Système respiratoire

Pour mesurer si des nanoparticules inhalées par une mère abîment les poumons de sa descendance, 2 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes. Les femelles gestantes puis allaitantes reçoivent les nanoparticules directement dans la trachée sous anesthésie, une fois par semaine pendant six semaines. Leur descendance passe des mesures de fonction pulmonaire de 5 à 45 minutes, éveillée, à quatre stades de développement, de la fin de gestation à l'âge adulte. Le porteur annonce que les souriceaux grandissent normalement, tout en prévoyant qu'un comportement maternel anormal et des anomalies de développement pourraient apparaître, et une mise à mort rapide dès l'atteinte d'un point limite.

Objectifs

Les nanotechnologies sont en plein essor depuis le début du XXIème siècle. Cependant, l'utilisation exponentielle des nanoparticules (NP) suscite des inquiétudes quant à leurs potentiels effets sur la sante de l’Homme et sur l’environnement. En effet, en raison de leur présence dans de nombreux produits du quotidien (produits cosmétiques, alimentation, produits d’entretien, expositions professionnelles etc.), nous y sommes régulièrement exposés, que ce soit par voie cutanée, orale ou pulmonaire. Des analyses toxicologiques sont donc nécessaires pour connaitre les risques liés à leur utilisation, notamment dans le cadre d’expositions pendant la période périnatale, lorsque l’organisme en développement est particulièrement sensible aux agressions environnementales. Des études récentes réalisées chez la souris ont montré que des nanoparticules administrées à des femelles gestantes ou lactantes peuvent atteindre le fœtus, traversant la barrière placentaire via la circulation sanguine, ou le souriceau après passage dans le lait maternel. Les conséquences de ces expositions périnatales jusqu’à l’âge adulte sont encore peu étudiées, il apparait cependant qu’elles peuvent provoquer des défauts dans divers organes (reins, foie, organes sexuels) chez la descendance. Une étude a montré qu’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la gestation (voie pulmonaire) provoque des anomalies de développement pulmonaire chez la descendance. Ce présent projet s’inscrit dans leur continuité. Le développement pulmonaire (chez l’Homme comme chez la souris) comporte une phase prénatale et une phase post-natale allant jusqu’à un mois après la naissance chez la souris. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la période de lactation sur le développement et la fonction pulmonaires de la descendance et d’évaluer les potentiels effets combinés d’une exposition pendant la gestation et la lactation, à l’aide d’approches in vivo et in vitro complémentaires. Les résultats obtenus permettront de contribuer à l’évaluation des risques liés à ce type d’exposition chez les femmes enceintes, allaitantes et leurs enfants.

Bénéfices attendus

Bien que l’impact d’une exposition directe aux nanoparticules sur le site d’exposition (poumons, systeme digestif) ait été bien décrit ces dernieres années, les conséquences d’expositions maternelles aux nanoparticules sont relativement peu etudiées et se concentrent sur le développement prénatal de la descendance. Les analyses des conséquences a l’age adulte d’expositions périnatales a ces nanoparticules sont rares, notamment dans le cas particulier du développement pulmonaire. Ce projet nous permettra donc d’en apprendre davantage sur la toxicite des nanoparticules chez la souris, dans un modèle in vivo permettant d’étudier la transmission de ces particules de la mère a la descendance (circulation sanguine, lait maternel) et ses conséquences sur le développement pulmonaire des souriceaux dans des conditions physiologiques. Ce projet aura pour bénéfice de contribuer a l’évaluation des risques liés a des expositions périnatales aux nanoparticules pour les femmes enceintes, allaitantes ainsi que leurs enfants.

Procédures

Les femelles gestantes et lactantes seront soumises a des expositions pulmonaires aux nanoparticules (administration par voie pulmonaire via la trachée) sous anesthésie de manière hebdomadaire pendant 6 semaines (geste technique realisé en quelques minutes, réveil et récupération rapides pour l’animal). La descendance sera soumise à des mesures longitudinales non invasives de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant de 5 à 45 minutes à plusieurs stades de leurs vies.

Impact sur les animaux

La descendance des souris femelles exposées aux nanoparticules au cours de la gestation ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. Dans le cadre de ce projet, les expositions comprendront la période de gestation ainsi que celle de lactation. L’exposition des femelles chaque semaine pendant la gestation puis la lactation pourrait induire un stress conduisant à un comportement maternel anormal. Des anomalies de développement pourraient apparaitre chez la descendance, une attention particulière sera portée a leur croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux nanoparticules (prélèvement d'organes).

Remplacement

Notre étude porte sur l’impact d’une exposition maternelle aux nanoparticules sur le développement pulmonaire de la descendance. Ces nanoparticules peuvent passer des poumons de la mère à son systeme sanguin, s’accumuler dans ses organes et enfin atteindre la descendance, en traversant le placenta ou en passant dans le lait maternel ingéré par les nouveau-nés. Cette transmission résulte d'une complexité impossible a modéliser de manière bioinformatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Nous avons optimisé les protocoles afin d’étudier le phénotype pulmonaire à la fois des mâles et des femelles. Nous réalisons un maximum d’analyses sur le même animal afin d’utiliser tous les animaux générés dans nos procédures et d’en minimiser le nombre, tout en gardant la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence des variations biologiques Afin de reduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous n’effectuerons que les seules expériences indispensables, et nous nous efforcerons de réutiliser les animaux lorsque celà est possible, notamment le contingent de mâles d’accouplement nécessaires pour générer des femelles gestantes.

Raffinement

Pour les besoins de notre étude, nous travaillerons avec les femelles gestantes et lactantes particulièrement sensibles au stress. Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser ce stress, en les hébergeant a deux par cage, en rangeant ces cages aux endroits de plus faible passage dans le box d’hébergement, et en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanieres de papier. Apres le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, et seront hebergées en groupes sociaux de 5 souris maximum par cage, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront realisées en limitant au maximum la souffrance et l’angoisse animale. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise a mort rapide à l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Le modele murin a été choisi dans notre projet car la souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la litterature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, le projet nécessite un modèle mammifère permettant la transmission des nanoparticules de la mère a la descendance par la circulation sanguine et le lait maternel. Or, les quelques études décrivant cette transmission ont été réaliées dans le modèle murin. Le but du projet est de caractériser les effets d’une exposition périnatale aux nanoparticules sur le développement et la fonction pulmonaires jusqu’à l’âge adulte, les poumons se développant chez la souris en pré et post-natal. Le phénotype pulmonaire de la descendance sera analysé a 4 stades : en fin de gestation (dernier tiers), a la naissance (nouveau-ne) afin d’étudier l’impact d’une exposition prénatale, au stade juvénile afin de visualiser les effets d’une exposition post-natale pendant la période de lactation et à l’âge adulte afin d’en évaluer les conséquences a long terme

3 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon leur groupe, elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans une veine ou entre les côtes, avec dans ce dernier cas une plaie cutanée qui se forme nécessairement, ou onze injections hebdomadaires d'un agent cancérigène, puis jusqu'à quatorze injections de traitement sur quarante jours et deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie. Le porteur indique que les tumeurs en développement peuvent comprimer les tissus voisins et provoquer des douleurs et un inconfort important. Il affirme que les réponses immunitaires ne peuvent être comprises que dans un organisme vivant, et rappelle que 50 à 80 % des patients ne répondent pas de façon satisfaisante à l'immunothérapie actuelle.

Objectifs

Les cancers du poumon représentent la principale cause de décès par cancer chez les hommes en France, et leur origine complexe est influencée par une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux. Cette interaction crée des variations dans la susceptibilité au cancer du poumon parmi les individus. Les traitements de première ligne contre ce type de cancer incluent la chirurgie, la radiothérapie et divers traitements médicamenteux tels que la chimiothérapie, les thérapies ciblées et l'immunothérapie, qui peuvent être utilisés seuls ou en combinaison. L'autophagie, un processus cellulaire essentiel pour l'élimination des composants endommagés et le recyclage des nutriments, joue un rôle clé dans la réponse au stress cellulaire. Des recherches récentes ont mis en évidence son influence sur l'immunité antitumorale, notamment dans le cadre de l'immunothérapie. Bien que le lien entre autophagie et immunothérapie ne soit pas encore totalement élucidé, des données croissantes suggèrent que l'autophagie pourrait moduler la réponse tumorale à ces traitements. Par conséquent, cibler l'autophagie et ses modulateurs au sein du microenvironnement tumoral est considéré comme une stratégie prometteuse pour améliorer les résultats de l'immunothérapie contre le cancer. Dans ce projet, nous visons à évaluer l'impact de la modulation de l'autophagie sur l'efficacité des traitements anticancéreux dans des modèles de cancer du poumon, en neutralisant une protéine clé impliquée dans ce processus. Nous cherchons également à comprendre comment cette neutralisation influence les réponses immunitaires et la formation de la mémoire immunitaire dans le contexte du cancer.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer du poumon est d'une importance cruciale, tant en France qu'à l'échelle mondiale. Ce cancer, qui est l'un des plus courants en France, affecte un nombre croissant de personnes, incluant désormais de plus en plus de femmes. L'immunothérapie, explorée intensivement au cours des quinze dernières années, a montré des résultats prometteurs chez certains patients. Cependant, une grande proportion de patients, entre 50 et 80 pourcents ne répondent pas de manière satisfaisante à ces traitements. Il est donc essentiel de développer des options thérapeutiques supplémentaires, notamment des traitements administrés avant (néoadjuvants) ou après (adjuvants) la chirurgie, pour améliorer la prise en charge à long terme des patients. En résumé, l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques est impérative pour relever ce défi de santé publique et offrir un espoir tangible aux personnes touchées par cette maladie. Cette étude a pour objectif d'évaluer si la neutralisation d'une protéine impliquée dans le métabolisme cellulaire pourrait constituer une nouvelle approche thérapeutique contre le cancer du poumon. Il est également pertinent de noter que ce cancer touche environ 400 000 nouvelles personnes chaque année en Europe.

Procédures

Dans ce projet, les souris subiront diverses interventions en fonction de leur groupe expérimental : Pour les souris avec un fond génétique particulier, en plus des différentes interventions, elles recevront 5 injections consécutives d’un agent chimique pour induire la déplétion de la protéine. Chaque injection dure quelques secondes et sera administrée une fois par jour pendant 5 jours, 21 jours avant l’induction tumorale. Pour un groupe expérimental, les souris recevront d'abord une injection intraveineuse de cellules tumorales. Cette procédure prend quelques secondes à quelques minutes par souris, effectuée sous contention. Ensuite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, qui dureront quelques secondes chacune. Jusqu’à 14 injections seront administrées, à raison de 2 injections par semaine sur une période maximale de 40 jours. Certaines souris seront anesthésiées pour le suivi de la croissance tumorale par imagerie bioluminescente, chaque session durant environ 10 minutes et réalisée 2 fois par semaine pour suivre l’évolution des tumeurs. Pour un autre groupe, les souris recevront une injection intercostale de cellules tumorales, une procédure d'environ 15 minutes incluant l’analgésie, l'anesthésie, et le réveil. Ensuite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, qui dureront quelques secondes chacune, jusqu’à 14 injections réparties sur 40 jours. Un suivi par imagerie bioluminescente sera effectué, chaque session durant environ 10 minutes, 2 fois par semaine pour surveiller la progression tumorale. Pour un troisième groupe, les souris recevront des injections intrapéritonéales d’un un agent cancérigène, qui dureront quelques secondes chacune. Ces injections seront administrées une fois par semaine pendant 11 semaines pour induire des tumeurs. Par la suite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, jusqu’à 14 injections au total, réparties sur une période de 40 jours.

Impact sur les animaux

Certains animaux de ce projet recevront des injections de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intercostale. Ces injections, qu'elles soient intraveineuses, intercostales ou sous-cutanées, peuvent provoquer une légère douleur temporaire au site d'injection. Dans le cas des injections intercostales, une plaie cutanée se forme nécessairement, ce qui peut entraîner une douleur et un risque accru d'infection. Les injections intraveineuses, quant à elles, peuvent également causer une irritation locale et un stress pour l'animal. L'administration d'un agent chimique pour induire un cancer peut provoquer des effets secondaires tels que perte de poids, diminution de l'appétit, et léthargie. Ces symptômes peuvent être plus prononcés juste après l'injection, bien qu'ils tendent à se dissiper en quelques minutes. Les tumeurs en développement peuvent exercer une pression sur les tissus environnants, provoquant des douleurs et un inconfort important. De plus, les tumeurs peuvent induire des perturbations physiologiques et métaboliques, telles que des inflammations, des désordres de la fonction organique, et une altération générale de l'état de santé des animaux. Les injections intrapéritonéales (au niveau de l'abdomen) peuvent induire un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur immédiate et transitoire au point d'injection. L'anesthésie utilisée pour certaines procédures peut réduire la capacité de l'animal à réguler sa température corporelle et peut entraîner un risque cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques afin de répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'impératif d'utiliser des animaux vivants découle de l'incapacité actuelle à reproduire in vitro ou ex vivo la complexité des effets des traitements anti-cancéreux sur la tumeur, les tissus environnants, les facteurs solubles et le système immunitaire. Les réponses immunitaires ne peuvent être pleinement comprises que dans le contexte d'un organisme vivant. Les modèles animaux reproduisent mieux la complexité du microenvironnement tumoral, y compris les interactions entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les vaisseaux sanguins.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 3880 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu sera enrichi à l’aide de coton de nidification). Une surveillance régulière permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, tels que les yeux mi-clos, ou des comportements anormaux, afin de permettre une intervention rapide pour traiter tout problème de bien-être. Des points limites précoces et adaptés à chaque type d'expérience seront établis pour garantir que la douleur et la souffrance des animaux soient minimisées autant que possible. Par exemple, la perte de poids, l'apparition de signes cliniques sévères (comme une altération de l'état général ou des difficultés respiratoires), ou une augmentation rapide de la taille des tumeurs au-delà d'un seuil défini entraîneront une intervention immédiate. La réaction au site d'injection sera régulièrement évaluée pour détecter tout signe d'inflammation ou d'infection, avec des interventions vétérinaires prêtes en cas de complication comme l’utilisation d’antiseptique. Les animaux présentant des signes de douleur recevront des analgésiques adaptés à leur état spécifique. En cas de problèmes empêchant les souris de se nourrir normalement, un gel alimentaire sera ajouté directement dans la cage. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les mâles qui montreront des signes d'agressivité seront placés en hébergement individuel pour prévenir les blessures et le stress causés par les combats. Des ajustements seront faits en temps réel pour améliorer les conditions de vie des animaux ou modifier les protocoles de traitement si nécessaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques : - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé, ce qui permet de bénéficier d'une vaste expertise en termes d’élevage, de techniques d’expérimentation animale, ainsi que du suivi microbiologique et vétérinaire. - Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les différentes lignées utilisées dans cette procédure ne présenteront pas de phénotypes dommageables et seront immunocompétentes.

Des femelles gestantes sont enfermées chaque jour dans une machine à enfumer, placées le matin dans un espace restreint, puis laissées le soir sur une litière humide en cage inclinée, le cycle lumineux étant inversé le week-end. 480 souris, 120 femelles et 360 souriceaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les petits étant exposés à la fumée de cigarette jusqu'à leur trentième jour de vie. Le porteur affirme que les femelles "tolèrent bien" cette exposition, "sans nuisance particulière", tout en anticipant que le stress chronique quotidien peut conduire à un cannibalisme maternel. Toutes sont tuées à la fin de la procédure, pour prélever notamment les poumons et mesurer les effets des deux expositions.

Objectifs

L'objectif de notre projet est d'évaluer les interactions entre les expositions au stress chronique maternel et au tabagisme pendant les premières années de vie et leurs conséquences sur la santé respiratoire de l'enfant/de la progéniture. L'approche expérimentale qui fait l'objet de la présente demande vient compléter une approche épidémiologique réalisée sur une cohorte mère-enfant, avec pour objectif général d'identifier les mécanismes biologiques sous-tendant les interactions entre stress chronique et chimique. Le volet expérimental du projet va nous permettre de comprendre à quel(s) stade(s) du développement pulmonaire cette interaction exerce son effet, grâce aux analyses fonctionnelles et moléculaires qui seront réalisées sur les prélèvements pulmonaires notamment.

Bénéfices attendus

Ce projet explore la relation entre l'exposition aux polluants, en particulier le tabac, et la vulnérabilité induite par le stress sur la santé respiratoire. Il se concentre sur un problème majeur de santé publique qui a été peu exploré jusqu'à présent : comment l'exposition précoce à un événement stressant de la vie rend les individus plus susceptibles de développer des troubles respiratoires après une exposition à des polluants environnementaux tels que le tabac. L'identification de biomarqueurs enrichira la construction d'AOPs (adverse outcome pathways) et donc, au-delà de la science fondamentale, renforcera le panel d'outils de régulation dans ce domaine. Ces biomarqueurs seront aussi recherchés chez les patients, ce qui devrait conduire à terme à de fortes implications en santé publique grâce à l'approche pluri- et transdisciplinaire du projet dans son ensemble (volets épidémiologique et expérimental).

Procédures

Les femelles gestantes seront exposées à la fumée de cigarettes quotidiennement, selon une procédure non douloureuse (cage placée dans une machine à enfumer), et/ou à différents stress chroniques. Ainsi, un évènement de stress léger sera appliqué le matin (femelle placée dans un environnement restreint), ainsi que le soir (litière humide, cage inclinée). Les week-ends, seule une inversion du cycle de lumière (30 min de lumière toutes les 3 h) sera appliquée. La descendance sera exposée quotidiennement à la fumée de cigarette jusqu'au 30è jour de vie. Elle sera soumise à des mesures longitudinales non invasives de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant 1h à plusieurs stades de leur vie (Pléthysmographie).

Impact sur les animaux

D’après nos résultats antérieurs, les souris femelles exposées aux polluants au cours de la gestation tolèrent bien une telle exposition, sans nuisance particulière. Leur descendance ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. L’exposition des femelles au stress chronique chaque jour pendant la gestation pourrait induire un stress pouvant conduire à un cannibalisme maternel. Dans le cadre de ce projet, une attention particulière sera portée à la croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels. La mesure de la fonction pulmonaire par pléthysmographie corps entier est non invasive, elle est réalisée sur animaux vigiles et libres de mouvement, elle n’induit pas d’effets indésirables.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux différents stress (chronique et/ou chimique).

Remplacement

L'objectif de notre projet est d'évaluer les interactions entre les expositions au stress chronique maternel et au tabagisme pendant les premières années de vie et leurs conséquences sur la santé respiratoire de l'enfant/de la progéniture. De cette co-exposition résulte une complexité impossible à modéliser de manière bioinformatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet est de 480 animaux (360 souriceaux + 120 femelles gestantes). Ce nombre a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données historiques du laboratoire, du nombre moyen le plus bas de naissances par portée, et de données (publiées ou non), nous permettant de réaliser des calculs statistiques permettant de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif et pour déterminer des points d'arrêt d'expérimentation. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations inter individus et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’effet ou non d’une condition expérimentale. Précédemment au laboratoire nous avons harmonisé les procédures afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le choix des points temporels d’analyses a été conservé par rapport aux études précédentes du laboratoire. Ainsi, les résultats précédemment obtenus au laboratoire sur les effets de l’exposition à la fumée de cigarette et/ou sur la période du développement pulmonaire pourront être comparés. En fonction du calendrier des expériences et de la réussite des accouplements, le nombre d'animaux utilisés pourra être revu à la baisse.

Raffinement

Les expérimentations seront réalisées conformément aux règles éthiques visant à respecter le bien être animal, c’est-à-dire dans un environnement contrôlé (stabulation dans des enceintes autonomes d'animalerie). Ces conditions expérimentales offrent de plus l’avantage de minimiser l’impact de stress non contrôlés sur les paramètres mesurés. Plus spécifiquement, pour la réalisation du protocole de stress, les animaux seront stabulés dans des enceintes autonomes. Ces enceintes permettent d'éviter aux animaux d'être dérangés par le bruit extérieur (source de stress que nous ne pourrions contrôler dans un projet qui s'intéresse à l'effet d'événement stressant). Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser le stress (non souhaité), notamment en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanière de papier. Après le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, et seront hébergées en groupes sociaux, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. L'exposition à la fumée de cigarettes se fait en placant directement les cages dans la machine à enfumer Teague, ce qui permet de ne pas avoir à changer les animaux de cages. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort rapide à l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi dans notre projet pour plusieurs raisons. La souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la littérature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, nous maitrisons l'ensemble des techniques nécessaires à l'expérimentation. Les analyses seront réalisées à J21 (stade tardif de l'alvéolisation), J30 (jeune adulte) et J60 (adulte, maturité pulmonaire atteinte).

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

Tués à l'issue d'une sixième intervention menée sans réveil, pour prélever la trachée greffée et de la muqueuse nasale, 20 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit six chirurgies sous anesthésie générale sur 56 jours, dont une de quatre à cinq heures, avec un prélèvement de 50 mL de sang à chaque anesthésie. Le porteur attend des douleurs cervicales de cinq à six jours, des troubles de la déglutition, un risque d'infection du site opératoire et, pour les animaux porteurs d'un stent, des difficultés respiratoires si le dispositif se déplace. Il décrit le remplacement trachéal chez l'humain comme une impasse thérapeutique et conclut que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable" avant tout essai clinique.

Objectifs

En chirurgie des voies aériennes pédiatriques, les maladies nécessitant d’enlever une grande partie de la trachée sont des impasses thérapeutiques. En effet, une résection étendue nécessite un remplacement trachéal dont la technique chirurgicale n’est pas maitrisée à ce jour. De nombreuses techniques de remplacement ont été publiées chez l’adulte et l’enfant, avec des suites opératoires compliquées. Le remplacement trachéal reste exceptionnel. Néanmoins, la problématique clinique demeure. Notre équipe a fait le choix d’un projet de recherche de remplacement trachéal avec un procédé de décellularisation. L’objectif du projet est l’évaluation in vivo de ce remplacement de trachée par une étude comparative de la survie sans événement respiratoire et de l’aspect endoscopique après remplacement trachéal avec et sans stent trachéal.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’y a pas d’étude comparative de l’évolution clinique et endoscopique d’un modèle vivant de gros animal après un remplacement trachéal. Cette étude comparative permettra d’analyser d’une part les événements cliniques et endoscopiques survenant dans les suites à court et moyen termes, avec ou sans stent trachéal, et d’autre part les processus cellulaires, tissulaires et systémiques sous-jacents. Les différences attendues, dans le groupe avec stent par rapport au groupe sans stent, sont une diminution des événements respiratoires obstructifs par fragilisation de la trachée et diminution du calibre de la trachée. Les bénéfices à long terme seront la preuve de concept de la fiabilité du remplacement trachéal par décellularisation et la possibilité d’une étude du remplacement trachéal chez l’homme. De plus, des résultats positifs permettront également d’envisager la technique pour des indications différentes

Procédures

20 porcs auront six interventions chirurgicales sous anesthésie générale. La première intervention dure 60 minutes. La deuxième dure 240 à 300 minutes. Les troisième, quatrième, cinquième interventions durent 30 minutes. La sixième intervention dure 90 minutes et est sans réveil. Un prélèvement sanguin de 50 mL sera réalisé lors de chaque anesthésie générale. Les interventions auront lieu sur une période de 56 jours.

Impact sur les animaux

La première intervention peut être génératrice de stress et de douleur modérée dont la durée prévisible est de 3 à 4 jours. L’infection du site opératoire est une complication potentielle. Le prélèvement du muscle peut entrainer des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Il n’y pas de trouble de déglutition attendu. La perte de poids, sauf cause infectieuse, n’est pas attendue. La deuxième intervention peut être source de difficulté à respirer soit aiguë, soit progressive dans le temps. Il n’y a pas de risque hémorragique attendu. Des douleurs modérées sont attendues au site opératoire cervico-trachéal, d’une durée prévisible de 5-6 jours. Le prélèvement musculaire peut entraîner des douleurs modérées à la mobilisation de la tête. Le geste trachéal peut générer des troubles modérés de la déglutition. Les difficultés majeures d’alimentation ne sont pas attendues. Des douleurs cervicales légères à modérées sont attendues après les interventions 3, 4, et 5, d’une durée prévisible d’un à deux jours. Pour les animaux qui seront porteurs de stent trachéal, une mobilisation du stent peut également être cause de difficulté à respirer.

Devenir

Les 20 animaux seront mis à mort à l’issue de la sixième intervention pour prélèvement du complexe trachée native-matrice trachéale implantée, et pour prélèvement de muqueuse nasale.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur le remplacement trachéal circonférentiel au sein d’un organisme vivant complexe (avec une anatomie proche de celle de l’homme). Il n’y a ni modèle in vitro ni modèle in silico. Par ailleurs, cette étude n’a pas été rapportée par une autre équipe à ce jour. Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour ce projet avant la réalisation d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Nous avons déjà débuté les études chirurgicales d’implantation sterno-céphalique sur des porcs vivants. Ces chirurgies nous ont permis d’affiner et de perfectionner les techniques chirurgicales au préalable, et d’étudier la sécurité de cette intervention. Le nombre total d’animaux a été calculé́ en respectant les critères pour une analyse statistique non paramétrique par échantillons appariés. Les extrémités du remplacement seront conservées pour études histologiques, immunologiques et biomécaniques. Les prélèvements non utilisés seront cryopréservés ou fixés pour une possibilité d’étude rétrospective sans recourir à de nouvelles expérimentations animales. Enfin lors de la mise à mort, sur le principe de la mutualisation des prélèvements, d’autres tissus du porc pourront également être mis à disposition de nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, de manière globale, en expérimentation animale.

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Le vétérinaire référent du Laboratoire passera une fois par semaine et à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (dyspnée, alimentation, perte de poids, douleur). Les animaux auront un traitement antalgique adapté. Afin d’éviter une surinfection de la zone de greffe, une antibioprophylaxie systématique sera administrée. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, prostration, fièvre) ou de difficulté aiguë à respiratoire sans traitement possible, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Parmi les différents modèles animaux envisageables (rongeurs, lapins, chèvre, mouton, porc), le porc a une trachée dont les caractéristiques anatomiques et biomécaniques se rapprochent le plus de celle de l’homme. De plus, des modèles de porcs sont déjà utilisés dans d’autres études de remplacement trachéal. Enfin, l’immunologie du cochon est bien connue. Cette connaissance établie facilitera notre analyse de la réaction inflammatoire potentielle sur le site de greffe. Animaux matures sexuellement pour limiter la croissance des tissus, plus intense chez les animaux en croissance (juvéniles). L'âge est relativement secondaire en revanche nous visons des animaux dont le poids est stabilisé entre 45 et 60 kg. Cette stabilité (relative) du poids est habituellement atteinte entre 12 et 18 mois.

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection anesthésiante dans l'abdomen précède l'instillation d'un liquide directement dans les poumons, geste répété une seconde fois pour une partie d'entre elles, avec un risque de blessure de la trachée. Certaines reçoivent ensuite une goutte de liquide par le nez six fois en deux semaines, et la croissance des tumeurs pulmonaires peut s'accompagner de difficultés respiratoires. La mise à mort sert à prélever les organes pour analyser le système immunitaire, et le porteur conclut qu'il n'existe "pas d'autre possibilité" que l'animal pour reproduire la réponse immunitaire.

Objectifs

L'élastine est une molécule donnant leur élasticité aux organes. Les poumons, de part leur besoin d'élasticité sont riche en élastine. Quand elle se dégrade des molécules appelées peptides d'élastine se forment et peuvent influencer les cellules du système immunitaire. Au cour de la croissance des tumeurs dans les poumons, beaucoup de peptides d'élastine sont produits. De plus ces peptides peuvent provenir d'un emphysème, c'est-à-dire de la destruction des poumons, qui est présent chez 50 à 60% des patients atteints de cancer des poumons. L'objectif de ce projet est de déterminer comment les peptides d'élastine influencent les cellules du système immunitaires pour les empêcher de combattre les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'acquérir des connaissances supplémentaires sur la façon dont les peptides d'élastine influence le système immunitaire dans le cancer. A plus long terme, ce projet nous permettra de proposer de nouvelles thérapies ciblant les peptides d'élastines.

Procédures

Les souris subiront: Procédure 1 et 3: Une injection dans l'abdomen de produit anesthésiant et une injection d'un petit volume de liquide directement dans les poumons. Procédure 2: Deux injections dans l'abdomen de produit anesthésiant et deux injections d'un petit volume de liquide directement dans les poumons à quelques jours d'écart. Procédure 4: Une injection dans l'abdomen de produit anesthésiant et une injection d'un petit volume de liquide directement dans les poumons. Une semaine après les souris devront absorber une petite goutte de liquide par le nez 3 fois par semaine pendant 2 semaines soit 6 fois.

Impact sur les animaux

L'injection dans l'abdomen peut causer une douleur légère de courte durée. L'injection dans les poumons peut provoquer un inconfort. Dans de rares cas, il peut y avoir une blessure de la trachée qui conduira à l'euthanasie de la souris. La croissance des tumeurs dans les poumons pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires. L'administration par le nez peut provoquer un inconfort.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Les résultats précédemment publié par la communauté scientifique nous a confirmé qu'il n’existe pas d'autre possibilités que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre dans la réponse immunitaire. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire au plus juste afin de limiter le nombre de souris.

Raffinement

Les techniques utilisées ont été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme proche de l'humain pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes adulte est indispensable puisque la dégradation des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait changer nos résultats mais le cancer du poumon que nous étudions est une maladie de l'adulte.