Système respiratoire

450 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 380 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 70 d'un niveau modéré. Des injections leur provoquent une hypertension artérielle pulmonaire qui conduit, selon le porteur, à une insuffisance cardiaque droite, avec essoufflement à l'effort et fatigue. À la fin, chacun subit une échocardiographie, un prélèvement sanguin puis un cathétérisme cardiaque de trente minutes sous anesthésie. Le porteur affirme veiller à ce que les animaux "ne subissent aucun stress", alors que la procédure elle-même installe chez eux une maladie cardiovasculaire évolutive.

Objectifs

La pathogenèse de l’hypertension artérielle pulmonaire est complexe, et implique des facteurs hémodynamiques et environnementaux, ainsi que des prédispositions individuelles. Il n'existe actuellement aucun traitement curatifs pour les patients atteints d'hypertension artérielle pulmonaire. Notre objectif est d'évaluer la pertinence d'une nouvelle cible thérapeutique de l’hypertension artérielle pulmonaire.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de valider l'intérêt de notre cible thérapeutique pour réduire le développement de l’hypertension artérielle pulmonaire. Les traitements actuels de l’hypertension artérielle pulmonaire étant non curatifs, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.

Procédures

L'induction de l'hypertension pulmonaire sera réalisée sous anesthésie. Tous les animaux subiront une échocardiographie, réalisée sous anesthésie, à la fin des procédures (20 min par animal). Les prélèvements sanguins à la veine caudale, réalisés sous anesthésie, seront réalisés au moment des échocardiographies (5 min par animal) lors de la fin de procédure (J21 ou J28). A la fin des procédures, tous les animaux subiront un cathétérisme cardiaque sous anesthésie (30 min par animal).

Impact sur les animaux

L'induction de l'hypertension artérielle pulmoniare sera réalisée par des injections de différents produits. Ces injections n'induiront pas de brulures car les solutions administrées seront tamponnées au préalable. Ceci conduira au développement d'une hypertension artérielle pulmonaire cez tous les animaux exposés, dont les effets secondaires sont des atteintes pulmonaires aigües (essouflement à l'effort, fatigue).

Devenir

Euthanasie de tous les animaux pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.

Remplacement

L’objectif de recherche est de mieux comprendre le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire et de déterminer la pertinence d'une nouvelle cible thérapeutique dans l'hypertension pulmonaire. Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'hypertension artérielle pulmonaire qui est un processus complexe.

Réduction

Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives (échocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Afin de réduire encore le nombre d’animaux utilisés, les animaux sont mis à mort en fin d'expérimentation après un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque, et les tissus prélevés sont partagés afin de minimiser encore le nombre d'animaux utilisés. Le nombre total de rats utilisés sera de 450 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Un test statistique adéquat permet de bien définir le nombre d’animaux nécessaires à cette étude.

Raffinement

Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des analgésiques. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement (évaluation de la présence de points limites précoces) et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaliers surveilleront quotidiennement l'apparition de points limites précoces, notamment la perte de poids.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celle de l’homme. De plus notre étude porte sur les effets au niveau vasculaire pulmonaire et ventriculaire droit de l'hypertension artérielle pulmonaire. L'utilisation de l'animal vivant est indispensable par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'insuffisance cardiaque qui est un processus complexe. De plus, dans un but d'étude préclinique il est crucial de pouvoir tester nos molécules pharmacologiques sur l'animal entier afin de déterminer la présence d'effets secondaires non désirés. Jeune adulte (6 à 8 semaines, 100-200g). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’hypertension artérielle pulmonaire est plus rapide. De plus, chez l'homme l'hypertension artérielle pulmonaire se développe chez les jeunes adultes.

2 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souriceaux porteurs d'une mutation du syndrome d'Ondine, maladie qui interrompt la respiration pendant le sommeil, subissent des gavages, une injection intrathécale sur animal vigile et des mesures cardio-respiratoires répétées de la naissance à trois semaines. Le porteur signale une forte mortalité des souriceaux mutants à la naissance et une vulnérabilité à l'anesthésie qui le conduit à injecter sans anesthésier. Le projet teste deux pistes pharmacologiques pour une maladie sans traitement, en s'appuyant sur une recommandation de l'Agence européenne du médicament de tester sur rongeurs juvéniles.

Objectifs

Le syndrome d'Ondine est une maladie génétique rare, constatée dès la naissance : le nouveau-né́ diminue sa respiration jusqu’à l'arrêter pendant le sommeil. Une caractéristique majeure est l'absence d'un réflexe respiratoire important : l'augmentation de la respiration lorsque l'on inhale du CO2 (sensibilité́ à l’hypercapnie). La maladie est provoquéé par une mutation hétérozygote d'un gène déterminant dans le développement embryonnaire du système nerveux autonome qui contrôle les grandes fonctions vitales comme la respiration. Actuellement, il n'existe aucun traitement pharmacologique et le recours à une ventilation mécanique à vie pendant le sommeil est nécessaire. Ce projet vise à étudier deux pistes de stratégies thérapeutiques pharmaceutiques.

Bénéfices attendus

L’utilisation d’un traitement pharmacologique réduirait le recours à la ventilation mécanique, l’unique prise en charge actuelle pour cette pathologie et ainsi réduirait les risques dus à un arrêt accidentel pendant le sommeil ou à une ventilation inadaptée. Les retombées de ce projet sont ainsi directement utiles en termes de prévention et d’implications thérapeutiques. De plus, pour des médicaments à visée pédiatrique, l’agence européenne du médicament recommande des tests sur des rongeurs juvéniles pour garantir l’innocuité et l’efficacité du produit sur la population cible.

Procédures

- Gavage en lait réalisé en moins de 2 minutes, fréquence : toutes les deux heures sur les souriceaux dont la poche de lait est vide entre 7h et 19h de la naissance à sept jours de vie (P7) puis 3 fois par jour jusqu'à P14- Gavage en molécule réalisé une fois - Injection intrathécale (injection sous la membrane protégeant le cerveau) de molécule sur animal vigile, réalisé une fois - Mesures cardio-respiratoires répétées 3 fois espacées de 4 heures puis une fois à 4 jours après la seule injection aigue pour une cinétique ventilatoire (évolution de la ventilation après l'injection unique de médicament). Les mesures cardio-respiratoires réalisées une fois par jour à 7, 14 et 21 jour. La durée d'une mesure cardio-respiratoire est d'une heure maximum. A chaque fin d'enregistrement, les souriceaux retournent dans la portée avec leur mère- A noter qu'aucun prélèvement d'organes ou de sang n'est effectué sur animaux vigiles. Le génotypage des reproducteurs s'effectue par prélèvemnt de follicule pileux, une méthode non invasive. Pour les souriceaux, le génotypage est réalisé par prélèvement tissulaire au niveau de la queue vers 4 jors de vie.

Impact sur les animaux

Les mesures cardio-respiratoires sur les souriceaux sont toutes non invasives et la séparation maternelle pour les réaliser n’excède l’heure. Les apnées et l’hypoventilation des mutants avec la mutation constitutive sont accompagnées pour certains mutants d’un défaut de succion/déglutition qui expliquerait en partie leur perte de poids. Ces effets indésirables attendus sont pris en charge par le gavage en lait. Le gavage peut tout de même représenter une gêne pour le souriceau mais nécessaire pour les maintenir en vie. Les modèles dont la mutation est restreinte dans des tissus spécifiques font des apnées et ne répondent pas à l’hypercapnie (hypercapnie : la pression partielle en CO2 dans le sang est augmentée) à la naissance mais leur phénotype respiratoire ne compromet pas leur survie. Leur croissance pondérale est similaire à leurs congénères sauvages. L’administration de traitement par injection sans anesthésie peut induire un stress sur l'animal qui sera de courte durée car le geste est précis et maîtrisé. De plus, les mutants ont une vulnérabilité à l'anesthésie. Le recours à l'anesthésie pourrait conduire à une mortalité précoce ne permettant pas de vérifier l'effet des molécules testées. La nuisance par le génotypage des souriceaux par prélèvement tissulaire au niveau de la queue engendre une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, des prélèvements de sang ou de tissus auront lieu en post-mortem.

Remplacement

L’étude préclinique sur des animaux en développement est un préalable recommandé par l’Agence européenne du médicament pour les stratégies thérapeutiques pharmacologiques notamment pédiatrique, l’utilisation de l’animal ne peut être évitée. Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique. De plus, des modèles in vitro ne sont pas adaptés car non représentatifs de la pathologie dans sa complexité d’expression et de prise en charge thérapeutique.

Réduction

Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle et de la forte mortalité des souriceaux mutants à la naissance, nous avons déterminé un lot expérimental (génotype ; dose ; génotype*dose) de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Nos méthodes de mesures étant non invasives, nous privilégions une étude longitudinale ce qui réduit l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Surveillance journalière des cages de souris expérimentées : boissons et nourriture à volonté des mères, papier doux de quantité suffisante pour le nid, vérification du comportement de la mère envers les petits de sa portée (regroupement de la portée), état de la portée – Suivi clinique : présence de lait dans l’estomac les premiers jours de vie, prise de poids, température corporelle et vérification des points limites à l’aide de grilles d’évaluation adaptées à l’âge de l’animal (état du pelage de la souris, sa posture, sa mobilité, l’absence d’automutilation, croissance pondérale). Fréquence de suivi clinique : journalier la première semaine, une fois par jour et en jours de semaine de la deuxième semaine puis deux fois par semaine jusqu'à la fin de la procédure. Les points limites choisis sont suffisament prédictifs pour éviter toute souffrance animale. En cas de point limite atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires par un personnel compétent.

Choix des espèces

Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques d'une maladie génétique. Nous travaillons sur les pistes thérapeutiques pharmacologiques d'une maladie génétique congénitale dont les manifestations cliniques sont précoces et la prise en charge pharmaceutique est encore inexistante. A ce jour, la seule prise en charge des patients est la ventilation mécanique. Nous avons à disposition des modèles murins sur lesquels nous pouvons prendre en charge dès la naissance et tester les stratégies thérapeutiques pharmacologiques. De plus, les études précliniques sur des animaux en développement constituent une recommandation de l'agence européenne du médicament comme préalable à la recherche des médicaments pédiatriques.

2 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère pour plus de la moitié. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas par voie nasale sous anesthésie puis suivies jusqu'à quatorze jours, pour tester des peptides antimicrobiens issus d'invertébrés et mesurer leur toxicité. Le porteur indique surveiller perte de poids, prostration et tremblements, et prévoit de tuer les souris avant l'apparition des signes de morbidité. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit l'infection pulmonaire et que la souris constitue un "modèle incontournable".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de valider l’utilisation des Peptides Antimicrobiens (PAM), antibiotiques naturels, produit par des invertébrés issus d’environnement extrême. Ces PAM ont des propriétés physico-chimiques originales qui pourraient créer de nouveaux médicaments actifs, dirigé contre les infections pulmonaires. En amont des expérimentations animales, des expériences menées in-vitro ont permis de démontrer que certains peptides antimicrobiens issus d’environnement extrême, notamment certains membres de la famille des BRICOS-PAM ont obtenus d'excellentes valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) contre six pathogènes bactériens hautement virulents et résistants aux antibiotiques) ainsi qu’une thermostable (toujours actifs après 1h à 90 °C), pas activité hémolytique, activité anti-biofilm et une absence de toxicité sur lignées cellulaires. De ce fait, les résultats donnent une fenêtre thérapeutique très large. Cependant, il reste à évaluer son activité (pharmacologie), décrire son comportement et le devenir de la substance dans un organisme vivant (pharmacocinétique, PK) et déterminer le degré de toxicité (dose maximum tolérée, DMT) dans un organisme. Dans un premier temps, pour évaluer l'efficacité de nos candidats médicaments sur des modèles infectieux pulmonaires pathogène (notamment des genres Pseudomonas), une preuve de concept (POC) sera mise en évidence. En cela, nos recherches nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’a pas été possible jusqu’ici de remplacer par des tests in vitro.

Bénéfices attendus

Détermination de la dose du PAM à administrer par voie pulmonaire, intraveineuse ou par voie intrapéritonéale aux souris pour déterminer la meilleure fenêtre thérapeutique. Connaissance de la stabilité et du devenir de chaque composé dans les organes de la souris après une ou plusieurs administrations. Validation chez la souris de l’effet thérapeutique curatif des composés contre une infection Pseudomonas aeruginosa.

Procédures

Pour les procédures « détermination du degré de toxicité » et « la pharmacocinétique », les composés seront administrés par voie intranasale ou par voie intraveineuse 1 fois par expérience sous anesthésie. L’infection des souris avec Pseudomonas est réalisée par voie intranasale sous anesthésie, 1 fois par expérience de preuve de concept (POC). Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés une ou deux fois par 24h sous anesthésie pour la POC. Les animaux après infection seront suivis jusqu’a 14 jour maximum

Impact sur les animaux

Lors de la détermination du degré de toxicité et de la pharmacocinétique, les souris des temps courts (5, 15, 30 et 60 min) seront étroitement surveillées pendant la première partie du protocole puis surveillées toutes les deux heures par jours par la suite (pour les temps supérieurs à 2h) pour observer l’absence de douleur, de lésions et de maladie. Lors de ces observations la perte de poids sera également surveillée. Dans le cas où l'injection des composés testés entrainerait tout changement de comportement : prostration, tremblement, diminution de l’exploration, et/ou d’aspect physique externe une grille d'évaluation a été mise en place. Pour limiter la peur et le stress physique de l’injection du composé cela sera fait sous anesthésie. Pour limiter la peur, la détresse et le stress physique de l’infection, les souris seront infectées une seule fois par voie intra-nasale en début de protocole expérimental (n°4) , après anesthésie à l’isoflurane 2% et leur état physique et comportemental sera évalué.

Devenir

Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d’expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.

Remplacement

Seules les études in vivo permettent de déterminer la pharmacocinétique et la bio-distribution d’un composé, ainsi que son efficacité face à une infection pulmonaire aigüe. L’efficacité chez la souris constitue un prérequis avant toutes phases cliniques sur l'homme. A ce jour, aucun système in vitro ne permet à ce jour d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à une infection pulmonaire aigüe. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable. En amont, la démonstration de la validité scientifique de méthode in vitro sera effectué sur lignées cellulaires, notamment pour tous les aspects de toxicité.

Réduction

Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, l’analyse de nombreux paramètres se fait simultanément sur une même souris après prélèvement des différents organes (rate, foie, cerveau, poumon, reins, sang). Les expériences sont répétées 3 fois et chaque expérience est analysée de manière indépendante. Ces conditions nous permettent de vérifier la reproductibilité des observations et de générer des résultats statistiquement analysables. La taille minimale de groupe nécessaire pour mener spécifiquement à bien la procédure a été faite. Ce nombre d’individus tient compte de la précision des mesures et de la différence statistique significative entre animaux témoins et animaux testés. Les tests seront réalisés de façon séquentielle plutôt que simultanés. De plus, le premier type d’étude nous permettra de réduire le nombre d’animaux pour les études deux et trois.

Raffinement

Le stress ayant une influence directe sur les mesures réalisées, le bien-être des animaux est impérativement pris en compte à chaque étape de l’expérimentation. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toutes douleurs, souffrances, angoisses ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur pendant l’expérience : Les animaux manipulés sont isolés dans une pièce séparée afin d’éviter tout stress aux animaux non manipulés. De façon à réduire le stress, l’inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées avant l’infection ou l’injection du peptide. De plus, la surveillance sera accrue, de façon quotidienne, selon les procédures. L’apparence physique, le poids, l’alimentation et le comportement des animaux seront surveillés, afin de détecter le plutôt possible une éventuelle morbidité. Des grilles de signes cliniques ont été établies et seront utilisées pour évaluer un « score » de douleur et permettre d’évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables seront euthanasiés. Les souris seront sacrifiées au maximum à 14 jours post-infection, avant l’apparition des signes de morbidité. Si des signes de morbidité sont observés, les points de cinétiques seront revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocement par rapport à celles initialement prévues.

Choix des espèces

La souris possède d'importantes similitudes génétiques (98% des gènes sont communs à l’Homme) mais aussi immunologiques, physiologiques et pathologiques. Une très bonne connaissance anatomique et physiologique et de nombreux outils sont disponibles pour cette espèce. En particulier, de nombreux anticorps contre les cellules immunitaires, des cytokines, voies de signalisation pro-inflammatoires assurent la réalisation d’expériences clés pour l’étude de la réponse immunitaire. La faible variabilité intra-individuelle et interindividuelle est à prendre en compte. De nombreuses pathologies infectieuses expérimentales ont été validées, notamment lors d'infection par Pseudomonas aeruginosa chez les modèles murins et notamment en C57BL/6 et BALB/c. La différence de gravité de l'infection pulmonaire induite par Pseudomonas aeruginosa peut être déterminée par des différences dans les réponses inflammatoires de l'hôte. Le choix de la souche sera effectué en fonction du choix de l’étude la réponse immunitaire à médiation humorale ou cellulaire. Dans un modèle de pneumonie chez la souris simulant également les concentrations pulmonaires mesurées chez l’Homme. Les modèles chez la souris ont permis d’établir l’efficacité in vivo des molécules mais aussi d’en évaluer les critères d’efficacité microbiologique d’un point de vue pharmacodynamique, indispensable à l’optimisation des doses chez l’Homme. Les animaux utilisés sont âgés de 8 semaines au moment de la procédure expérimentale. Les souris possèdent un poids d’environ 21g à 8 semaines. Chez les souris, le mâle atteint sa maturité sexuelle à l'âge de 8 semaines et la femelle à seulement 7 semaines. Cet âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.

2 472 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les animaux subissent dès l'âge d'une semaine une amputation de phalange sur animal vigile, puis une à deux chirurgies d'une à deux heures et demie, des injections intracérébrales de virus, la pose de cathéters et de sondes et des injections répétées, avant d'être tués pour prélever le cerveau. Le porteur qualifie la phalangectomie de "nuisance" et reconnaît le stress des contentions et des chambres de pléthysmographie, tout en affirmant l'absence d'inflammation liée aux virus. Il indique qu'aucune approche autre que l'expérimentation animale n'est envisageable en l'état, espérant que ces données fonderont de futures études in silico.

Objectifs

La respiration et l'activité du cœur et des vaisseaux sanguins sont contrôlées par des réseaux de neurones situés dans une partie du cerveau nommée tronc cérébral. Ces deux fonctions vitales participent ensemble au renouvellement de l’oxygène (O2) et du dioxyde de carbone (CO2) dans l’organisme. Cependant, nous ne savons toujours pas précisément quels sont les mécanismes nerveux qui permettent à l’activité cardiovasculaire de varier pendant la respiration. L’objectif général du projet est d’identifier les neurones impliqués dans ce processus et d’en expliquer les mécanismes. A l’aide de techniques innovantes basées sur l’utilisation de virus modifiés, nous localiserons d’abord ces neurones avec une grande précision dans le tronc cérébral. Ensuite, il s’agira de stimuler les neurones que nous aurons identifiés afin de mesurer les effets physiologiques provoqués. Dans d’autres expériences basées sur des techniques récentes d’imagerie, l’activité électrique de ces neurones sera enregistrée. Enfin, nous chercherons à savoir comment les paramètres cardiovasculaires et respiratoires contrôlés par ces neurones varient dans le cadre de comportements spécifiques. Les expériences proposées devraient permettre de démontrer que les neurones identifiés participent bien au contrôle cardiovasculaire pendant la respiration, notamment grâce à notre capacité de les activer ou les inactiver. Chez l’homme, ce contrôle nerveux cardiovasculaire que nous étudions est présent chez les individus en bonne santé, tandis qu’il est altéré dans de nombreuses pathologies. Notre projet a donc pour ambition de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ces processus physiopathologiques dans l’espoir de disposer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le projet de recherche proposé vise a améliorer nos connaissances sur le contrôle nerveux de deux fonctions vitales que sont la respiration et le système cardiovasculaire. Les résultats obtenus devraient permettre d'élucider les mécanismes neuronaux à l'origine de la genèse du rythme respiratoire et du couplage cardiorespiratoire. Plus précisément, il s'agit d'itentifier les populations de neurones qui contrôlent l’activité respiratoire et qui régulent l’activité cardiovasculaire et ainsi de mieux comprendre l’origine de la synergie entre les activités respiratoire et cardiovasculaire. Ces mécanismes sont d’une importance cruciale tant d’un point de vue fondamental que clinique. En effet, le fonctionnement normal de ces systèmes garantit l'oxygénation optimale de toutes les cellules de l'organisme, tandis que l’altération de ces mécanismes conduit à des pathologies mortelles telles que l’hypertension artérielle ou encore l’insuffisance cardiaque chronique. Les explorations fonctionnelles réalisées dans ce projet permettront pour la première fois d’établir une relation de cause à effet entre l’activité des neurones identifiés et le fonctionnement en synergie des activités respiratoire et cardiovasculaire. Ces découvertes pourraient donc permettre d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles et de lutter plus efficacement contre ces maladies. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront également de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.

Procédures

Une biopsie de la phalange distale sera effectuée sur tous les animaux (rats et souris) âgés d'une semaine. En effet, le jour postnatal 7 (P7) semble être l'âge le plus adéquat pour réaliser cette biopsie. Une seule intervention chirurgicale d'une durée comprise entre 1h30 et 2h30 sera réalisée dans deux procédures chez le rat et/ou la souris. Dans les deux autres procédures, deux interventions chirurgicales d'une durée comprise entre 1h30 et 2h30 seront effectuées chez la souris et/ou le rat. Ces deux interventions seront séparées d'une vingtaine ou d'une quarantaine de jours. Selon les procédures, les animaux seront soumis à différents types d’interventions. Tous les animaux recevront une ou plusieurs micro-injections cérébrales de virus modifiés (une seule fois, durée de l’intervention : 20-30 minutes). Chez certains animaux, une ou deux canules optiques intracérébrales seront fixées à la surface du crâne (une seule fois, durée : 45 minutes environ) et un cathéter sera également inséré dans une artère pour mesurer la pression artérielle (une seule implantation fixe, durée : environ 35 minutes). Dans d’autres cas, une sonde de télémétrie sera implantée en sous-cutané chez les animaux pour mesurer l’activité électrique cardiaque (une seule implantation fixe, durée : environ 40 minutes). Chez d’autres animaux, plusieurs injections de composés pharmacologiques seront réalisées par voie intrapéritonéale (fréquence : 2 injections par jour espacées de 12h, pendant 15 jours ; durée d’une injection sous anesthésie légère: 5 minutes). Enfin, pour mesurer les paramètres respiratoires sur le long terme, certains animaux seront d’abord acclimatés dans un pléthysmographe (1h par jour pendant 10 jours), avant de les placer de nouveau dans cet appareil pour les enregistrements chroniques (1h par jour, pendant 2 semaines environ).

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables attendus sur les animaux sont inhérents à la mise en œuvre de plusieurs protocoles décrits dans le présent projet. C’est notamment le cas de la phalangectomie sur animal vigile qui représente une nuisance et de l’anesthésie qui en soi génère du stress. Le test de contention utilisé afin de mesurer le niveau de stress des animaux génère également du stress. Le fait de placer les animaux dans une chambre de pléthysmographie de manière répétée ou encore d’effectuer plusieurs fois des injections de composé 21 sous anesthésie induit un stress. Dans tous les protocoles, la douleur, la souffrance et le stress liés aux procédures chirurgicales seront réduits à un niveau minimum grâce à l'emploi d'une anesthésie, d'une antalgie et de soins médicamenteux appropriés. Les responsables de projet ont une grande expérience dans la mise en œuvre des techniques de chirurgie et de la prise en charge ainsi que du suivi post-opératoire des animaux. Une réduction transitoire, plus ou moins marquée de l'activité locomotrice est observée pendant 12 à 24h environ suivant la chirurgie. La cicatrisation complète des plans cutanés suturés est observée dans les 5 à 7 jours qui suivent la chirurgie. Enfin, il n'y aura pas de nuisances ou effets indésirables suite à l'injection intracérébrale des virus utilisés dans ce projet. En effet, il s’agit de virus non-réplicatifs dont le génome a été altéré dans le but de ne produire que certaines protéines essentielles à la fonction virale souhaitée (ciblage et manipulation des neurones d’intérêt). Les données de la littérature et notre propre expérience indiquent que les conditions dans lesquelles ces virus sont injectés (niveau de titre, volumes injectés etc.) n'induisent pas d'inflammation notoire au niveau du site d'injection ou ailleurs dans le cerveau (tissu nerveux sain dans la zone d'injection, cellules aux aspects normaux etc).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, dans la plupart des cas le cerveau des animaux devra être prélevé dans le but de localiser les neurones d’intérêt. Dans d’autres cas, le modèle expérimental mis en œuvre nécessitera une euthanasie préalable.

Remplacement

Ce projet a pour but d'élucider les mécanismes de genèse du rythme respiratoire et de couplage entre neurones respiratoires et cardiovasculaires. Pour l’instant, les connaissances incomplètes sur le sujet ne permettent pas d’envisager d’approches autres que l’expérimentation animale pour répondre à ces questions (comme une étude in silico par exemple). En effet, il s'agit de mécanismes physiopathologiques fondamentaux pour lesquels il n'existe que très peu ou pas de résultats antérieurs. Cette absence de connaissances a priori sur ces mécanismes explique donc l'incapacité actuelle à modéliser le fonctionnement des réseaux cardiorespiratoires centraux. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.

Réduction

Le présent projet repose sur l’utilisation de techniques modernes, encore jamais employées pour étudier le contrôle central cardiorespiratoire. L'aspect novateur de l'étude garantit des avancées majeures et indispensables sur la physiopathologie de ces systèmes. En particulier, la technique d’enregistrement des activités cellulaires par imagerie du voltage sur la préparation perfusée in situ nous permettra de répondre à de nombreuses questions grâce à la mise en œuvre de plusieurs protocoles expérimentaux. Cela sert le double objectif d’optimisation des aspects scientifiques et éthiques. De plus, la variabilité interindividuelle sera réduite par l’utilisation de souches murines fixées génétiquement. Enfin, une analyse de puissance statistique sera réalisée systématiquement avant chaque expérimentation afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à la question expérimentale. Une fois les expérimentations réalisées, des tests statistiques appropriés permettront de valider ou non la question initiale posée. Les différentes stratégies expérimentales proposées ici nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour servir les objectifs scientifiques de cette étude en utilisant les outils, approches techniques et modèles murins les plus appropriés à chaque partie de l’étude. En particulier l'usage de souches transgéniques chez la souris et le rat, combiné aux approches opto- ou pharmacogénétiques, permet de cibler beaucoup plus spécifiquement les neurones d'intérêt par rapport aux autres techniques existantes, ce qui contribue à la réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie conventionnelle, dans des pièces où la température est contrôlée et dans des cages avec environnement enrichi. Le nombre limite d’animaux par cage sera respecté et les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures expérimentales induisant de la douleur, ici des approches chirurgicales. Cette anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards, notamment pour ce qui concerne les pourcentages de gaz dans l’air lors des phases d’induction et de maintien. Elle sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire rigoureux en utilisant notamment une fiche individuelle de suivi. Les responsables du projet possèdent une grande expérience dans ce domaine.

Choix des espèces

Dans ce projet, deux espèces d’animaux seront utilisées, souris et rats. L’intérêt général de ces deux modèles repose essentiellement dans leur proximité physiopathologique avec l’Homme (transférabilité des résultats), la reproduction rapide des animaux, et les conditions requises pour leur stabulation qui sont relativement peu contraignantes. Le modèle souris présente l’avantage d’être très permissif à la transgenèse, il existe aujourd’hui une banque importante de souris transgéniques qui nous permettra d'identifier précisément les mécanismes en jeu grâce à la variété de recombinaisons génétiques possibles. Le modèle rat présente l’avantage d’être plus robuste physiologiquement que le modèle souris, notamment en ce qui concerne l’approche in situ (voir procédure 3), permettant d’utiliser moins d’animaux (car moins de perte expérimentale) pour chaque objectif expérimental. Les animaux adultes provenant des établissements éleveurs seront maintenus dans l'établissement utilisateur et les expériences seront effectuées sur la descendance. Une biopsie de phalange distale (phalangectomie) sera d'abord effectuée à l'âge d'une semaine (P7), ce qui permettra de réaliser le génotypage et d’identifier ainsi chaque animal. Pour pouvoir comparer les résultats obtenus dans l'ensemble du projet de recherche, toutes les expérimentations reposeront sur des injections virales effectuées à l'âge de trois semaines (P21). A cet âge, le génotype des animaux sera donc connu. Les expérimentations finales des procédures 1, 2 et 4 seront réalisées chez le rat et/ou la souris à l’âge adulte (2-5 mois), et celles de la procédure 3 sera réalisée chez le rat à un stade juvénile (P30-35). Nous cherchons à déterminer les mécanismes générant le rythme respiratoire et le couplage central cardiorespiratoire dans les conditions les plus physiologiques possibles, chez des organismes pleinement développés et non-sénescents. Ces mécanismes sont pour l’instant mieux connus pour les stades développementaux précoces, notamment grâce aux approches in vitro qui ne fonctionnent qu’à ces âges. La préparation in situ, utilisée en procédure 3, est optimale chez le rat juvénile à condition d'être réalisée à P30-35 maximum. C'est donc cette contrainte temporelle qui justifie d'effectuer les injections virales à P21 (sevrage) pour permettre un temps d’expression suffisant des transgènes.