 30 et 60 minutes et les souris ne sont opérées qu’une seule fois. - Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer les déficits moteurs. Durée maximale: 15 min. - Certains animaux subiront une perfusion intracardiaque pour prélévement (procédure terminale, durée : 3 min). - Des enregistrements électrophysiologiques sur animaux anesthésiés (procédure terminale, durée: 5h). Un même animal peut subir plusieurs interventions mais chaque intervention n'est faite qu'une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues concernent d'une part les injections intrapéritonéale et sous-cutanées et d'autre part, les chirurgies stéréotaxiques. Les nuisances liées à la chirurgie stéréotaxique sont bien tolérées et n'ont que peu d'impact sur les animaux grâce aux soins post-opératoires. En revanche, elles peuvent être plus sévères chez les animaux rendus parkinsoniens. Ce modèle de la maladie de Parkinson entraine en effet la destruction unilatérale des neurones dopaminergiques. Cette destruction peut affecter les comportements alimentaire et dipsique chez environ 20% des animaux et entrainer une perte depoids sévère. De tels effets ne sont pas observés chez les animaux injectés contrôles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes in vitro ne peuvent pas reproduire le fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique.
Réduction
En maintenant notre animalerie dans le respect des bonnes pratiques, nous nous efforçons de minimiser la variabilité induite par le stress ou par la présence de pathogènes. Afin de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire, nous utilisons le calcul de Puissance lors de la planification des expériences : ce calcul permet de fixer un effectif tel que l’on ait 80% chances de vérifier notre hypothèse pour un seuil de significativité inférieur à 5%. Cependant ce calcul nécessite de connaître au préalable la taille de l’effet et la variabilité des mesures, ce qui n’est pas toujours possible. Par expérience nous avons déterminé pour les expériences de physiologie que des effectifs comprenant 10 à 15 cellules issues de 7 à 8 animaux (mâles et femelles) nous permettent de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux. Pour les analyses moléculaires et cellulaires, 6 animaux/groupe sont nécessaires. Ceci prend en compte les problèmes susceptibles de survenir aux différentes étapes de l’expérimentation et qui peuvent amener à écarter des animaux. Les analyses statistiques appropriées seront réalisées. D’autre part, afin de réduire le nombre de souris et de s’assurer de la reproductibilité des résultats, les paramètres d’injection (coordonnées stéréotaxiques, quantités de vecteurs infusés et délai d'expression des transgènes) et les conditions expérimentales pour les expériences in vitro (ex : utilisation de nouveaux anticorps) sont toujours testés lors d’expériences pilotes. Enfin, pour limiter le nombre d'animaux produits, nous utilisons à la fois des animaux mâles et femelles.
Raffinement
Les souris sont maintenues en groupe (de 2 à 5 animaux par cage) pour éviter l’isolement social, avec enrichissement de l’environnement qui est régulièrement renouvelé afin de diversifier au maximum l'environnement et permettre un maximum de comportements proches des comportements naturels. Lors de la chirurgie, nous utiliserons un anesthésique volatil qui par rapport à un anesthésique injectable permet une induction et un réveil rapides ainsi qu'une meilleure stabilité du niveau d’anesthésie. Ceci améliore la récupération post-opératoire et limite la létalité. Cet anesthésique n’ayant pas d’effet antalgique, une injection d'antalgique est réalisée 30 minutes avant la chirurgie. La température corporelle des souris est maintenue constante par une couverture chauffante thermostatée. Du gel ophtalmique maintient les yeux humides. Avant l’incision du scalp, une analgésie locale est effectuée. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés et la zone opérée est désinfectée. La fréquence des visites augmente pour s’assurer d’une bonne récupération des animaux et intervenir rapidement si problème. Nous vérifions particulièrement les signes de douleurs selon une grille qui tient compte de l’aspect général de l’animal, de son poids, de son comportement naturel et induit. Si un animal présente des signes de douleurs (pelage terne, poil hérissé, dos voussé, yeux mi-clos, apathie), il reçoit un traitement antalgique toutes les 24h et est observé deux fois par jour. Si au bout de 48h, il n’y a pas d’amélioration la souris reçoit à nouveau une injection d'antalgique. L’absence d’amélioration le lendemain entraine l’euthanasie. D’expérience, les chirurgies stéréotaxiques consistant à délivrer des vecteurs viraux sont bien tolérées. Les modèles de la maladie de Parkinson peuvent nécessiter un traitement antalgique pour environ 20% des animaux. 10% à 20% de ceux-ci ne sont pas améliorés par le traitement antalgique et sont euthanasiés.
Choix des espèces
Compte tenu du degré de similarité anatomique et cellulaire important entre le cerveau de souris et le cerveau humain, la souris est un modèle de choix pour étudier le rôle des CINs en condition normale et pathologique. D’autre part la souris nous permet d’utiliser tous les avantages des techniques de transgénèse et d’induction de protéines d’intérêt par injection d’AAVs. Nous utilisons des souris sauvages C57/BL6J et des souris transgéniques sans phénotype dommageable sur le même fond génétique. Les animaux utilisés dans ce projet sont adultes (P>30, 20 à 35g) car nous travaillons sur la maladie de Parkinson, une maladie neurodégénérative touchant le sujet adulte.
Description anatomique, perturbation fonctionnelle et enregistrement de la voie cortico-réticulo-spinale afin d’identifier son rôle chez l’animal contrôle et dans des modèles de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la queue sur le souriceau vigile, puis à l'âge adulte une chirurgie d'une heure et demie sous anesthésie, ou deux chirurgies d'une heure espacées de deux semaines. Une semaine plus tard commencent les tâches de locomotion fine, un jour sur deux pendant six semaines, jusqu'à dix-huit séances et dix-huit heures par animal. 2 151 souris passent par ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 477 d'entre elles et modéré pour 674, afin de cartographier une voie nerveuse reliant le cortex à la moelle épinière. Deux lignées reproduisent la sclérose latérale amyotrophique : les animaux sont utilisés avant l'apparition des symptômes, les reproducteurs gardés quelques jours au-delà des premiers signes, et tous sont tués pour prélèvement.
Objectifs
Le projet vise à caractériser le rôle d’une connexion entre le cortex et la moelle épinière via une région appelée formation réticulée, dans la motricité des pattes postérieures de la souris. Cette connexion existe mais est peu étudiée. Nous cherchons maintenant à caractériser son anatomie plus précise (cartographie), ainsi que le rôle de ces neurones dans une situation physiologique, chez l’animal éveillé libre de ses mouvements. Plus pécisément, nous avons pour objectif de : 1) effectuer la cartographie complète de cette voie, 2) analyser les conséquences de perturbations de cette voie (inhibition ou ablation) sur les comportements moteurs des souris, 3) identifier les neurones de cette voie en enregistrant leur activité électrique grâce à des électrodes, , et corréler leur activité avec le comportement observé, 4) identifier si cette voie est impliquée dans des modèles animaux de sclérose latérale amyotrophique.
Bénéfices attendus
Les fonctions de la connexion entre le cortex et la moelle épinière via une région appelée formation réticulée sont encore mal connues, mais elle pourrait servir à compenser l’atteinte d’autres voies (celle directe entre le cortex et la moelle épinière) lors de situations pathologiques (sclérose latérale amyotrohique, lésion traumatique de la moelle épinière, etc.). Notre projet permettra de caractériser l’activité de ces neurones dans le cadre d’un comportement moteur, et ainsi de poser des hypothèse sur les conséquences de leur atteinte en situation pathologique.
Procédures
Les souriceaux seront soumis à une biospie de queue réalisée sur animal vigil (durée: quelques secondes). Les animaux adultes subiront, sous anesthésie, soit une chirurgie unique durant environ 1,5 heure, soit deux chirurgies à 2 semaine d'écart, chacune durant au plus 1 heure. Au minimum une semaine après la dernière chirurgie, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum 1h, à raison d’un jour sur deux, pendant jusqu’à 6 semaines. Au maximum chaque animal sera donc testé 18 fois, pendant 18 heures au total.
Impact sur les animaux
La biospie de queue entraine une douleur légère de courte durée. Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux. Deux lignées de souris modèles de la sclérose latérale amyotrophique sont utilisées. Toutefois, nous nous intéressons à ce qui se passe avant le développement des symptômes de la maladie, donc les animaux utilisés pour les expériences de comportement et les enregistrements ne présenteront pas de symptômes. Seuls les animaux nécessaires à la reproduction pourront être gardés quelques jours après l’apparition des tous premiers symptômes (position anormale ou tremblement du membre postérieur lors du test de suspension par la queue, ou arrêt de la prise de poids), tant qu’il n’y a pas de paralysie ou d’atteinte de la locomotion.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Le projet porte sur la voie cortico-reticulo-spinale, c’est-à-dire un circuit complexe comprenant plusieurs noyaux du cerveau et la moelle épinière. Un tel circuit est impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doit être intact pour pouvoir être étudié. Il est impossible à modéliser numériquement car les propriétés des différents éléments sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et obtenir des résultats spécifiques de genre. Les expériences seront effectuées de façon séquentielle, afin de disposer des résultats de la cartographie et des expériences pilotes avant d’effectuer les expériences de comportement. Un arbre décisionnel précis permet de n’effectuer ensuite que les lots pour lesquels la faisabilité est avérée, ce qui permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. En cas de necessite des decisions seront prises en accord avec le veterinaire, la Structure chargee du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour une prise en charge adaptee des animaux. Des animaux qui ne subissent par les chirurgies sont herbergés avec les animaux tests. Ils sont présents sur la plateforme d’arrivée des tests de comportements, réduisant ainsi le stress des animaux tests et les motivant à faire les tâches sans qu’une restriction hydrique soit nécessaire.
Choix des espèces
L’étude de la communication entre le cortex et les circuits locomoteurs spinaux requiert l’utilisation de mammifère. La souris est un modèle largement utilisé dans l’étude du cortex moteur, et des comportements locomoteurs. De plus, nous avons la possibilité de mimer chez la souris les mutations génétiques que l’on peut retrouver dans les formes familiales de sclérose latérale amyotrophique, ce qui n’est pas possible dans d’autres espèces. Les animaux sont utilisés à partir de 30 jours après la naissance, car c’est l’âge à partir duquel la voie de communication entre le cortex et la moelle a fini son développement
Elevage de souris transgéniques à des fins de recherche biomédicale à visée thérapeutique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Produites pour alimenter d'autres projets du même laboratoire sur les maladies neuromusculaires, 25 400 souris de sept lignées génétiquement altérées vont être élevées et génotypées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 20 865 d'entre elles et modéré pour 4 535. Chaque souriceau subit entre le septième et le douzième jour de vie un prélèvement de queue et un tatouage des phalanges, l'ensemble prenant moins de cinq minutes. Les animaux porteurs des pathologies étudiées peuvent développer une atteinte locomotrice, une respiration accélérée ou des signes de déshydratation, et le porteur indique les tuer avant l'apparition des symptômes lorsqu'aucune expérience ne les attend. Les autres sont maintenus en vie pour la reproduction ou versés à des projets applicatifs, l'effectif de 25 400 étant estimé à partir de l'historique de production de l'établissement et de "besoins" susceptibles d'évoluer.
Objectifs
Ce projet a pour but de produire et de génotyper des animaux d'élevage à des fins d'utilisation scientifique. Il permettra l’élevage de 7 souches de souris génétiquement altérées nécessaires à la mise en œuvre de différents projets de recherche ayant pour but de comprendre la physiopathologie des maladies étudiées dans notre Laboratoire et de trouver des approches thérapeutiques innovantes pour des maladies neuromusculaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de molécules d’intérêt ou de produits de thérapie génique pour un groupe de maladies humaines rares et orphelines de médicaments, sur des modèles de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de maladies neuromusculaires rares.
Procédures
Les prélèvements de tissus à partir d'un très petit morceau de queue sont réalisés sur animaux vigiles. Cet acte est réalisé en même temps que le tatouage des phalanges et n’est pratiqué qu’une seule fois. Au total, moins de 5 minutes sont nécessaires pour réaliser ces deux actes par animal. En effet, si les prélèvements de tissus s'executent en moins d'une minute, les instruments doivent être désinfectés entre chaque animal ce qui peut prendre 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la méthode de prélèvement de tissu sur jeunes animaux vigiles pour le génotypage. La contention d’animaux jeunes pour se faire peut entrainer un stress et une douleur légère passagère ne dépassant pas quelques heures. Les animaux porteurs des pathologies étudiées dans notre Laboratoire peuvent présenter un phénotype dommageable de type atteinte locomotrice, polypnée ou signes de déshydratation. Ces symptômes peuvent correspondre à un degré d'inconfort jugé modéré.
Devenir
Euthanasie des animaux ou maintien en en vie pour la reproduction ou une utilisation continue dans des projets applicatifs.
Remplacement
Un effort de remplacement est réalisé en amont voire en parallèle du programme d'élevage. En effet, nous essayons dans un premier temps de répondre aux questions biologiques qui se posent à nous à l'aide de modèles cellulaires. L’utilisation d’animaux dans des études n'est effective que lorsque les modèles cellulaires ne peuvent pas répondre aux questions biologiques. Par exemple, lorsqu'il est nécessaire d’étudier les symptômes liés à des troubles du comportement moteur caractéristiques des maladies neuromusculaires que nous étudions ou encore pour étudier la biodistribution d’un traitement dans l'organisme.
Réduction
Nous avons prévu d’utiliser un total de 25400 souris pour fournir les animaux nécessaires à l'ensemble des expériences pour les 5 années d'études à venir sachant que nos besoins peuvent évoluer en fonction d'éventuelles ré-orientations des objectifs scientifiques à l'appui de nouvelles publications scientifiques et de nouveaux résultats. Aussi nous sommes-nous basés sur les données statistiques de 2022 et 2023 ainsi que sur l'historique des données de production des lignées maintenues dans notre établissement pour faire cette estimation. Cette base d'estimation nous amène à envisager une moyenne de 5080 souris par année pour les 7 lignées de souris objet de ce dossier, soit un total de 25400 souris sur 5 ans. Les deux sexes seront utilisés dans les protocoles lorsque la maladie n’est pas liée au sexe ou que le projet n’est pas dépendant d’un des deux sexes.
Raffinement
Dans ce programme d’élevage, les animaux mimant les pathologies étudiées seront utilisés pour les projets applicatifs ou seront euthanasiés avant l’apparition des symptômes. Nous évitons ainsi l’expression du phénotype dommageable quand il n’est pas associé à un besoin expérimental. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi (maisonnette en cellulose, bâtonnets en bois, élément pour la confection des nids, copeaux, tunnel, autres éléments spatiaux d'enrichissement) et sont observés quotidiennement. Au moment du sevrage, nous ne séparons les fratries que par sexe et ne regroupons pas les mâles (frères et germains) à plus de 2 semaines d'écart d'âge pour limiter le risque d’agressivité. De la nourriture est ajoutée directement sur le sol de la cage et des pipettes d’eau plus longues sont mises en place pour que les juvéniles sevrés ou les animaux présentant une atteinte locomotrice aient facilement accès à l'eau et à l'aliment. Le cas échéant, un aliment hydratant et nourrissant peut être placé à même le sol dans une coupelle pour les animaux déshydratés. Pour ne plus attraper les animaux par la queue lors du change des litières, les zootechniciens utilisent leurs mains jointes en creux ou des tubes pour inciter les animaux à passer d’une cage à l’autre par eux-mêmes. Concernant les biopsies de tissu pour l'identification génétique des animaux, elles sont effectuées une seule fois entre 7 et 12 jours de vie par prélèvement d'un très petit bout de queue (moins de 0,5 mm). Ce prélèvement de tissu est réalisé à un âge où l’ossification et l’innervation des tissus ne sont pas encore bien différenciées.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter les mutations génétiques responsables des différentes maladies étudiées dans notre Equipe, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques mimant ces maladies. Les animaux de ce projet d’élevage seront utilisés à un stade précoce pour les identifications individuelles (microtatouage) et l'identification génétique ; et à un stade plus tardif de maturité sexuelle pour le renouvellement des reproducteurs.
Rythmes cérébraux hippocampiques et codage neuronal chez les souris modèle des troubles du spectre autistique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier comment l'hippocampe rejoue les expériences vécues, 356 souris porteuses de mutations liées à l'autisme vont être utilisées : 196 opérées et enregistrées sous anesthésie profonde sans jamais se réveiller, 160 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ces dernières reçoivent des électrodes intracrâniennes au cours d'une chirurgie stéréotaxique de deux heures, puis sont enregistrées une heure par jour pendant deux semaines, pendant qu'elles explorent une arène ou dorment, hébergées seules jusqu'à cinq semaines. Le porteur signale que certains souriceaux porteurs de la mutation meurent à la naissance d'une hypotonie générale, et que d'autres animaux perdent leur implant par choc accidentel. La surveillance repose sur des points limites de bien-être général qui déclenchent des soins ou la mise à mort, dont les seuils ne sont pas donnés.
Objectifs
La sensibilité extrême aux informations sensorielles des personnes autistes sous-entend un traitement cérébral de l’information bien particulier. Ce projet a donc pour objectif d’étudier les propriétés du traitement cérébral de l’information chez des souris reproduisant des traits observables dans les troubles du spectre de l’autisme. Plus précisément, nous étudierons l’activité de groupes de neurones présents dans une région du cerveau appelée hippocampe, structure impliquée dans la mémoire épisodique (mémoire des évènements autobiographiques -vécus à la première personne) et sociale. Il a été montré, chez le rongeur puis chez l’Homme, que lorsque nous vivons une expérience certains neurones de cette structure s’activent dans un ordre temporel précis qui récapitule, dans une fenêtre temporelle réduite (quelques millisecondes) cette même expérience. Lorsque l’individu est hors contexte, ces mêmes neurones reproduisent à nouveau cette même activité séquentielle, rejouant sans la vivre directement l’expérience passée. Or, cette propriété de réactivation séquentielle, rendue possible par l’architecture des circuits neuronaux de l’hippocampe, joue un rôle primordial dans la mémoire et l’apprentissage. Puisque l’architecture neuronale de l’hippocampe est altérée chez la personne autiste et dans les modèles de l’autisme, nous émettons hypothèse qu’une des traits comportementaux propre à la personne autiste est due à une anomalie de ce traitement séquentiel. Nous tenterons de caractériser ces altérations ainsi que les mécanismes responsables de ces déficits chez des souris reproduisant des traits observables dans les troubles du spectre de l’autisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiologiques responsables des déficits cognitifs propres aux troubles du spectre autistique. A long terme, ceci pourrait permettre l'élaboration de traitements prévenant ou rémidiant à ces déficits.
Procédures
Un groupe d’animaux subira des enregistrements électrophysiologiques intracrâniens sous anesthésie profonde suivie de chirurgie terminale sous anesthésie. Le deuxième groupe se verra implanter des électrodes intracrâniennes sous chirurgie stéréotaxique (2h). Ceci se fera sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgesie. Une semaine plus tard l'activité cérébrale sera enregistrée alors que l’animal explore une arène circulaire et lors de phases de sommeil, pour un total d'une heure par session, une session par jour pour un maximum de deux semaines. A la fin des enregistrements, les animaux seront soumis à une chirurgie terminale sous anesthésie profonde et analgesie. Une fois implantés les animaux seront hébergés en individuel pour 5 semaines maximum (3 semaines en moyenne), le temps des enregistrements.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables suivants sont attendus : l'anesthésie peut engendrer une détresse respiratoire; il peut survenir une douleur post-opératoire; un stress associé à l'isolement d'une partie des animaux ; un stress associé à la manipulation par l'experimentateur; la perte des implants par choc accidentel; la mort à la naissance de certaines souris portant le gène d'autisme (hypotonie générale). Les souris Nudes ont un phénotype dommageable et sont hébergées dans une animalerie adaptée (SOPF). Pour l'expérimentation, elles sont transférées dans une animalerie conventionnelle sous armoire ventilée pour une utilisation immédiate et sans réveil.
Devenir
Les animaux seront mis a mort et les cerveaux prélevés post-mortem caractériser leur état histologique et révéler la localisation des électrodes après les enregistrements.
Remplacement
L’étude de l’intégrité des oscillations hippocampique et de leurs fonctions nécessite l’observation de systèmes neuronaux intacts. Par conséquent, cette étude ne peut se faire que sur l’animal soit vigile en comportement, soit anesthésié. Ceci rend donc impossible l’utilisation de modèle in silico ou d'organoides. A ce jour, très peu d'enregistrements électrophysiologiques de l’activité hippocampique ont été réalisés chez les souris porteuses des gènes impliqués dans l'autisme que nous étudions. Nous avons opté pour l’utilisation de souris plutôt que de rat étant donné que les modèles d’autismes qui nous intéressent nécessitent la réalisation de mutation de gènes. La souris présente davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale (la réalisation de mutation génétique est plus simple que sur d’autres modèles).
Réduction
Afin de réduire au maximum les éventuelles souffrances induites par les chirurgies ainsi que le nombre d’animaux, la procédure d’enregistrements sous anesthésie (Procédure 1) a été mise en place pour déterminer en premier lieu, les phénotypes électrophysiologiques propres à nos modèles. Ainsi, elle permet de préciser à l’avance les paramètres et patrons à examiner lors des enregistrements chez l’animal en comportement. Par exemple si nos enregistrements anesthésiés révèlent une anomalie spécifique à un certain rythme cérébral dans une structure et non une autre, nous n’étudierons que la structure impliquée et le comportement auquel elle est associée. Ceci nous permettra donc de limiter le nombre d’implantation à des fins d’enregistrements en comportement. L’avancée technologique concernant la miniaturisation des systèmes électroniques et d’électrodes permet maintenant d’enregistrer un grand nombre de canaux, sur de multiples sites simultanément. Un grand nombre de nos analyses reposant sur le nombre de cellules enregistrées , ces progrès nous permettent de diminuer fortement le nombre de souris utilisées. Pour les souris des portées de modèles autistiques, les animaux présentant le génotype requis par l’étude constitueront la population cible ; les animaux ne présentant pas le génotype requis seront aussi étudiés en tant que contrôles de la population cible, réduisant le nombre de portées à produire dans le cadre de cette procédure. De même, les mâles et femelles seront étudiés dans le cadre des procédures TSA, aboutissant à une utilisation de l’ensemble des animaux de chaque portées. Enfin, les données obtenues au cours du projet seront mises à disposition de la communauté scientifique pour analyses complémentaires et utilisation dans des modèles computationnels. Les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.
Raffinement
Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). La souffrance animale est minimisée par les conditions d'élevage (cages collectives, les animaux sont mis en présence de matériel d’enrichissement : un dôme en carton permettant la nidification (sauf protocole 2) , une tige de papier pouvant être rongée et faisant aussi office de matériel de nidification, ainsi qu’une briquette en bois pour le rongeage), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie, regulation thermique), le suivi régulier des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité). Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet, dès lors qu’ils ont atteint l’âge adulte. Les souris sont habitués progressivement à la manipulation afin de minimiser le stress. Bien que les animaux soient sujets à une mutation génétique, ces derniers ne présentent aucun phénotype dommageable s’ils ont survécu à la naissance. Enfin les animaux ont un accès illimité à l'eau et la nourriture.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser la pathologie cérébrale concernée par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'humain) et les dommages éventuels (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives, notamment des aspectis sociaux et de mémoire spatiale, a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus au sein de l’équipe et avec la communauté scientifique ainsi qu’une minimisation du nombre d'animaux utilisés. Les animaux seront de jeunes adultes (7-8 semaines) puisque nous nous intéressons à un système nerveux mature. Nous voulons aussi minimiser autant que possible la durée d'élevage en conditions d'animalerie de laboratoire.
Etude de deux peptides sur leur effet thérapeutique potentiel dans un modèle murin de maladie neurodégénérative impliquant la protéine Tau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet portent une mutation du gène Tau qui leur fait développer, à partir de quatre mois, une paralysie progressive des membres postérieurs. 676 d'entre elles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 436 et modéré pour 240. 240 subissent une biopsie de la queue pour génotypage et 304 une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, geste qui peut provoquer une ulcération de la cornée ou une exophtalmie, afin de faire produire dans leurs neurones un fragment de protéine censé bloquer l'agrégation de Tau. Certaines sont tuées un mois après l'injection, d'autres à cinq mois pour éviter des symptômes moteurs plus graves, et d'autres encore, écrit le porteur, "pour fin d'accouplement et génotype sans intérêt".
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est notamment caractérisée par le dysfonctionnement de la protéine Tau dans les neurones du système nerveux central. Cette protéine, dont la dégradation normale est altérée dans la maladie, s’accumule et s’agrège de façon toxique dans les neurones et finit par entraîner la dégénérescence du cerveau. Nous avons mis en évidence qu’une protéine X interagissait avec Tau. Nous avons également constaté que l’expression de cette protéine X est faible dans le cerveau de patients atteint de la maladie d'Alzheimer et que cette baisse est associée à l’apparition des formes pathologiques de Tau dans les neurones. La partie de la protéine X impliquée dans l’inhibition de l'agrégation de la protéine Tau a été identifiée. Nous proposons dans ce projet d’étudier l’impact thérapeutique potentiel de cette partie de la protéine X sur la progression de cette maladie de Tau chez la souris. Pour cela, nous disposons au laboratoire d’un modèle de souris porteur d’une mutation du gène de Tau générant une maladie proche de la maladie d'Alzheimer et présentant une accumulation de Tau dans les neurones du cerveau et de la moelle épinière. Notre objectif à court terme est de produire dans le cerveau et la moelle épinière de souris deux formes plus ou moins longue de cette partie de la protéine X afin de déterminer à moyen terme leur efficacité à ralentir/guérir la maladie.
Bénéfices attendus
Si la production dans les neurones des parties de la protéine X, dont nous savons qu'elles sont capables d'empêcher l'agrégation de Tau, agit sur l'évolution de la maladie chez ces souris, de nouvelles perspectives thérapeutiques seraient envisageables chez l'homme atteint de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Une biopsie de la queue de courte durée sera effectué sur 240 animaux. Pour l'expérimentation, 304 animaux issus d'accouplement de souris homozygotes Tau seront soumis à une injection intraveineuse. Une injection rapide (moins de 20 secondes) est effectuée sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Certaines souris seront génotypées. La contention et la biopsie de queue sont des gestes bien maîtrisés mais qui peuvent générer de légères douleurs et un court moment de stress chez la souris. Le modèle de souris Tau présente un trouble moteur se développant spontanément et progressivement à partir de 4 mois d’âge et développe une paralysie légère et progressive des membres inférieurs pénalisant la mobilité de la souris. Les expériences d’injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbitaire peuvent présenter dans de très rares cas une opacité/ulcération de la cornée ou une exophtalmie.
Devenir
Certaines souris seront euthanasiées pour fin d'accouplement et génotype sans intérêt. D'autres seront euthanasiés à 1 mois post-injection et cela avant l'apparition des troubles moteurs (à partir de 4 mois) pour vérifier la présence de la partie de la protéine X dans les neurones. Enfin certaines souris vieilliront jusqu'à 5 mois d'âge pour vérifier l'effet de la partie de la protéine X sur l'agrégation de Tau dans les neurones, âge auquel elles seront toutes euthanasiées pour limiter l'apparition de symptôme moteur plus grave pour les souris.
Remplacement
Nos résultats obtenus sur des neurones en culture tendent à montrer un effet inhibiteur de cette partie de la protéine X sur l’agrégation et l’accumulation de la protéine Tau. Le passage sur un modèle souris est nécessaire pour évaluer les bénéfices potentiels de ces fragments de protéine au plan moléculaire et surtout au plan fonctionnel sur la motricité de l'animal. En effet, nous voulons voir dans ce modèle si ces fragments peuvent 1) être exprimé dans les neurones, 2) protéger ces cellules de la toxicité de Tau et 3) prévenir une perte fonctionnelle lié à la toxicité de ces neurones. N’ayant aucun autre modèle disponible pour cette évaluation indispensable avant des études possible chez l’homme, ce passage sur modèle animal est incontournable.
Réduction
Nous récupérerons les cerveaux et moelles épinières des animaux soumis aux tests de motricité pour l’analyse moléculaire. Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à notre étude, le cerveau et la moelle épinière de chaque souris seront coupés en deux. Chaque partie sera analysée par deux types d'analyses. Le calcul du nombre d'animaux nécessaire a été effectué par des tests statistiques et basé sur une comparaison de deux moyennes (témoins/traités) au cours du temps dans chaque expérience.
Raffinement
Le modèle de souris utilisé présente un trouble moteur léger à partir de 4 mois d’âge qui progresse jusqu’à 5 mois d’âge. Afin de limiter une possible souffrance de l’animal liée à un trouble moteur, la nourriture sera déposée directement et systématiquement dans la cage à partir de 4 mois d’âge. L’ensemble des expériences d’injection seront réalisées sur des souris anesthésiées. Une observation attentive de la douleur sera effectuée. Après réveil de l’animal, une évaluation hebdomadaire du mal être des animaux basée sur une observation attentive de 5 minutes du comportement de l'animal, sera effectuée par l’expérimentateur et/ou les animaliers sur différents critères (voir tableau scoring). Des analgésiques pourront être administrés par voie sous cutanée pour réduire au minimum une possible souffrance des animaux. Cette observation sera renforcée par un portoir dit "intelligent" dans lequel les souris seront analysées sur leurs motricité 24h/24h, 7j/7j. Cette activité nous permetta d’identifier les cages de souris présentant des niveaux de motricité anormales (agressivité, immobilité …) et d'intervenir précocément pour améliorer en conséquence le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Etant donné nos résultats positifs sur l’efficacité de la région de la protéine X à inhiber l’agrégation de la protéine Tau purifiée, nous avons choisi d’étudier ce modèle murin qui présente certaines anomalies observées dans la pathologie humaine aussi bien sur le plan moléculaire que comportemental. Ce modèle, déjà bien caractérisé, fait l’objet de nombreuses publications scientifiques et nous donne une bonne base de travail pour la mise en place de ce projet. La production de la région d'intérêt de la protéine X sera induite à 1 (stade précoce) et 3 (stade médian) mois d'âge; l’évolution de la tauopathie sera suivie au niveau moléculaire et fonctionnel sur la locomotion des souris et comparée à l’évolution des animaux témoins.