Système respiratoire

Anesthésiées pour une chirurgie de trente minutes, deux patchs d'albumine bovine implantés sous la peau, 280 souris immunodéficientes gardent ensuite ces implants de trois à six mois. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec douleur post-opératoire, inflammation et risque d'infection au site d'implantation. Le porteur privilégie des femelles, décrites comme plus calmes au moment de la réintroduction dans le groupe après l'isolement du réveil, et n'a prévu aucun test statistique pour ces 280 animaux, seulement des "observations directes". Toutes sont tuées pour que les implants et les tissus autour soient prélevés.

Objectifs

Le développement d’implants, composés uniquement à base d’albumine et associés à l’ingénierie tissulaire, s’apparente à une nouvelle voie de recherche potentielle pour la régénération du cartilage chez l’Homme. Les implants seront entièrement composés d’albumine bovine et seront construits en deux parties : une partie dite « poreuse » et une autre partie dite « lisse ». L’objectif, ici, est de proposer un matériau bicouche biomimétique, favorisant la regénération tissulaire. Nous souhaitons, dans un premier temps, tester la biocompatibilité de ces implants chez la souris, en vue de leur utilisation pré-clinique en observant l’intégration de l’implant celllulaire après une implantation en sous-cutanée chez des souris nude immunodéprimées. Les tests in vivo sur ces souris nude seront une première étape de validation avant des tests plus importants sur gros animal, puis des applications cliniques. Demande de modification car suite à des résultats préliminaires positifs nous souhaiterions faire un suivi de la dégradation du biomatériau qui nous oblige à augmenter le temps d'implantation entre 3 et 6 mois.

Bénéfices attendus

Les biomatériaux sont devenus un élément clé pour le développement de l’ingénierie tissulaire. Nous espérons, à terme, le développement d’un nouvel implant pour la régénération du cartilage chez l’Homme. Dans le contexte actuel, cet implant offrirait une nouvelle voie de recherche, permettant ainsi de surmonter les limites des traitements conventionnels : intégration tissulaire chez le patient de l'implant, et morbidité du site donneur dans les traitements actuels prélevant un greffon d'un site donneur implanté au niveau d'un site receveur à un autre endroit du corps. Cet implant sera innovant car il sera formulé à partir de matériau d’origine naturelle, et ensemencé de cellules saines du patient lui même. Il ne nécessitera donc pas de traitement immunosuppresseur et ne sera pas sujet au rejet immunitaire. Ce projet est en accord avec les nouvelles avancées en santé humaines, visant à réaliser des implants tout biologiques et personnalisés pour chaque patient.

Procédures

Procédures chirurgicales : 1 par animal, implantation sous cutanée de deux patchs d'albumine, sur animaux anesthésiés. 30 minutes d'intervention par animal.

Impact sur les animaux

La procédure de mise en place de l’implant est une procédure invasive. Les nuisances attendues sur les animaux concernent : la douleur liée à la chirurgie, l’inflammation post opératoire, l’infection au niveau du site d’implantation.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement.

Remplacement

Des études in vitro antérieures ont démontré l’efficacité de ces échafaudages bicouches pour l’adhésion et la différenciation de chondrocytes. Pour une étude plus approfondie, ce projet contraint de mettre en place des études in vivo. En effet, la complexité de l'environnement physiologique sous-cutané, impossible à reproduire in vitro (vascularisation, cellules du système immunitaire, molécules inflammatoires…) atteste de la nécessité de continuer les expérimentations sur un modèle animal (rongeurs), sans remplacement possible. Seuls les échafaudages bicouches efficaces in vitro seront testés sur les animaux.

Réduction

Etant donné le nombre d’analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques…) et afin de valider les résultats, le nombre maximum d’animaux nécessaires a été évalué à 280 souris pour 3 ans, nombre d'animaux nécessaire pour pallier la différence interindividuelle des cellules issues des donneurs, des aléas de la chirurgie, et des nombreuses analyses prévues qui nécessiteront chacune plusieurs échantillons. Il n'y aura pas de tests statistiques, nous effecturons des observations directes.

Raffinement

Afin de nous assurer du bien-être des animaux, nous porterons une attention particulière tout d’abord à l’anesthésie per-opératoire, en faisant en plus de l’anesthésie générale, une analgésie pré opératoire. L’analgésie post-opératoire sera réalisée en injection sous cutanée. Les anti-inflammatoires non stéroidiens seront évités car les phénomènes de cicatrisation et de régénération tissulaire étudiés sont liés aux phénomènes inflammatoires locaux qui se mettent en place. La chirurgie sera privilégiée le matin car les animaux seront isolés dans une cage en post-opératoire précoce le temps du réveil, et remis en groupe dans la soirée. Nous privilégierons également l’emploi de femelles car elles présentent un comportement plus calme lors de la réintroduction en groupe après une période d’isolement. Comme l’intervention pourrait avoir des retentissements sur le déplacement de l’animal durant les premières heures après la chirurgie, la nourriture sera mise dans la litière et le bec du biberon placé bas afin de faciliter l’alimentation. Nous mettrons en place également des éléments d’enrichissement de l’environnement (bâtonnets, nids, coton…) afin de permettre la fabrication de nids notamment. Le type d’animal utilisé présente un phénotype dommageable mais les animaux seront dans des cages fermées et sur un portoir ventilé dans un environnement stérile et des conditions de manipulation adaptée à l’entretien de tels animaux. Si les animaux implantés au cours de l'étude présentent des signes précoces de douleur, d’inconfort ou de détresse (changements de comportement : animal prostré et isolé du reste du groupe, perte de poids et d’appétit, variations de leur apparence physique : anomalie cicatricielle observée au niveau des points de sutures), l’expérimentation sera arrêtée. Ces potentiels signes de douleurs seront évalués et scorés à partir d'un tableau de référence, permettant de juger si l'animal devra être mis à mort si celui ci atteint un point limite.

Choix des espèces

Pour tester la biocompatibilité et l’intégration tissualire, nous utiliserons des souris immunodéficientes : souris pour les implants, ensemencés ou non de cellules. Seuls les implants validés in vitro seront implantés chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines de vie minimum) pour présenter des systèmes physiologiques matures.

Un inhibiteur de la protéine HSPB5 développé par le laboratoire comme candidat médicament contre la fibrose pulmonaire motive l'utilisation de 1 040 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dose de bléomycine leur est administrée en trente secondes par aspiration au fond de la gorge sous anesthésie, ce qui déclenche entre le deuxième et le septième jour une inflammation des poumons, une perte de poids et des troubles respiratoires, puis une fibrose progressive. Le porteur justifie un effectif supérieur aux usages du domaine par la quantité de vésicules extracellulaires qu'il doit obtenir des animaux pour les injecter à d'autres souris. Sur le remplacement, il indique qu'aucun modèle in vitro ne peut se substituer à l'étude d'un "animal entier", le poumon comptant plus de quarante types cellulaires.

Objectifs

Les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique ont une accumulation de vésicules, appelées vésicules extracellulaires (EVs). . Ces vésicules aggravent la maladie de ces patients en transportant des molécules actives (protéines, ADN etc). .Si on inhibe la machine des cellules pour incorporer ces molécules actives dans ces EVs, on réduit la progression de la fibrose dans des modèles murins de fibrose pulmonaire. Nous avons déjà des données suggérant que l’inhibition de la protéine de stress HSPB5 modifie la sécrétion d’EVs. Les objectifs de ce projet sont de : 1) Confirmer que l’inhibition d’HSPB5 modifie la sécrétion des EVs 2) Tester si l’absence d’HSPB5 réduit l’activité des EVs pour aggraver la fibrose.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire développe des inhibiteurs de la protéine de stress HSPB5 comme un médicament dans la fibrose pulmonaire. Nous avons déjà des données suggérant que l’inhibition d’HSPB5 modifie la sécrétion d’EVs. Nous devons mieux comprendre les rôles d’HSPB5 pour développer notre médicament et permettre une meilleure prise en charge des patients atteints de fibrose pulmonaire.

Procédures

Les souris seront soumises à une administration unique de bléomycine par aspiration oro-pharyngée sous anesthésie générale (isoflurane). Cette intervention dure 30 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Le modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine est le modèle le plus utilisé en recherche dans le domaine de la fibrose. Les souris sont exposées à la bléomycine par aspiration oro-pharyngée sous anesthésie générale. Le modèle est composé d’une étape inflammatoire puis d’une fibrose pulmonaire progressive. Entre 2 et 7 jours après bléomycine, un phénomène inflammatoire se met en place. Il est associé à une perte de poids des animaux, ce qui peut entrainer des troubles respiratoires plus ou moins importants suivant la dose injectée. Pour ce projet, une faible dose de bléomycine sera utilisée. Cette dose permettra de réduire au maximum l’apparition potentielle d’effets indésirables induits chez l’animal, et entrainera une fibrose pulmonaire détectable.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour des études biochimiques et histologiques.

Remplacement

Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.

Réduction

Nous réduirons le nombre d’animaux au minimum requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Pour la procédure 2, une analyse de puissance a été réalisée pour établir les effectifs. Pour la procédure 1, les effectifs décrits sont supérieurs au nombre d’animaux utilisés classiquement. Ceci est expliqué par le nombre d’EVs que nous devons produire pour les injections décrites en partie 2 et par les contraintes statistiques associées aux études biochimiques et histologiques (méthodes indispensables à notre projet). Des tests statistiques d’analyse de variance seront réalisés pour toutes les données d’analyses (histologie, dosage de collagène etc). Après avoir déterminé la distribution normale ou non des données, nous utiliserons des tests paramétriques ou non.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit) au centre de zootechnie de l’université de Bourgogne. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). Ils bénéficieront d’un environnement enrichi avec accès ad libitum à des suppléments alimentaires (aliments gélifiés, morceaux de pommes), afin de limiter la perte de poids. Un suivi quotidien par du personnel qualifié et ayant l’habitude du modèle sera réalisé pour repérer au plus vite les éventuels signes de détresse. Les administrations oro-pharyngées seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal (isoflurane). Après l’injection, les souris seront placées sous lampe chauffante pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale de l’animal à son réveil de l’anesthésie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. De plus, l’utilisation de souris offre l’avantage de pouvoir travailler sur des modèles génétiquement modifiés. Dans ce projet nous utiliserons des souris délétées pour le gène Hspb5. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience du modèle, la toxicité de la bléomycine est d’autant plus importante et rapide que les souris sont petites. Pour minimiser les signes de toxicité aigüe de la bléomycine, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g.

Pour tester si le blocage du métabolisme des acides gras réduit le remodelage des bronches, 204 souris femelles vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'allergène dans l'abdomen puis jusqu'à quarante-quatre instillations dans le nez sous anesthésie gazeuse, jusqu'à développer un asthme. Les mesures respiratoires se font par trachéotomie sous anesthésie et sans réveil, alors que la déclaration de gravité ne compte aucune procédure sans réveil. Le porteur annonce des points limites portant sur la perte de poids, le comportement anormal et la difficulté respiratoire, et prévoit de corriger toute gêne respiratoire par quinze secondes de bronchodilatateur.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autres l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique. La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante, car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. L’objectif de ce travail est d’étudier si le blocage du métabolisme des acides gras par un fragment d’anticorps contre une des molécules de cette chaine métabolique au moment d’installation des caractéristiques de l’asthme est capable de diminuer les symptômes de la maladie dans le modèle murin de l’asthme chronique allergique.

Bénéfices attendus

Ce projet montrera si le blocage d’une des molécules qui jouent le rôle important de régulation du métabolisme énergétique dans les muscles lisses bronchiques permet de diminuer les symptômes d’asthme et notamment de remodelage du muscle lisse bronchique chez les animaux de laboratoire. Les données ainsi obtenues ouvriront la voie pour la nouvelle thérapie de cette pathologie respiratoire.

Procédures

Les animaux seront soumis à quarante-quatre (maximum) instillations intranasales sous anesthésie gazeuse (durée jusqu’à 2 minutes) et les deux injections intra-péritonéales de l’allergène (2 injections). Les mesures de paramètres respiratoires d’une durée de 10 minutes seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés dans la procédure sans réveil.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir un léger stress suite aux contentions pour l’injection/l’instillation des allergènes et un bref placement dans une boîte en plexiglass. Les souris ressentiront une légère douleur des piqûres pendant l’injection. L’anesthésie sous isoflurane induit également un léger stress. La sensibilisation aux allergènes induit des symptômes asthmatiques chez l’animal : l’inflammation des voies respiratoires et éventuel remodelage bronchique. Ces symptômes peuvent survenir après l’instillation de l’allergène et éventuellement provoquer une dyspnée (un essoufflement). Après l’anesthésie, l’opérateur observera les animaux et toute dyspnée sera corrigée par l'utilisation d’un broncho-dilatateur d’action rapide.

Devenir

L’objectif de ce projet est d’estimer l’efficacité de traitement contre le remodelage bronchique dans l’asthme. Suite au développement des symptômes d’asthme, les animaux recevront le traitement et les paramètres respiratoires seront réalisés. Puis les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. Grace au modèle animale, nous testerons les hypothèses apparues après nos résultats in-vitro sur les lignées cellulaires. L’utilisation du modèle murin d’asthme chronique allergique dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Nos expériences ne seront pas répétées. Nous allons comparer les organes des groupes de souris asthmatiques avec ceux des animaux témoins qui recevront ou non le traitement pouvant diminuer les symptômes d’asthme. Comme il a été déjà démontré par nos travaux précédents, les groupes de souris doivent être composés de 10 souris minimum afin de mettre en évidence une différence significative sur les différents paramètres analysés grâce aux pléthysmographie invasive notamment la résistance bronchique dont la variabilité est importante. Afin d’analyser l’inflammation broncho-alvéolaire nous utilisons les 6 animaux par groupe.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des femelles. La majorité des études sur l’asthme est menée sur les souris femelles. L’utilisation des femelles permet de rapprocher le modèle murin de la maladie humaine car la sévérité de l’asthme est plus fréquente chez la femme que chez l’homme. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes adultes âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.

Vingt et un jours enfermées dans un caisson où l'oxygène est abaissé à 9 %, ou recevant de l'élastase déposée dans les narines sous anesthésie, 288 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue pour prélèvement du sang, des poumons, du cœur, du foie, du rein et de la rate. Elles sont génétiquement modifiées pour surexprimer une protéine qui empêche la formation des vaisseaux pulmonaires, afin d'observer l'apparition d'une hypertension artérielle et d'un emphysème. Le porteur indique que les manipulations ont lieu en journée, pendant la phase de sommeil des souris, ce qui ajoute un stress, et affirme dans le même passage que l'hypoxie chronique n'apporte aucune douleur et ne provoque qu'une légère fatigue. Sur la réduction, il annonce des groupes de 8 souris sans exposer le calcul qui mène aux 288 animaux.

Objectifs

Avec l’âge et dans certaines maladies pulmonaires comme l’hypertension et l’emphysème, le réseau vasculaire décline et la structure des tissus se dégrade, ce qui affecte les poumons et provoque des difficultés respiratoires. L’un des mécanismes liés au déclin du réseau vasculaire implique la défaillance d’un facteur essentiel à la formation de nouveaux vaisseaux. L'action de ce facteur serait pertubée par une protéine dont l’expression augmente avec l’âge chez la souris, mais n’a pas encore été étudiée dans le poumon. Notre objectif est d'étudier l'effet de l'élimination de la vascularisation pulmonaire. Pour cela, nous souhaitons utiliser des souris génétiquement modifiées surexprimant la protéine empêchant la formation des vaisseaux pulmonaires. Nous nous attendons à observer chez ces souris transgéniques l'apparition de maladies pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l'effet de l'élimination de la vascularisation pulmonaire dans deux maladies pulmonaires liées à l’âge (hypertension artérielle et emphysème pulmonaires).

Procédures

Les animaux seront placés dans un caisson à hypoxie, dans lequel la quantité d'oxygène est diminuée (9%) en continu (21 jours) permettant d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patients. D’autre part, afin d’induire un emphysème pulmonaire, les animaux seront traités à l’élastase (ou contrôle sans effet) : un dépôt de gouttes contenant le traitement au niveau des narines de l'animal effectué sous anesthésie générale, lors d’une seule procédure rapide de 5 minutes. A la fin de la procédure d'élastase et au bout de 21 jours suite au traitement, nous mesurerons les fonctions pulmonaires à l’aide d'un appareil durant 15 minutes environ pour chaque souris sous anesthésie générale, connectée grâce à une sonde.

Impact sur les animaux

Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie chronique, sans apporter de douleur à l'animal. Les souris ne montrent aucune difficulté respiratoire liée à l'hypoxie, seulement une légère fatigue. Les différentes procédures (hypoxie, inhalation intranasale d’élastase, Flexivent) peuvent générer du stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal, lors des anesthésies ou encore lors des déplacements de cage. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil, cela induit également un stress.

Devenir

L'étude nécessite le prélèvement du sang et des organes (poumons, coeur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologiques (expression de différents gènes) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon), ainsi les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

En parallèle des études menées sur la souris, une étude est portée sur des cellules primaires humaines pulmonaires obtenus lors d'une chirurgie chez des patients avec ou sans emphysème. Différents types cellulaires sont isolés. La culture cellulaire permet de comparer des cellules de patients vs témoins sur différents critères. L’étude de souris génétiquement modifiées semble néanmoins incontournable afin d’étudier à l’échelle d’un organisme entier l’effet de l'élimination de la vascularisation au niveau pulmonaire, nous permettant ainsi d’accéder à des données essentielles à la caractérisation de certaines maladies.

Réduction

Nous choisissons d'étudier des groupes de 8 souris. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même fratrie pour réduire au maximum la variabilité des différentes mesures. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.

Raffinement

L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les responsables de ce projet. L'environnement des souris sera composé de maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton pour jouer. Les zootechniciens et responsables du projet seront en contact concernant le bien-être et la santé des animaux. Les points suivants seront considérés comme points limites pour les animaux qui seront mis à mort: 1. incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire. 2. Modification du comportement, douleur intense, détresse ou souffrance. 3. perte de poids trop importante, blessures diverses... Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine et contrôlé au cours des différentes procédures, cependant nous nous attendons à une perte de poids chez les souris sous hypoxie. Si un animal présente un de ces points limites, il recevra une anesthésie et une analgésie adaptée à la mise à mort.

Choix des espèces

Les modèles de maladies pulmonaires que nous souhaitons utiliser sont bien maitrisés et ont déjà largement été utilisés, ils ont fait l'objet de plusieurs publications. Nous utiliserons des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et nous considèrons que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures, afin d'étudier l'effet des maladies pulmonaires sur les souris génétiquement modifiées.

Les souris dont l'état se dégrade sans répondre aux mesures prévues sont tuées avant le terme du protocole. 528 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un allergène sur une narine sous anesthésie, quatre fois en douze jours ou vingt fois en cinq semaines, puis une infection par un virus du rhume, et pour certains groupes une mesure quotidienne de la respiration dans un système clos pendant cinq à neuf jours, après inhalation d'une molécule qui contracte les bronches. Toutes sont tuées, les poumons devant être prélevés à deux moments, au pic de l'exacerbation asthmatique et en fin d'expérience.

Objectifs

L’asthme est une maladie pulmonaire chronique complexe aboutissant à une obstruction bronchique réversible, qui affecte les enfants et les adultes. Dans le monde, en 2019, on estime que 262 millions de personnes souffraient d’asthme et que cette maladie a entraîné 461 000 décès. Cependant, ces chiffres sont très probablement sous-estimés. L’asthme est sévère pour environ 10% des patients qui souffrent de symptômes persistants malgré une bithérapie de fond incluant des fortes doses de corticoïdes inhalés. Les exacerbations ou aggravations des symptômes d’asthme restent un problème majeur dans le suivi et l’évolution des asthmatiques, qu’ils soient sévères ou non. Elles représentent le motif principal de recours aux soins, et peuvent conduire à l’hospitalisation voire entraîner le décés des patients. Environ 50 à 80% des exacerbations sont associées à des infections virales respiratoires (chez les adultes et les enfants, respectivement). Parmi les virus impliqués, 50-60% sont des rhinovirus, virus qui provoquent un rhume chez les individus sains sans autre conséquence. Même si certains mécanismes impliqués dans les exacerbations ont été identifiés, les connaissances restent insuffisantes pour développer des traitements efficaces. Il y a donc un réel besoin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui conduisent aux exacerbations viro-induites des asthmatiques. Les cellules natural killer (NK) sont une sous-famille de globules blancs. Ce sont des cellules immunitaires impliquées dans la réponse précoce contre les virus, qui sont présentes en grande quantité dans les poumons. Cependant, leurs rôles dans les exacerbations de l’asthme induites par les virus sont largement méconnus. Des études in vitro ont montré que la fonction des cellules NK humaines dirigée contre les rhinovirus était diminuée chez des patients atteints d’asthme sévère. L’objectif de ce travail est de mettre en place un modèle d’exacerbation de l’asthme induite par un rhinovirus chez la souris, afin de caractériser les cellules NK pulmonaires et leurs fonctions et de tester des thérapeutiques capables de restaurer leurs fonctions.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur le rôle de cellules immunitaires particulières (les cellules natural killer) dans l’asthme et ses exacerbations induites par les virus. Mieux comprendre cette maladie est essentiel pour proposer de nouvelles thérapeutiques. En effet, certains patients et surtout les plus sévères échappent aux traitements actuels. A court terme, ce projet permettra de proposer et d’évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le traitement des exacerbations viro-induites de l’asthme chez l’adulte.

Procédures

Les animaux recevront sous anesthésie une petite goutte d’un allergène (molécule vis-à-vis de laquelle on peut être allergique) déposée sur une narine. L’allergène sera donné 4 fois en 12 jours, ou 20 fois en 5 semaines, selon le modèle. Les souris seront infectées avec un virus du rhume 1 seule fois, de la même manière : une goutte sur une narine, sous anesthésie. Certains groupes recevront en plus 1 injection unique en intraveineuse avec un traitement, sous anesthésie. Enfin, dans certains groupes, la respiration sera mesurée sur animaux vigiles se déplaçant librement dans un système clos (1 fois par jour pendant 5 à 9 jours).

Impact sur les animaux

Les nuisances de ce protocole sur les animaux sont : • L’anesthésie peut provoquer un stress, une hypothermie, et un risque faible d’arrêt cardiorespiratoire • L‘injection d’anesthésique peut entraîner une courte douleur (moins de 5 minutes) • L’infection avec un virus du rhume peut entrainer des symptomes viraux, inférieurs à ceux de la grippe • La mesure de la respiration peut être source de stress pour les animaux qui peuvent se déplacer librement mais sur une surface réduite. • Certaines mesures de la respiration doivent se faire après avoir respiré une molécule nébulisée induisant une contraction des bronches. Chez les animaux non asthmatiques, il ne se passe rien. Les animaux asthmatiques en exacerbation pourraient présenter des difficultés respiratoires.

Devenir

Afin de caractériser l’inflammation au niveau des poumons pour confirmer l’exacerbation de l’asthme, et évaluer l’effet des traitements, nous devons récupérer les poumons à 2 temps de l’expérience : au moment de l’exacerbation et à la fin de l’expérience. Nous devons pour cela procéder à la mise à mort de l’ensemble des animaux du projet. L’étude cellulaire et moléculaire du poumon est indispensable pour mieux comprendre les mécanimes de l’exacerbation de l’asthme induite par les virus, et evaluer l’effet et l’efficacité des traitements testés.

Remplacement

Il s’agit de l’étude d’une pathologie faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux paramètres dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro, ou modélisées. Nous allions néanmoins ce travail à des études in vitro analysant les fonctions des cellules NK de patients asthmatiques qui pourront enrichir le projet présenté ici, et orienter le choix des molécules ciblées par la thérapeutique.

Réduction

Les effectifs sont ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous effectuons une étude pilote afin d’obtenir des données préliminaires solides et de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaires en utilisant un outil informatique. Les nombres d’animaux présentés sont donc des nombres maximaux, et sont susceptibles d’être revus à la baisse.

Raffinement

Les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Elles seront anesthésiées avant chaque administration (allergène, virus, traitement) et le jour de la mise à mort. Un test de reflexe des extrémités sera effectué pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Une fiche d’observation sera remplie quotidiennement afin d’assurer un suivi de l’état des animaux et de prendre les mesures adaptées (surveillance accrue, apport de nourriture gélifiée) le plus précocément possible. Si ces mesures sont insuffisantes, et que l’état de l’animal ne s’améliore pas ou se dégrade, il sera euthanasié avant la mise à mort prévue initialement.

Choix des espèces

Les modèles animaux souris sont des modèles de base pour étudier le système immunitaire, et reproduisent les différents paramètres de la pathologie asthmatique allergique. En outre de nombreux anticorps spécifiques existent permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines au début des protocoles) comme dans la majorité de la littérature sur le sujet. En outre, notre projet est focalisé sur l’asthme de l’adulte et ses exacerbations.