Système respiratoire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système urogénital
Développement de vaccins optimisés contre les infections respiratoires aéroportées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
3 052 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 456 d'entre elles et modéré pour 1 596. Elles subissent un génotypage par phalangectomie, de trois à douze prises de sang sur animal vigile, jusqu'à trois administrations intranasales et trois injections intramusculaires sous anesthésie, puis de sept à quatorze séances d'imagerie réparties sur cinq à sept semaines. Une partie est infectée par la grippe ou le SARS-CoV-2, à doses non létales ou létales, avec abattement, poils hérissés, dos voûté et perte de poids attendus chez les souris non traitées. Le porteur écrit qu'il privilégiera la culture cellulaire ou les organoïdes dès que ce sera possible, tout en concluant que les méthodes actuelles ne permettent pas d'étudier la mise en place d'une réponse immunitaire locale.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de développer un vecteur vaccinal optimisé pour une délivrance intranasale contre les infections respiratoires (virus Influenza A (IAV) et SARS-Cov-2) avec une efficacité accrue par rapport aux vaccins actuels administrés en intramusculaire. Une administration intranasale améliora grandement la mise en place d’une mémoire immunitaire forte, durable, et localisée, nécessaire à l’élimination rapide et efficace du virus, et évitant sa dissémination à d’autres individus. Dans notre stratégie, le vaccin sera administré à des souris de laboratoire sous forme de microgouttes dans le nez de souris de laboratoire. L’objectif sera, d’une part, d’analyser la capacité de notre vaccin à activer le système immunitaire et à induire une mémoire immunologique locale forte dans le nez des souris vaccinées. D’autre part, nous allons étudier la capacité du vaccin à protéger durablement et efficacement ces souris contre une infection par diverses souches de IAV et du SARS-Cov-2. La mise en place d’une mémoire immunologique lors d’une vaccination est un processus complexe qui nécessite l’utilisation d’un modèle souris pour son étude. La souris est un animal qui permet de modéliser de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection respiratoire chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les maladies respiratoires ont des impacts sociaux et économiques majeurs, tant au niveau individuel que sociétal, et ciblent particulièrement les populations à risque du monde (i.e., nourrissons, personnes âgées et patients immunodéprimés). De nombreux experts prédisent que de nouvelles pandémies de grippe seront très probables l’année prochaine, alors que le SARS-CoV-2 circule toujours avec de nouveaux variants. Même si des vaccins existent, aucun vaccin administré par voie nasale n'est disponible utilisant la technologie de l’ARN messager. Or, une forte réponse immunitaire dès l’arrivée du virus au lieu d’infection, i.e., le nez, favorise significativement l’élimination plus rapide du virus, évitant ainsi la propagation de la maladie d’un individu à l’autre. L’augmentation de l'efficacité des vaccins actuels aura un impact sur les questions économiques ainsi que sur les domaines sociaux et culturels, avec un impact majeur sur la santé et des conséquences sociales. De plus, dans ce projet, nous sélectionnons des antigènes très conservés par des souches de virus différentes et ainsi développerons des vaccins « universels » qui protégera chaque individu contre différentes souches d’un même virus et évitera le besoin d’une vaccination répétée pour des variants différents. D’un point de vue scientifique et technologique, ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le fonctionnement des réponses immunitaires associées à la muqueuse nasale. D’autre part, les équipes de recherche impliquées dans ce projet ont à cœur de sensibiliser le public et participent activement à accroître l'exposition de la recherche immunologique sur les vaccins à un large public. Un meilleur accès à la recherche sur les vaccins sans aiguille, mais en spray nasal, pourrait aussi accroître l’acceptation du vaccin au sein de la population. Par ce projet, nous espérons ouvrir de nouvelles perspectives dans le développement de vaccins, qui pourrait également être utilisée pour la conception de nouveaux vaccins contre d’autres virus aéroportés et/ ou dans la lutte contre les cancers du système respiratoire et du cerveau par exemple.
Procédures
Le génotypage est réalisé sur les fragments tissulaires issus de l’identification par phalangectomie (une seule fois). De trois à douze prises de sang seront effectuées (quelques secondes par animal par prise de sang) sur animaux vigiles. Jusqu’à trois administrations intranasales (quelques secondes par animal) sur animal anesthésié. Jusqu’à trois injections intramusculaires (quelques secondes par animal) sur animal anesthésié. L’imagerie non-invasive in vivo sera réalisée sur animaux anesthésiés à l’isoflurane (quelques minutes) avec le système IVIS de 7 à 14 fois sur 5 à 7 semaines via une injection intrapéritonéale de D-luciférine.
Impact sur les animaux
Des souris de laboratoire seront utilisées pour ce modèle d’infection pour imiter les infections chez l’Homme. L’instillation intranasale du virus de la grippe ou du SARS-CoV-2 permet le développement d’une infection chez la souris. La période critique chez la souris avec les souches virales et les doses infectieuses utilisées sera à partir de J6 post-infection pour des doses non-létales et à partir de l’infection pour des doses létales. Les signes cliniques attendus sur les souris non traitées sont les suivants : abattement, poils hérissés, dos voûté, perte de poids et manque d’appétit, selon les doses virales. L’imagerie non-invasive in vivo sera réalisée sur animaux anesthésiés à l’isoflurane via une injection intrapéritonéale de D-luciférine, pas de nuisance attendue sauf une sensation de piqure lors de l'intrapéritonélae.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront infectés. De plus les animaux “contrôles” non-infectés devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentes dans les organes et nous devons absolument mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.
Remplacement
Nous reconnaissons que les avancées dans les techniques de recherche et les technologies alternatives permettent un remplacement et/ou une réduction de l’utilisation d’animaux. Dès qu’il sera possible de remplacer un modèle murin par une modélisation in vitro, via de la culture cellulaire ou la conception d’organoïdes 3D nous privilégierons cette solution, comme nous l’avons déjà fait par le passé. Il est important de noter que nos diverses formulations vaccinales seront systématiquement soumises à une caractérisation in vitro et à une validation sur des modèles de cultures cellulaires avant toute autre étape. Cependant, les méthodes alternatives actuelles, comme la modélisation mathématique ou les systèmes in vitro, ne permettent pas d’étudier la mise en place d’une réponse immunitaire lors d’une vaccination, notamment au niveau systémique, en préservant l'intégrité scientifique. De plus, l’infection par voie respiratoire fait intervenir de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection humaine que nous ne pouvons pas reproduire par le biais de techniques in vitro. Par conséquent, nous utiliserons un modèle murin, le seul à permettre l'étude approfondie du mécanisme de transport du vaccin et des réponses immunitaires qu'il engendre. L'utilisation de modèle murin est essentielle pour tester nos vaccins réactivant localement et de manière systémique le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des avancées significatives dans la lutte contre les infections respiratoires.
Réduction
Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animaux. La taille d'effet est calculée pour un certain niveau de risque et de puissance . Les animaux seront répartis en lots de 7 individus maximum par cage. Nous estimons qu’un effet cage peut représenter une part de la variabilité totale des données, ce qui nous amène à augmenter le nombre d’individus d’un certain facteur par rapport à un cas où aucun effet cage n’est observé. Les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, des résultats significatifs . Le plan expérimental mis en œuvre est emboîté. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques ou l’analyse de la variance.
Raffinement
Pour l’administration par voie intranasale, les souris seront soumises à une anesthésie légère et de courte durée à l’isoflurane pour assurer une respiration calme et ample. Le raffinement sera aussi assuré par l’expérimentateur par un suivi clinique des animaux (observation et pesée). Les expériences pratiquées dans ce protocole seront réalisées en accord avec les points limites acceptables définis dans la littérature. Les signes cliniques permettant d’évaluer l’état de douleur ou détresse seront évalués afin de mettre à mort les animaux dépassant un certain niveau de souffrance défini par un point limite intégrant plusieurs critères. Pratiquement, 2 types de critères (a et b) sont mesurés systématiquement. Le point limite est défini par l’occurrence d’un critère (b) minimum ou de 4 critères (a). Si le score limite est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
La souris est le modèle privilégié pour les expérimentations dans le domaine du développement de vaccins et de la réponse immunitaire. Ceci est principalement dû à la connaissance approfondie du génome murin, ce qui permet de tirer parti de nombreux outils soigneusement caractérisés. Parmi ceux-ci figurent les souris génétiquement modifiées pour exprimer des protéines spécifiques d'intérêt. De plus, la souris présente des avantages pratiques significatifs. Elle est aisément manipulable, dispose d'une courte période de gestation et peut donner naissance à plusieurs individus par portée, ce qui crée des conditions d'élevage optimales pour les expériences. Grâce à sa grande similitude génétique avec l'Homme, il est envisageable de transférer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Cette corrélation renforce la pertinence des découvertes réalisées avec les souris, ouvrant la voie à des avancées cliniques prometteuses dans la lutte contre les maladies infectieuses. Les animaux seront accueillis à 6-7 semaines d’âge (âge constituant un compromis adéquat entre maturité suffisante du système immunitaire et mis en expérimentation à partir de 7-8 semaines d’âge).
Impact de l’exposition périnatale à la pollution atmosphérique sur les pathologies pulmonaires chroniques.
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
Des femelles gestantes reçoivent de la dioxine par instillation dans la trachée au treizième jour de gestation, puis passent une semaine enfermées jour et nuit dans un isolateur reproduisant l'air de Paris ou de Pékin. Leurs petits sont ensuite maintenus quatorze jours dans une atmosphère à 85 % d'oxygène, et d'autres souris sont exposées à la fumée de cigarette deux heures par jour, trois jours par semaine, pendant un à trois mois. 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 644 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, alors que le porteur écrit qu'aucun effet létal n'est observé chez les souriceaux, qu'aucune détresse respiratoire n'a été identifiée chez les adultes, et que chaque procédure est conçue pour minimiser leur souffrance. Les bénéfices annoncés, des biomarqueurs "transposables à l'Homme" pour des maladies respiratoires du nouveau-né et de l'adulte, restent au conditionnel.
Objectifs
La pollution atmosphérique est reconnue comme étant la principale cause environnementale de maladies et de décès prématurés dans le monde selon l’Organisation Mondiale de la Santé. L'exposition périnatale à la pollution de l'air semble être un déterminant précoce dans les processus physiopathologiques des maladies respiratoires chroniques de l’enfant et de l’adulte. Cependant, aucune étude à ce jour n'a démontré de corrélation entre la progression de ces pathologies pulmonaires au cours de la vie et la détérioration de la qualité de l'air. L'un des principaux challenges dans l'étude des effets de la pollution atmosphérique sur la santé résulte de l'extrême complexité du mélange atmosphérique. La pollution atmosphérique est constituée d'un mélange complexe de plusieurs milliers de composants qui évoluent dans le temps et dans l'espace. Par conséquent, il nous faut étudier la dynamique globale d’une atmosphère polluée pour comprendre son impact sur les pathologies respiratoires de l’enfant et de l’adulte. Or, nous disposons d'un système unique en Europe permettant de soumettre des animaux à des atmosphères polluées complexes, système permettant d’aborder de manière pertinente et réaliste la problématique des effets de ces pollutions sur la santé. Nous nous intéressons particulièrement aux effets de la pollution atmosphérique sur une pathologie néonatale affectant le développement de l'alvéole pulmonaire pour laquelle aucun traitement n'est disponible à ce jour. Elle se caractérise par une expression très variable de la maladie (dans sa sévérité notamment), les déterminants de cette variabilité restant largement méconnus à l'heure actuelle, alors même que cette variabilité impacte grandement la qualité de la prise en charge thérapeutique des nouveau-nés atteints et leur devenir à l’âge adulte. Étudier le rôle du récepteur aux polluants chez les souriceaux génétiquement modifiés et exposés à la pollution atmosphérique in utero permettrait de mieux comprendre les mécanismes de ces maladies respiratoires néonatales et de l’adulte. De plus, la caractérisation de l'exposition des nouveau-nés atteints de cette pathologie pourrait permettre de mieux comprendre leur variabilité phénotypique, et ainsi améliorer leur prise en charge thérapeutique.
Bénéfices attendus
L’identification de marqueurs biochimiques, des gènes de susceptibilité et l’état de régulation de leur expression permettrait de cartographier ces pathologies, de stratifier leur sévérité, d’intégrer l’hétérogénéité des tableaux cliniques et de dégager de nouvelles pistes thérapeutiques. Ce projet pemettra de mettre en lumière des biomarqueurs prédictifs et diagnostiques transposables à l’Homme et de comprendre les mécanismes physiopathologiques de pathologies respiratoires du nouveau-né et de l'adulte pour dégager de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Liste des actes expérimentaux, leur durée et leur fréquence : Exposition à un polluant de référence (dioxine) : Description : instillation intra-trachéale sous isofluorane chez les femelles gestantes avec une dose faible de 1nmol/kg de dioxine Durée : moins de 2 min en moyenne par instillation et par animal. Fréquence : 1 seule fois à E13.5 Exposition à des atmosphères réalistes et complexes : Description : hébergement en isolateur des femelles gestantes (de E13.5 à E20.5) à une atmosphère de type Paris, Pékin ou filtrée Durée : 24 heures par jour. Fréquence : Continue sur une période de 7 jours Exposition à l'hyperoxie : Description : Souriceaux exposés à une atmosphère contenant 85% d'oxygène. Durée : 24 heures par jour. Fréquence : Continue sur une période de 14 jours (de P0 à P14). Exposition à la fumée de cigarette : Description : Exposition à la fumée de cigarette des souris adultes en utilisant la machine de type Teague® Durée : 1 mois pour le premier groupe et 3 mois pour le second groupe Fréquence : 2h par jour, 3 jours par semaine Surveillance clinique quotidienne : Description : Inspection visuelle des animaux pour détecter tout signe de détresse ou de souffrance (respiration, comportement, apparence physique). Durée : 15 minutes par groupe de cages. Fréquence : Une fois par jour. Pesée des souriceaux et des mères : Description : Pesée des souriceaux et des mères pour suivre la croissance et l'état de santé. Durée : 1 minute par animal. Fréquence : Deux fois par semaine. Sorties en normoxie pour les mères allaitantes : Description : Transfert des mères allaitantes en conditions normoxiques pour réduire le stress oxydatif. Durée : 3 heures par jour pendant 14 jours (de P0 à P14) Fréquence : Quotidienne. Prélèvements: Description : Le prélèvement du sang total, des urines totales se fera au moment de la mise à mort. Durée : 5 minutes par animal. Fréquence : Une seule fois,. Analyses post-mortem : Description : Euthanasie des animaux suivie de prélèvements d'organes (poumons, foie, cerveau, etc.) pour analyses histopathologiques et biochimiques. Durée : 30 minutes par animal. Fréquence : Une seule fois, à la fin de la période expérimentale. Ces actes expérimentaux sont essentiels pour la collecte de données précises et fiables tout en garantissant le bien-être des animaux. Chaque procédure est conçue pour minimiser le stress et la souffrance des animaux tout en permettant d'atteindre les objectifs de recherche.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes exposées 7 jours à la pollution atmosphérique peuvent présenter des signes de stress liés au changement de lieu d’hébergement et au bruit environnant. Les femelles gestantes seront hébergées par 2 afin de limiter leur stress. De plus, les études précédentes déjà réalisées au laboratoire n’ont pas révélées de différences significatives dans les naissances précoces des petits jusqu’à présent. Aucun effet léthal est observé chez les souriceaux exposés à 85% d'oxygène (modèle pré-clinique de pathologie respiratoire du nouveau-né). En revanche ces jeunes souris pourraient développer une gêne respiratoire ou une pathologie de la souris adulte. Les souris adultes ont une résistance limitée à l’oxygène concentré, ainsi les mères allaitantes peuvent présenter une gêne respiratoire. Cepandant, l’expertise de notre laboratoire a permis de développer des protocoles pour palier à ces conséquences. Enfin, aucune léthalité ou détresse respiratoire n’a été identifiée dans les modèles murins pré-clinique de pathologies chez l'adulte par enfumage aux temps choisis pour l’étude (90 et 150 jours après la naissance).
Devenir
A l’issue des procédures l’ensemble des animaux seront mis à mort conformément aux directives éthiques en vigueur et décrites dans cette saisine. Cette décision est justifiée par plusieurs raisons scientifiques et éthiques : - Les analyses post-mortem histopathologiques, biochimiques, cellulaires, moléculaires et morphométriques détaillées sont nécessaires en fin de chacune des différentes procédures afin de comprendre les mécanismes physiopathologiques. - Fiabilité des données : pour obtenir des données précises et comparables l’analyse post-mortem de l’ensemble des animaux de ce projet est nécessaire.
Remplacement
Notre étude qui porte sur l’impact de la pollution atmosphérique réaliste sur les trajectoires pulmonaires résultent d’une compléxité impossible à modéliser par la bio-informatique ou par des modèles non physiologiques (in vitro) pour l'étude des effets explorés à ce stade. L’utilisation des modèles animaux est donc nécessaire pour définir les signatures combinatoires complexes (biochimique, cellulaire, moléculaire et inflammatoire) des pathologies comme la dysplasie bronchopulmonaire et la bronchopneumopathie obstructive chronique en réponse à la pollution atmosphérique.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet est de 700 animaux soit 100 femelles gestantes et 600 souriceaux théoriques attendus pour un projet de 5 ans. Ce nombre a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données historiques du laboratoire et du nombre moyen le plus bas de naissances par portée. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations inter individus et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’une condition. L'effet d'une condition sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques paramétriques. Un calcul de l’effectif sera réalisé sur la base de notre étude préliminaire avant chaque étape afin d’ajuster le nombre d’animaux à inclure dans les procédures particulièrement au vu des naissances surnuméraires possibles (> 6 souriceaux par portée). Cette ajustement permettra de fixer la puissance statistique à 80%, standard admis, garantissant de détecter une différence de condition de l’ordre de 20% avec un risque de faux positif limité à 5%. En effet, précédemment au laboratoire nous avons harmonisé les procédures afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Par exemple, les signatures combinatoires de ce projet ont déjà été établies sur les animaux non transgéniques et pourrons être comparer avec les mêmes critères que les animaux transgéniques utilisés ici. Ce qui limite le nombre de contrôle interne nécessaire à ce projet. De la même manière, le choix des points temporels d’analyses a été conservé par rapport aux études précédentes du laboratoire. Ainsi, les résultats obtenus au laboratoire sur la pollution atmosphérique pourront être comparés. Ceci permet de diminuer drastiquement le nombre de conditions à tester dans ce projet et d’augmenter la puissance statistique. Enfin, à partir d’un seul animal nous pouvons établir l’ensemble des analyses combinatoires par individu en sachant que les protocoles d’analyses ont été optimisés en ce sens.
Raffinement
Avant d’être gestante, les femelles seront élévées avec soin par les mêmes zootechniciens et expérimentateurs pour une meilleure habituation. De même, nous avons fait le choix de garder une animalerie unique depuis leur élevage jusqu’à leur entrée dans le projet et leur mise bas pour permettre de limiter au maximum leur manipulation inutile, leur stress et optimiser leur bien être. Les femelles gestantes seront hébergées par 2 dans des cages ventillées pour favoriser leur entraide et diminuer leur anxiété au moment de la mise bas. Les souriceaux une fois sevrés seront élevés dans les cages ventillées par 5 maximun afin d’assurer leur bien être et leur vie sociale. Un enrichissement de l’habitat sous forme de maisonnettes, de briquettes de bois et de morceaux de cotons permettra de réduire le stress des animaux et de favoriser leur bien-être. L’ensemble des zootechniciens et expérimentateurs du projet a une expertise particulière quant aux différents protocoles et procédures de ce projet ce qui assurera une manipulation douce en adéquation avec le statut des femelles gestantes et de leurs souriceaux. L’instillation oro-pharyngée, l’exposition à une atmosphère complexe, l’hébergement en hyperoxie ou l’enfumage sont des techniques maitrisées au sein de notre équipe expérimentée. Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée du protocole, y compris les week-ends et jours fériés par les zootechniciens et expérimentateurs formés et habitués à ce type de projet. Ainsi, la mise en place de points limites précis (décrit en détails pour chaque procédure plus bas) permettra d’intervenir rapidement et efficacement pour éviter toute souffrance de l’animal. En cas de douleur observée sur l’animal ne répondant pas aux stratégies de soin mises en place, une mise à mort de l’animal sera pratiquée et une autopsie sera réalisée afin d’en comprendre les causalités.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples que seul ce modèle peut permettre : 1) le modèle murin est un modèle de choix lorsque l’on veut étudier des trajectoires physiopathologiques du fait de leur rythme rapide de reproduction, leur longévité et leur robustesse. 2) L’expertise pointue de notre équipe depuis de longues années sur les modèles pré-cliniques murins opère à plusieurs niveau : physiologique, chirurgicale, biochimique, cellulaire et moléculaire. 3) Les signatures combinatoires étudiées ont été particulièrement travaillées en amont de ce projet pour une transposabilité optimisée de l’espèce murine à l’espèce humaine. Les biomarqueurs identifiés dans ce projet pourront faire l’objet d’une recherche dans un protocole clinique chez l’Homme. 4) La génétique de la souris compte parmi les meilleures connaissances de la communauté scientifique et nous permet une diversité et une finesse d’outils analytiques sur lequel nous prendrons appui (exemple : les atlas transcriptomiques, les données physiologiques, les normes biochimiques…) 5) Seule la souris nous permet d’identifier précisement l’impact de la pollution sur les mécanismes physiopathologiques de ces maladies respiratoires. En effet, la construction d’un modèle génétiquement modifié est le seul qui nous permettra de suivre l’expression du récepteur aux polluants dans les cellules progénitrices du poumon. Il est le seul qui nous permettra de comprendre le rôle de la voie de signalisation aux polluants dans l’alvéologénèse afin de déterminer les trajectoires de ces pathologies pulmonaires en fonction de la présence ou de l’absence de réponse aux polluants.
Compréhension des mécanismes immunitaires associés à des nanoparticules d’ARNm en fonction de leur voie d’administration chez la souris naïve
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
2 055 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vaccin à ARNm par voie intranasale, par voie oro-trachéale avec introduction d'un cathéter dans la trachée, ou par voie intramusculaire, puis quatre séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie et quatre prélèvements de sang au sinus submandibulaire, en contention et vigiles. Un lot pilote de 30 souris sert uniquement à entraîner les intervenants à ce geste de prélèvement. Aucune maladie n'est induite, les souris sont tuées pour prélever poumons, nez, rate, ganglions et sang, et le porteur inscrit ces travaux dans une "production souveraine" de vaccins et l'ambition française de se placer "à l'avant-garde" des biothérapies.
Objectifs
Les récents succès des vaccins à base d’ARN messager (ARNm) contre le SARS-Cov2 ont validé le potentiel thérapeutique de cette classe de médicament. Le projet RNAvac a pour objectif de produire une nouvelle génération de vaccins ARNm en développant des technologies innovantes afin de lever les limitations des vaccins à ARNm démontrées par leur courte durée de protection induite nécessitant de fréquents rappels et leur inefficacité à bloquer les infections au site d’entrée du virus chez les personnes vaccinées. Il vise à étendre leur utilisation pour le traitement d’autres pathologies, comme le cancer. Pour relever ce défi, un consortium de 11 laboratoires académiques s’est structuré pour accélérer la production de vaccins innovants afin de les déployer pour lutter contre d’éventuels épidémies virales et traiter les cancers muqueux dont les besoins médicaux sont loin d’être satisfaits. L’ambition est d’accélérer la production française de ces vaccins innovants afin de les déployer en cas de menaces sanitaires (virus NIPAH, West Nile …), d’épidémies récurrentes (grippe…), et d’améliorer le traitement des cancers, qui reste un besoin médical non satisfait. Plus spécifiquement, ce projet vise à décrire et comparer les réponses immunitaires induites par différents vaccins à ARNm en fonction de leur voir d’administration, soit intra-pulmonaire, soit intra-nasale chez la souris saine.
Bénéfices attendus
Ce projet fait partit d’un consortium de grande envergure qui vise à développer de nouvelles générations de vaccins ARN messager pour lutter contre d’éventuels épidémies virales et traiter les cancers dont les besoins médicaux sont loin d’être satisfaits. Les éléments de rupture qui seront apportés par le projet sont : une approche de formulation originale de vaccins avec des ARNm bioproduits plus efficaces et moins couteux, une stratégie innovante de stabilisation d’ARNm, l’administration par voie mucosale de vaccins ARNm et le double ciblage ARN/antigène vers les cellules dendritiques pour favoriser la réponse immunitaire mémoire post-vaccinale. Le consortium s’appuie sur plusieurs infrastructures nationales et un réseau de start-ups et d’entreprises, des centres hospitaliers universitaires, qui vont faciliter le transfert technologique pour l’industrialisation et vers le patient. L’ambition long-terme est d’accélérer la production souveraine de ces vaccins innovants afin de les déployer en cas de menaces sanitaires, d’épidémies récurrentes et d’améliorer le traitement des cancers, qui reste un besoin médical non satisfait. En conclusion, ce projet s’inscrit pleinement dans l’ambition de la France de se positionner à l’avant-garde des technologies de biothérapie et de bioproduction à base d’ARNm.
Procédures
1a_Administration des ARNm par voie intranasale : sous anesthésie générale, 1 fois, 20secondes 1b_Administration des ARNm par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min 1c_Administration des ARNm par voie intramusculaire : en contention, animal vigil, 1 fois, 1min 30secondes 2_Mesure de la bioluminescence/fluorescence émise par les nanoparticules d’ARNm: sous anesthésie générale, 1 fois/semaine (total = 4) , 5min 3_Prélèvement de sang : en contention, animal vigil, 1 fois/semaine (total = 4), 2min
Impact sur les animaux
Aucune pathologie modèle ne sera testée chez l’animal. Il s’agit ici d’évaluer l’immunogénicité de différentes formulations d’ARNm en fonction de leur voie d’administration. Des données préliminaires in vitro obtenues dans les laboratoires collaborateurs vont nous permettre de limiter le nombre de doses à tester pour les différentes formulations d’ARNm, à celles présentant la plus faible toxicité minimisant ainsi les nuisances. Les nuisances associées aux administrations des formulation d’ARNm comprendront : le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et la douleur associée à l'introduction d'un cathéter dans la trachée pour la voie orotrachéale; le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et l'administration d'un bolus par la voie intranasale; le stress généré par la contention et la douleur associée au prélèvement submandibullaire.
Devenir
L’objectif de ce projet est d’améliorer nos connaissances dans les réponses immunitaires associées aux aARNm en fonction de leur voie d'administration. Ceci, afin d’améliorer leur transposabilité vers une utilisation clinique. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements (lavages nasaux, broncho-alvéolaires / prélèvements des poumons, nez, sang total, rate, ganglions drainant) seront réalisés afin d’analyser les dynamiques des populations immunitaires.
Remplacement
Ce projet est la suite de résultats obtenus sur des modèles in vitro dans des équipes collaboratrices. Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques/processus associés aux réponses immunitaires mucosales et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent et nécessaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modalités d’administration de biothérapies (intranasale, intratrachéale ou intramusculaire) sont très bien décrites chez la souris et sont maitrisées par notre équipe. L’utilisation de la souris permettra de mimer les phénomènes immunitaires observés chez l’Homme. Les outils transgéniques, permettant une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires mis en jeu dans l’immunogénicité à long terme induit par les ARNm sont disponibles chez la souris. Enfin, l’étude de la mécanistique immunitaire induit par les ARNm délivrés par voie pulmonaire est possible chez la souris grâce à des outils appropriés disponibles au laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux est optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, …). Les modèles murins et les différentes modalités d’administration sont maitrisés par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point. De plus, les expériences sont organisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Des données ont déjà été générées permettant de réduire le choix des doses et des temps d’analyses. L’utilisation d’imagerie non-invasive (via l’utilisation de formulations d’ANRm fluorescent/luminescent) permettra un suivi longitudinal des animaux, limitant leur nombre. 1 lot pilote de 30 animaux a été inclus afin d'entraîner les intervenant à la maîtrise du geste de prélèvement de sang par ponctions au niveau du sinus submandibulaire. Ceci permettra d’augmenter le robustesse de ce geste et donc de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée à l’observation, au cours des expérimentations envisagées, des points suivants: (1) une perte de poids de l'animal, et/ou (2) détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal et altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir ou de boire, poil hirsutes) et/ou (3) symptômes évidents. Ces symptômes, incluant des éléments physiques, physiologiques et comportementaux permettront d'établir un score clinique permettant de déterminer objectivement la poursuite ou non de l'expérimentation sur l'animal.
Choix des espèces
L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable, car les réponses vaccinales font (1) intervenir un certain nombre de cellules immunitaires différentes et (2) dépendent de l’organe considéré et donc de la voie d’administration. L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines formulations augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études chez l’animal sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. L’utilisation de la souris se justifie également d’un point de vue technique avec la disponibilité au sein du laboratoire de l’ensemble des réactifs/kits/consommables spécifiques de cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires à long terme associée aux ARNm. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire, ce qui pourrait perturber l’évaluation des traitements. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec gestes techniques procédures.
Conséquences de la dysbiose intestinale liée à l’âge sur les défenses immunitaires contre les infections respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Pour vérifier si le microbiote intestinal de souris âgées transmet une sensibilité accrue aux infections respiratoires, 1 653 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées. Trois semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson, un gavage de matières fécales sur animal éveillé, puis une infection par le pneumocoque ou le virus grippal déposée dans le nez sous anesthésie générale. Le porteur prévoit la mise à mort vingt-quatre heures après le pneumocoque et quatre jours après la grippe, en indiquant que ce calendrier précède l'apparition des signes cliniques, tout en décrivant une perte de poids qui commence dès le deuxième ou le troisième jour. Au-delà de ces délais peuvent survenir prostration, tremblements, respiration laborieuse et hypothermie, et une perte de poids de 20 % déclenche la mise à mort.
Objectifs
Les personnes âgées sont sensibles aux infections respiratoires. Des travaux récents montrent que le microbiote intestinal intervient dans les mécanismes de défense contre les infections, dont les infections respiratoires. Le microbiote intestinal produit de nombreux métabolites qui diffusent dans le sang et activent le système immunitaire dans les poumons. La fonction du microbiote intestinal (dysbiose) chute avec l’âge. Nous proposons que la dysbiose liée à l’âge participe à la susceptibilité des personnes âgées aux infections respiratoires virales et bactériennes. A notre connaissance, cette hypothèse de travail n’a pas encore été étudiée. Afin de valider cette hypothèse, notre premier objectif sera de démontrer que le microbiote intestinal isolé de souris âgées transmet une susceptibilité accrue à l’infection chez des souris receveuses jeunes. Pour cela, des expériences de transfert de flore fécale seront réalisées. Brièvement, des souris dépourvues en flore intestinale ou préalablement traitées avec une large gamme d’antibiotiques (afin d’éliminer le microbiote résiduel) recevront du microbiote (fèces) de souris âgées ou de souris jeunes. Les souris colonisées seront ensuite infectées avec le pneumocoque (première cause de pneumonie bactérienne chez l’homme) ou le viral grippal. Nous déterminerons la charge bactérienne et virale dans les poumons. Nous nous attendons à ce que les souris ayant reçu le microbiote de souris âgées soient plus sensibles à l’infection par rapport aux souris ayant reçu le microbiote de souris jeunes. Nous déterminerons la composition du microbiote et quantifierons les métabolites microbiens (fèces et sang) des souris colonisées. Nous corrélerons ces données avec les paramètres infectieux. Cela nous permettra d’identifier des candidats potentiellement impliqués dans la défense contre l’infection. Les candidats identifiés seront ensuite testés dans nos modèles d’infection. La demande concerne la procédure de colonisation des souris, le suivi des souris colonisées, l’infection des souris avec le pneumocoque ou le virus grippal, la quantification de la charge infectieuse et l’analyse des mécanismes immunologiques sous-tendant la susceptibilité à l’infection. La demande concerne également des procédures expérimentales visant à valider les candidats à potentiel thérapeutique issus de nos recherches. Il pourra s'agir de métabolites dont la production chute massivement chez la souris/individu âgé(e).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre pourquoi les personnes âgées sont sensibles aux infections respiratoires. Ce projet pourrait permettre d’identifier des métabolites microbiens (dérivés du microbiote intestinal) capables, à distance, d’activer certaines cellules du système immunitaire et de favoriser la défense contre les infections respiratoires. Outre l’intérêt fondamental, des retombées thérapeutiques sont attendues de ce projet.
Procédures
Le traitement aux antibiotiques (ajoutés dans l’eau de boisson) durera trois semaines. La colonisation des souris sera réalisée par gavage sur animaux vigiles. Les souris seront infectées deux à trois semaines après colonisation. L’infection sera réalisée par voie intra-nasale sous anesthésie générale. Les souris seront euthanasiées avant l’apparition des signes cliniques liés à l’infection (24 heures près l’infection par le pneumocoque et 4 jours après infection par le virus grippal). Ce choix maximise les données obtenues à partir de chaque animal, afin de limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour le traitement, en fonction de la nature du ou des métabolites, ces derniers seront administrés par gavage ou dans l’eau de boisson. Les doses correspondront à des doses physiologiques. Outre les paramètres cliniques, des études de pharmacocinétique et de biodistribution seront menées par prélèvements de sang et dans différents organes.
Impact sur les animaux
Un stress momentané est possible suite à la colonisation (gavage sur animaux vigiles). Dans nos conditions expérimentales, les animaux infectés par le virus grippal commencent à perdre du poids à partir du 3ème jour. Le sacrifice a lieu 4 jours après l’infection, avant l’apparition des signes cliniques. Lors de l’infection par le pneumocoque, les animaux commencent à perdre du poids au 2ème jour. La mise à mort des animaux a lieu 1 jour après l’infection. Les conséquences de l’infection peuvent se traduire par des signes légers ou modérés tels que la diminution des soins et une consistance anormale des fèces. Des signes sévères de mal-être post-infection peuvent aussi survenir au-delà de 5 jours (virus grippal) et de 2 jours (pneumocoque) tels que la prostration, tremblement, poil piqué associé à une ligne dorsale marquée, respiration laborieuse (fréquence et type significativement modifiés), état général apathique, hypothermie, et perte de poids.
Devenir
Les animaux sont euthanisés selon la procédure en vigueur à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Les expériences ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3 R. L’étude des effets physiopathologiques de l’infection par le pneumocoque ou le virus grippal et de l’efficacité des transferts de flore nécessitent l’utilisation d’organisme entier, et ne laissent pas la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des systèmes cellulaires. Suite à l’infection respiratoire, le système immunitaire s’active et conduit à une inflammation. Celle-ci se traduit par le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et par la production de facteurs solubles (cytokines, chimiokines etc). Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de cellules et de facteurs solubles qui ne peut pas être reproduite in vitro. Par ailleurs, les effets des transferts de flore fécale ne peuvent être évalués qu’in vivo. Le modèle souris est pertinent pour ce type d’étude.
Réduction
Il n’existe pas de méthode de substitution pour étudier les effets physiopathologiques de l’infection par le virus grippal ou le pneumocoque et pour évaluer l’efficacité de médicaments lors de l’infection. Il en est de même pour l’étude du microbiote intestinal et de ces interactions avec les cellules immunitaires du poumon. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres modèles n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’informations. Le modèle souris est particulièrement pertinent pour ce type d’étude.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par (i) la mise au point de procédures rigoureuses, (ii) la formation du personnel, (iii) un suivi quotidien de l’état de santé des animaux (iv) le recours à des procédures non invasives et non douloureuses. Pour les procédures induisant une douleur, les animaux seront anesthésiés. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant la durée de l’étude. Les conséquences de l’infection peuvent se traduire par des signes légers ou modérés tels que la diminution des soins et une consistance anormale des fèces. Tout signe éventuel de détresse (signes sévères) incluant prostration, changement du comportement de l’animal (diminution des soins, animal prostré), tremblement, poil piqué associé à une ligne dorsale marquée, consistance anormale des fèces associée à une distension de l’abdomen, respiration laborieuse (fréquence et type significativement modifiés), état général apathique, hypothermie fera l’objet d’une attention particulière. Si une perte de poids supérieure à 20% survenait, ou un signe évident de souffrance, les animaux concernés seront euthanasiés selon la procédure en vigueur. Les points limites sont définis selon les directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, hypothermie, problèmes ambulatoires, accès à la nourriture et à l’eau, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou plaie etc. Afin de réduire le stress, le milieu sera enrichi avec du matériel de nidification. Les procédures sont réalisées dans une zone calme différente de la pièce d’hébergement. Les animaux seront manipulés avec délicatesse (de préférence par le même expérimentateur). Outre le respect de la règle des R, ces précautions sont importantes pour éviter tout biais sur les résultats expérimentaux.
Choix des espèces
La souris représente un modèle de choix pour modéliser les infections respiratoires. Par ailleurs, même si la composition du microbiote varie entre une souris et un humain, il y a de nombreux points communs sur leur activité métabolique, notamment les produits issus de la fermentation. De nombreux métabolites communs sont retrouvés chez la souris et l’homme.
Rôle des cellules endothéliales et musculaires lisses sénescentes dans le vieillissement vasculaire pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Vingt et un jours enfermées en continu dans un caisson à 9 % d'oxygène : c'est ainsi qu'une hypertension artérielle pulmonaire est provoquée chez une partie des 1 152 souris de ce projet, dont 384 seront tuées sans jamais se réveiller et 768 utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent de l'élastase par incision et injection dans la trachée pour déclencher un emphysème, avant une mesure de la fonction pulmonaire de quinze minutes sous anesthésie. Le porteur signale que les manipulations ont lieu pendant la phase de sommeil des souris et que la nourriture déclenchant le transgène est amère, ce qui leur fait perdre du poids. Il écrit dans le même paragraphe que les souris exposées à l'hypoxie chronique perdent du poids "sans apporter de douleur à l'animal" et ne montrent "aucune difficulté respiratoire", alors que le protocole vise à leur donner une hypertension pulmonaire.
Objectifs
Le vieillissement des vaisseaux sanguins avec diminution du nombre de capillaires est un élément clé du vieillissement de l'organisme, ce qui réduit l'apport de nutriments et d'oxygène aux tissus. Les cellules endothéliales (CEs) qui composent les vaisseaux, sont nécessaires à la fonction des poumons. Un nombre élevé de CEs vieillissantes est associé au vieillissement prématuré du poumon et à plusieurs maladies pulmonaires. Ces cellules vieillissantes ne sont plus capables de se diviser et libèrent des facteurs nocifs pour les poumons. Ceci a pour conséquence la diminution de la formation de nouveaux vaisseaux contribuant alors au phénomène observé avec l'âge et dans certaines maladies. Tout comme les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses jouent également un rôle dans le développement de maladies pulmonaires, et seront aussi étudiées. Notre objectif est d'évaluer l'impact du vieillissement des cellules endothéliales et musculaires lisses au cours du vieillissement et de deux maladies, l'hypertension (HTP) et l'emphysème pulmonaires. Pour cela, nous étudierons le vieillissement cellulaire, la fonction pulmonaire, la densité et le remodelage vasculaire chez des souris jeunes et âgées, avec ou sans maladies pulmonaires. De plus, nous travaillerons avec des souris génétiquement modifiées pour éliminer les cellules endothéliales et musculaires lisses vieillissantes afin d'étudier le rôle de ces cellules dans les maladies pulmonaires liées à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer le rôle du vieillissement des cellules endothéliales et musculaires lisses pulmonaires avec l'âge et dans deux maladies pulmonaires liées à l’âge (hypertension artérielle et emphysème pulmonaires).
Procédures
Les différents animaux subiront une biopsie non invasive (1 seul geste de quelques secondes, ne nécessitant pas d'anesthésie) par poinçonnage d'oreille, effectuée au moment du sevrage (1 mois), nécessaire à leur identification. Les animaux seront placés dans un caisson à hypoxie, dans lequel la quantité d'oxygène est diminuée (9%) en continu (21 jours) permettant d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patients. D’autre part, afin d’induire un emphysème pulmonaire, les animaux seront traités à l’élastase (ou contrôle sans effet) : une petite incision et injection au niveau de la trachée sont effectuées sous anesthésie générale, lors d’une seule procédure rapide de 5 minutes. A la fin de la procédure d'injection d'élastase et au bout de 21 jours suite au traitement, nous mesurerons les fonctions pulmonaires à l’aide d'un appareil durant 15 minutes environ pour chaque souris sous anesthésie générale, connectée grâce à une sonde.
Impact sur les animaux
Les différents animaux subiront une biopsie non invasive (un seul geste) par poinçonnage d'oreille, effectuée au moment du sevrage (1 mois). Cette méthode d'identification peut causer une douleur légère de courte durée. Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie chronique, sans apporter de douleur à l'animal. Les souris ne montrent aucune difficulté respiratoire liée à l'hypoxie, seulement une légère fatigue. Les différentes procédures (hypoxie, instillation intratrachéale, mesure de la fonction pulmonaire) peuvent générer un stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal lors des anesthésies ou encore lors des déplacements de cages. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil, cela induit alors également un stress. La nourriture spéciale permettant l'expression du transgène chez la souris a un goût amer, ce qui entraîne une légère perte de poids chez la souris.
Devenir
L'étude nécessite le prélèvement du sang et des organes (poumons, coeur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologiques (quantification des marqueurs de sénescence, expression de différents gènes) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon), ainsi les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
En parallèle des études menées sur la souris, une étude sera portée sur des cellules issues d’échantillons pulmonaires obtenus lors d'une chirurgie chez des patients avec ou sans emphysème. La culture de cellules endothéliales permet d’étudier et de comparer des cellules de patients vs témoins sur différents critères. L’étude de souris génétiquement modifiées semble néanmoins incontournable afin d’étudier à l’échelle d’un organisme entier l’effet de l'élimination des cellules endothéliales et musculaires lisses vieillissantes sur des souris avec des maladies pulmonaires, nous permettant ainsi d’accéder à des données essentielles à la caractérisation de ces maladies.
Réduction
Nous choisissons d'étudier des groupes de 8 souris. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même fratrie pour réduire au maximum la variabilité des différentes mesures. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.
Raffinement
L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les responsables de ce projet. L'environnement des souris sera composé de maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton pour jouer. Les zootechniciens et responsables du projet seront en contact concernant le bien-être et la santé des animaux. Les points suivants seront considérés comme points limites pour les animaux qui seront mis à mort: 1. incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire. 2. Modification du comportement, douleur intense, détresse ou souffrance. 3. perte de poids trop importante, blessures diverses... Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine et contrôlé au cours des différentes procédures, cependant nous nous attendons à une perte de poids chez les souris porteuses d'hypertension pulmonaire. Aucune perte de poids supérieure à 10% n'est attendue. Si un animal présente un de ces points limites, il recevra une anesthésie et une analgésie adaptée à la mise à mort.
Choix des espèces
Les modèles de maladies pulmonaires que nous souhaitons utiliser sont bien maitrisés et ont déjà largement été utilisés, ils ont fait l'objet de plusieurs publications. Nous utiliserons des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et nous considèrons que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures, afin d'étudier l'effet des maladies pulmonaires sur les souris génétiquement modifiées. Nous étudierons également des souris âgées de plus de 18 mois pour étudier l’effet de l'augmentation de cellules vieillissantes chez ces souris mutantes.
Compréhension des mécanismes immunitaires associés aux anticorps thérapeutiques dans un modèle d’infection respiratoire à Pseudomonas aeruginosa et évaluation d’une protection à long terme chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Infectées puis réinfectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa au moyen d'un cathéter introduit dans la trachée, 3 390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 1 680 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 1 710 autres un niveau léger. Le porteur écrit qu'aucun traitement antidouleur ni anti-inflammatoire ne peut être administré pendant l'évolution de la maladie, faute de quoi l'évaluation des traitements testés serait faussée, et décrit une inflammation et une gêne respiratoire douloureuses selon leur intensité. L'alternative aux antibiotiques que le projet dit vouloir ouvrir, des anticorps inhalés combinés à des immunomodulateurs, en reste au stade des données précliniques.
Objectifs
Les infections respiratoires provoquent le décès de plus de 3 millions de personnes chaque année dans le monde. Ces pneumonies bactériennes ou virales sont particulièrement problématiques du fait de l’augmentation importante des phénomènes de résistances aux chimiothérapies antimicrobiennes. Aujourd’hui, les anticorps sont administrés exclusivement par voie intraveineuse. Or, cette voie n’est pas appropriée pour le traitement des maladies pulmonaires. En effet, les anticorps ne diffusent pas passivement dans les différents compartiments de l’organisme. Après administration intraveineuse, seule une fraction négligeable de l’anticorps accède au territoire pulmonaire. Depuis plusieurs années, des données précliniques soutiennent l’intérêt de l’inhalation pour améliorer l’efficacité des anticorps. Cette voie d’administration est d’ores-et-déjà une référence pour l’utilisation de bronchodilatateurs ou de corticoïdes chez les patients atteints d’asthme ou de bronchopneumopathies obstructives. L’inhalation permet d’administrer d’a,nticorps directement dans le poumon, sous la forme d’un aérosol. Lors d’infections respiratoires, ceci permettrait une plus grande rapidité d’action des anticorps, une forte concentration à proximité de l’agent pathogène, tout en limitant le passage systémique et les potentiels effets secondaires des anticorps. Nous avons démontré que le processus d’aérosolisation permettait d’administrer des anticorps ayant conservé leurs propriétés physiques et immunologiques, grâce à l’utilisation de dispositifs médicaux adéquats et au développement de formulations spécifiques. Nous avons également démontré qu’un anticorps dirigé contre la bactérie Pseudomonas aeruginosa, responsable de pneumonies, administré par inhalation, atteignait les poumons en plus grande quantité comparativement à une administration par voie intraveineuse. Ceci est associé à une meilleur efficacité. Des études préliminaires ont montré qu'une administration pulmonaire unique d'un anticorps anti-microbien avec certains agents immunomodulateurs permet de protéger les individus face à une seconde infection. Ce projet vise donc à décrire et comprendre les réponses immunitaires anti-infectieuses à long terme induites par des anticorps administrés par voie pulmonaire en combinaison avec des agents immunomodulateurs afin de favoriser leur transfert vers la clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet, basé sur des données préliminaires solides, vise à développer des stratégies thérapeutiques innovantes basées sur des combinaisons d’anticorps et d’immunomodulateurs inhalés pour induire une réponse à long terme contre des pathogènes respiratoires. Cette approche anticorps/immunomodulateurs offrirait une alternative thérapeutique aux antibiotiques/antiviraux, contre des pathogènes résistants, avec un effet durable permettant de prévenir les infections secondaires. Elles permettraient notamment de traiter les infections respiratoires à P. aeruginosa dans un contexte de bronchopneumopathies obstructives, de mucoviscidose et d’infections nosocomiales ou communautaires. Ces pathologies représentent un lourd tribut en termes de morbi/mortalité, perte de productivité et coût pour le système de santé. L’inhalation d’anticorps en combinaison avec des immunomodulateurs, pourrait offrir les avantages d’une nouvelle option thérapeutique face à l’antibiorésistance et d’un effet à long terme pour prévenir de nouvelles infections (chez un même individu) par ce pathogène, qui est rencontré à la fois lors d’infections respiratoires aigües mais aussi chroniques. Plus largement, l’inhalation d’anticorps en combinaison avec des immunomodulateurs pourraient être exploitée dans d’autres pathologies infectieuses respiratoires (infections à d’autres bactéries résistantes aux antibiotiques comme Klebsellia pneumoniae, Acinetobacter baumani ou d’autres infections virales comme le virus respiratoire syncitial, le SARS-CoV-2 ou le virus de la grippe). Les effets à court terme et à long terme des anticorps sont déjà documentés et utilisés pour le traitement de diverses pathologies. Il s’agit ici d’utiliser une voie optimale pour l’administration des anticorps à visée respiratoire (voie inhalée) et de potentialiser leurs effets en combinant les anticorps avec des immunomodulateurs pour en faire des médicaments plus efficaces contre la réapparition d’infections secondaires. La voie inhalée propose une administration non-invasive directement dans le territoire malade (poumon) pour une action rapide dans le tissu malade.
Procédures
_Infection et ré-infection par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min _Administration des agents immunomodulateurs par voie intranasale : sous anesthésie générale, 1 fois, 20secondes _Administration de l’anticorps ou des agents immunomodulateurs par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min _Administration des agents immunomodulateurs par voie intraveineuse : en tube à contention, 1 fois, 1min 30secondes _Administration des agents immunomodulateurs par voie orogastrique : en contention, 1 fois, 30secondes _Prélèvement de sang : sous anesthésie générale, 1 fois/semaine, 1min
Impact sur les animaux
Les infections peuvent générer une inflammation et une gêne respiratoire qui peuvent être douloureuses selon leurs intensités. Les animaux peuvent également présenter des douleurs associées à un stade avancé de la maladie. Aucun traitement antidouleur ou anti-inflammatoire ne peut malheureusement être envisagé pendant l’évolution de la maladie car ceci entrainerait un facteur confondant avec l’évaluation de l’efficacité des stratégies thérapeutiques et la compréhension des mécanismes inflammatoires/immunitaires associés. Les nuisances associées aux administrations des agents thérapeutiques/agent pathogène comprendront: le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et la douleur associée à l'introduction d'un cathéter dans la trachée pour la voie orotrachéale; le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et l'administration d'un bolus de 40µL pour la voie intranasale; le stress généré par la contention et la douleur associée à l'introduction d'une sonde de gavage dans l'œsophage pour la voie intragastrique; le stress généré par le maintien dans un tube à contention pour la voie intraveineuse.
Devenir
L’objectif de ce projet est d’améliorer nos connaissances dans les réponses immunitaires associées aux anticorps thérapeutiques/immunomodulateurs anti-infectieux inhalés. Ceci, afin d’améliorer leur transposabilité vers une utilisation clinique. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements (lavages nasaux, broncho-alvéolaires / prélèvements des poumons, rate, ganglions drainant) seront réalisés afin d’analyser les dynamiques des populations immunitaires.
Remplacement
Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques/processus associés aux infections respiratoires et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent et nécessaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modèles murins d’infection à P. aeruginosa sont très bien décris dans la littérature et permettent de mimer les phénomènes observés chez l’Homme. Les outils moléculaires, permettant une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires mis en jeu dans la protection à long terme induit par les Ac/immunomodulateurs, sont disponibles chez la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux est optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …). Les modèles murins d’infection à P. aeruginosa sont maitrisés par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point. De plus, les expériences sont organisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Un grand nombre de données ont déjà été générées permettant de réduire le choix des doses (bactérie et traitements) et des temps d’analyses. Nous utiliserons des outils statistiques adéquats. La souris est le modèle le plus adapté pour ces études précliniques car nous pouvons étudier la mécanistique de l’effet à long terme induit par les Ac/immunomodulateurs délivrés par voie pulmonaire avec des outils appropriés (cytométrie en flux, microscopie confocale, Luminex,….).
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique (selon notre score) des animaux sera réalisée de façon pluriquotidienne par les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale et l’atteinte des points limites décrits. Ceci inclura une attention particulière à l’observation du poids de l'animal et d'un certains nombres de symptômes qui seront utilisés pour établir un score clinique. Si l’un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie à l’isoflurane 2,5%. Un soin particulier sera apporté les 7 jours suivants une infection avec des visites biquotidiennes à l’animalerie. De la nourriture en gel sera déposée de manière préventive dans les cages pendant cette période afin de faciliter l’accès à l’eau et à la nourriture pour les animaux impactés par l’infection.
Choix des espèces
L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable, car les réponses vaccinales font (1) intervenir un certain nombre de cellules immunitaires différentes, (2) sont directement liées au contexte inflammatoire de l’hôte et (3) dépendent de l’organe considéré et donc de la voie d’administration. Le modèle infectieux à Pseudomonas aeruginosa se caractérise par une réponse inflammatoire exacerbée rapide (1 à 3 jours). L’utilisation de la souris se justifie également d’un point de vue technique avec la disponibilité au sein du laboratoire de l’ensemble des réactifs/kits/consommables spécifiques de cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires à long terme associée aux anticorps. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire, ce qui pourrait perturber l’évaluation des traitements. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec certaines procédures. Ce facteur poids rend les animaux plus résistants à l’infection et là encore pourrait gêner la correcte évaluation de l’efficacité de la réponse immunitaire au traitement.
Genotypage invasif des lignees transgéniques
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Une biopsie de l'oreille ou du bout de la queue, moins d'une minute de contention, moins de 5 mm de tissu prélevé : l'acte est bref et il concerne 100 000 souris. Toutes sont déclarées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, 10 000 sont annoncées comme réutilisées, les autres sont tuées, à l'issue d'un projet autorisé ou dès le génotypage quand elles ne portent pas le génotype recherché. Le porteur indique qu'au moins la moitié des souris nées dans son animalerie ne portent pas ce génotype, qu'un quart est utilisé pour des prélèvements de tissus et un quart pour des projets validés par le ministère. Le chiffre de 100 000 n'est adossé à aucun calcul dans le résumé, ni à un nombre de lignées, ni à une durée.
Objectifs
L'objectif est la caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés
Bénéfices attendus
Il est nécessaire d'identifier tous les individus génétiquement modifiés dans le cadre de la gestion d’élevage afin de répérer les animaux d'intérêt pour les différents projets scientifiques.
Procédures
Prélèvement d'une biopsie (auriculaire ou caudale) par animal (contention et biopsie < 1 minute, prélèvement en lui même < 1s, taille du prélèvement < 5mm)
Impact sur les animaux
L’effet indésirable qui peut survenir est une douleur légère et très passagère (quelques secondes) lors du prélèvement.
Devenir
Les animaux génotypés sont utilisés soit pour l'élevage, soit pour l'expérimentation. Dans le cas de l'expérimentation, les animaux sont euthanasiés à l'issue d'un projet scientifique autorisé par le ministère. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Les animaux qui n'ont pas le génotype nécessaire pour les expérimentations ou le maintien de la lignée seront euthanasiés lorsqu'ils ne peuvent pas être réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype.
Remplacement
Les animaux produits dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents organismes scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Avant de déposer cette demande, une alternative non-invasive (arrachage de bulbe pileux) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables. De plus, cette méthode, ainsi que d’autres méthodes non-invasives (analyse de fécès, prélèvement buccal) entraînant toutes un niveau de stress équivalent à la biopsie invasive à la queue ou à l’oreille, n’ont pas été retenues.
Réduction
L'animalerie élève de nombreuses lignées pour prélèvement de tissus ou pour des protocoles d'expérimentation animale. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Le maintien des lignées par reproduction nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter la consanguinité, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité génétique des animaux et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Selon les lignées et les projets, au moins la moitié des animaux n'ont pas le génotype nécessaire à l'expérimentation, environ un quart est utilisé pour prélèvement de tissu, et un autre quart dans des projets scientifiques validés par le ministère. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans d’autres projets.
Raffinement
Les méthodes de prélèvement (biopsie à l’oreille ou à la queue) et de marquage (boucle d'oreille lors du sevrage, ou tatouage avant sevrage) ont été choisies pour minimiser l'inconfort en fonction de l'âge des animaux (et donc du développement de la queue et de l'oreille). La biopsie à l’oreille prélevée lors du marquage au sevrage des animaux n'induit pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'incomfort, et du fait que l'oreille est très peu vascularisée, n'engendre pas de saignement. Dans le cas de biopsies précoces, quand l'oreille n'est pas assez développée, la biopsie est prise sur l'extrémité de la queue, qui n'est pas ossifiée dans les 10 jours après la naissance. Le saignement est minime (moins d'une goutte) et s'arrête immédiatement. Le marquage comme le prélèvement sont réalisés avec du matériel adapté, le geste est rapide et sûr, réalisé en routine par du personnel formé. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les animaliers. Ainsi, de même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé, en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées modifiées génétiquement permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. 5 à 10% des animaux sont utilisés après sevrage (entre 21 et 30 jours après la naissance) lorsqu'un génotypage précoce n'est pas nécessaire. Pour minimiser le stress, sexage, marquage et biopsie sont réalisés en même temps.
SARS-CoV-2 : histoire naturelle de l’infection, essais d’efficacité de traitements et de vaccins sur hamster doré
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Tués à l'issue au motif du risque lié à un agent pathogène de groupe III, 1 000 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit le SARS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie gazeuse, puis des traitements ou des vaccins administrés sur animal vigile, et jusqu'à trois prélèvements de sang au sinus rétro-orbital. Le porteur décrit l'infection comme une perte de poids transitoire d'environ 10 %, que l'animal contrôle au bout d'une semaine, et présente le hamster doré comme un modèle des formes non sévères de la COVID-19. La mise à mort de la totalité des animaux est acquise dès le départ, quelle que soit leur récupération.
Objectifs
Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SARS-CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SARS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SARS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire du hamster Syrien modèle de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SARS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SARS-CoV-2.
Bénéfices attendus
L’étude chez le hamster des infections à SARS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.
Procédures
L’inoculation de la souche virale est réalisée par voie nasale sous anesthésie gazeuse. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés par différentes voies à l’animal vigile par des manipulateurs expérimentés. Ces manipulations durent quelques secondes. Le traitement par voie nasale est administré sous anesthésie. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Les prélèvements sanguins nécessaires pour ces analyses seront réalisés au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié avec ajout d’un collyre anesthésique. Ces prélèvements effectués par un manipulateur expérimenté durent quelques secondes. Un maximum de 3 prélèvements sanguins sont prévus sur les animaux sur toute la durée du protocole.
Impact sur les animaux
Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SARS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection et retrouve son poids d’origine vers le 10ème jour.
Devenir
La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.
Remplacement
L’étude de la physiopathologie de l’infection et de l’efficacité vaccinale ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées. L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SARS-CoV-2 ainsi que son innocuité sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l’efficacité du traitement.
Réduction
Les modèles d’infection à SARS-CoV-2 chez le hamster sont maîtrisés depuis 2020 au laboratoire. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de répétabilité et reproductibilité satisfaisantes qui nous permettent de réduire nos études à des groupes de 6 animaux pour atteindre une significativité statistique.
Raffinement
Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation une semaine avant les expérimentations. Les hamsters sont hébergés par deux dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger. Une grille de points limites est établie afin de limiter la douleur des animaux.
Choix des espèces
Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SARS-CoV-2, quel que soit le variant, et représente un modèle de choix pour étudier les formes non sévères de la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires (perte de poids modérée et hyposmie/anosmie), l’animal contrôlant naturellement l’infection au bout d’une semaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles ou femelles. Ils sont sensibles à l’infection SARS-CoV-2 et ne développent pas de symptômes graves.
Développement d’un modèle murin de la forme infantile sévère de la maladie de Pompe par backcross répétés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
Les souris de ce projet sont croisées à répétition pour rendre plus sévère la maladie qu'elles portent, jusqu'à obtenir une atteinte musculaire massive, des troubles cardiaques et respiratoires et une mort précoce. 504 souris vont être utilisées, 468 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 36 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent une biopsie de la queue pour génotypage, puis six tests fonctionnels de force et d'endurance dès l'âge de 20 jours. Le porteur ne décrit comme effets attendus qu'une légère cambrure de la colonne, un léger écartement des membres postérieurs et un dandinement, alors que l'objet déclaré du projet est d'obtenir un modèle plus grave que ceux qui existent. Toutes seront tuées pour doser le sucre accumulé dans leurs muscles et leur cerveau.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer un nouveau modèle animal plus représentatif de la forme infantile de la maladie de Pompe. La maladie de Pompe est causée par une défaillance du métabolisme du sucre, qui va s’accumuler dans les muscles et induire une faiblesse musculaire importante, des problèmes cardiaquse et respiratoires. Cette maladie est causée par une mutation dans l'ADN qui va entrainer une absence de l'alpha-glucosidase acide (GAA). Cette enzyme permet, chez une personne saine, d'utiliser le sucre, stocké dans les muscles, lors d'un effort musculaire. Le déficit en GAA va induire une augmentation du sucre dans les muscles et ainsi les détériorer. La forme infantile, est la forme la plus sévère de la maladie. S'ils ne sont pas traités, les nouveau-nés, atteint d’une forte faiblesse musculaire, dès la naissance, meurent généralement avant la deuxième année de vie. Un traitement est actuellement disponible : ce traitement ne soigne pas la maladie mais ralenti son développement, son efficacité est réduite au cours du temps et il reste très contraignant (injection toutes les deux semaines). Avec ce traitement, l’espérance de vie de ces enfants varie entre 3 et 7 ans. Pour étudier correctement cette maladie et développer un médicament efficace, nous avons besoin d’un modèle animal ayant, comme les bébés, une atteinte musculaire très importante ainsi que des problème cardiaque et respiratoire et une mortalité précoce.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de développer un modèle murin très sévère de la maladie de Pompe infantile. En effet, la forme infantile est la forme plus sévère, avec un décès du nouveau-né dès la deuxième année s’il n’est pas traité. Un traitement est actuellement disponible mais il reste très contraignant (injection toutes les deux semaines), couteux et perd en efficacité avec le temps (mortalité entre 3 et 7 ans). Le développement d’un modèle plus représentatif de la forme infantile de la maladie de Pompe nous permettra dans un second temps de valider le médicament que nous sommes en train de développer afin d’obtenir des data plus robuste en traitant des symptômes que nous n’avons pas dans les souris classiques de la maladie de Pompe.
Procédures
Les souriceaux seront génotypés grâce au prélèvement d'un petit bout de queue, cet acte durera moins de 15 secondes. Les souris réaliseront 6 différents tests d’évaluation fonctionnels afin de mesurer leur force, leur endurance, etc. Chaque test dure entre 30 secondes et 3 minutes.
Impact sur les animaux
Du stress lié à la manipulation est attendu sur les souris. Le génotypage des souris induira une légère douleur lors de la récupération d'un petit bout de queue. Chez les souris malades, des effets indésirables liés à la progression de la maladie de Pompe seront attendus (légère cambrure de la colonne vertébrale, léger écartement des membres postérieurs, dandinement lors de la marche, dos arqué, écartement des membres). Si l'atteinte musculaire des souris est trop importante, nous modifions l'agencement de la cage (boisson + nourriture au sol) pour faciliter le déplacement des souris et l'accès à la nourriture.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, par une méthode réglementaire, à la fin de l’étude. Des prélèvements de différents tissus seront réalisés afin de mesurer la quantité de sucre dans les tissus (muscles, cerveau, etc.) signe de l'évolution de la maladie.
Remplacement
Les travaux réalisés précédemment sont encourageants pour développer un modèle plus sévère pour la maladie de Pompe infantile. Basé sur les résultats obtenus (accentuation du phénotype dès la première génération de souris), nous voulons poursuivre dans ce sens pour développer un modèle animal plus sévère. Nous ne pouvons donc pas remplacer le modèle murin dans ce contexte.
Réduction
Des tests statistiques ont été utilisé afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaire pour conduire à des résultats suffisent fiable.
Raffinement
Une nourriture adaptée pourrait être mise en place si les souris sont trop faibles. Les souris ne réaliseront pas plus de deux tests d'évaluations fonctionnels par jour afin de ne pas les stresser et fatiguer. Comme nous mettons en place une nouvelle colonie avec une maladie potentiellement plus sévère, les souris seront observées régulièrement et les points limites pourront être adaptés en fonction de nos observations.
Choix des espèces
Le modèle murin est un bon modèle pour étudier la maladie de Pompe puisque, comme chez l’homme, l’absence de GAA entraine une augmentation de sucre dans les muscles, ainsi qu’il perte de la force musculaire. De plus, le changement de fond génétique que nous voulons apporter ici à déjà montrer une augmentation de sévérité dans d’autres modèle murin. Nous réaliserons des tests d'évaluations fonctionnels précoce (20 jours, 1.5 et 3 mois) car si la maladie est suffisamment sévère, la faiblesse musculaire devrait se voir dans les premières semaines.
Caractérisation des émissions respiratoires de porcs infectés par un virus Influenza A
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
Six porcs de cinq semaines reçoivent un virus grippal directement dans la trachée, pour que soit mesuré ce qu'ils exhalent, dans l'intérêt déclaré de la filière porcine et de la santé humaine. Ils subissent ensuite six écouvillonnages nasaux et cent prélèvements d'air, deux par jour et par animal, tous sur animaux vigiles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque une fièvre de quatre jours, une baisse d'appétit, de la toux et des difficultés respiratoires. Tous sont tués pour prélèvement de tissus, et le porteur reconnaît qu'un générateur d'aérosols pourrait produire des particules virales, mais écrit qu'il "ne reproduit pas totalement" l'excrétion naturelle.
Objectifs
Le projet vise à produire des connaissances sur les émissions respiratoires de porcs infectés par un virus Influenza A. Les épidémies provoquées par ces virus transmissibles par voie aéroportée ont des impacts économiques et sanitaires importants pour la filière porcine et sont aussi des enjeux de santé humaine. Le protocole expérimental proposé dans ce projet a pour objectif de caractériser l’excrétion du virus dans les émissions respiratoires des porcs infectés. La charge virale présente dans ces émissions sera évaluée. La distribution de la taille des particules ainsi que la composition biologique et biochimique des aérosols qui transportent cette charge virale seront décrites. Des collectes d’air exhalé, grâce à un banc de prélèvement, seront effectuées sur un lot de 6 porcs. Des analyses physico-chimiques, bactériologiques et virologiques seront effectuées sur ces prélèvements. Conjointement, des écouvillons nasaux et leur analyse virologique permettront de suivre l’infection virale chez les animaux. La phase de collecte se déroulera sur la première semaine post-inoculation, période où l'excrétion virale est maximale.
Bénéfices attendus
Le projet vise à documenter les modalités de diffusion d’un virus influenza porcin, en caractérisant la charge virale dans l’air exhalé ainsi que la taille et la composition des microgouttelettes respiratoires porteuses de virus. Les résultats du projet contribueront à plusieurs aspects. D'une part, il s'agira de mieux évaluer et modéliser les risques d’exposition animale/humaine en cas de foyer détecté dans un élevage. D'autre part, les résultats permettront de proposer des contre-mesures environnementales efficientes pour limiter la propagation du pathogène (ex : adaptation des stratégies de traitement de l’air, préconisations organisationnelles dans les activités, etc.).
Procédures
Les animaux seront soumis à un challenge viral par voie trachéale : acte réalisé en moins d’une minute. Les animaux seront également soumis à 6 prélèvements nasaux par écouvillonnage : acte réalisé en moins d'une minute. Enfin, les émissions respiratoires des porcs seront prélevées à l'aide d'un banc de collecte : 10 minutes de prélèvement en continu pour la collecte de l’ensemble des exhalaisons des porcs auxquelles s'ajoutent 10 autres minutes pour la collecte en continu des aérosols. Au total, 100 prélèvements d'émissions respiratoires seront effectués au cours de cette procédure expérimentale, à savoir 2 prélèvements d'émissions respiratoires par porc par jour de collecte. Ces procédures seront réalisées sur animal vigile.
Impact sur les animaux
L’infection par un virus Influenza A porcin provoque une hyperthermie ne persistant guère plus de 4 jours ainsi qu’une baisse de l'appétit et des troubles respiratoires très modérés (dyspnée, toux, et éternuements) au cours de la première semaine post-inoculation. Aucune symptomatologie sévère n’est attendue lors de cette procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Des prélèvements de tissus (pour recherche virologique) sont prévus à la fin de la procédure, la mise à mort des animaux est donc indispensable.
Remplacement
Une alternative non animale disponible tiendrait à l’aérosolisation du virus influenza avec un générateur d’aérosols. Toutefois, cette technique physique ne reproduit pas totalement le processus naturel d’excrétion et d’aérosolisation qui se produit au niveau de l’organisme de l’animal. Le projet ayant pour objectifs d’étudier la composition physique et biologique des aérosols exhalés par des animaux infectés et de la mettre en relation avec la charge microbiologique, l’utilisation d’une technique produisant des aérosols de manière artificielle et pouvant modifier les caractéristiques des émissions respiratoires n’est pas envisageable. L’expérimentation consistant en la génération naturelle d’aérosols par les animaux, il n'y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal.
Réduction
Le dispositif expérimental, qui repose sur un total de 6 porcs inoculés, a été pensé de manière à minimiser le nombre de porcs utilisés tout en garantissant la fiabilité des résultats. De plus, des études antérieures ont montré la nécessité de regrouper a minima 3 prélèvements individuels pour optimiser la sensibilité analytique et maintenir des conditions de manipulation animale efficace. En limitant la manipulation à 10 min par animal, nous optimisons la qualité de l’échantillonnage des émissions respiratoires tout en minimisant le temps de contention des animaux. Cela nécessite en revanche de cumuler les échantillonnages pour détecter les particules virales dans les exhalaisons pour améliorer la sensibilité analytique. Ainsi, l’expérimentation sur un premier groupe de 3 animaux permettra de constituer un jeu de données initial, et une répétition sur un second groupe de 3 porcs permettra d’étudier la répétabilité de la mesure. L'objectif du projet étant de produire des connaissances sur les émissions respiratoires de porcs infectés par un virus Influenza A porcin, le dispositif expérimental ne comporte pas de lots d'animaux Témoin et les données ne feront l'objet d'aucune analyse statistique du type Cas/Témoin.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Le porc est l’espèce cible du virus Influenza A porcin. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Les porcs seront inoculés par un virus Influenza A porcin à 5 semaines d'âge conformément au modèle d'infection appliqué par notre Laboratoire dans le cadre d'expérimentation impliquant ce contaminant.
Implication des cellules lymphoïdes innées de type 2 dans la réponse allergique.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une perte de poids supérieure à 20 %, une hyperventilation, une perte de poils, un isolement social ou une baisse d'activité en cage font sortir la souris du protocole. 1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 840 d'entre elles subissent une trachéotomie d'une vingtaine de minutes pour mesurer leur fonction pulmonaire et prélever un lavage broncho-alvéolaire, 320 des prises de sang à la queue ou à la joue, après deux à quatre semaines d'instillations nasales d'extrait d'acarien. Le porteur cherche à décrire le comportement de certaines cellules immunitaires dans le poumon asthmatique et ne situe qu'à long terme d'éventuelles retombées thérapeutiques.
Objectifs
Ce projet se focalise sur le rôle des populations immunitaires localisées aux interfaces épithéliales des bronches en conditions physiologiques et en conditions inflammatoires. L’inflammation asthmatique se caractérise par l’activation et le recrutement (local et périphérique) de cellules immunitaires connues pour provoquer des altérations physiologiques au niveau des parois bronchiques suite à une stimulation par des allergènes inhalés. Afin de comprendre la régulation de la réponse immunitaire médiée par ces cellules dans un contexte inflammatoire, les souris sont mises dans des conditions d’induction d’asthme allergique via une exposition à différents extraits d’allergènes comme la papaïne et l’extrait d’acarien (House Dust Mite, HDM), et des molécules stimulantes (IL-33). Ainsi nous étudierons les modifications à court-terme (induites par la papaïne et IL-33) et à long-terme (induites par le HDM) du comportement des cellules immunitaires. Nous effectuerons plus particulièrement des études sur l’activation, la prolifération, la motilité, et les altérations morphologique de ces cellules immunitaires au cours de l’inflammation. Ces études permettront de déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires orchestrés par ces cellules immunitaires, en plus des modifications physiologiques observées.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au cours de l’inflammation du poumon dans un contexte d’asthme allergique. À court terme, ce projet permettra d’établir les différences de comportement des cellules immunitaires en inflammation dans différentes lignées de souris génétiquement modifiées, engendrées par les différents modèles d’induction d’asthme. Les résultats de ce projet devraient communiquer la nature des mécanismes moléculaires et cellulaires entre certaines protéine et cellules immunitaires dans le poumon asthmatique. Cela permettra de déterminer si ces mécanismes contribuent à la progression vers une pathologie chronique, ou à un rétablissement à l’homéostasie. À long terme, ces résultats pourraient participer à de futures recherches sur des stratégies thérapeutiques ciblées contre ces mécanismes moléculaires, afin de lutter contre l’exacerbation de l’inflammation et d’atténuer les dommages physiologiques, au vu de l’impact important de cette maladie en santé publique.
Procédures
Les interventions prévues sont les suivantes : 320 animaux subiront des prélèvements sanguins venant de la veine caudale latérale ou de la veine submandibulaire. 840 animaux subiront une procédure chirurgicale (maximum 20 minutes) permettant d’accéder à la trachée afin d’effectuer des trachéotomies pour les mesures de fonctions pulmonaires et ensuite prélèvements de lavage broncho-alvéolaires.
Impact sur les animaux
La stimulation par certaines molécules en 3 jours consécutifs peut induire une inflammation des poumons à court-terme. Le modèle d'instillations intranasales d’extrait d’acarien sera appliqué pour une plus longue durée allant à 2 semaines dans certaines expériences pour simuler une inflammation asthmatique aigüe, et à 4 semaines dans d’autres expériences afin d’induire une chronicité. Ces inflammations des voies respiratoires peuvent provoquer les nuisances suivantes : des irritations et constrictions aux niveau des bronches, et possiblement une augmentation du rythme respiratoire. Nous nous attendons donc à ce que les animaux utilisés dans ce projet présentent un rythme respiratoire augmenté à l’œil nu. Mis à part cette nuisance, la littérature ne décrit pas d’autres signe de nuisance apparente, Il n’y aucune difficulté d’alimentation/d’abreuvement, ni de mortalité causée par l’inflammation pulmonaire induite par ces modèles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés à pour un accès à leurs organes et à l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.
Remplacement
La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossibles à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront néanmoins entreprises en culture 2 dimensions afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique d’inflammation car les effets des modèles d’asthme allergique sont déjà décrits dans la littérature. Par exemple, nous savons que les changements de comportement des cellules immunitaires ne sont à tester qu’à partir de 24 heures après la dernière instillation de la molécule testée. Les mécanismes moléculaires et cellulaires, ainsi que leurs modulations ne seront analysés qu’à des points de temps précis où des différences significatives des populations immunitaires sont détectées. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire, ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement après la validation des altérations de mécanismes moléculaires impliqués dans les changements de comportement des cellules immunitaires (prolifération, activation, motilité) chez les souris génétiquement modifiées, une étude du blocage des molécules concernées se fera par l’injection de molécules inhibitrices. Ainsi, nous vérifierons dans les organes cibles si les molécules bloquées avaient un effet favorisant ces changements de comportement. L’application de ces molécules bloquantes uniquement dans le cas d’une prolifération/ activation/ motilité statistiquement significative permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste. Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’analyser les différents organes pour les populations immunitaires.
Raffinement
Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences. Certains seront évalués pour leurs capacités respiratoires et leurs sérologies à des points de temps spécifiques. Une fiche d’observation tout au long des conditions permettra de vérifier leur état (pelage, poids, interactions, mobilité) et des scores seront tenus afin de vérifier que les modèles décrits n’induisent pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis : perte de poids importante (>20%), hyperventilation, modification d’état du pelage/alopécie, isolement social, et diminution de l’activité dans les cages. Le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de diminuer la dose des stimulants et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Dans le cas des anesthésies par voie gazeuse, nous veillerons à chauffer les animaux anesthésiés à l’aide d’un tapis chauffant lors des inoculations intranasales. Nous appliquerons également du gel hydratant sur les yeux des animaux anesthésiés afin d’éviter les dessèchements. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.
Choix des espèces
La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. En outre, il existe un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiés dont l’utilisation permettra la réalisation d’études sur les dynamiques et mécanistiques des cellules immunitaires impliquées dans l’asthme allergique. Le détail du nombre de souris dans chaque procédure est décrit dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte, et la mise en place des modèles d’induction de l’inflammation asthmatique débutera à 6 semaines. Dans une de nos procédures, nous analyserons l’effet de l’inflammation asthmatique à partir de 14 jours (2 semaines). Ces âges ont été retenus comme les plus significatifs pour observer la mise en place et le suivi de l’inflammation allergique des voies respiratoires chez la souris. De plus, comme le modèle HDM se pratique sur 4 semaines dans certaines expériences, les souris doivent être analysées à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après les inoculations intranasales et que l’on ne se situe pas sur l’interprétation d’un facteur de vieillissement.
Effet de l’entrainement aérobie sur l’initiation, le développement et l’évolution de la fibrose pulmonaire dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Les souris courent une heure par jour, cinq jours par semaine pendant quatre semaines, sur un tapis roulant qui les y pousse par un stimulus aversif. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers, modérés et sévères, avant qu'on leur instille de la bléomycine dans la trachée pour provoquer une fibrose pulmonaire sur vingt et un jours. Le porteur affirme que cette administration n'entraîne "aucune lésion ni douleur particulière" et que la fibrose est indolore faute d'innervation sensitive dans le poumon, tout en annonçant une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30 %. Les survivantes sont tuées pour prélever les poumons, le sang et le liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une pneumopathie interstitielle fibrosante caractérisée par l’accumulation de tissu conjonctifs dans les poumons conduisant à une insuffisante respiratoire restrictive d’évolution fatale. En l’absence de traitement efficace, la médiane de survie à partir du diagnostique est d’environ 3 ans avec une évolution variable selon les patients. L’hypothèse physiopathologique actuelle suggère une dérégulation du dialogue entre les cellules épithéliales alvéolaires et les fibroblastes sous-jacent. Cette dérégulation jouerait un rôle essentiel dans le processus de développement de la fibrose en conduisant à une cicatrisation aberrante de l'épithélium alvéolaire suite à des micro-lésions alvéolaires répétées, et un dépôt excessif de collagène. L’activité physique a des effets bénéfiques sur la santé tant sur le plan préventif que curatif. En effet la pratique d’une activité physique améliore la condition physique et agit sur la santé et le maintien de l’autonomie. En outre il est maintenant admis que l’activité physique joue un rôle primordiale dans la prévention de pathologies tels que certains cancer, maladie cardio-vasculaire, maladies osteo-articulaires et dégénératives, etc.. Notre hypothèse est que l’entrainement aérobie pourrait prévenir la mise en place et l’évolution de la fibrose pulmonaire.
Bénéfices attendus
L’activité physique semble améliorer la condition physique et la qualité de vie des patients porteurs de pneumopathies interstitielles diffuses (PID). Notre hypothèse est que l’entrainement aérobie aurait un effet protecteur sur la survenue de la fibrose pulmonaire en modifiant le métabolisme, en limitant l’inflammation et en diminuant les marqueurs pro-fibrosant. Notre projet, conduit en parallèle d’une étude clinique, à pour objet de valider ces théories sur un modèle murin de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine et ainsi permettre d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes sous jacent. Ce projet permettra de montrer par quels mécanismes l’activité physique contribue à la prévention (ou limite) le développement de la fibrose pulmonaire. In fine la combinaisons des études clinique et in vivo chez l’animal permettront de mieux comprendre les effets de l’activité physique sur cette pathologie et de pouvoir tenir un discours de santé publique et de promotion de l'activité physique dans le cadre de la prévention des pathologies respiratoires fibrosante.
Procédures
La réalisation de ce projet nécessite la réalisation d'un entrainement sur tapis roulant (1h/jour, 5jours par semaine pendant 4 semaines) et l'induction d'une fibrose pulmonaire (21jours). Pour cela, après les 4 semaines d'entrainement, l’induction de la fibrose pulmonaire sera assurée par l’administration d’un agent pro-fibrosant sous anesthésie générale (durée 10 min). Au sein de chaque groupe la ventilation (inspiration/expiration) sera évaluée sur des souris vigiles (durée 1h). Suite à cela la capacité du poumon à se rétracter et à se distendre sera réalisée après anesthésie (durée 10 min). Enfin les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
L’administration de bléomycine par la trachée n'entraîne aucune lésion ni douleur particulière au réveil de l'animal. Le développement d'une fibrose pulmonaire est également indolore du fait de l'absence d'innervation sensitive à la douleur dans le tissu fonctionnel pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30 pour cent. Lors de l’anesthésie gazeuse, les niveaux d’anesthésie seront ajustés en temps réels en fonction des réactions de l’animal afin d’éviter les risques anesthésiques. Pour inciter les souris à courir, le tapis est doté d’un système utilisant un stimulus aversif. L’entrainement est stoppé dés lors que la souris refuse de courir. Lentrainement et l'évaluation de la ventilation peuvent occasionner un stress.
Devenir
A la fin de la période de maintien ou en cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d'organes, du sang et du liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Remplacement
La réalisation de ce projet nécessite l'induction d'une fibrose pulmonaire in vivo. De fait, il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale in vivo à ce jour. D'autre part, l'étude des mécanismes induit par l’activité physique sur la fibrose pulmonaire peut-être plus facilement entreprise chez la souris du fait de l'existence d'outils permettant une approche mécanistique plus poussée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Le nombre total d'animaux impliqué est de 400. Le modèle murin de fibrose pulmonaire utilisé dans ce projet est à l’heure actuelle le mieux décrit dans la littérature et le plus utilisé. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes donc basé sur la littérature existante ainsi que sur nos résultats précédent afin de prendre en compte les effet du traitement pro-fibrosant et la potentielle variabilité des variables physiologiques entre les différents individus. Ainsi La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront réalisés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront maintenues par groupes sociaux de 4 individus dans des conditions réglementaires d'hébergement. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d'abri en cellulose. Concernant l'instillation intra-trachéale de bléomycine, celle-ci sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'à leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale de Bléomycine et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé aux animaux afin de faciliter l’alimentation et leurs récupérations dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédent l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiées via l’observation des signes suivants: relâchement musculaire, perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, perte du réflexe palpébral et respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance que pourrait ressentir les animaux. En cas d'atteinte des points limites, les animaux seront euthanaisés.
Choix des espèces
Ce projet nécessite de réaliser un entrainement aérobie, d'induire une fibrose pulmonaire, de réaliser des explorations fonctionelles respiratoires et de prélever des tissus. Il n'existe donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques dans notre contexte. Notre choix c'est porté sur la souris car le modéle murin de fibrose pulmonaire induite par instilation intratrachéale de bléomycine est un modèle validé dans la littérature et courament utilisé. Il est parfaitement décrit et il a permis la description de multiples phénomènes moléculaires et cellulaires impliqués dans la fibrogénèse pulmonaire et a été utilisé pour tester de nombreuses stratégies thérapeutiques. Pour réaliser nottre projet, nous avons besoin que le système respiratoire soit mature et fonctionnel. D'autre part, les souris jeunes sont peu sensibles à la bléomycine comparées aux souris âgées et il est bien décrit dans la littérature que les souris C56Bl/6J âgées développent une fibrose pulmonaire sévère avec un risque de surmortalité important. En tenant compte de ces informations, le compromis qui a été choisi est un âge de 8 semaines.