Système respiratoire

30 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de remplacement de la trachée par une matrice soutenue par une endoprothèse d'environ 150 minutes, une partie subissant en plus une fibroscopie ou une bronchoscopie rigide. Le porteur indique attendre douleur post-opératoire, risque infectieux et stress, pris en charge par morphine et antibiotiques. Il teste deux matrices de substitution à l'allogreffe artérielle et affirme que le remplacement par une méthode sans animaux n'est pas possible pour une greffe des voies aériennes.

Objectifs

Les tumeurs trachéales sont une pathologie rare (2 à 6 nouveaux cas/100000 personnes chaque année). Le traitement qui assure les meilleurs résultats à long terme de la survie globale est la résection chirurgicale. Pour des résections limitées à moins de 5 cm de la trachée il est envisageable de réaliser une résection et anastomoses des extrémités. Le problème se pose quand la tumeur envahie plus de 5cm de trachée. Dans ce cas il nous faut un substitue trachéale ou trachéobronchique en fonction de l’étendue de la pathologie (extension à l’arbre bronchique ou la carène). La greffe trachéo-bronchique est un véritable défi chirurgical et biologique. Des échecs successifs ont été observés avec les prothèses synthétiques, les bioprothèses, les allogreffes trachéales, et les autogreffes d’organes et tissus divers. Notre équipe a proposé le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle cryopréservée soutenue par une endoprothèse. Cette technique est la seule à avoir prouvé son efficacité et durabilité. Ces résultats ont été démontrés chez l’animal (brebis) et ils ont permis des applications cliniques chez l’homme. L’apparition de néo-cartilage semble se développer à partir des cellules souches mésenchymateuses du receveur, le corps humain agissant comme bioréacteur naturel. Cependant il existe une pénurie d’allogreffe artérielle qui, face à la demande accrue grâce à une technique qui a montré son intérêt et qui se répand dans d’autres pays, devient un problème de disponibilité. Une matrice alternative de disponibilité illimitée et sur mesure représenterait l’avenir d’une chirurgie de remplacement des voies aériennes avec des indications plus vastes. L’objectif principal de ce projet est de tester deux matrices alternatives à l’allogreffe artérielle cryopréservée dans le remplacement des voies aériennes in vivo chez la brebis : une matrice en collagène et une matrice biologique (aorte porcine décéllularisée). Les deux matrices ont été étudiées in vitro par rapport la capacité d’être colonisée par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines et d’en favoriser leur pénétration et prolifération. Il est nécessaire maintenant de tester in vivo chez la brebis ces matrices alternatives. Celles-ci seront comparées à l’allogreffe aortique cryopréservée en termes de propriétés mécaniques, biologiques, capacité de colonisation par les cellules de l’hôte et génération de novo de cartilage.

Bénéfices attendus

Ce projet représente la suite des travaux de recherche concernant le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle, réalisée chez la brebis, permettant l'utilisation de la technique chez l'homme, avec la formation de nouvelles voies respiratoires. Ce nouveau projet représente une étape fondamentale d’un travail de recherche essentiel qui vise à tester l'efficacité de matrices alternatives à l'allogreffe artérielle afin de proposer des solutions thérapeutiques plus facilement accessibles, de disponibilité illimitée et sur mesure. Cela pourrait représenter l’avenir d’une chirurgie de remplacement des voies aériennes avec des indications plus vastes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions exclusivement sous anesthésie générale. Trois types de procédures sont prévues : 1)Les 30 animaux subiront tous la procédure chirurgicale de remplacement trachéal par matrice stentée. La procédure aura une durée moyenne de 150 minutes. 2)Une fibroscopie flexible sous anesthésie générale sera réalisée pour 6 animaux. La procédure aura une durée moyenne de 5 minutes. 3)Une bronchoscopie rigide avec ablation de l’endoprothèse trachéale sous anesthésie générale sera réalisée pour 12 animaux. La procédure aura une durée moyenne de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont le risque anesthésique, la douleur post-opératoire, une infection post- opératoire, une perte de poids temporaire au cours de la période post-chirurgicale, le stress. En fonction du moment per/post opératoire, l’analgésie est obtenue : par injection, lors de l’induction, de chlorhydrate de morphine (par voie intra-musculaire ; morphine Lavoisier, France) renouveler toutes les 4 à 6 heures. Ce traitement analgésique pourra être poursuivi, après évaluation de la douleur de l’animal et examen clinique, pendant les 48 à 72 heures post-opératoires. Une injection de Ketofen 10 % (par voie intramusculaire ; Ceva, France) est réalisée sur l’animal extubé. Ce traitement anti-inflammatoire sera poursuivi sur une période de 3 à 5 jours. Afin de prévenir les infections, un traitement antibiotique prophylactique sera réalisé par injection de Vetrimoxin 48 heures (15 mg d'amoxicilline par kg de poids vif deux fois à 48 heures d'intervalle, par voie intramusculaire, Ceva, France). En cas d’infection post-opératoire, qui peut être décelée par une perte de poids ou rougeur et chaleur au niveau de la cicatrice, le traitement par antibiotique sera renouvelé. Afin de réduire le stress associé à la chirurgie, les animaux seront hébergés deux semaines avant la date de l’intervention et ils seront gardé dans des boxes communs sauf en immédiat postopératoire.

Devenir

A la fin de la période expérimentale (de 1 mois à 12 mois après la chirurgie) les animaux seront mis à mort selon le calendrier prévu. Des prélèvements des matrices et des trachées en contiguïté des greffons seront réalisés afin de réaliser les études d’ histologie et d’immunohistochimie prévues.

Remplacement

Avant l’implantation des matrices chez les brebis les matrices ont été testées in vitro afin d’étudier leurs propriétés biologiques et la capacité d’être colonisées par des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines et d’en favoriser leur pénétration et prolifération. Néanmoins, le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur la greffe des voies aériennes au sein d’un organisme vivant complexe. Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour ce projet avant la réalisation d’essais cliniques chez l’homme, n’existant pas d’autre méthode alternative. Cette affirmation se base sur : des discussions avec des confrères; des conférences en pneumologie et chirurgie thoracique ; une recherche bibliographique approfondie effectuée sur la période 2010-2023 dans les bases de données en utilisant es mots-clés suivants: replacement, trachea, aorta, alternatives.

Réduction

Un modèle ovin de remplacement trachéal a largement été publié par notre équipe avec un taux de survie postopératoire globale de 90% à 12 mois. L’expérience de notre équipe sur ce modèle animal nous permettra de réduire le nombre d’animaux normalement prévus pour une mise au point chirurgicale. Néanmoins il faudra considérer une mise au point par rapport les matrices alternatives qui seront greffées et la nécessité d’avoir un groupe « contrôle » afin de pouvoir comparer les résultats de la même série d’expériences (validité des matrice alternatives par rapport l’allogreffe artérielle cryopréservée). Le nombre d'animaux a donc été déterminé par une approche statistique qui nous permet de n’inclure que 30 animaux, 10 par groupe. Les paramètres étudiés seront : la tolérance clinique de la matrice, l’apparition de complications postopératoires, les résultats histologiques et immunohistochimique sur les matrices après mise à mort des animaux (l’apparition et l’évolution des structures cartilagineuses issues d’un processus de néochondrogénèse et ré-épithélialisation).

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi). Les animaux seront laissés dans des boxes communs sauf dans les premiers jours postopératoires afin d’éviter des problèmes au niveau des cicatrices. Le vétérinaire réfèrent du Laboratoire passera une fois par semaine voire les animaux ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (alimentation, perte de poids, dyspnée, douleur). Ces périodes ont une durée variable qui va de minimum 2 semaines jusqu’à que l’animal ne nécessite plus d’une surveillance rapprochée au sein de l’animalerie du Laboratoire. Cette durée est déterminée par le vétérinaire responsable qui doit donner son accord afin que l’animal puisse repartir dans son centre d’origine. Les animaux auront un traitement antalgique adapté. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, cachexie, prostration, fièvre) ou de dyspnée persistante pendant plus de 24h, les animaux seront mis à mort. Les animaux sont maintenus à jeun 12 heures avant l’intervention chirurgicale (alimentation solide) l’eau est laissé à disposition. Un examen clinique pré-anesthésique est réalisé : couleur des muqueuses, temps remplissage capillaire, auscultation cardiaque et pulmonaire, fréquences cardiaque et respiratoire, température, tympanisme gastrique. Les paramètres de surveillance anesthésiques seront évalués toutes les cinq minutes : Couleur des muqueuses et temps de recoloration capillaire ; Tonus musculaire mandibulaire ; Positionnement du globe oculaire (Myosis/mydriase, Réflexe palpébral) ; Fréquences cardiaque et respiratoire ; Oxymétrie de pouls ; Température ; Electrocardiogramme ; Pression artérielle invasive. L’expérience de l’équipe chirurgicale dans ce type de procédures représente un gain au raffinement, en termes de temps d’intervention, gestion et maitrise des risques ; en effet l’intervention de remplacement des voies aériennes est une procédure utilisée en soins courants chez l’homme dans notre centre.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour ce projet est l’ovin. La pertinence est justifiée par l’expérience de l’équipe sur ce modèle animal. En effet un modèle ovin de remplacement trachéal a largement été publié par notre équipe. Le modèle animal choisi pour cette étude est la brebis d’un âge moyen de trois mois et d’un poids compris entre 20 et 30 kg. Ce choix est justifié par l’importante expérience de notre équipe sur le remplacement trachéal, de la carène et des bronches sur ce modèle animal. Tous les animaux seront issus du même élevage et recevront des soins en accord avec les principes du « Guidelines on the protections of experimental animals » du Conseil de la Communauté Européenne (1986).

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation pulmonaire leur est induite par injection de bléomycine ou de LPS, puis elles reçoivent un agent de contraste par un cathéter posé sous anesthésie pour tester une technique d'imagerie à particules magnétiques. Le porteur indique que la fibrose pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires, de la prostration et une perte de poids, les animaux perdant plus de 15 % de leur poids étant tués. Il affirme que les procédures ont un caractère de stricte 'nécessité' et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester in vivo l'imagerie à particules magnétiques (MPI) pour le diagnostic précoce de l'inflammation pulmonaire en utilisant un nouvel agent de contraste composé de microparticules de polydopamine couplées à un anticorps anti-VCAM-1. Ces molécules d’adhésion endothéliales VCAM-1 sont exprimées à la surface des cellules endothéliales lors d’un épisode inflammatoire aigu ou chronique comme une inflammation systémique, une atteinte rénale ou une maladie rénale chronique. Des tests préliminaires sur cet agent de contraste en imagerie à particules magnétiques ont montré que les propriétés magnétiques de cet agent de contraste permettaient une sensibilité de détection en MPI supérieur à celle de l’imagerie par résonance magnétique (IRM). D’autres part, des études in vitro et in vivo ont montré les propriétés biocompatibles et biodégradables de cet agent de contraste et il a été également démontré que cette stratégie était efficace pour cibler les cellules endothéliales activées humaines, ouvrant la voie à une potentielle translation en clinique. L'utilisation de cet agent de contraste semble donc être un outil prometteur pour la détection en pré-clinique de l'inflammation en MPI et nous prévoyons de tester dans ce projet la capacité de détecter l’inflammation pulmonaire dans différents modèles chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation in vivo dans le cerveau, les reins et la muqueuse intestinale. Nous savons que ces microparticules ont un signal en MPI du fait de leur propriété magnétiques spécifiques. Il est donc attendu de la technique d'imagerie MPI utilisant les M3P qu'elle puisse elle aussi permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation pulmonaire par rapport aux animaux contrôles n'ayant pas d'inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie MPI avec injection de produit de contraste (durée : environ 30min).

Impact sur les animaux

Les deux modèles présentés peuvent en effet induire des effets indésirables sur les animaux. La bléomycine est un agent anti-cancéreux dont un de ces effets secondaire est d’induire de la fibrose pulmonaire, d’où son utilisation courante en recherche préclinique pour l’induction d’inflammation pulmonaire. Le LPS est un sucre que l'on trouve à la surface des bactéries dont l'injection simule la présence de bactérie et induit ainsi une réaction immunitaire forte. Il est important de noter que la dose de LPS choisie pour ce projet (100 µL à 0.5 mg/mL) n'induit pas de mortalité chez les souris. L'induction de l’inflammation pulmonaire et la fibrose pulmonaire peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Dans ces deux modèles, les animaux peuvent être en mal-être qui peut alors être repéré par de la prostration, une inactivité dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids. Lors du protocole d'imagerie MPI, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux pour l'administration de l'agent de contraste peut provoquer un hématome.

Devenir

Tous les animaux de cet étude sont mis à mort à l’issue des 2 procédures.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisées sur l'gent de contraste en imagerie à particules magnétiques (utilisation de "fantômes") et ont permis de montrer que les propriétés magnétiques des microparticules conféraient un signal spécifique en imagerie à particules magnétiques (MPI). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de l'agent de contraste pour les molécules d'adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et de détectabilité de l'agent de contraste en imagerie MPI lorsqu'elles sont injectées dans un organisme. D'après les études pilotes citées, on sait que l'agent de contraste cible efficacement l'inflammation dans d'autres pathologies et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie MPI pour révéler l'inflammation pulmonaire. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets, ayant utilisé des protocoles d'imagerie similaires pour évaluer l'inflammation dans d'autres tissus avec les mêmes types de microparticules. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Les données de ces 5 animaux étaient comparées à 5 autres animaux du groupe contrôle. Il semble intéressant d'étudier l'effet sexe sur le développement de ces modèles d'inflammation ainsi que l'efficacité du ciblage de l'agent de contraste et de leur détection par imagerie photoacoustique, nous prévoyons donc de réaliser chaque modèle sur 5 souris mâles et 5 souris femelles. Avec les animaux contrôles (recevant des injections de liquide physiologique), cela fait donc 20 animaux par modèle. De plus, nous aurons besoin d'évaluer la sensibilité et la spécificité de la méthode en utilisant des microparticules non ciblées, en utilisant 20 autres animaux (10 animaux pour chaque modèle d'inflammation (5 mâles et 5 femelles) et 10 animaux contrôles (5 mâles et 5 femelles aussi) ), amenant au total à 40 animaux par modèle. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons avec pour paramètres : moyenne anticipée groupe 1 (modèle) = 10 +/- 5 et groupe 2 (contrôle) = 1, alpha = 0.05, ayant donné un résultat de 5 animaux nécessaires par groupe. Les moyennes de signal obtenues seront analysées par un test de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des animaux de type boite à œuf, tunnel PVC et/ou igloo PVC est prévu. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure (points limites cités plus loin) ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une coupelle de croquettes humides aura été préalablement placée dans la cage afin de permettre aux animaux malades de s'alimenter et de s'hydrater plus facilement. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite 15 minutes après les instillations (LPS ou bléomycine), puis 1 heure après et 2 fois par jour jusqu’à l’euthanasie des animaux. De plus, pendant la durée des modèles et avant la perfusion intracardiaque réalisée pour le prélèvement des organes d'intérêt (reins), la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie. En amont de ce projet, pour limiter la douleur engendrée par l’intubation lors de l’injection intratrachéale, nous avons choisi de n'utiliser qu'une dose de LPS, connue pour ne pas induire de mortalité chez les souris. Les points limites suivants et les décisions prises en conséquence sont définis comme suit : Niveau 1 : diminution de l’activité dans la cage, réduction de l’interaction avec les congénères, absence de toilettage, dos vouté, rétrécissement de l’ouverture orbitaire, changement de position des oreilles et des moustaches (oreilles vers l’extérieur, moustaches vers l’avant ou vers l’extérieur) --> Augmentation de la surveillance (4 fois par jour). Niveau 2 : perte de poids de plus de 15 %, prostration dans la cage, absence de réaction au toucher, tremblements/convulsions, saignements rectaux --> Mise à mort de l’animal par administration d’une dose létale d’anesthésique.

Choix des espèces

D’un point de vue scientifique cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic d’un mauvais état de santé chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un diagnostic positif d'inflammation cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.

2 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, la trachée est disséquée puis suturée pour y injecter une molécule provoquant une fibrose pulmonaire, avant des prélèvements sanguins et des injections de cellules et de molécules thérapeutiques, le porteur reconnaissant des difficultés respiratoires et une perte de poids. Les poumons sont prélevés après la mise à mort. Des cultures de cellules humaines sont utilisées en parallèle, mais le porteur conclut qu'aucune alternative ne modélise l'"organe entier" et qualifie la souris d'animal "incontournable".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique, évolutive et mortelle caractérisée par le remplacement du tissu pulmonaire normal par un tissu cicatriciel (fibrose) ne permettant plus les échanges gazeux au niveau des alvéoles pulmonaires. Les patients atteints souffrent d’une dyspnée (difficulté à respirer) qui peut s’aggraver dramatiquement au décours d’une maladie infectieuse respiratoire (exacerbation). Il n’existe actuellement aucun traitement pour stopper la progression de la maladie. Les mécanismes aboutissant à la FPI ne sont que partiellement connus. La FPI résulte d’un processus de cicatrisation excessive des alvéoles pulmonaires en réponse à des agressions répétées (tabac, infections virales, pollution…), et sa progression est probablement favorisée par un dérèglement des cellules immunitaires présentes dans les poumons (inflammation). Parmi ces cellules immunitaires, nous nous intéressons à une population de cellules X qui participent en temps normal à la lutte contre les infections bactériennes et virales. Cependant, ces cellules X constituent une arme à double tranchant car elles sont également capables d’amplifier l’inflammation et la fibrose. Nos résultats préliminaires chez l’homme et chez la souris montrent qu’il existe un lien entre ces cellules X et la progression ou la sévérité de la fibrose pulmonaire. En outre, des publications récentes ont montré leur rôle délétère dans la fibrose du foie. Les objectifs du projet sont 1) de caractériser le comportement des cellules X dans deux modèles expérimentaux de fibrose pulmonaire, 2) d’étudier l’effet de l’absence des cellules X sur la progression de la fibrose, et 3) d’étudier le potentiel thérapeutique de trois molécules capables de bloquer ou activer les fonctions des cellules X. Ces différentes approches fondamentales et précliniques permettraient de valider les cellules X comme nouvelle piste thérapeutique dans la FPI.

Bénéfices attendus

La FPI est une maladie progressive et fatale impliquant des interactions fonctionnelles multi-directionnelles entre tissu pulmonaire et cellules immunitaires. Dans cette étude, nous investiguerons le rôle d’un type de cellules immunitaires dans des modèles murins de fibrose pulmonaire afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. L’étude de ces interactions complexes d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins de fibrose pulmonaire assurerait une meilleure connaissance de l’immunologie pulmonaire chez les patients FPI. Les résultats des différentes parties du projet seront profitables, notamment via l’amélioration du diagnostic clinique de la FPI et via le développement de nouvelles thérapies efficaces et ciblées.

Procédures

En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Une semaine plus tard, un prélèvement sanguin à partir de la veine faciale (sous-maxillaire) est prévu (durée 25 secondes) sur animaux vigiles. Entre J9 et J20, les souris recevront deux doses d’une molécule thérapeutique dont on veut évaluer l'action sur la fibrose pulmonaire. L’injection se fera via 2 voies non invasives, la voie intranasale (durée 25 secondes) et la voie intrapéritonéale (durée 10 secondes). Pour la voie intranasale, les souris seront sous anesthésie générale afin d’éviter le réflexe de déglutition et ainsi le passage des molécules injectées dans l’oesophage au lieu de la trachée. Avant l’administration de la molécule thérapeutique, les souris recevront à l’état vigile une injection de cellules X par voie intraveineuse (veine caudale, durée 30 secondes). A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire. L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids (entre le 7eme jour, et jusqu'au 14eme jour après injection). Une mise à mort est prévue en cas d'atteinte des points limites inférieur à 10% des effectifs selon notre expérience).

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

Afin de limiter l’utilisation de modèles animaux, des méthodes alternatives sont déjà utilisées dans notre projet, comme des cultures ex-vivo de cellules pulmonaires humaines et une lignée de cellules X humaines. Cependant, ces méthodes alternatives ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions notamment parce que ces modèles n’intègrent pas 1- la complexité de la physiopathologie de la fibrose pulmonaire, 2- le système immunitaire dans sa globalité et 3- ne peuvent pas reproduire le dynamisme du recrutement cellulaire vers d’autres tissus/organes via la circulation sanguine. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. En outre, la bonne compréhension des mécanismes immunitaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules immunitaires issues.

Réduction

D’une part, nous utiliserons l'effectif minimal tout en respectant l’hypothèse scientifique. Le nombre d’animaux, calculé par un test statistique, est de 24 en moyenne par groupe. Ce chiffre tient également compte du risque d'atteindre les points limites définis selon notre grille de score amenant à la sortie précoce des animaux du protocole (habituellement entre 0% et 10% des effectifs entre les jours 7 et 14 après traitement). D’autre part, dans le but de réduire le nombre d’animaux élevés, nous prévoyons d’utiliser non seulement les souris transgéniques portant le gène d’intérêt (enrichies en cellules X), mais également les souris issues des mêmes portées mais ne portant pas le gène d’intérêt (ces dernières seront incluses dans des groupes contrôles). De plus, des stratégies d’optimisation de l’utilisation de chaque animal seront appliquées afin de respecter le principe de réduction : collecter le maximum d’organes de toutes les souris expérimentales, partage des tissus/organes au sein de notre unité de recherche, tri et utilisation des cellules d’intérêt ex vivo

Raffinement

Les contraintes induites par les conditions expérimentales seront réduites par plusieurs approches. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures. Des antalgiques seront donnés en post opératoire. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture gélifiée facile à ingérer en cours de protocole. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’au moment du sacrifice. Cette surveillance clinique sera effectuée au moins 3 fois par semaine par l'expérimentateur afin de détecter précocément et réduire toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux . Cette surveillanve clinique évalue l’apparence de l’animal, son comportement, la diminution du poids et la fermeture de la suture. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. Afin de prévenir une douleur légère, détectée par l’un de ces critères (moindre déplacement ou mauvaise posture ou toilettage excessif ou état défensif ou plissement des yeux) un analgésique sera administré aux animaux. Les souris seront mises à mort dès la détection de points limites.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle animal murin dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. D’une part, les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose humaine. D’autre part, l’étude du système immunitaire murin a conduit vers de nombreuses découvertes dans le domaine d’immunothérapie. Les souris offrent aussi la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et ainsi de cibler le rôle d’un type de cellules immunitaires en particulier dans le poumon. Les cellules X sont très conservées entre espèces et présentent de nombreux points communs chez l’homme et la souris, permettant la mise en place de modèles pré-cliniques bien profitables dans le domaine thérapeutique. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire, ainsi la souris est un animal incontournable pour répondre à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 16 semaines. La fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.

576 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit un emphysème par une injection d'élastase dans la trachée, via une incision au cou refermée par suture, et active un modèle génétique par des injections de tamoxifène. Les souris sont ensuite mises à mort pour prélever et étudier leurs poumons. Il reconnaît disposer de modèles d'organoïdes humains, mais affirme qu'ils ne peuvent "pas se substituer complètement" au modèle murin.

Objectifs

L’emphysème est une maladie pulmonaire impliquant une destruction irréversible des alvéoles, sans médicament disponible actuellement. Dans les poumons de patients ayant un emphysème, les cellules vieillissantes exprimant le gène p16 sont augmentées et empêchent la réparation des alvéoles. Ces cellules peuvent sécréter différents facteurs bloquant la prolifération et la différenciation des cellules voisines. Nos données préliminaires montrent que l'absence de p16 répare l'emphysème chez la souris. Notre hypothèse est que les cellules souches épithéliales des alvéoles, ou pneumocytes 2 sont à l'origine de ce processus de régénération alvéolaire lorsque p16 est absent. Ainsi, l’objectif du projet est d'étudier si l'absence du gène p16 spécifiquement dans les pneumocytes 2 pourrait mener à une réparation des alvéoles pulmonaires. Pour se faire, nous allons utiliser des souris ayant une absence de p16 dans les pneumocytes 2. L’emphysème sera induit par une injection d’élastase dans la trachée, substance qui provoque une destruction alvéolaire partielle. L’emphysème sera évalué par des analyses sur coupes de poumon. Pour tenter de comprendre les mécanismes impliqués dans la réparation, nous étudierons la composition cellulaire des poumons de ces souris avec des analyses de l’expression génique de cellules individuelles. Pour étudier la capacité de ces cellules à former des alvéoles, nous utiliserons le modèle de formation d'organoïdes (structure d’auto-assemblage de cellules épithéliales et mésenchymales en 3 dimensions).

Bénéfices attendus

Nous anticipons : i) de montrer que les cellules responsables de la régénération dans le poumon emphysémateux en l'absence de p16, sont les pneumocytes 2, ii) d'identifier une ou plusieurs sous-populations de cellules épithéliales issues de la différenciation des pneumocytes 2, ayant des capacités régénératives modulées par la délétion de p16. Ces cellules régénératrices seront considérées comme cruciales dans la régénération alvéolaire et leur signature génétique sera analysée.

Procédures

Instillation intra-trachéale (dans la trachée) sous anesthésie générale, injection intra-péritonéale (dans le péritoine) sur animal vigile et prélevement des poumons sous anesthésie générale, sans réveil.

Impact sur les animaux

Un modèle de souris génétiquement modifiée sera utilisé pour induire l’absence de p16 dans les pneumocytes 2. Ce phénotype n'est pas dommageable pour les animaux. Pour activer ce modèle génétique, il est nécessaire de faire une injection par jour pendant 3 jours de Tamoxifen par voie intrapéritonéale. Cette procédure cause une douleur de courte durée au moment de l'injection (aiguille). Dans de rare cas, les injections peuvent causer des péritonites chez les animaux. L'injection d’élastase se fait dans la trachée, à l’aide d’une aiguille. Cela nécessite une petite incision au niveau de l’avant du cou que nous refermons avec du fil de suture. La plaie au site d’injection pourrait s’infecter.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever et étudier leurs poumons.

Remplacement

La variabilité des caractéristiques des patients ayant de l'emphysème comme leur âge ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Le modèle de souris emphysémateuse ayant une déletion de p16 dans les pneumocytes 2 permettra d’étudier directement si les cellules responsables de la régénération sont les pneumocytes 2, dans l’emphysème pulmonaire. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. Actuellement, nous disposons de modèles d'organoïdes chez l'humain qui ne peuvent pas se substituer complètement aux modèles murins mais qui représentent des outils in vitro d’intérêt pour étudier la dysfontion des celules épithéliales chez les patients atteints d'emphysème pulmonaire. Les inconvénients majeurs de ces modèles sont la disponibilité des échantillons et la variablilité entre les patients (consommation de tabac, arrêt de la cigarette, sévérité de l'emphysème, âge, comorbidité, traitement,...).

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 576, correspondant au minimum pour obtenir des résultats significatifs. Pour l’ensemble des manipulations animales un total de 576 souris ayant une absence de p16 dans les pneumocytes 2 seront utilisées. Les animaux seront répartis de cette manière : i) le nombre d'alvéoles pulmonaires sera évalué à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 20 souris seront injectées à l’élastase vs 20 souris au PBS (contrôle), ii) la composition cellulaire des poumons de ces souris sera analysée à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 8 souris seront injectées à l’élastase vs 8 souris au PBS (contrôle) iii) le modèle d’organoides alvéolaires permettra d'étudier les propriétés des pneumocytes 2 à former des alvéoles à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 20 souris seront injectées à l'elastase et 20 souris a PBS (contrôle). Pour chaque expérience et pour chaque groupe de souris injectés soit à l'élastase, soit au PBS, la moitié des souris seront injectées au Tamoxifen permettant d'avoir des souris contrôles (ayant une expression de p16 dans les pneumocytes 2) et des souris présentant une absence p16 dans les pneumocytes 2. Chaque expérience sera réalisée de manière préventive (Tamoxifen administré 3 jours avant l'injection) et de manière curative (Tamoxifen administré à partir de 21 jours, lorsque l'emphysème est déjà constitué).

Raffinement

Les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie. Il y aura une présence quotidienne des zootechniciens et une surveillance accrue de notre part durant les 24h suivant l’instillation d’élastase. Les souris sont hébergées en groupe de 4 par cage, dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal être, les points limites suivants constitueront des critères d'arrêt et conduiront à la mise à mort des souris : blessure, infection, masque facial ou signes de douleur.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique injection d’obtenir un emphysème important chez la souris. Les animaux seront utilisé à l’âge 2 mois, correspondant à la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris.

1728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent, sous anesthésie, des instillations de cellules immunitaires et de la bactérie Pseudomonas aeruginosa dans les voies respiratoires, certaines à dose létale, pour étudier des globules blancs suppresseurs comme modulateurs de l'inflammation pulmonaire. Le porteur indique que l'infection peut entraîner perte de poids et souffrance, l'euthanasie étant alors pratiquée. Sur le remplacement, il se borne à affirmer que ces connaissances ne peuvent être obtenues qu'à l'échelle de l'organisme.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa (P.a) est une cause majeure d'infections respiratoires chez l'homme, notamment chez les personnes atteintes de mucoviscidose, ou celles atteintes d'emphysème et de bronchite chronique. Cette bactérie provoque des infections aiguës dramatiques chez les personnes immunodéprimées (personne dont les défenses immunitaires sont affaiblies) et elle devient progressivement multirésistante aux antibiotiques et représente une menace considérable pour la santé publique. Il est bien établi dans d’autres pathologies telles que le cancer et les maladies infectieuses qu'une catégorie de globules blancs immuno-suppresseurs particuliers, les cellules myeloides suppressives ( MDSCs) sont induites par l'infection et/ou les infections. Il est également connu que dans les infections où P.a est présente, par exemple chez les patients placés sous ventilation respiratoire, ou chez les patients souffrant de mucoviscidose, c’est l’inflammation exacerbée qui est la cause de la morbidité. Les cellules MDSCs générées post-infection/inflammation représentent probablement un mécanisme protecteur pour contrecarrer cette réponse excessive inadaptée. En effet, il a été montré que des MDSCs fabriquées à partir de moelle osseuse de souris C57/Bl6 sont anti-inflammatoires, lorsqu ’infectées in vitro avec la bactérie P.a. En effet, la littérature indique que les MDSCs (avant ou après infection par P.a) peuvent inhiber la réponse immune. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle des MDSCs comme modulateurs de l’inflammation pulmonaire exacerbée observée chez les patients infectés, et dans les modèles de souris d’infections à P.a et d'étudier les mécanismes en jeu.

Bénéfices attendus

Il est bien connu que la bactérie P.a entraîne une forte morbidité et/ou mortalité chez les patients immuno-déprimés (patients sous-ventilation mécanique, patients souffrant de mucoviscidose, sujets grands brûlés), dûes à une inflammation exacerbée non contrôlée. A ce titre, nous pensons que ce projet pré-clinique visant à utiliser les cellules myeloides suppressives (MDSCs), cellules spécifiquement 'anti-inflammatoires’ est innovant et pourrait grandement bénéficier à la communauté scientifique, et à moyen terme aux patients souffrant de ces pathologies.

Procédures

Pour l’ensemble des souris étudiées, les injections intrapéritonéales (dans la cavité abdominale) d’anesthésiques réalisées sur les animaux vigiles durent quelques secondes. Lorsque l’animal est endormi (au bout de quelques minutes), les instillations des cellules et des bactéries s’effectuent par la voie oro-pharyngée et intra-nasale, respectivement, en déposant quelques gouttes de liquide sur les narines ou au niveau du pharynx . Ces instillations durent au maximum une minute. Pour certains animaux, juste avant la première instillation oro-pharyngée (J0) nous réaliserons un prélèvement sanguin de quelques microlitres à la veine sous-maxillaire sur les animaux vigiles. Ce prélèvement dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Sur la base de la litterature utilisant des macrophages transferrés de façon adoptive par la même voie, l’instillation par voie oro-pharyngée des cellules myéloides suppressives (MDSCs) pourrait entrainer une perte de poids très modérée durant 24-48h. Dans toutes les procédures, l’instillation de MDSCs et les infections par P.a par voie oro-pharyngée sera effectuée sous anesthésie. D’après l’état de l’art, l’instillation des MDSCs et l’infection sous-létale avec P.a n’entraînera pas d’effets indésirables (pas de perte excessive de poids progressive, pas de réduction de la mobilité, pas de négligence du toilettage. Pour les animaux instillés avec une dose létale, la cinétique de développement des signes cliniques nous permettra d’anticiper la souffrance et la douleur pouvant être associées. En cas de souffrance et de douleur, l’euthanasie de l’animal sera effectuée. Les pathologies développées par les souris souffrant de mucoviscidose peuvent entraîner à partir de la naissance une dégradation de l’état général des souriceaux nécessitant une surveillance journalière.

Devenir

Dans le cadre de l’étude de la réponse immune post traitement, il est important d’euthanasier les animaux à la fin de l’expérience pour pouvoir étudier leurs réponses immunitaires.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur la souris ne peuvent pas être actuellement obtenues autrement qu’à l’échelle de l’organisme, compte-tenu de la complexité des mécanismes à étudier.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous utilisons 6 souris par groupe expérimental. Trois procédures expérimentales seront effectuées. La 1ère nous permettra d’étudier la présence des cellules myéloides immunosuppressives (MDSCs) dans les poumons et les ganglions de souris après infection par Pseudomonas aeruginosa (P.a). Si des différences ne sont pas observées dans cette procédure, un certain nombre d’expériences ultérieures ne seront pas effectuées, ce qui permettra de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les tests statistiques adéquats permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée sur le bien-être des animaux par une surveillance journalière qui sera assurée par le personnel de l'animalerie, en complément à celle des expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages avec 6 souris maximum par groupe expérimental dans une animalerie dédiée aux expérimentations à caractère infectieux. L’ensemble des actes sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté. Une grille d’évaluation des signes cliniques (prenant en compte l’apparence physique, le poids, le comportement ou la progression de la maladie) sera renseignée une fois ou deux fois par jour, suivant les procédures. Les souris présentant une souffrance et/ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale et/ou physique seront euthanasiées. En cas d’affaiblissement des animaux, des croquettes humidifiées seront mises dans la cage afin que les souris puissent accéder plus facilement à la nourriture. Lorsque nécessaire, l'utilisation d'analgésiques locaux sera effectuée, afin de minimiser l'inconfort potentiel des animaux lors des procédures.

Choix des espèces

Les souris utilisées seront âgées de 6-8 semaines, c’est à dire à l’âge de maturité du système immunitaire de souris à l’état normal. L’utilisation de souris dans notre projet se justifie par des raisons scientifiques. En effet, la souris est un animal sensible à l’infection respiratoire à la bactérie que nous utilisons dans ce projet, et cette espèce est utilisée classiquement depuis de nombreuses années par la communauté scientifique.