Système respiratoire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système urogénital
Etude de la fibrose pulmonaire: évaluation par imagerie et évaluation de nouveaux traitements chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Pour mettre au point des traceurs d'imagerie de la fibrose pulmonaire et tester des traitements, 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La fibrose est induite à la bléomycine, suivie d'injections de traceurs radioactifs, de jusqu'à cinq séances d'imagerie de quarante minutes sous anesthésie, d'un gavage quotidien de J8 à J28 ou d'injections intrapéritonéales quotidiennes, puis d'une ponction dans le cœur. Pendant la phase d'inflammation, les souris peuvent perdre du poids, se déshydrater, respirer difficilement et rester prostrées, sans analgésie, le porteur indiquant que les antidouleurs interféreraient avec le développement de la fibrose. Le nombre de souris par groupe a été fixé d'après l'expérience de l'équipe, le porteur précisant qu'aucune approche statistique n'a été utilisée.
Objectifs
Ce projet porte sur l’étude de la fibrose pulmonaire qui se caractérise par une modification de la structure du tissu pulmonaire qui devient plus rigide. Elle résulte de l’accumulation excessive de protéines comme le collagène et mène à des défauts de fonctionnement des poumons. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode permettant un diagnostic précoce et le suivi de la progression de la maladie. Peu de traitements sont disponibles car les mécanismes menant à la fibrose sont peu connus. Ces traitements permettent uniquement de ralentir la progression de la maladie mais ne permettent pas de la stopper. De plus, il n’existe, à l’heure actuelle, aucun moyen de suivre l’efficacité de ces thérapies chez les patients. Ce projet est donc construit avec un triple objectif: 1/ Mettre en place de nouveaux traceurs d’imagerie pour le diagnostic précoce et le suivi de la progression non-invasif de la fibrose pulmonaire, 2/ évaluer l’action de ces traceurs pour le suivi de l’efficacité de traitements anti-fibrose et enfin 3/ évaluer les effets de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
La découverte de biomarqueurs pour la FPI en est encore à ses débuts et il n'existe pas de consensus dans ce domaine, en particulier pour l'imagerie moléculaire. L'imagerie actuelle de la FPI repose uniquement sur le scanner haute résolution et n'a que peu d'impact sur le diagnostic précoce et la survie. En outre, l'efficacité des thérapies actuellement approuvées pour la FPI dans l'ensemble de la population atteinte de FPI reste incertaine et les outils permettant de contrôler l'efficacité des thérapies font cruellement défaut. Ce projet permettra donc de développer et d’évaluer des traceurs d’imagerie qui pourraient être des biomarqueurs d'imagerie pour la FPI. Un nombre important de patients atteints de FPI doivent subir une biopsie pulmonaire pour obtenir un diagnostic définitif. Cependant, l'hétérogénéité spatiale des lésions fibrotiques dans le poumon de la FPI rend difficile l'échantillonnage précis de la zone pulmonaire malade afin d'obtenir une décision de diagnostic fiable. Le développement de sondes radiomarquées spécifiques des zones pulmonaires affectées par la FPI, telles que les sondes développées dans notre projet, pourrait aider les cliniciens à prendre des décisions thérapeutiques. En outre, ce projet fournira des outils innovants pour la détection de voies biologiques spécifiques impliquées dans la fibrose pulmonaire. Dans ce contexte, les sondes développées dans le cadre de ce projet constitueront une première étape dans le développement de thérapies personnalisées pour les patients atteints de FPI, ce qui n'est pas le cas actuellement, en identifiant les répondeurs potentiels ou les non-répondeurs aux thérapies évaluées dans ce projet. Notre projet ambitieux favorisera donc le développement de thérapies ciblées qui sont inexistantes pour le traitement de la FPI.
Procédures
Intervention subies par les animaux : - Injection de traceur radioactifs par voie IV sous anesthésie (100µl, 2 minutes, 1 à 4 injection par animal) - Prélèvement sanguins sous anesthésie (2 minutes, 4 par animal, n=30 (procédure 1 seulement)) - Imagerie in vivo sous anesthésie (40 minutes maximum, 1 à 5 imagerie par animal) - Traitement par gavage sur souris vigile (procédure 3 uniquement, 200µl, gavage quotidien de J8 à J28, 1 minute) - Traitement par injection IP sur souris vigile (procédure 4 uniquement, 100µl, quotidien de J8 à J28, 1 minute) - Prélèvement de sang terminal sans réveil par ponction intracardiaque sans thoracotomie sur animal anesthésié (1 minutes).
Impact sur les animaux
Durant la phase d’inflammation de J0 à J7 les animaux peuvent subir une perte de poids importante et présenter des signes cliniques caractéristiques tels que la déshydratation, l’augmentation de la fréquence respiratoire (associé à une difficulté respiratoire) et un comportement de prostration et d’isolement. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures.
Devenir
A l’issue de chaque procédure la totalité des animaux seront mis à mort afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéine) et les comparer avec nos techniques d’imagerie in vivo.
Remplacement
L’étude de la fibrose pulmonaire ainsi que l’effet d’un traitement sur celles-ci ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement complexe et pluricellulaire présent physiologiquement, ni la fonction pulmonaire (rigidité, stress mécanique dû à la respiration…) dans son ensemble. Néanmoins, les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, les traceurs/composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum. De plus l’imagerie in vivo permet d’évaluer les traceurs/composés à plusieurs stades de fibrose sur les mêmes animaux limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminée suivant notre experience de ce type de manipulation et aucune approche statistique n'a été utilisée. De plus, le nombre d’animaux utilisé pourra être revu à la baisse pour certaines procédures en fonction des résultats obtenus lors des procédures précédentes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages, en groupe (10 maximum par cage), suivant un cycle jour/nuit inversé avec accès illimité à l’eau et la nourriture. Les litières des cages seront supplémentées par un enrichissement de type « SIZZLE PAD ». Les gestes de ce projet (injection, imagerie, mise à mort) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les animaux recevant de la bléomycine seront observés une fois par jour pendant la phase aigüe d’inflammation (de J0 à J7) puis trois fois par semaine de J8 à J28 pendant la phase de progression de la fibrose. Le développement de la fibrose reposant sur l'induction d'une phase d'inflammation, il n'est pas possible d'utiliser des analgésiques qui pourraient interfèrer avec le bon développement de la fibrose. En dehors des effets induits par le modèle, aucun effet indésirable n’est attendu mais des points limites adaptés ont été définis. Toute observation d’un signe de souffrance excédent les points limites sera suivie de l’arrêt immédiat du protocole et de la mise à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles de choix pour l’étude de la fibrose pulmonaire. La souris est l’espèce la plus utilisée et la plus connue notamment pour le modèle à la bléomycine, permettant ainsi une extrapolation à l’homme et une comparaison à de résultats antérieurs. Les souris débuteront les études à un âge de 8 semaines, déterminé en fonction de résultats déjà publiés. Cet âge correspondant à un stade de développement adulte de l’animal.
Identification d’une nouvelle piste thérapeutique dans l’atteinte pulmonaire de la sclérodermie systémique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Abordées chirurgicalement sous anesthésie générale pour recevoir de la bléomycine directement dans la trachée, 228 souris vont être utilisées, 20 tuées avant tout réveil et 208 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à J14 pour analyse des poumons, après cinq séances d'imagerie par tomographie de trente minutes. La fibrose ainsi provoquée sert à tester si une protéine, CD146, peut devenir une cible thérapeutique dans la sclérodermie systémique. Le porteur décrit une douleur et une perte de poids possibles après la chirurgie, et annonce vouloir mettre au point une instillation non chirurgicale pour "limiter la morbimortalité des souris", reconnaissant ainsi que la technique employée aujourd'hui en tue une partie.
Objectifs
La sclérodermie systémique (ScS) est une pathologie auto-immune caractérisée par une mauvaise fonction des petits vaisseaux sanguins responsables d’une inflammation cutanée et fréquemment pulmonaire. L’atteinte pulmonaire, appelée fibrose, est responsable d'une toux et essoufflement handicapant des patients pouvant aboutir au décès. Cette atteinte représente la principale cause de décès et son mécanisme reste mal connu. CD146 une protéine impliquée dans la formation des vaisseaux été récemment identifiée comme une nouvelle piste thérapeutique dans la ScS. Nous avons montré dans l’atteinte cutanée chez l’humain et dans un modèle de sclérodermie cutanée induite par la bléomycine (agent profibrosant), que CD146 était impliqué. Ces résultats nous conduisent aujourd’hui à poser l’hypothèse du rôle de CD146 dans la fibrose pulmonaire sclérodermique et d’en étudier le mécanisme. Pour cela nous comparerons le développement d’une fibrose pulmonaire induite par la bléomycine entre des souris saines et des souris pour lesquelles le gêne CD146 a été inactivé. Nous étudierons les mécanismes impliqués et évaluerons l’efficacité d’un traitement par CD146 afin de prévenir ou diminuer la fibrose pulmonaire. Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la fibrose pulmonaire de la ScS et de proposer CD146 comme nouvelle piste thérapeutique pour le traitement des patients.
Bénéfices attendus
L‘évaluation du rôle de la protéine CD146, une protéine impliquée dans la formation des vaisseaux, dans notre modèle murin de fibrose pulmonaire permettra d’approfondir les connaissances dans le domaine de la fibrose pulmonaire de la sclérodermie systémique. La mise en évidence d’une telle voie physiopathologique et d’un tel marqueur permettra d’obtenir un outil d’évaluation et pronostic simple pour les patients atteints de sclérodermie avec fibrose pulmonaire mais surtout de développer des thérapeutiques ciblées sur CD146 dans cette population à haut risque de mortalité.
Procédures
Les animaux seront soumis à une instillation intratrachéale, qui dure 10 minutes, de bléomycine (un agent profibrosant) ou sérum physiologique sous anesthésie générale par voie chirurgicale. Nous tenterons également de mettre au point un modèle par instillation par voie non chirurgicale afin de limiter la morbimortalité des souris. Les animaux auront une imagerie, qui dure 30 minutes,par tomographie par emission de positons à J-1 , J0, J3, J7 et J14 sous anesthésie générale. A J14, les animaux seront euthanasiés après anesthésie générale pour analyse des poumons
Impact sur les animaux
Du fait de l’instillation intratrachéale d'un agent profibrosant, une douleur et une perte de poids pourront suivre la chirurgie. Une surveillance particulière sera réalisée. Le protocole sera arrêté si l'animal présente des difficultés à respirer, s'il est prostré ou si la perte de poids de l'animal est supérieure ou égale à 20%. Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir. Au moyen de cette grille, nous déterminerons un score régulièrement (3 fois/semaine). Ainsi, selon le score obtenu, l'analgésie peut- etre effectuée (score 4 à 9). Si le score est élevé (10 à 20) : l’arrêt de l’expérimentation par mise à mort de l’animal sera immédiate.Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour analyse histologique des tissus.
Remplacement
Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux. Malgré les stratégies de remplacement mises en place dans le projet, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique. Par ailleurs, les animaux génétiquement modifiés (souris transgéniques et knockouts) représentent un atout majeur pour l’obtention de résultats les plus pertinents relatifs à la compréhension des maladies humaines. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à l’étude intégrée des phénomènes physio-pathologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d’animaux en fonction des données disponibles dans littérature. L’objectif sera d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence une différence entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre tout en réduisant le nombre d’animaux au minimum nécessaire. Un dernier lot d’animaux sera nécessaire afin d’optimiser la procédure et limiter la souffrance. Le protocole initial et tel qu’il est décrit dans la littérature consiste en une instillation intra-trachéale par voie chirurgicale. Au cours de l’étude nous nous efforcerons de mettre en place une technique non chirurgicale par intubation en passant par les voies naturelles. Cela limitera la mortalité mais aussi la morbidité liée à la douleur tout en garantissant une technique d’induction aussi efficace. Afin de limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal, tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, des stratégies ont été mises en place. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale les données obtenues sur chaque animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Des stratégies d’optimisation sont mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse.
Raffinement
L'induction trachéale s'effectue sous anesthésie des souris à la kétamine/xylazine par voie intra-péritonéale, avec injection de buprénorphine 30 minutes avant l'incision et d'une anesthésie locale de la souris par injection sous-cutanée de lidocaïne 5%. Du fait de l’instillation intratrachéale de bléomycine, une douleur et une perte de poids pourront suivre la chirurgie. Une surveillance particulière quotidienne sera réalisée. Le protocole sera arrêté si l'animal présente des difficultés à respirer, s'il est prostré ou si la perte de poids de l'animal est supérieure ou égale à 20%. Au moyen de la grille d'évaluation de la douleur, nous déterminerons un score régulièrement (3 fois/semaine). Grille d'évaluation de la douleur permettant de reconnaître la douleur, de la quantifier et d’agir. Ainsi, selon le score obtenu, l'analgésie peut- etre effectuée (score 4 à 9) par administration de buprénorphine .Nous nous efforcerons de mettre au point une technique non invasive par instillation à travers une sonde d’intubation oro-trachéale. Ainsi aucune douleur et gêne ne pourra être attribuée à l’induction, limitant ainsi la douleur et les décès pour la procédure.
Choix des espèces
Les souris utilisées seront des souris mâles et femelles C57bl/6. Nous utiliserons ces souris car c’est l’espèce de souris la plus utilisée dans la littérature pour le modèle murin de fibrose pulmonaire induit par bléomycine. En effet les thérapeutiques disponibles actuellement ont été évaluées sur un modèle murin de fibrose pulmonaire. L’utilisation de cette espèce nous garantit donc des résultats analysables et extrapolables aux données déjà disponibles dans la littérature. Les souris seront à un stade adulte, elles auront ainsi entre 8 et 12 semaines lors de l’induction, cet âge est celui utilisé dans la littérature pour l’induction de fibrose pulmonaire.
Etude des cancers pulmonaires bronchiolaires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Respiration saccadée, perte de poids de plus de 20 %, prostration de plus de vingt-quatre heures, plaie de plus d'un centimètre carré : ces seuils déclenchent la mise à mort. 1 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent une biopsie d'oreille et cinq injections intrapéritonéales, une par jour pendant cinq jours, certaines dix injections hebdomadaires, d'autres jusqu'à six injections sous-cutanées et trois instillations dans la trachée, et vont développer une inflammation, une fibrose ou un cancer du poumon. Ces atteintes sont provoquées pour comprendre comment les cellules souches pulmonaires régénèrent le tissu, une question de recherche fondamentale dont le porteur attend qu'elle éclaire un jour la fibrose et le cancer humains.
Objectifs
Les cellules souches pulmonaires situées au niveau de la bronchiole pulmonaire jouent un rôle essentiel dans le maintien tissulaire assurant la fonction de l'organe. Ces cellules ont la capacité de se différencier en différents types cellulaires contribuant à la restauration de la fonction pulmonaire suite à une blessure. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre la régénération pulmonaire en utilisant des modèles murins.
Bénéfices attendus
La compréhension approfondie du rôle des cellules souches pulmonaires est cruciale dans la compréhension et la gestion des pathologies pulmonaires. Ces cellules jouent un rôle central dans la réparation et la régénération des tissus endommagés. Comprendre comment ces cellules sont régulées est important pour mieux comprendre les troubles pulmonaires tels que la fibrose ou le cancer et offrir de nouvelles avancées dans le domaine de la médecine pulmonaire.
Procédures
Ce projet est basé sur un total de 1660 souris qui subiront toutes une biopsie d'oreille (1x 30 secondes) et seront toutes injectées 5x en injection intrapéritonéale (1 x par jour pendant 5 jours). Durée de l’intervention : 1minute par souris par jour. Les 1660 souris recevront une injection intrapéritonéale 1x, durée de l’intervention : 1min, en fin d'expérience. Parmi ces 1660 souris: - 420 recevront une injection intrapéritonéale 1x. Durée de l’intervention : 1 min ; - 210 recevront une injection intrapéritonéale 10x, (1x par semaine pendant 10 semaines). Durée de l’intervention 1 min; - 420 recevront deux injection en sous-cutanée 1x (durée de l’intervention 1 min), une injection intrapéritonéale 1x (durée de l’intervention 1 min) et une instillation intratrachéale 1x, durée de l’intervention 5 min ; -420 souris recevront 6 injections en sous-cutanée 1x tous les 3 jours (durée de l’intervention 1 min), 3 injections intrapéritonéales 1x tous les 3 jours (durée de l’intervention 1 min) et de 3 instillations intratrachéales 1x tous les 3 jours, durée de l’intervention 5 min
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer une inflammation, une fibrose ou un cancer avec les nuisances associées à ces pathologies qui sont une difficulté respiratoire (respiration lente, saccadée ou très rapide) et une perte de poids. Les injections peuvent entrainer des plaies au niveau des sites d’injection.
Devenir
Cette étude vise à comprendre les mécanismes de régénération pulmonaire pour mieux appréhender les pathologies pulmonaires humaines que sont la fibrose et le cancer. Afin de valider nos hypothèses, nous devons collecter le matériel biologique, c'est à dire le poumon. Le poumon étant un organe vital, nous devons mettre à mort les animaux en fonction des cinétiques de chaque procédure.
Remplacement
Les cultures primaires de cellules bronchiolaires humaines en organoïdes et culture ALI sont en cours de mise au point au laboratoire. Ces cultures seront utilisées dès que possible et remplaceront à terme les expériences sur la souris. Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et ne recapitulent pas pour l'instant l’hétérogénéité cellulaire de l’épithélium pulmonaire, c’est pourquoi, nous avons besoin de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum selon la méthode statistique prédictive en tenant compte des differents parametres. En fonction des résultats obtenus dans chaque procédure, tous les points de cinétiques ne seront pas réalisés et toutes les procédures ne seront pas effectuées.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier et par les personnes en charge de l’expérimentation à l’aide d’une fiche d’observation. Les animaux seront pesés 2x par semaine tout au long des expériences. Les mesures correctrices ont été définies comme suit : - Dos vouté : Addition d’enrichissement et de nourriture gélifiée. Si pas d’amélioration 48h après, mise à mort de l’animal. - plaie 10% par rapport à la pesée précédente : Addition d’enrichissement et de nourriture gélifiée. Pesée quotidienne. Si perte de poids >10% du poids de la veille, mise à mort de l'animal - Prostration/inactivité : Visite 2x/jour. Addition d’enrichissement et de nourriture gélifiée. Si pas d’amélioration 24h après, mise à mort de l’animal. - agressivité : Séparation de l'animal agressif - tremblement : Visite 2x/jour si pas d’amélioration 48h après addition d’enrichissement et de nourriture gélifiée, mise à mort de l’animal Les points limites entrainant la mise à mort de l’animal ont été définis comme suit : -Plaie >1cm2 - Respiration rapide - Respiration lente - Halètement (à confirmer 20 minutes plus tard) : La respiration est forte et saccadée. - plaie au niveau des sites d’injection. - perte de poids>20% du poids de référence (jour 1 de l’expérience). Prostration > 24h, Dos vouté>48h, tremblement>48h. Perte de poids continue >10% (du poids précèdent) puis >10% (du poids de la veille) malgré mesures correctrices mises en œuvre.
Choix des espèces
Les modèles murins utilisés dans ces procédures sont les modèles de référence pour l'étude de la régénération pulmonaire et nous permettrons de comparer nos résultats avec ceux de la communauté scientifique. Les animaux seront âgés d’au moins 8 semaines (adultes) pour ne pas interférer avec le développement pulmonaire embryonnaire qui continue jusqu’à trente jours après la naissance.
Etude chez la souris de l’action protectrice d’un probiotique instillé en prophylaxie et en curatif sur les infections pulmonaires à Pseudomonas aeruginosa.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Anesthésiées deux à trois fois pour recevoir dans la narine un probiotique puis une suspension de Pseudomonas aeruginosa, 845 souris développent une infection pulmonaire aiguë. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec pertes de poids, chute de température et immobilité progressive sur sept jours au maximum. Le porteur qualifie de faible l'intensité de chaque geste pris isolément, préhension, anesthésie, injection d'analgésique, tout en reconnaissant que l'évolution de l'infection va jusqu'à une intensité sévère. Toutes les souris infectées sont tuées, précisément parce qu'elles ont subi cette infection pulmonaire aiguë.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive et chez les patients en réanimation. Cette bactérie devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi, il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, exercent des effets positifs sur la santé. Nous avons pu valider une preuve de concept, suite aux résultats prometteurs d’une bactérie à potentiel probiotique actuellement en développement au laboratoire, et ayant une action protectrice vis-à-vis de l’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa. L'objectif du projet est de tester l'efficacité du probiotique à des souris ayant une infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentielles bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines étant à l’origine d’infections pulmonaires notamment dans la mucoviscidose ou la bronchopneumopathie chronique obstructive.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés deux à trois fois et recevront durant 1 minute du sérum physiologique ou un probiotique dans la narine puis la seconde fois une suspension bactérienne sur une durée de 1 minute. Si une troisième instillation est prévue, les souris recevront du sérum physiologique ou un probiotique durant 1 minute dans la narine.
Impact sur les animaux
Selon les procédures, les suivis quotidiens pourront durer de 3 à 7 jours. Ce projet peut induire un stress chez les animaux notamment lors de la préhension de l’animal, pour les suivis, les pesées et la prise de température (2 à 3 fois par jour maximum) : intensité faible, durée environ 1 min. Les animaux auront au maximum 3 anesthésies : Intensité faible, durée environ 2 min. Des pertes de poids et de température, une mobilité réduite voire, une inactivité après le début de l’infection pulmonaire peuvent être observées, elles sont d’intensité progressive avec l’évolution de l’infection pouvant aller jusqu’à une intensité sévère sur une durée de 7 jours maximum. Les analgésies par injection des animaux sont d’intensité faible et d’une durée d’environ 30 secondes.
Devenir
A l'issu du projet tous les animaux ayant été infectés, seront mis à mort. Et certains auront des prélèvements de tissus. Tous les animaux doivent être mis à mort, car ils ont subi une infection pulmonaire aigue.
Remplacement
Nous souhaitons observer dans cette demande un pourcentage de survie d’animaux à une infection pulmonaire causée par Pseudomonas aeruginosa mais également observer les effets aux niveaux tissulaires (poumons et autres) de l’instillation du probiotique sur l’infection à Pseudomonas aeruginosa. Les modèles cellulaires et/ou autres modèles in vitro ne permettent pas à ce jour de conclure sur la survie d’un animal ou des dommages tissulaires à une infection pulmonaire. Pour cette raison, nous faisons le choix de conserver le modèle animal. De plus, nous souhaitons étudier la sécurité du potentiel probiotique ce qui doit impérativement se faire sur un modèle animal.
Réduction
Lors des études de survies, l’analyse de la survie sera réalisée par des tests statistiques, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 10 souris. Afin de réduire le nombre d’animaux, le nombre de souris dans notre groupe recevant uniquement notre probiotique est réduit au minimum car nous n’attendons aucune mortalité. Lors des procédures d’études de l’inhibition de Pseudomonas aeruginosa au niveau pulmonaire, le nombre de souris nécessaire afin de garantir une puissance statistique est de 6 souris minimum dans chaque groupe. Pour nos procédures de test du probiotique de manière curative 10 souris minimum sont nécessaires dans chaque groupe. Par ailleurs, dans nos procédures, nous nous limitons à une seule souche clinique de notre probiotique alors que plusieurs espèces sont décrites.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table se suivi de soin. De plus, un gel appétent contenant de l'analgésiant est déposé dans les cages 24h/24. Ce gel permet une analgésie continue pour les animaux tout au long de la journée. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement (2 à 3 fois par jour) à l’aide d’une table de suivi de soins mise en place afin de réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies, car leur sensibilité à Pseudomonas aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante à 24h. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Profilage toxicologique de mélanges chimiques complexes associés aux particules de carbone suie: application aux hydrocarbures aromatiques polycycliques
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Injectés trois jours de suite dans l'abdomen avec des hydrocarbures aromatiques polycycliques associés aux particules de suie, 112 rats passent ensuite par dix échocardiographies de vingt minutes, une IRM de trente à quarante-cinq minutes et un cathétérisme cardiaque terminal. 72 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 40 d'un niveau léger, et tous sont tués pour prélever poumons, aorte et cœur. Le porteur attend une atteinte cardiaque dès l'injection, avec accumulation de tissu non contractile et baisse de la contractilité, et suit les animaux jusqu'à 180 jours. Sa grille déclenche la mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids ou d'un score cumulé supérieur à 4, qui additionne poil ébouriffé, posture anormale, immobilité et automutilation.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer une stratégie intégrée visant à identifier et étudier le potentiel bioactif de mélanges complexes de polluants environnementaux émis lors de procédés de combustion et susceptibles d’induire des effets respiratoires et cardiovasculaires. Ce projet se focalisera sur une famille de polluants environnementaux ubiquistes, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et leurs dérivés oxygénés (oxy-HAP) associés aux particules de carbone suie.
Bénéfices attendus
L’ensemble de cette étude in vivo permettra de mettre en évidence la prédictivité du biotest et d’apporter de nouvelles connaissances sur les effets chroniques d’expositions à faibles doses de mélanges de HAP.
Procédures
Les animaux subiront des injections IP lors des injection qui durée 10 secondes (avec la contention de l'animal vigile ) pendant 3 jours consecutif puis une échocgraphie cardique d'une durée de 10* 20 minutes, une irm d'une durée de 30-45 minutes et la fonction cardiaque sera également évaluée par cathétérisme cardiaque en phase terminal d'une durée de 20-30 minutes avec prlévement d'organe a la fin de la procédures .
Impact sur les animaux
Nous supposont une atteinte cardique sur l'animal du a la toxicité intrinseque de la molécule injecter des que l'animal a recut la molécule . L'atteinte cardiaque correspond à une accumulation de tissue non-contractile et une dysfunctionnement des mitochondries. Ces deux effets induiront (probablement) une diminution de la relaxation cardiaques. L'atteinte entraine une diminution de la contractibilité cardiaque .
Devenir
Le projet nécessite des prélévements d'organes vitaux pour chaque procédure.
Remplacement
Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous vérifions dans ce projet l’intérêt de mesurer la bioaccessibilité in vitro, pour estimer une biodisponibilité par inhalation in vivo. Le volet in vivo faisant l’objet de cette saisine permettra de fournir des indications sur la prédictivité de méthodes in vitro.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons un criblage cellulaire à l’aide de cultures pour choisir le mélange de molécules à tester (fraction bioaccessible) ce qui limite considérablement le nombre d’animaux à utiliser. Nous limitons les prélèvements tissulaires qui ne se feront qu’à un seul temps avec un suivi de la fonction cardiaque de façon non invasive pour nous guider dans la date de mise à mort, avec une durée maximale de suivi de 180 jours. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=12 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie. L’analyse répétée en échocardiographie / IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Nous utiliserons un nombre limité d’animaux afin de mettre au point tous les marqueurs biologiques envisagés. Les organes d’intérêt sont les poumons, l’aorte et le cœur mais d’autres organes seront prélevés pour constituer une banque de tissus pouvant être analysés ultérieurement (foie ; intestins ; reins).. Les tests statistiques utilisés seront: Pour la fonction cardiaque par échographie . Pour l'hémodynamique invasive, Test paramétrique.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 animaux par cages avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation de deux semaines après réception des rats sera maintenue avant tout début de protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation du bien-être animal se décompose en : A) changement du poids corporel 0. Normal 1. Perte de poids
Choix des espèces
Le rat Wistar adulte est par excellence l’espèce utilisée dans la plupart des études toxicologiques dont il existe au sein du consortium des données historiques. Rats Wistar adultes de 225-250 g âgés d’environ 50 jours en début de protocole. L'évaluation toxicologique des molécules à tester sera effectuée sur des rats adultes s'assurant ainsi d'une maturité des systèmes de défense mis en jeu.
Elevage de lignées murines transgéniques avec génotypage par méthodes invasives
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Nées de lignées transgéniques entretenues pour alimenter d'autres projets, 50 764 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées de souffrance légère. Entre le septième et le douzième jour de vie, chacune est tatouée aux phalanges ou aux coussinets et subit l'ablation de l'extrémité de la queue pour le génotypage, les deux gestes enchaînés sous contention et sans anesthésie. Le porteur présente le tatouage comme un moyen "de ne pas mutiler les animaux" et retient la biopsie caudale notamment parce qu'elle évite l'anesthésie. 40 000 de ces souris passeront dans d'autres autorisations de projet, les autres sont tuées selon leur génotype, dès le sevrage si aucune utilisation n'est possible, plus tard si elles servent à l'élevage et deviennent trop âgées ou "mauvais reproducteurs".
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Ces animaux sont identifiés par marquage et caractérisés à l’aide d'une biopsie (prélèvement de tissus). Cette demande d'autorisation de projet pour l'identification des animaux et le prélèvement de tissus se justifie par la nécessité de sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes de projet) ; sélectionner les animaux d'entretien des élevages ; sélectionner les animaux pour : • le maintien des compétences, • les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo.
Bénéfices attendus
La biopsie est une étape nécessaire pour déterminer quels sont les animaux dont le profil ADN est pertinent pour mener à bien les expérimentations, dans le but de trouver des thérapies innovantes qui puissent être transposées en recherche clinique. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux de cette DAP seront soumis à deux gestes techniques invasifs qui sont réalisés ensembles: 1/ l'identification par tatouage digital: 1 fois, durée de quelques secondes 2/ biopsie de queue: 1 fois, durée de quelques secondes
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress.
Devenir
A l'issue de cette unique procédure, le devenir des animaux est différent selon leur génotype: a/- ils sont prévus pour expérimentation, formation ou maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP): utilisation continue b/- ils sont sélectionnés pour entretien des colonies, puis mis à mort lorsque trop âgés ou mauvais reproducteurs c/- ils sont utilisés ex vivo, donc mis à mort avant utilisation d/- ils sont mis à mort dès sevrage si aucune utilisation possible au vu de leur génotype e/- ils sont mis à mort à tout moment si atteinte d'un point limite.
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’EU établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’EU. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté à jour de ses formations et qui ont un bon regard sur les points limites découlants de ces gestes. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté en respectant les conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Ces cages sont enrichies avec des palets de Woodwool qui permettent au souris de nidifier et de se cacher. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
Au sein de notre EU les équipes de recherche utilisent le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Les animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 de manière à cibler l'orientation des animaux avant sevrage.
Etude des effets biologiques d’un faisceau d’électrons à haute énergie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
Les souris dont le poids passe sous un seuil de référence, qui présentent des difficultés respiratoires ou une fibrose avancée au scanner sont mises à mort. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Une partie reçoit une irradiation du thorax à 13 ou 15 grays, qui provoque une inflammation pulmonaire pendant un à trois mois puis, en cas de forte toxicité, une fibrose des poumons à quatre ou cinq mois. Les autres reçoivent des cellules tumorales sous la peau de la patte, avec des risques de dermite, d'ulcération et de nécrose cutanée, pour comparer un nouveau faisceau d'électrons de haute énergie à un faisceau témoin en vue de son intégration dans de futures machines de radiothérapie.
Objectifs
La radiothérapie induit des effets secondaires qui affectent la qualité de vie des patients atteints de cancers. Pour améliorer les traitements de la radiothérapie et limiter ses effets secondaires, nous explorons de nouvelles méthodes d’irradiation comme la radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. Afin de pouvoir explorer son potentiel clinique, nous caractériserons dans ce projet les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie en étudiant d’une part, les toxicités qu’elle pourrait induire, et d’autre part, son pouvoir à éliminer les cellules tumorales.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons déterminé le potentiel clinique d’une nouvelle méthode de radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. En cas de résultats positifs, cette nouvelle méthode pourrait être intégrée, aux futures machines de radiothérapie et permettre une amélioration des traitements par radiothérapie (i.e. moins d’effets secondaires) pour les patients atteints de cancer.
Procédures
Dans une première procédure, 3 lots d’animaux seront irradiés avec une nouvelle méthode de radiothérapie et ils seront ensuite suivis par scanner pour petit animal. Ils seront anesthésies pendant 5 à 10 minutes pendant l’irradiation et environ 5 minutes pour chaque scanner mensuel. Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée aux animaux vigiles constituant 3 lots d’animaux : - 1 premier lot ne subira aucun autre geste technique - 1 second lot sera anesthésié en vue d’être irradié avec le faisceau contrôle sur les tumeurs implantées en sous cutanées. La durée de l’anesthésie sera de 2 minutes par animal - 1 troisième lot sera irradié avec le faisceau d’intérêt sur les tumeurs implantées en sous cutanées. L’anesthésie durera entre 5 et 10 minutes.
Impact sur les animaux
Pour l’étude de la toxicité sur tissu sain, les animaux, ayant reçu une irradiation thoracique, développeront une phase d’inflammation pulmonaire(1 à 3 mois post-irradiation) qui évoluera après 4 ou 5 mois vers une fibrose pulmonaire en cas de forte toxicité radio-induite (dose de 13 et 15 Gy). Suite au développement de la fibrose, une perte de poids des animaux pourra être observée. Pour l’analyse de l’efficacité antitumorale, les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée au niveau de la patte développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. L’injection de cellules tumorales provoquera une douleur et gêne de courte durée. Les potentielles toxicités cutanées (dermites, ulcération, nécrose) à court terme induites par le traitement seront évaluées par une grille de score adaptée
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des modèles in vitro (i.e lignée de cellules en culture) existent et sont utilisés dans le cadre d’études préliminaires des effets radiobiologiques d’un faisceau d’irradiation. Des études préliminaires ont été réalisé avec certains de ces modèles au laboratoire et nos résultats préliminaires sont encourageants (lignée de cellules tumorales/modèle ex vivo de coupes d’organe mis en culture. Cependant, ces modèles restent simples et ne permettent pas de prendre en compte la complexité du développement des toxicités induites par la radiothérapie chez le patient, ce qui nécessite le recours à l’animal
Réduction
Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études pilotes ont été réalisées sur un autre faisceau d’irradiation (faisceau contrôle) au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour évaluer les effets radiobiologiques du nouveau faisceau. De la même manière, des études pilotes utilisant des tumeurs greffées sous la peau nous ont permis d’évaluer les temps optimaux d’irradiation post-greffe ainsi que les doses de traitements adaptées 2-Dans le cadre de l’étude des effets secondaires de la radiothérapie dans le poumon, le bras contrôle avec notre faisceau se base sur des données déjà acquises par le laboratoire ce qui nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé pour avoir une puissance statistique suffisante lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications pulmonaires par imagerie scanner permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombres d’animaux utilisés pour cette étude. Les tests statistiques adaptés seront utilisés pour étudier la « survie sans complication » des animaux dans le cadre de l’étude sur le tissu sain. Pour la partie tumorale, des tests seront réalisés pour l’étude de la survie avant qu’un point de limite éthique soit atteint.
Raffinement
Pour la procédure d’évaluation des effets secondaires de la radiothérapie, plusieurs critères seront pris en compte : 1-Le poids des animaux sera suivi de manière hebdomadaire dans la période de 1 à 4 mois post-irradiation (i.e. pendant la phase de pneumopathie). Ensuite, de 5 à 7 mois post-irradiation, le poids des animaux sera suivi de manière bi-hebdomadaire (en début et fin de semaine) afin de surveiller les potentielles pertes de poids. Les animaux pour lesquels le poids sera inférieur au poids limite de référence seront mis à mort pour éviter toutes souffrances. 2-Si des difficultés respiratoires et/ou un isolement sont observés, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. 3-Le suivi scanner sera également un point majeur de notre évaluation du développement de effets secondaires. Si un animal présente des signes de fibrose avancée sur les images scanner, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. Pour la procédure d’évaluation de la réponse antitumorale sur un modèle de tumeurs sous cutanée, plusieurs critères seront pris en compte : 1-La taille de la tumeur sera un élément important et déterminant pour assurer le bien-être de l’animal. Le poids des animaux et la taille de leurs tumeurs seront évalués de manière bi-hebdomadaire. 2-De potentielles lésions cutanées peuvent survenir dans la zone d’irradiation de la tumeur. Une grille de score spécifique mise en place lors d’études pilotes et antérieures permettront d’évaluer le grade de ces lésions et limiter les douleurs chez l’animal (mise en place de traitements antalgiques ou mise à mort de l’animal si stade trop avancé) Pour les deux procédures, une anesthésie générale ainsi qu’une contention physique sur un support adaptée sera réalisée au moment de l’irradiation pour éviter tout inconfort et douleurs des animaux. Aucune douleur n’est attendue au moment de l’irradiation dans ces conditions. Les animaux seront hébergés dans des conditions standards
Choix des espèces
La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique pertinent pour la radiothérapie car les réponses moléculaires et cellulaires (e.g. fibrose radique) des tissus murins à l’irradiation sont comparables à celles observées chez l’Homme ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines à 10 semaines Les organes étudiés sont alors matures, limitant les potentiels biais expérimentaux induits par l’irradiation d’organes à des stades de maturation différents. De plus, les animaux adultes supportent également mieux l’anesthésie et l’irradiation.
Rôle et régulation de la thrombopoïèse pulmonaire lors d’une infection virale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une partie des souris est génétiquement modifiée pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2, ce qui les rend infectables par les variants humains du virus. 5 040 souris vont être utilisées, 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 240 opérées sous anesthésie sans réveil. Sept jours après inoculation, le porteur décrit chez ces souris une température corporelle tombée à 25 degrés et une perte de poids supérieure à 20 %, et prévoit par ailleurs des chirurgies pulmonaires de quatre à cinq heures, des interventions sur les os du crâne, jusqu'à cinq prélèvements de sang sous la mâchoire et des injections derrière l'œil. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, rate et moelle osseuse, ce cumul de prélèvements sur un même animal étant présenté comme une mesure de réduction.
Objectifs
Les mégacaryocytes sont des cellules qui se développent dans la moelle osseuse et qui permettent la formation de plaquettes dans le sang, nécessaire notamment à la coagulation sanguine. Récemment, nous avons démontré que cette formation de plaquettes n’est pas restreinte à la moelle osseuse mais qu’elle peut aussi avoir lieu dans les poumons. Des études récentes et nos données préliminaires suggèrent que cette formation de plaquettes dans les poumons pourrait jouer un rôle clef lors d'une infection virale pulmonaire. Chez l’homme au cours des infections à Sars-CoV-2 une augmentation très importante de ces mégacaryocytes pulmonaires a été reportée chez les patients atteints de COVID-19 en comparaison à d’autres patients atteints d’autres causes de détresse respiratoire. Nous pensons que la formation de plaquettes au niveau des poumons augmente au cours des infections pulmonaires, et cette augmentation semble liée à une aggravation de la détresse respiratoire et à une inflammation aigüe. Les mécanismes y conduisant ne sont pas connus et ce sont donc ces mécanismes que nous proposons d’identifier en utilisant des modèles d’infections pulmonaires chez la souris et des techniques de microscopie intravitale. L’identification de ces mécanismes devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques non seulement pour les infections pulmonaires comme la COVID-19 mais aussi pour d’autres pathologies inflammatoires pulmonaires comme l’asthme ou les fibroses pulmonaires où l'activation des plaquettes contribue au développement de la pathologie
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) déterminer l’implication bénéfique ou délétère de la production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales ; (ii) étudier la cinétique de production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales pulmonaires et de l’inflammation pulmonaire ; (iii) caractériser et identifier de nouveaux mécanismes de la biologie plaquettaire (production, modifications, rôles) ; (iv) identifier potentiellement des nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies pulmonaires dans lesquelles les plaquettes sont impliquées.
Procédures
Dans ce projet, - Les souris sous anesthésie générale subiront une injection de virus. L’injection ne dépasse pas 1 minute. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront entre un et cinq prélèvement sanguin. Les prélèvements ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques jours plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques heures ou minutes plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une injection de molécules puis une chirugie quelques heures ou quelques minutes plus tard. Les souris anesthésiées subiront une procédure de chirurgie sur les os du crane. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris anesthésiées subiront une injection de virus, puis quelques jours plus tard une injection de cellules, et quelques heures après ils seront mis à mort par anesthésie. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie generale subiront une injection de virus. Puis quelques jours plus tard une injection de cellules sous anesthésie generale et locale. Les injections ne dépassent pas 2 min.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous utiliserons un variant du SARS-CoV-2 adapté pour infecter les souris qui induit des pertes de poids inférieures à 10% sur toute la durée de l’infection ainsi qu’une faible baisse de la température corporelle
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront mises à mort pour des prélevements de tissus et de sang.
Remplacement
Notre projet a pour but de mieux comprendre la production de plaquettes sanguines au cours des infections virales pulmonaires. Afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire suffisamment proche de l’homme. Il est impossible de ne travailler sur des modèles in vitro strictement cellulaires car il n'est pas possible pour l'instant d'obtenir en dehors d'un organisme vivant la production de plaquettes pleinement fonctionnelles. En effet cette production est dépendante du flux sanguin et de nombreuses interactions cellulaires. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier, le plus adapté étant la souris.
Réduction
Des expériences préliminaires ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les analyses statistiques seront réalisées sur un logiciel d’analyse en combinant les résultats de n=4 expériences indépendantes avec 5 souris par lot (soit 20 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus lors de certaines étapes clés de notre projet, nous poursuivrons ou arrêterons certaines expériences. Après mise à mort de l’animal, des prélèvements seront réalisés, afin d’obtenir le plus d’informations possibles sans avoir à utiliser d’autres animaux. Nous prélèverons par exemple à la fois le sang, les poumons, la rate et la moelle osseuse, ce qui nous permettra de réaliser plusieurs tests à partir d'un seul animal.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux. Les injections sont réalisées sous anesthésie générale. Pour la chirurgie qui est une procédure sans réveil nous utilisons aussi une anesthésie générale, combinés à des anesthésiques locaux et un analgésiant. La température corporelle et l’hydratation des animaux sont maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. Un gel est appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement. Les souris infectées seront surveillées quotidiennement jusqu’à l’arrêt des procédures. La température, le poids, l’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Pour notre projet visant à explorer la biologie des plaquettes sanguines dans les infections par des virus, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques ii) de l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà présentes dans l’équipe permettant de suivre les plaquettes et les mégacaryocytes, et iii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité et de la biologie plaquettaire chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, notre projet est basé sur l’étude de la dynamique de production de plaquettes par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez la souris. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes majoritairement âgées entre 8 et 12 semaines, mais également certaines de plus de 40 semaines afin d’étudier notre modèle à différents âges chez la souris. A ces stades de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Imagerie in vivo non invasive par échographie et photoacoustique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 200
2 415 souris et 200 rats vont être utilisés, chacun pouvant subir jusqu'à 18 anesthésies, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'imagerie par échographie et photoacoustique dure jusqu'à 40 minutes par séance et peut se répéter chaque semaine pendant 18 mois, avec parfois l'injection intraveineuse d'un produit de contraste sans analgésie. Le projet est une prestation de service qui ouvre cette imagerie à d'autres équipes : 1 831 animaux non-humains seront tués pour prélèvement d'organes, 784 renvoyés au laboratoire demandeur pour y poursuivre son projet. Le porteur juge l'analgésie "non nécessaire" pour un acte qu'il qualifie de non invasif, tout en admettant que la procédure peut aggraver la faiblesse, la perte de poids ou la souffrance des animaux fragiles.
Objectifs
L'objectif de ce projet générique de service est de fournir aux scientifiques un accès à l'imagerie échographique et photoacoustique non invasive et en temps réel de tissus d'animaux vivants anesthésiés. Les principales applications comprennent : 1- Le suivi de molécules photoacoustiques ou fluorescentes dans les tissus (biodistributions) 2- L'observation superficielle (par exemple, la peau) ou en profondeur (par exemple, les organes de la cavité abdominale) pour une caractérisation anatomique (par exemple, épaisseur des parois, diamètres des cavités) 3- Une caractérisation fonctionnelle et hémodynamique des tissus (par exemple, débits vasculaires, perfusion tissulaire, contractilité myocardique) 4- Le suivi non invasif de la progression tumorale 5- La caractérisation de potentielles nouvelles molécules thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le suivi par imagerie ultrasonore à haute résolution associée à la photoacoustique est une approche non invasive qui permet d'obtenir des résultats concernant l'anatomie, la fonction, voire le profil moléculaire des organes où chaque animal est son propre contrôle. Cette méthode offre la possibilité d'orienter plus efficacement la recherche fondamentale et clinique dans des domaines tels que la cardiologie, la neurologie, l'oncologie, etc. Les données générées seront publiées, ce qui les rendra accessibles à la communauté scientifique et médicale.
Procédures
La procédure d'échographie/photoacoustique est réalisée sous anesthésie mais est non invasive. Elle permet d'analyser l'anatomie et la fonction des tissus mous des animaux (cœurs, cerveaux, foie, reins, etc.) avec ou sans pathologie et/ou traitement. Il peut être nécessaire d'injecter un produit de contraste par voie intraveineuse (pendant l'anesthésie de l'animal) pour une meilleure visualisation des tissus. La procédure d'échographie/photoacoustique se déroule sur une durée maximale de 40 minutes (temps médian de 11 minutes), incluant l'anesthésie, la mise en place et la préparation de l'animal, l'acquisition d'images et le réveil. La durée d'acquisition des images est variable en fonction de la complexité de l'organe et/ou des séquences d'images et peut varier de 5 à 30 minutes. L'imagerie proposée pour un suivi longitudinal pourra s'étaler sur une période allant d'une semaine à plusieurs mois (maximum 18 mois), avec une fréquence d'imagerie d'au moins une fois par semaine. Pour les protocoles courts (
Impact sur les animaux
La contention et les phases d'induction et de réveil lors d'une anesthésie peuvent générer du stress. Les injections intraveineuses peuvent entraîner une légère douleur car elles sont effectuées sous anesthésie mais sans analgésie. Pour cette procédure, l'administration d'analgésie est considérée comme non nécessaire, voire susceptible d'ajouter des effets indésirables pour ce type d'intervention non invasive. Cependant, dans le cas d'animaux fragiles présentant un phénotype dommageable, il n’est pas improbable que cette procédure puisse exacerber l'apparition éventuelle d'effets indésirables tels que la faiblesse, la perte de poids ou la souffrance.
Devenir
À la fin du protocole expérimental, les animaux seront soit euthanasiés et les organes cibles prélevés pour des analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, soit nous organiserons un retour sur le site du demandeur pour la poursuite du projet dans le cadre d’une utilisation continue.
Remplacement
L'imagerie ultrasonore joue un rôle essentiel dans la compréhension des grandes fonctions en recherche préclinique, en particulier dans des domaines où les méthodes substitutives ne peuvent pas fournir des informations équivalentes. Le suivi des processus physiologiques tels que le métabolisme, la perfusion tissulaire, la fonction des organes complexes ou la distribution de médicaments dans le corps offre ainsi des informations précieuses sur les grandes fonctions biologiques. Les modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire fidèlement ces fonctions complexes, dynamiques et spatiales présentes dans les systèmes biologiques.
Réduction
Nos procédures sont non invasives, ce qui nous permet de maximiser le nombre d'expériences réalisées tout en minimisant l'utilisation d'animaux. Le suivi longitudinal, où chaque animal est son propre témoin, sera effectué par imagerie non invasive de la fonction des organes afin d'explorer leur évolution dans le temps dès l'apparition des premiers signes de dysfonction. Nous limiterons donc le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Toutes les procédures sont effectuées de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux, notamment par l'utilisation d'anesthésie et d'antalgiques en cas de douleur. Les souris seront surveillées quotidiennement par notre personnel qualifié afin de détecter le moindre signe de souffrance chez l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie
Choix des espèces
L'utilisation de rongeurs tels que les souris et les rats permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives, digestives, le cancer, etc. L'utilisation de souris génétiquement modifiées reproduit des modèles de pathologie, ce qui en fait un choix privilégié dans la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Le panel d'âges sera variable car il dépendra du projet scientifique auquel nous serons confrontés. Techniquement, nous pouvons imager des animaux allant de P15 (15 jours après la naissance) à 24 mois d'âge.
Etude des effets cardiovasculaires de l’infection au Sars-Cov2 dans des modèles murins EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Infectées par le SARS-CoV-2 au moyen d'une administration intranasale sous anesthésie, 1 680 souris humanisées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées après mesure de leur pression pulmonaire. Certaines passent trois semaines en hypoxie chronique, d'autres subissent une chirurgie du cou avec injection intratrachéale. Le porteur reconnaît que l'infection peut conduire à la diarrhée, à l'affaiblissement, à la malnutrition puis à la mort, et revendique un protocole jamais mené ailleurs dans le monde. Il qualifie la mesure de pression artérielle à la queue de "procédure indolore", et liste par ailleurs l'hémorragie, la douleur post-opératoire et l'arrêt cardio-respiratoire parmi les suites possibles des chirurgies.
Objectifs
L’objectif de notre recherche est de mieux comprendre les altérations vasculaires et cardiaques liées à l'infection au SARS-Cov2. Nous allons utiliser des modèles murins (des souris transgéniques exprimant le récepteur humain du virus) afin de pouvoir suivre in vivo les effets de l'infection et de l'inflammation induite par cette infection. Notre but est d'augmenter les connaissances sur les conséquences au long cours du Covid19 pour améliorer la prise en charge des patients. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d’évaluer au long cours les altérations de la fonction cardiovasculaire à la suite d’une infection au SARS-Cov2. Nous utiliserons 2 lignées de souris afin de déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets. Les résultats serviront à mieux comprendre été prévenir les conséquences pulmonaires, vasculaires et cardiaques du Covid19
Procédures
Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudal pour génotypage (EU1). Cet acte ne dure que quelques secondes. Certaines souris seront soumises à une administration intra-nasale sous anesthésie pendant 15 minutes (EU1). Certaines souris recevront dans l’eau de boisson un anti-hypertenseur pendant 10 jours (EU1). Certaines souris seront étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie pendant 20 minutes (EU2). La pression artérielle sera aussi mesurée à la queue sur animaux vigiles (procédure indolore) après accoutumance à la contention pendant 5 jours (EU2). Certaines souris seront en plus soumises à une hypoxie chronique pendant 3 semaines avant l’étape finale (EU2). Pour les procédures chirurgicales sous anesthésie, la douleur sera évitée par l’administration d’anesthésiques et d’analgésiques (EU2). Certaines souris subiront une petite chirurgie au niveau du cou comprenant une anesthésie et une analgésie pendant 15 minutes et une injection intra-trachéale avant l’étape finale (EU2). Certaines souris recevront 1 à 5 injections intrapéritonéales (1 par jour) ou administrations intranasales sous anesthésie générale pendant 15 minutes avant l’étape finale (EU2). Pour toutes les souris, l’étape finale sera une procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie avec analgésie pendant 15 minutes avant l’euthanasie (EU2).
Impact sur les animaux
Le transport des animaux entre les 2 sites peut engendrer une anxiété temporaire. L’infection induit une maladie pulmonaire et chez certains animaux une maladie intestinale avec des conséquences qui peuvent être très sévères selon la lignée murine: les plus forts sont la perte de poids, la diarrhée, l’affaiblissement allant jusqu’à la malnutrition puis la mort. les souris seront soumises à un stress hypoxique. L'hypertension pulmonaire induite par l’hypoxie chronique est modérée chez la souris normale mais pourrait être sévère chez les souris post infection induisant un stress physique. Un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de l’acclimatation à la prise de pression systémique vigile. L’anesthésie peut induire des effets tels que l’hypothermie, des difficultés respiratoires ou dans les cas les plus critiques un arrêt cardio-respiratoire. La procédure chirurgicale peut également être source d’hémorragie ou de douleur post-opératoire. Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections.
Devenir
Les 1680 animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés en fin d’expérimentation à l’issue d’une mesure de la pression pulmonaire sous anesthésie. Les animaux sont utilisés à des fins expérimentales qui nécessitent leur euthanasie afin de pouvoir mesurer leurs paramètres hémodynamiques et étudier les tissus.
Remplacement
Pour comprendre les conséquences au niveau de la fonction et de la structure des vaisseaux pulmonaires de l’infection au SARS-Cov2, il est nécessaire d’infecter des animaux afin d’être dans les conditions les plus proches des patients et afin de conserver l’ensemble des phénomènes intervenants dans la régulation des vaisseaux pulmonaires : inflammatoires (interactions cellules immunes et cellules vasculaires), vasculaires (interactions des cellules vasculaires entre elles), respiratoires (hypoxie locale) et éventuellement nerveux. Les études in vitro ne permettent pas d’évaluer les conséquences de façon intégratives. De plus, la régulation de la pression artérielle pulmonaire ou systémique et de la fonction cardiaque ne peuvent être évaluées qu'in vivo. Cependant, une fois ces conséquences tissulaires et cellulaires identifiées in vivo, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (cellules vasculaires en culture) infectées ou non.
Réduction
1680 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Le poids des animaux est suivi tout au long des procédures. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum et une température et hygrométrie constantes. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée et le poids des animaux sera mesuré régulièrement. Les points limites seront évalués selon une grille de suivi. Après infection, les souris seront observées quotidiennement et pesées tous les jours pendant 1 semaine, puis toutes les semaines. La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémique au cours de la procédure finale. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20 pour cent de perte de poids. Une perte de sang importante, des signes de souffrance (prostration, poil hérissé, yeux fermés) qui se maintiennent, une prostration, une incapacité à se déplacer, des yeux larmoyants et exorbités constituent également des points limites. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique.
Choix des espèces
Nous effectuons des expériences avec des souris modifiées par transgénèse afin d’humaniser les souris pour en faire un modèle d’étude de l’infection au SARS-Cov2 dont la pertinence a été démontrée comme modèle pour étudier les effets liés au Covid19. Ces modèles de souris sont plus connus et plus facilement utilisables pour des études in vivo et pour les analyses d’organes que les autres modèles animaux existants (e.g. furet). Les études sur les effets de l’infection au SARS-Cov2 seront effectuées au stade adulte, lorsque le développement pulmonaire, vasculaire et cardiaque est fini, après l'âge de 8 semaines.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 25000
300 000 rongeurs vont être utilisés, 275 000 souris et 25 000 rats, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour, en plus du tatouage d'identification, et les lignées entretenues peuvent porter un phénotype dommageable dont le porteur admet ne pas toujours connaître l'impact avant caractérisation. À l'issue, les animaux sont soit expédiés, soit tués, le porteur précisant qu'ils "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. L'objet du projet est de fournir des rongeurs génétiquement modifiés à des laboratoires, activité présentée comme un bénéfice en soi puisqu'elle améliore la "qualité génétique, sanitaire et zootechnique" des animaux livrés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la caractérisation et/ou l’élevage de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des traits physiologiques spécifiques, et parfois pathologiques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes ou encore la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent, ou de queue) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie de taille réduite peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Enfin, certaines lignées transgéniques sont induites par une hormone. Pour induire cette mutation d’intérêt, une injection de l’hormone pourra également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 300 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Expression d’un phénotype dommageable et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques ou stress exprimé pendant l’évaluation Bien Etre Animal. Douleur et stress associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum, oreille ou queue) en plus d’une identification. Douleur et stress associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions. Douleur, stress et perte de poids dûs à l'injection du ligand.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).
Raffinement
Les observations par le personnel technique permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en faisant appel aux techniciens qualifiés et compétents et au vétérinaire. Si un point d’intervention est atteint, le technicien met en place un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal , l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les normes éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l’animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5j après la fécondation.
Evaluation de candidats médicaments dans la fibrose pulmonaire induite par injection intranasale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose pulmonaire leur est induite par injection intranasale de lipopolysaccharides, de bléomycine ou d'élastase sous anesthésie, puis elles reçoivent des candidats médicaments dont le mode d'administration, la fréquence et la durée dépendent de la demande du "sponsor". Le porteur écrit que l'injection intranasale "ne provoquera pas de nuisance" et que le principal effet indésirable se limite à une modification de la respiration, alors qu'il décrit par ailleurs une maladie d'issue fatale par insuffisance respiratoire. Il annonce aussi que l'administration des candidats médicaments "aura des conséquences bénéfiques sur le développement de la maladie", ce qui pose comme acquis le résultat que l'étude est censée établir.
Objectifs
Les maladies pulmonaires sont généralement associées à une inflammation des voies respiratoires. Parmi les plus graves on retrouve la fibrose pulmonaire, caractérisée par une détérioration progressive du tissu pulmonaire conduisant à une inflammation généralisée et à la formation de cicatrices pulmonaires. Cette pathologie perturbe les échanges gazeux du poumon entraînant une insuffisance respiratoire à l'issue fatale. Elle affecte environ 3 millions de personnes dans le monde, et son taux moyen de survie est de 3 à 5 ans avec un âge moyen de début de 66 ans (75% ont plus de 65 ans). De nombreux facteurs de risque sont décrits, à commencer par la fumée de cigarette, les maladies de reflux gastro-œsophagien, ou certains agents infectieux. Si les risques sont identifiés, les causes sont encore inconnues. Le diagnostic de la fibrose est souvent difficile. Il nécessite la corrélation de plusieurs observations issues des examens physiques et de l’historique physiopathologique précis du patient, parfois associés à une biopsie pulmonaire ou à un lavage broncho-alvéolaire. Aucun traitement n’est actuellement disponible. Seuls certains médicaments sont utilisés pour freiner l’avancée de la maladie, mais ils ne sont que de faible efficacité. L’ultime recours est la greffe pulmonaire mais ne permet, en cas de succès, qu'un léger rallongement de l’espérance de vie. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments sur des modèles murins de fibrose pulmonaire induits par un agent inflammatoire (lipopolysaccharides ou bléomycine ou élastase) injecté par voie intranasale. Les candidats médicaments à tester seront administrés en curatif ou préventif et plusieurs voies d’administration seront envisagées afin de couvrir au mieux les potentiels effets recherchés dans le modèle murin utilisé. Ce projet prévoit 240 souris par an soit 1200 animaux sur la totalité du projet.
Bénéfices attendus
Ces pathologies étant incurables, il est donc nécessaire de pouvoir évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques ou cellulaires pour mieux traiter ces pathologies. Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de la fibrose pulmonaire afin de répondre à un besoin important de santé. Plusieurs voies d’administration des candidats médicaments seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression des manifestations cliniques de la fibrose pulmonaire.
Procédures
L'injection intranasale permettant l'induction de la fibrose pulmonaire sera réalisée sous anesthésie générale. Au moment du réveil de l'anesthésie, tous les animaux seront réhydratés. Le jour de l'euthanasie, un analgésique sera injecté au moins 30 minutes avant la mise à mort. Un prélèvement de sang pourra être réalisé 1 fois par semaine, selon la demande du sponsor. Les animaux seront soumis aux candidats médicaments à tester dont le mode d’administration, la fréquence et la durée dépendent de la demande du sponsor. En point final, un prélèvement de sang, un lavage bronchoalvéolaire et d'autres organes/fluides pourront être collectés après euthanasie de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex-vivo.
Impact sur les animaux
L'injection intranasale ne nécessitant pas l'introduction de corps étranger dans la cavité nasale, ce mode d'administration ne provoquera pas de nuisance. Le principal effet indésirable induit par ce modèle murin est une modification de la respiration des animaux. L'administration des candidats médicaments aura des conséquences bénéfiques sur le développement de la maladie.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à la fin de l'étude et des prélèvements seront réalisés post-mortem.
Remplacement
Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la fibrose pulmonaire. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante (test non- paramétriques de Mann-Whitney et Kruskal Wallis) pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience. Une étude se composera de 5 groupes de 12 souris, soit 60 souris par étude. Au sein de chaque groupe, la moitié des souris (n=6) sera dédiée à une étude histologique et l'autre moitié (n=6) à une étude cellulaire, biochimique, moléculaire sur les différents prélèvements effectués. A raison de 4 études par an, ce projet nécessitera donc 240 souris par an, soit 1200 souris pour la durée totale du projet.
Raffinement
Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Nous utiliserons un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle des animaux suite à l'anesthésie. Lors du réveil de l'anesthésie, les souris seront réhydratées par voie sous-cutanée avec une injection de NaCl chauffée à température corporelle. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs ayant connaissance du modèle afin d'apporter les meilleurs soins aux animaux. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
L’utilisation du modèle murin dans l’étude des maladies pulmonaires est très fortement documentée. Il est impossible d’explorer l’ensemble de ces évènements par une approche substitutive de culture cellulaire. L’approche cellulaire reste cependant absolument nécessaire pour la validation des cibles et la mise en évidence de la première preuve de concept d’efficacité. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, à partir de 7 semaines car leur système immunitaire est mature.