Système respiratoire

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des candidats médicaments et des agents perturbateurs de la respiration, jusqu'à deux fois par jour pendant 30 jours consécutifs, subissent jusqu'à dix micro-prélèvements de sang après section de la pointe de la queue, et peuvent présenter bronchoconstriction, dépression respiratoire ou bronchospasme. Le porteur présente ces micro-prélèvements sur animal non contenu comme laissant la souris "signifier librement tout manquement à leur bien-être". L'effectif de 1 080 découle d'une estimation de quinze candidats médicaments sur cinq ans dans "l'hypothèse la plus défavorable", sans que ce nombre de composés soit justifié.

Objectifs

La pléthysmographie sur animaux vigiles et non contraints et la mesure des oscillations forcées sur animaux anesthésiés sont des techniques utilisées pour étudier la fonction pulmonaire chez les rongeurs de laboratoire. Ces techniques mesurent les variations de fréquence, de débit et de pression qui se produisent avant et après l'exposition à un médicament ou toutes autres provocations. A ce jour, aucun modèle alternatif n’est suffisamment intégré et complexe pour permettre d’étudier l’effet d’un candidat-médicament sur la fonction pulmonaire et seule la mesure directe sur animal vivant permet de mettre en évidence l’absence d’effet ou un effet délétère d’un candidat-médicament sur la fonction pulmonaire. Il est également possible de mesurer une activité bénéfique si le candidat-médicament permet de rétablir une fonction respiratoire normale après qu’elle est été perturbée par un agent perturbateur (constituant bactérien, allergènes, médicaments…) Notre objectif est de mesurer l’effet de produits pharmacologiques en cours de développement, candidats-médicaments, sur la fonction pulmonaire chez la souris dans le but de sélectionner les traitements sans impact ou rétablissant une fonction respiratoire normale.

Bénéfices attendus

La mesure de l'activité des composés pharmacologiques sur les paramètres respiratoires permettra de sélectionner les composés ne présentant aucun effet délétère et ceux présentant une activité bénéfique lorsqu’il permet de rétablir une fonction respiratoire normale après qu’elle est été perturbée par un agent sensibilisant (constituant bactérien, allergènes, médicaments…). Ce projet permet de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs afin de poursuivre leur développement pour le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour administrer les candidats-médicaments étudiés et des agents perturbateurs de la fonction respiratoire. Ces composés pourront être administrés sur animaux vigiles ou sur animaux anesthésiés (anesthésie de quelques minutes). Les candidats-médicaments pourront être administré de 1 à 30 jours consécutifs et de 1 à 2 fois par jour. Les traitements 2x/jour et/ou de longue durée ne seront effectués qu’avec des voies d’administration qui le permettent. Afin de suivre les paramètres sanguins (biochimiques, formule sanguine…) au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang sur une durée minimum de 72h. Un prelèvement de sang terminal sera effectué sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins de 0.5mm) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins. Les agents perturbateurs peuvent entrainer un remodelage bronchique (sans phénotype visible), ou des effets transitoires tel qu’une bronchoconstriction, une dépression respiratoire ou un léger bronchospasme qui se traduit par une courte période d’apathie (quelques secondes à quelques dizaines de minutes et visible des expérimentateurs les plus aguerris) suivi d’une récupération rapide et complète de l’animal

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…) et pharmacocinétiques. Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans la distribution et l’activité des médicaments ou la complexité des réponses inflammatoires, circulatoires et de la fonction pulmonaire. De plus, les affections pulmonaires sont également fortement influencées par la respiration (mécanique) et les échanges gazeux qui impactent fortement les réponses cellulaires mais aussi l’organisme dans son entier. Une dysfonction de la respiration entraine irrémédiablement une atteinte de tous les organes et fonctions biologiques, elles-mêmes impliquées dans la réponse immunitaire et l’ADME d’un médicament (Administration, Distribution, Métabolisme et Elimination). Pour ces raisons, une approche chez l’animale, reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez la souris, car cette espèce est la mieux caractérisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments et permet le recourt à de très nombreux outils (animaux GM, pléthysmographie, produits et tests biologiques…) permettant de valider leur efficacité.

Réduction

L’étude de la variabilité des paramètres mesurés dans les études précédentes a permis de calculer que des lots de 6 à 12 animaux par groupe permettent une analyse statistique efficace des résultats. Les effectifs utilisés seront déterminés en fonction des analyses réalisées. D’après notre expérience, nous estimons qu’un maximum de 15 candidats-médicaments seront évalués sur une période de 5 ans, soit un maximum de 1080 souris selon l’hypothèse la plus défavorable (6 groupes de 12 souris pour chaque candidat-médicament étudié).

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’une maisonnette, d’une roue d'activité (Fast-trac), d’une balançoire, d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contrainte temporelle (délai de livraison, délai trop court avant une période de travaux ou de vide sanitaire…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur avant le début de l’étude puis plusieurs fois par jour. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations. Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie et jusqu’au réveil complet des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Malgré les précautions prises en amont, les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments, pour mettre en évidence l'atteinte d'un point limite. Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour l’étude de la fonction pulmonaire, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De plus, de nombreux outils permettant de caractériser les réponses biologiques sont disponibles pour cette espèce. Les souris seront âgées d’au minimum 7 semaines, animaux adultes afin que les systèmes respiratoire, circulatoire et immunitaire soient entièrement développés et mature.

Les souris subissent cinq injections sous-cutanées par semaine pendant dix, vingt-huit ou quarante-deux jours, ou une incision dorsale sous anesthésie pour implanter une mini-pompe diffusant un inducteur de fibrose pendant sept à vingt-huit jours. 126 souris âgées de six à huit semaines sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le produit injecté enflamme et épaissit la peau, les poumons et les reins, ce qui reproduit une partie de la sclérodermie systémique pour y repérer des pièges extracellulaires de neutrophiles. Le porteur annonce une surveillance rapprochée destinée à détecter des points limites "préalablement établis", sans indiquer lesquels.

Objectifs

La sclérodermie systémique est une maladie qui modifie et épaissit la peau et d’autres organes les empêchant de fonctionner correctement. Il n’existe pas encore de traitement efficace. Certains globules blancs de notre organisme (les neutrophiles) sont capables d’éjecter autour d’eux un ensemble de molécules que l’on appelle NETs et qui dans des conditions normales forment des pièges à bactéries. Cependant, ces molécules peuvent être libérées de façon incontrôlée et être impliquées dans la progression de certaines maladies. Le rôle des NETs dans la sclérodermie est encore mal compris. Nous avons montré que des neutrophiles de patients libérent plus de NETs que ceux de sujets sains lorsqu’ils sont stimulés in vitro. Dans ce projet, nous visons à mettre en évidence l’existence de NETs dans des souris chez lesquelles nous aurons reproduit en partie la sclérodermie afin de pouvoir tester dans le futur des médicaments qui empêcheraient la formation des NETs et qui potentiellement freineraient l’avancement de la maladie.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’acquérir des connaissances supplémentaires sur les phénomènes mettant en jeu les NETs dans les tissus et dans la circulation sanguine lors de la progression de la maladie et ainsi démontrer la pertinence de chacun des modèles pour l’utilisation ultérieur d’un inhibiteur de NETs. A plus long terme, cela nous permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les NETs dans un contexte de sclérodermie systémique.

Procédures

Dans une première procédure, les souris subiront une injection sous-cutanée d'une solution induisant la fibrose ou d'une solution saline, 5 fois par semaine pendant 10, 28 ou 42 jours. Dans une seconde procédure, les souris subiront 1) une injection sous-cutanée d'une solution d'anesthésiant, 2) une incision au niveau dorsal pour créer une poche sous-cutanée dans laquelle sera implantée la mini-pompe osmotique contenant une solution induisant la fibrose ou une solution saline et 3) une suture. La durée de l'intervention sera de 10 à 15 minutes et la diffusion sous-cutanée de la solution fibrosante durera 7, 18 ou 28 jours.

Impact sur les animaux

L’injection sous-cutanée peut causer une douleur légère de courte durée. La manipulation, l’anesthésie et l’intervention chirurgicale peuvent être des sources importantes de stress physiologique et psychologique chez la souris. Lors de la pose de la mini-pompe, les souris peuvent ressentir de la douleur ou de l’inconfort à l’endroit de l’implantation. Les injections répétées ainsi que la diffusion sous-cutanée des inducteurs de fibrose induisent une inflammation et un épaississement des tissus cutané, pulmonaire et rénal.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire et des NETs en particulier nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Les résultats précédemment publiés par la communauté scientifique nous ont confirmé qu’il n’existe pas d'autre possibilité que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes mettant en jeu plusieurs types cellulaires au cours de la sclérodermie systémique. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécéssaire au plus juste grâce à un logiciel de statistique afin de limiter le nombre de souris utilisées. Pour l’analyse des résultats a posteriori, des tests statistiques adaptés seront utilisés. Une répartition aléatoire des animaux sera réalisée dès leur arrivée. Une banque de tissus sera récupérée pour éviter de refaire des expériences dans l’avenir.

Raffinement

Nous utiliserons une mini-pompe pour faire diffuser l'inducteur de fibrose dans la peau, évitant les injections répétées. Le deuxième inducteur de fibrose que nous utiliserons est très instable dans le temps et nécessite d’être préparé extemporanément. Dans le cas des injections répétées de ce second inducteur, les injections seront réalisées par deux expérimentateurs au niveau du dos de l’animal. Une rotation systématique dans le sens des aiguilles d’une montre sera faite afin de ne pas injecter quotidiennement au niveau du même site. Par ailleurs, ces expériences (injections multiples ou implantation pompe) ne se feront pas en un seul essai (126 animaux) mais seront fractionnées de façon à travailler sur des groupes plus petits améliorant la prise en charge de chacune des souris. Dans le cas de l’implantation de la mini-pompe, une analgésie pré-opératoire sera effectuée par injection sous-cutanée de buprénorphine. Une surveillance post-opératoire rigoureuse sera mise en place après l’intervention pour détecter tout signe de douleur, d’infection ou autres complications. Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter les points limites préalablement établis et d’éviter ainsi tout stress et souffrance. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle cellulaire capable de reproduire la complexité des interactions entre le système immunitaire, le système vasculaire et les tissus. La souris est considérée comme le modèle le plus approprié à l’étude de ces interactions complexes et plus particulièrement à l’étude du système immunitaire. En effet, la maturation ainsi que la réponse à un stimulus du système immunitaire murin sont très proches de celles de l’Homme. Les souris utilisées dans ce projet seront des souris « jeune adulte » âgées de 6 à 8 semaines. Les souris à cet âge ont un système immunitaire mature, essentiel pour modéliser la réponse inflammatoire et fibrotique propre à la sclérodermie. En termes de poids et de taille, les souris de 6 à 8 semaines sont assez robustes pour tolérer les injections répétées sans causer de stress excessif pouvant conduire à une mort prématurée. Les souris de cet âge peuvent par ailleurs subir l’intervention chirurgicale associée à l’implantation de la mini-pompe sans complication post-opératoire. Enfin, ce stade de développement permet une tolérance à la mini-pompe sous-cutanée et favorise une diffusion homogène de l'inducteur de fibrose.

La quantité d'anticorps commandée par le client détermine le nombre de lapins engagés dans chaque expérimentation, à raison de deux lapins par immunogène. 1 050 lapins vont être utilisés sur la durée du projet, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour développer environ 500 anticorps destinés à la recherche. Chaque animal peut subir jusqu'à vingt-cinq injections intraveineuses, quinze injections intramusculaires, huit injections sous-cutanées, trois injections intradermiques d'une vingtaine de points chacune et dix prélèvements sanguins. Le porteur reconnaît l'existence de méthodes sans animaux comme le phage display, affirme qu'elles "n'apportent pas la même qualité d'anticorps", et indique tuer les lapins en fin de projet pour obtenir "le maximum de sérum".

Objectifs

Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Les anticorps seront utilisés principalement dans la recherche académique. Environ 500 nouveaux anti-corps seront développés.

Bénéfices attendus

Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenu grâces aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 10 prélèvements. - Injection intraveineuse sur animaux vigile, environ 1 min, maximum 25 injections. - Injection en intradermique (une vingtaine de points environs par inejction), environ 3 minutes, maximum 3 injections. - Injection en sous cutané, environ 1 minutes, maximum 8 injections. - Injection en intramusculaire, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection en intraveineuse dans la veine marginale, environ 1 min, maximum 25 injections. -

Impact sur les animaux

La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une inflammation au niveau des sites d’injections peut être observée. Il peut y avoir une légère douleur à l’injection. De par notre expérience Nous ne nous attendons pas à d’autres nuisances, mais nous resterons vigilants à tous effets imprévus

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent (type phage display), ces approchent n’apportent pas la même qualité d’anticorps. La qualité de la banque naïve utilisée et la méthode de screening de cette banque de phages display ne permet pas d’obtenir de anticorps d’affinité suffisante. Pour palier partiellement à ce défaut, cela nécessite d’utiliser des banques dites « immunes » qui nécessitent d’immuniser le lapin et n’apporte aucun bénéfice en termes de remplacement. De plus ces technologies de développement d’anticorps monoclonaux chez le lapin ou la souris, ne sont pas encore complètement matures. Ils nécessitent un matériel particulier et des réactifs adaptés. Les chances de succès sont limitées comme le démonter le nombre d’anticorps en clinque issue de phage display qui reste marginal. Enfin l’obtention d’anticorps polyclonaux ne peux pas être remplacée par un mélange d’anticorps monoclonaux. Cette approche des anticorps multi clonaux ne permets pas non plus d’obtenir la même efficacité.

Réduction

Le nombre de lapins utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, mais est déterminé par la quantité d’anticorps attendue par le client. Nous obtenons environ 50 à 60ml de sérum au minimum par lapin, la majorité des projets nécessite plus 100ml. En effet, l’immuno purification par chromatographie d’affinité de ces sérums requiert un volume suffisamment pour obtenir quelques milligrammes d’anticorps c’est pourquoi nous utiliserons 2 lapins par immunogènes.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints alors, l’animal sera mis à mort pour éviter des souffrances.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes (lapins âgés de 12 semaines minimum) car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.

Une incision au niveau du cou, refermée par un fil de suture, pour instiller dans la trachée une élastase qui détruit une partie des alvéoles pulmonaires : 288 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs prélèvent les poumons sous anesthésie après exsanguination, à vingt et un, quatre-vingt-dix ou cent cinquante jours selon les groupes. Le projet teste si l'activation d'une protéine du métabolisme des lipides dans les fibroblastes permet de reformer des alvéoles, piste qui déboucherait sur un traitement de l'emphysème humain, aujourd'hui inexistant. Le porteur dispose de co-cultures 3D de cellules humaines qu'il décrit comme des "outils in vitro d'intérêt", tout en concluant qu'elles "ne peuvent pas se substituer complètement" au modèle murin.

Objectifs

L’emphysème est une maladie pulmonaire provoquant une destruction alvéolaire irréversible, sans traitement disponible actuellement. Une des causes de l’absence de réparation des alvéoles est le manque de lipides dans les fibroblastes (cellules de structure) qui entourent les cellules souches épithéliales des alvéoles. Activer les voies qui augmentent la synthèse de lipides dans les fibroblastes pourraient être un moyen d’induire une réparation des alvéoles au cours de l’emphysème. SREBP (Sterol regulatory element-binding proteins) est une protéine importante impliquée dans la synthèse des lipides. Notre hypothèse est que l'augmentation de la protéine SREBP dans les fibroblastes pourrait favoriser la réparation des alvéoles au cours de l’emphysème. Pour tester cette hypothèse, nous allons utiliser des souris ayant une délétion de deux protéines (Insig1 et Insig2) qui empêchent la synthèse de lipides. L’emphysème sera induit par une injection d’élastase dans la trachée, substance qui provoque une destruction alvéolaire partielle. Le niveau de sévérité de l’emphysème sera évalué par des analyses morphologiques du poumon. Pour étudier la capacité de ces cellules à former des alvéoles, nous mettrons en culture 3D des fibroblastes issus de ces souris avec des cellules épithéliales de souris contrôles. Nous anticipons l'augmentation du nombre d'alvéoles chez les souris génétiquement modifiées et une augmentation de la prolifération et de la différentiation cellulaire en culture 3D.

Bénéfices attendus

Si les souris ayant une absence de Insig1 et 2 présentent une réparation alvéolaire suite à l'injection d'élastase, cette voie sera considérée comme cruciale dans la réparation alvéolaire et pourrait mieux être étudiée chez l'homme pour créer de nouvelles alvéoles chez les patients souffrant d'emphysème pulmonaire. Les agonistes de la voie SREBP pourraient alors être envisagés pour traiter l'emphysème chez l'Homme.

Procédures

Instillation dans la trachée sous anesthésie générale, injection dans le péritoine sur animal vigile et prélèvement des poumons sous anesthésie générale après exanguination, sans réveil. Les animaux seront répartis de cette manière : i) le nombre d'alvéoles pulmonaires sera évalué à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 24 souris seront injectées à l’élastase vs 24 souris au PBS (contrôle), ii) la co-culture 3D permettra d'étudier les capacités des fibroblastes à former des alvéoles à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 24 souris seront injectées à l'élastase et 24 souris a PBS (contrôle).

Impact sur les animaux

Le modèle génétique induisant la délétion de Insig1 et Insig2 dans les fibroblastes n'est pas un phénotype dommageable pour les animaux. L’injection d'élastase nécessite une petite incision au niveau de l’avant du cou que nous refermons avec du fil de suture. Cette procédure est modérée avec un faible risque d'infection au niveau de la plaie.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever et étudier leurs poumons.

Remplacement

La variabilité des caractéristiques des patients ayant de l'emphysème comme leur âge ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Le modèle de souris emphysémateuse ayant une activation de SREBP permettra de déterminer si les cellules responsables de la régénération sont les fibroblastes dans l’emphysème pulmonaire et si SREBP est la protéine clé dans ce processus. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. Actuellement, nous disposons de modèles de co-culture cellulaire 3D chez l'humain qui ne peuvent pas se substituer complètement aux modèles murins mais qui représentent des outils in vitro d’intérêt pour étudier la dysfonction cellulaire chez les patients atteints d'emphysème pulmonaire. Les inconvénients majeurs de ces modèles sont la disponibilité des échantillons et la variabilité entre les patients (consommation de tabac, arrêt de la cigarette, sévérité de l'emphysème, âge, comorbidité, traitement,...).

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 288, correspondant au minimum pour obtenir des résultats significatifs. Pour l’ensemble des manipulations animales nous utiliserons 3 groupes : Le groupe ayant une activation de SREBP et deux groupes contrôles nécessaires pour ce type de modification génétique. Pour chaque expérience et pour chaque groupe de souris, les animaux seront injéctés soit à l'élastase, soit au PBS. Pour résumer, nous aurons 8 animaux par condition, c'est à dire 16 animaux par modèle génétique, donc 48 animaux par expérience. Nous faisons 2 expériences (nombre d'alvéole et culture 3D) à 3 temps différents, ce qui fait un total de 288 animaux.

Raffinement

Les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière sur le comportement et les signes de douleurs des animaux ayant reçu une injection dans la trachée. Cela permettre de ne pas rater une mauvaise réaction de l’animal à l’instillation d’élastase lorsqu’il se réveille de l’anesthésie et ainsi d’agir à temps pour éviter toute souffrance. Une surveillance sur 24h est faite de principe, il y a très exceptionnellement un problème dans les suites de l’injection. Les souris sont hébergées en groupe de 4 par cage, dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Une grille d’évaluation des points limites sera utilisée pour graduer le mal être, avec mise à mort compassionnelle si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique injection d’obtenir un emphysème important chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge 2 mois, correspondant à la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris.

Fournir des anticorps à des équipes de recherche publiques ou privées, à raison d'environ 2 milligrammes par animal : 200 lapins New Zealand White sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre injections d'une information génétique codant l'antigène visé, par voie intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée, puis subit trois prélèvements sanguins de 25 à 40 minutes après administration orale d'un tranquillisant. Le porteur signale de la fièvre, un inconfort modéré et l'apparition de petites boules au point d'injection, et compte deux lapins par protocole. Tous sont tués en fin de protocole parce que chaque immunisation est spécifique d'un antigène, ce qui interdit de les réutiliser ailleurs.

Objectifs

L’objectif du projet est de générer par une approche d’immunisation génique des anticorps de lapin contre des antigènes d’intérêt pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L’immunisation correspond à un processus d’éducation et d’activation du système immunitaire contre un antigène spécifique. Parmi les différentes approches d’immunisation existantes, l’immunisation génique sera utilisée. Cette approche émergente vise à faire produire transitoirement un antigène en administrant une information génétique codant in situ pour un antigène spécifique, initiant ainsi une réponse immunitaire. Les anticorps obtenus seront utilisés dans des approches allant de la recherche au diagnostic. Le nombre de lapins prévus par protocole permettra d’obtenir une quantité suffisante d’anticorps (environ 2 milligrammes par lapin) pour une utilisation sur plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voire thérapeutiques. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

4 injections en intradermique, en intramusculaire ou en sous-cutanée de l’information génétique codant pour l’antigène d’intérêt (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor. Les prélèvements seront réalisés après administration par voie orale d’un tranquillisant à effet vasodilatateur, permettant de prélever le lapin dans de bonnes conditions pour le lapin et l'expérimentateur. L'injection couplée à un agent de transfection peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-agent de transfection). Les manipulations des lapins étant source de stress, une habituation sera mise en œuvre, afin de mettre en place une relation de confiance entre le lapin et les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant notamment dans la caractérisation de molécules thérapeutiques, a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en œuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d’une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Tous les souriceaux sont tués au plus tard deux jours après leur naissance, leurs tissus étant prélevés pour analyse. 744 souris vont être utilisées dans ce projet sur la forme congénitale de la maladie de Steinert, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mesures portent sur la ventilation des nouveau-nés éveillés pendant une heure, le jour de la naissance puis le lendemain, ce qui suppose de les séparer de leur mère aussi longtemps, et le porteur reconnaît que la mutation dans sa forme sévère peut conduire à une détresse respiratoire. Vingt-quatre femelles échappent à la mise à mort, gardées pour produire de nouvelles portées.

Objectifs

La dystrophie myotonique de Steinert est une maladie génétique qui touche environ 1 personne sur 8000 en France. Elle se manifeste par une faiblesse musculaire, des problèmes cardiorespiratoires, des cataractes précoces, et des troubles de l'apprentissage. La manifestation à la naissance (congénitale), la forme la plus sévère, peut se détecter dès la période prénatale par une réduction des mouvements fœtaux et un excès de liquide amniotique. À la naissance, les bébés présentent une faible tonicité musculaire, des difficultés à sucer et à avaler, et souvent des problèmes respiratoires. La maladie est due à une anomalie d’un gène spécifique caractérisée par une répétition excessive d'un motif particulier dans le gène. Plus cette répétition est longue, plus la maladie est sévère, pouvant atteindre jusqu’à 1000 répétitions chez certains patients. Le projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie, particulièrement dans sa forme sévère, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Actuellement, aucun traitement efficace n’existe. Pour étudier cette maladie, nous disposons de souris génétiquement modifiées portant le gène muté. Ces souris reproduisent certaines caractéristiques de la maladie humaine. Il s’agit alors d’identifier les mécanismes spécifiques liés à la mutation du gène et comprendre comment ces mécanismes contribuent aux symptômes sévères observés dans la forme congénitale de la maladie.

Bénéfices attendus

La maladie de Steinert est caractérisée par la répétition exagérée d'un motif spécifique. La compréhension de la conséquence de cette répétition est capitale pour mieux gérer la maladie, la progression des symptômes et leur variabilité, pour identifier d'autres gènes impliqués et pour tester de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Pour les femelles gestantes : Isolement de la femelle gestante 4 jours avant la mise bas. Pour les souriceaux : Mesure de la ventilation , de la fréquence respiratoire, du volume inhalé à chaque cycle respiratoire, de la durée et du nombre d'apnées chez les souriceaux éveillés pendant 1 heure le jour de la naissance et à J+1.

Impact sur les animaux

1/Séparation maternelle le temps de réaliser l'enregistrement des paramètres ventilatoires d'une heure. 2/ La mutation dans sa forme sévère peut conduire à une détresse respiratoire. 3/ Les femelles gestantes sont isolées 4 jours avant la mise bas pour permettre la nidation et réduire le stress lors de la prise en charge à la naissance.

Devenir

Tous les souriceaux sont euthanasiés au plus tard 2 jours après leur naissance. Prélèvement tissulaire postmortem pour des analyses à l'échelle des molécules. Les femelles sont ré-utilisées pour obtenir de nouvelles portées.

Remplacement

Les études sur des cultures cellulaires sont importantes dans la compréhension de la maladie. Toutefois, ces modèles sont limités car non représentatifs de la pathologie dans sa complexité d’expression et de prise en charge. Étant dans l’optique de recherche de traitement pharmacologique notamment pédiatrique, l’Agence européenne du médicament recommande l’utilisation de l’animal en développement. L’expérimentation animale ne peut alors être évitée. Dans la maladie de Steinert, il n’y a actuellement pas de traitement pharmacologique satisfaisant.

Réduction

Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la variabilité inter-individuelle sur les variables observées comme la ventilation, nous avons déterminé un effectif de 30 animaux pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.

Raffinement

Pendant les mesures, la surveillance est constante. Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux (deux premiers jours de vie) comportent le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau (coloration du souriceau, mouvement spontané, respiration spontanée, réaction à la douleur, présence de lait dans le ventre) et le comportement de la mère envers sa portée (constitution du nid, présence de lait dans le ventre). Pour les mesures, nous utilisons des techniques non invasives et contrôlées (durée de la mesure, température dans les chambres de mesure) pour minimiser l'angoisse des animaux. La durée maximale de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure. Les cages des femelles gestantes isolées puis les mères avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid. Par ailleurs, le personnel technique de l'animalerie effectue une vérification journalière obligatoire des espaces d'hebergement des souris et toutes les cages sont vérifiées.

Choix des espèces

L’approche sur un animal entier permet de voir les effets de la mutation dans un contexte physiologique. La souris constitue un modèle de neuro-développement humain et la souris avec modification génétique est largement utilisée dans l'analyse ou l'étude du développement d'une maladie génétique. Dans le cas de la maladie de Steinert, les modèles animaux existants sont murins. Ces modèles murins permettent alors de préciser les processus conduisant à la maladie et de tester ultérieurement les stratégies thérapeutiques. Notre investigation est au stade postnatal précoce, les deux premiers jours de vie (à la naissance (P0) et à P1).