Système respiratoire

Déjà utilisées dans un projet antérieur, cinq macaques à longue queue femelles de trois à quatre kilos sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et pourront être réutilisées ensuite dans un autre projet après accord du vétérinaire. Chacune reçoit un anticorps antiviral radiotracé par le nez sous anesthésie légère, subit une imagerie scintigraphique, une intubation trachéale avec une heure d'assistance respiratoire, des lavages nasaux et des prises de sang répétées. L'étude porte sur cinq individus sans analyse statistique, le porteur admettant que l'effectif et l'hétérogénéité du dépôt dans les voies respiratoires ne s'y prêtent pas. Le renforcement positif est écarté pour les lavages nasaux, les zootechniciens jugeant qu'un macaque non coopérant fait courir au personnel un risque de morsure.

Objectifs

Selon l’organisation mondiale de la santé, les infections des voies respiratoires basses demeurent la maladie transmissible qui fait le plus de morts dans le monde, et se placent au quatrième rang des principales causes de mortalité. Ces infections dues, entre autres, à des virus respiratoires entraînent des millions d’hospitalisations chaque année et est une cause importante de décès chez les personnes fragiles (âgées, jeune enfant…). Face à l’hésitation vaccinale, la moindre efficacité des vaccins dans certaines populations et l’émergence et une propagation rapide des virus pharmaco-résistants, de nouveaux traitements sont nécessaires pour contrôler les infections virales respiratoires. Pour de nombreux virus respiratoires, comme celui de la grippe, le virus respiratoire syncitial et celui de la Covid-19, les cavités nasales sont le site d’entrée, de réplication primaire du virus, et constitue un réservoir pour la transmission du virus aux poumons, où l’infection peut provoquer une pneumonie potentiellement mortelle. Le contrôle de la réplication des virus respiratoires et de l’infection dans les cavités nasales offre donc une réelle opportunité de limiter les pneumonies lorsqu’une épidémie émerge. Aujourd’hui, de nombreuses biothérapies à visée intranasale (protéines et vaccins) sont en cours de développement ou commercialisés pour diverses applications. S’appuyant sur des décennies de recherche translationnelle en immunothérapie sur les infections respiratoires, en ingénierie des anticorps et en inhalation le but de ce projet européen est de développer des traitements inhalables (par voie intranasale), à base d’anticorps contre différents virus respiratoires (grippe, COVID) afin de bloquer l’infection dans les cavités nasales. Plus concrètement, cela implique : 1/ d’évaluer le dépôt de l’anticorps dans les voies respiratoires après inhalation par voie intranasale chez le primate non humain afin de déterminer la dose délivrée dans les cavités nasales et 2/ d’analyser le devenir et l’impact de l’anticorps inhalé dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Les infections respiratoires représentent un lourd tribut en termes de morbi/mortalité, perte de productivité et coût pour le système de santé. L’impact sociétal potentiel du projet est immense. La prévention des décès et des hospitalisations dus aux virus respiratoires avec des anticorps inhalés aura un avantage direct pour la santé humaine et un potentiel économique et sociétal important. Cette approche anticorps/voie intranasale offrirait une opportunité de mieux contrôler les épidémies. L’approche par inhalation intranasale avec des anticorps capables de neutraliser différentes virus respiratoires est très attractive pour limiter la transmission entre personnes et pour prévenir des pneumonies sévères.

Procédures

- Pose des points de repère spatiale : sous anesthésie chimique légère- 10 minutes - Mesure du coefficient d’atténuation des cavités nasales : sous anesthésie chimique légère- 10 minutes - Administration par voie intranasale de l’anticorps radiotracé : sous anesthésie chimique légère - 1 minute au total - Imagerie scintigraphique du dépôt dans les voies respiratoires de l’anticorps radiotracé : sous anesthésie chimique légère - 15 minutes - Intubation par sonde intratrachéale : sera réalisée à l’occasion des gestes nécessitant l’anesthésie gazeuse à l’isoflurane- le geste lui-même dure environ 2 minutes mais les animaux seront intubés et sous assistance respiratoire pendant 1 heure. - Prélèvements sanguins : sous anesthésie–5-10 minutes par prise de sang Et sur animaux vigiles – 5-10 minutes par prise de sang. - Lavage nasal : sous anesthésie 5 -10 minutes par lavage.

Impact sur les animaux

Nous avons identifié quelques nuisances attendues/prévues : - Stress causé par la contention et manipulation des animaux, - Douleur causée par l’injection d’anesthésiques chimiques De plus, nous avons identifié des facteurs engendrant des potentiels effets indésirables/secondaires : l’utilisation d’anesthésiques pouvant éventuellement entraîner des troubles cardio-respiratoires, des hématomes lors des prises de sang, une irritation locale lors de l’inhalation par voie intranasale de l’anticorps radiotracé et lors des lavages nasaux.

Devenir

Au vu de l'espèce utilisé dans ce projet et de la classification de la gravité de la procédure (moderée), les animaux pourront être réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire réferent.

Remplacement

Le principe de remplacement de la règle de bien-être animal est appliqué. En effet, les résultats in vitro préalables à l’utilisation des animaux, notamment l’utilisation de répliques anatomiques de cavités nasales macaques, nous permettrons de calibrer les différentes expériences in vivo afin de limiter le nombre d’animaux nécessaire et d’utiliser d’emblée des posologies et modalités d’administration adaptées.

Réduction

Les animaux seront réutilisés d’un autre projet, mais naïfs vis-à-vis de l’anticorps anti-viral. L'étude est réalisée sur un effectif réduit (n=5) et servira à obtenir des données qualitatives, sans analyse statistique, du devenir et de l’impact de l’anticorps inhalé. Comme indiqué dans la saisine, les temps de prélèvements (sanguin et nasal) pourront varier selon les animaux car ils seront ajustés, au cours de l'étude, sur la base des données issues des premiers animaux. Une analyse statistique n'apparaît donc pas compatible compte tenu du n faible à chacun des temps (n

Raffinement

Pour réduire au maximum l’utilisation d’anesthésiques, du renforcement positif est inclus pour les prélèvements sanguins (PS) à T3h-72h post-inhalation (PS sans lavage nasal concomitant). A ces temps les PS seront réalisés sur animaux vigiles sans contention uniquement sur les animaux répondants car, d’après des études, certains animaux n’adhèrent pas à ce type de démarche même après plusieurs semaines d’entrainement. Pour les animaux non réceptifs les PS seront réalisés sur animal vigile mais immobilisé par contention. Le renforcement n’est pas envisagé pour les PS aux temps T15min->T60min car le respect de ces temps précis est primordial pour l’analyse pharmacocinétique. Il n’est pas envisagé pour les lavages nasaux pour des questions de sécurité du personnel car, d’après les zootechniciens, il est difficile d’entrainer un PNH à accepter l’administration nasale d’un soluté et d’en récupérer un volume. Ce geste sur un animal non coopérant amène des questions de sécurité (risque morsures). La totalité des lavages nasaux se fera donc sur des animaux anesthésiés avec des molécules et dosages adaptés. Enfin, vu que les lavages nasaux impliquent une anesthésie nous réaliserons les PS aux temps T0, T1sem, T2sem, T3sem, T4sem durant l’anesthésie. Pour réduire la douleur et éviter des hématomes la taille de l’aiguille sera adaptée et un point de compression sera appliqué. Si insuffisance respiratoire des mesures d’oxygénothérapie et réanimation seront mis en place. Pour réduire le risque d’irritation locale, la taille des embouts narinaires sera adaptée et les lavages seront réalisés avec soin. Au cours de l’anesthésie prolongée : -Gel oculaire pour prévenir la sècheresse des yeux - Humidification et réchauffement des voies aériennes par filtre échangeur d’humidité chaleur - Sonde d’intubation de taille adaptée avec ballonnet pour éviter une lésion trachéale et garantir une bonne ventilation. - Tapis chauffant pour maintien d’une température - Fluides de remplacement (solution isotonique) après des PS multiples. Les animaux sont hébergés par groupe de 3 et de 2 dans 2 volières conformes aux normes en vigueur. Ils disposent dans leur hébergement de plateformes surélevées, de tunnels, de jouets et de piscine. L’alimentation couvre les besoins journaliers et est complétée par une distribution de friandises. La nourriture pourra être cachée dans des jouets pour stimuler la recherche alimentaire. Les friandises distribuées sont différentes d’un jour à l’autre.

Choix des espèces

Le primate non humain est une espèce de référence pour les études de dépôt de particules inhalées dans le tractus respiratoire, permettant de mettre en place différentes conditions de ventilation et d’utiliser des dispositifs à qui seront directement utilisés chez l’homme. Le choix de l’espèce macaque se justifie par : - La tenue bipède, la morphologie du nez et le volume des cavités nasales. La tenue assise lors de l’administration de la molécule et la taille du nez permet l’utilisation de dispositif à visée humaine avec un embout adapté. Le volume des cavités nasales est compatible avec les volumes administrés avec les différents dispositifs. - Proximité anatomique de l’espèce. Les cavités nasales des macaques sont plus similaires à celle de l’homme, que celles d’autres espèces. - Proximité physiologique de l’espèce. La morphologie et la distribution de l’épithélium nasal (où se réplique le virus de la grippe et cible de l’anticorps) chez le macaque est plus proche de celles de l’homme que celles d’autres espèces (rongeurs, chiens) - Similarité des réponses immunologiques et biologique avec l’humain, faisant du PNH une espèce de référence pour les études réglementaires avec des anticorps thérapeutiques. 5 animaux adultes de 3-4 kg réutilisés de projets précédents après accord du vétérinaire référent.

Jusqu'à quarante séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie générale et quarante injections par animal : 500 souris et 100 rats vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré tient à la mise au point de protocoles d'imagerie par bioluminescence et par fluorescence, et à la formation de nouveaux utilisateurs de ces machines, en amont des projets scientifiques des équipes. Le porteur signale des phénotypes dommageables possibles, perte de motricité empêchant l'animal de s'alimenter, crises convulsives, amaigrissement, tumeur de plus d'un centimètre cube gênant l'alimentation ou provoquant une douleur permanente. Il présente ce projet de plateforme comme un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés ailleurs, en évitant de lancer de grandes études dont les résultats ne seraient pas satisfaisants.

Objectifs

L’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence du petit animal sont des techniques non invasives qui permettent de suivre des cellules spécifiques en temps réel et au cours de plusieurs sessions (suivi longitudinal). Ce suivi longitudinal est notamment utilisé pour le suivi de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs, l’étude du trafic cellulaire, la surveillance des cellules transplantées et les modèles d’expression génique. L’objectif de ce projet consistera d’une part à mettre au point différents protocoles d’imagerie pour répondre par la suite aux besoins des équipes de recherche, et d’autre part à la formation des nouveaux utilisateurs à cette technique. Pour atteindre cet objectif, des expériences en conditions réelles sur animaux anesthésiés doivent être menées.

Bénéfices attendus

Du point de vue scientifique, ce projet permettra de proposer des techniques à la pointe de la technologie pour répondre à des questions scientifiques diverses (suivi au cours du temps de la progression d'une maladie ou d'un traitement, la validation de nouveaux marqueurs, la surveillance des cellules transplantées). Ce projet permettra de mettre en place ou d’optimiser des protocoles d’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence sur des lots d’animaux pilotes. A la fin de chaque étude, nous pourrons estimer sa faisabilité avec la méthode choisie et l’équipement disponible, ce qui permettra de ne pas initier d’études impliquant un grand nombre d’animaux lorsque les résultats obtenus ne seront pas satisfaisants. Au contraire, l’acquisition de ces données préliminaires lorsqu’elles sont robustes et pertinentes pourraient être utilisées pour justifier les futures demandes d’autorisation de projets à portée scientifique.

Procédures

Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. Nous réaliserons 40 séances maximum par animal (2h maximum par séance) avec minimum 48h entre chaque imagerie. Les injections de molécule pour détecter la bioluminescence seront réalisées sur animal éveillé ou endormi en fonction des nécessités : 40 injections maximum (durée inférieure à 1 minute), avec minimum 48h entre chaque injection. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale nécessaire pour les examens d’imagerie sera associée à une hypothermie, un risque de difficultés cardiorespiratoires, et un risque rare de non-récupération de la vigilance suite à l’anesthésie. Les injections seront associées à une brève et légère douleur au point d’injection, avec un risque d’hématome possible très localement. En ce qui concerne les phénotypes dommageables, nous pourrons observer une perte de motricité empêchant l'alimentation, des crises convulsives, un amaigrissement, un développement d'une tumeur supérieur à1cm3 gênant l'alimentation et/ou l'hydratation et/ou entraînant une douleur permanente.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever puis analyser des tissus d’intérêt

Remplacement

Les développements méthodologiques et optimisations des protocoles existants seront réalisés dans un premier temps sur des échantillons de tissu ou de cellule. Seules les études nécessitant un organisme vivant complexe seront intégralement développées sur l'animal. En effet, les premières étapes permettent de valider des cibles d’intérêt puis l’utilisation d’un organisme vivant dans sa globalité permet d'étudier la complexité des échanges que ce soit au niveau cellulaire, structurel ou entres organes.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisé (600) est réduit au maximum. Selon les études, entre 5 et 10 animaux par lots pourront être utilisés pour valider les protocoles. Cinq animaux est le minimum nécessaire pour obtenir une preuve de concept en validant la faisabilité de la méthode. Un maximum de 10 animaux par lots sera utilisé pour avoir un échantillon suffisant et plus représentatif. L’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence est de fait une méthode non invasive pouvant être répétée pour un suivi au cours du temps, évitant ainsi certaines euthanasies à des temps d’intérêt en récoltant les données par ce moyen. De plus afin de limiter le nombre d’animaux, les équipes seront formés avec les animaux utilisés pour les études pilotes quand cela sera possible. Ce projet permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés à une échelle plus globale en réalisant des études pilotes pour des projets scientifiques, ce qui permettra de n’engager qu’un faible effectif d’animaux pour la mise au point des imageries. Ainsi si les résultats ne s’avéraient pas concluants un plus nombre d’animaux ne seraient pas engagés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions contrôlées de température, hygrométrie et éclairage. Les cages sont enrichies (nids, bâtonnets de bois à ronger). Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine à leur arrivée. Ils sont laissés au calme pendant une demi-heure dans la salle d’expérimentation pour qu’ils s’habituent à ce nouvel environnement. Lors de l’anesthésie générale nécessaire pour réaliser l’imagerie, du gel oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter tout dessèchement oculaire. De plus, leur température corporelle sera maintenue durant toute la durée de l’anesthésie à l’aide d’une chambre d’induction et de réveil chauffées et d’un plateau chauffant intégré au système d’imagerie. Les animaux seront remis dans leur cage d’origine une fois qu’ils seront parfaitement réveillés. Ils seront à nouveau examinés sous 24 heures pour vérifier leur récupération et plus si le besoin s’en fait ressentir. Nous limiterons le nombre d’imagerie dans la vie de l’animal et nous assurerons d’un délai de récupération de 48h minimum entre chaque session tout en vérifiant au préalable son bon état de récupération. Les animaux seront observés quotidiennement par la zootechnie et une fois par semaine par un membre de l’équipe.

Choix des espèces

Les rongeurs (souris et rat) sont les seules espèces utilisées dans ce type de machine pour acquérir des images capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribuent à répondre aux questions scientifiques posées. Dans notre contexte, les projets de recherche porteront sur l’étude des maladies neurodégénératives, les cancers ou les maladies du foie ou du poumon, pathologies pour lesquelles il existe de nombreux modèles de rongeurs déjà développés. Les animaux pourront être imagés entre 3 semaines et 18 mois, en fonction du protocole des équipes utilisatrices ou de la réutilisation au cours du temps des animaux. Nous essaierons donc de nous placer dans un stade physiologique similaire aux pathologies étudiées afin d’obtenir les meilleures chances de réussite de la transposition de nos résultats à l’Homme. Néanmoins, en l’absence de besoin spécifique pour le développement de la méthode, les animaux utilisés seront de jeunes adultes (âgés de 2 à 6 mois) afin d'avoir des conditions physiologiques les plus courantes possibles pour nos tests.

Une sonde de gavage enduite de lidocaïne descend dans la trachée de souris anesthésiées pour y déposer des bactéries et déclencher une pneumonie septique. 3 118 souris vont être utilisées de cette manière, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que ces interventions "n'engendrent pas de douleur résiduelle ni de stress supplémentaire", tout en prévoyant une ou plusieurs injections de morphinique sur animal vigile selon le score de douleur relevé chaque jour. La rubrique consacrée au choix de l'espèce ne justifie rien : elle reprend mot pour mot le texte sur l'hébergement et le transport, et l'effectif de 3 118 souris tient en une ligne, réduit "au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable".

Objectifs

Pour ce projet nous allons déterminer le rôle d’un récepteur cellulaire dans la réponse immunitaire suite à une infection pulmonaire aigüe (sepsis). Ensuite nous allons tester si l’utilisation d’une molécule thérapeutique ciblant ce récepteur peut apporter un bénéfice dans le traitement de ces infection pulmonaires. Finalement, nous allons étudier les interactions de ce récepteur immunitaire avec d’autres mécanismes immunitaires.

Bénéfices attendus

Le sepsis et une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde. Ce projet vise à déterminer le lien entre l’activité d’un récepteur immunitaire et l’établissement de l’immunosuppression induite par le sepsis. Mieux comprendre les mécanismes biologiques responsables de ce phénomène pourrait mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques utiles dans le traitement du sepsis.

Procédures

Afin d’induire une pneumonie et après anesthésie générale, les animaux seront placés sur le dos. Une injection de bactéries sera réalisée directement dans la trachée à l’aide d’une sonde de gavage, enduite d’analgésique. Cette injection intratrachéale dure moins d’une minute et sera réalisée sur une majorité des animaux (EU1). Afin de s’assurer du bien-être des animaux et de l’absence de douleur, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles expérimentaux a été mis en place. En fonction de l’évaluation, si un animal présentait des signes de douleur, une ou plusieurs injections de morphiniques pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Ce geste dure moins d’une minute (EU1). Certains animaux auront des administrations intraveineuses (IV) en caudale et en vigile (EU1). Le geste d’IV est très rapide et ne dure au maximum que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les modèles d’inflammation respiratoire aigüe sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours), sans perte de motricité. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendrent pas de douleur résiduelle ni de stress supplémentaire

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications cardiovasculaire et immunologiques.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre les différents compartiments immunitaires et non immunitaires du poumon pendant et après la pneumonie nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place (Annexe 9). En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) pour d’anesthésier localement la trachée. Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. Concernant le transport des animaux, ceux-ci seront transporté dans des cages contenant un maximum de 5 animaux par compartiment, avec accès à de la nourriture et de l’eau, par un transporteur agrée.

Choix des espèces

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place (Annexe 9). En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) pour d’anesthésier localement la trachée. Dans ces conditions, les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. Concernant le transport des animaux, ceux-ci seront transporté dans des cages contenant un maximum de 5 animaux par compartiment, avec accès à de la nourriture et de l’eau, par un transporteur agrée.

Une perte de 20 pour cent du poids en une semaine met fin au protocole. 54 souris porteuses d'une mutation du gène de la titine vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la mutation provoquant chez elles faiblesse musculaire et troubles respiratoires ou cardiaques. Elles passent une vingtaine de minutes sous anesthésie gazeuse pour une mesure de pression artérielle et un test respiratoire, puis une trentaine de minutes sous anesthésie générale pour un test de force, à l'âge d'un an. La cohorte de quarante animaux sera tuée pour prélever organes et tissus, et le porteur précise que les animaux qui les ont engendrés le seront aussi, la lignée n'étant pas maintenue.

Objectifs

Au cours de ce projet, nous allons caractériser un modèle souris qui développe une myopathie avec des problèmes respiratoires graves. Cette myopathie représente 65% des cas mondiaux de myopaythies héréditaires avec insuffisance respiratoire précoce. L’étude de ce modèle souris permettra de mieux comprendre les causes de la maladie et pourra ainsi servir pour des essais de traitement de la maladie.

Bénéfices attendus

L étude de ce nouveau modèle de souris myopathe nous permettra de mieux comprendre cette maladie et en particulier d 'étudier l 'importance de l 'activité respiratoire et cardiaque. Toutes ces nouvelles connaissances nous permettront d 'envisager de nouveaux traitements mieux ciblés qui seront d 'un grand bénéfice pour les patients atteints de cette myopathie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse d' une vingtaine de minutes dans un premier temps et à une mesure de la pression artérielle (phénotypage cardiaque) puis à un test respiratoire (plethysmographe). Ensuite ils subiront une anesthésie générale d 'une trentaine de minutes pour le test de la force musculaire.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle animal, les mâles et les femelles sont affectés avec une sévérité modérée (faiblesse musculaire, problèmes respiratoires et /ou cardiaques) ce qui peut générer un inconfort. Tous les animaux expérimentaux seront isolés temporairement ce qui peut générer un stress. L’induction de l’anesthésie nécessite la contention de l’animal peut générer un stress et/ou un inconfort. L’injection d’anesthésique peut induire une douleur ou un inconfort.

Devenir

Après la mesure de la force musculaire , les animaux de la cohorte (40) seront euthanasiés en vue de prélèvements d 'organes et de différents tissus. Les animaux ayant servi à la production de la cohorte seront également euthanasiés ( pas de maintien de la lignée).

Remplacement

Pour caractériser cette maladie ( myopaythie héréditaire avec insuffisance respiratoire précoce) et évaluer l’impact de cette mutation, nous souhaitons étudier le modéle souris porteur de cette mutation. Ce modèle étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et les conséquences de cette mutation. D’autre part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, respiratoire et cardiaque seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développerait pas et le bénéfice de la force musculaire, la fonction respiratoire et cardiaque ne pourraient pas être mesurées (REMPLACEMENT).

Réduction

Plusieurs tests seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en générant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests cardiaques et respiratoires, peu invasifs, offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en utilisant les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. Nos connaissances sur ces modèles animaux mutants et les études réalisées auparavant montrent que 10 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante et statistiquement valable. Nous prévoyons 54 animaux pour cette étude (REDUCTION).

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des faiblesses musculaires modérées apparaissaient, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage (interaction sociale). Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage pour faciliter l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration ou problèmes de déplacements. Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés et pesés une fois par semaine; une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Afin de diminuer le stress lié à aux diférents tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.(RAFFINEMENT).

Choix des espèces

La souris est une des seules espèces assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir un modèle de HMERF, une pathologie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherches dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe, ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec d'autres études et de mieux comprendre le pathomécanisme de cette maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier la fonction cardiaque, la fonction respiratoire et la fonction musculaire. Pour caractériser le phénotype de ces souris, les animaux seront étudiés à l âge d 'un an, ce qui correspond environ à la moité de la vie d 'une souris, sachant que chez l homme la pathologie se déclare vers 35/40 ans (envion demi- vie également)