Système respiratoire

5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une instillation de bléomycine dans la trachée déclenche une fibrose pulmonaire, puis les animaux reçoivent des traitements chroniques, pour tester les molécules de clients contre cette maladie respiratoire. Le porteur indique que le modèle provoque des difficultés respiratoires et une perte de poids massive qui mène généralement à la mort, une perte allant jusqu'à 30 % étant tolérée avant l'exclusion. Sur le remplacement, il reconnaît l'existence de cultures et de coupes de poumon in vitro en cours de mise en place, mais les juge insuffisantes et conclut au recours à l'animal "entier".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique est une cicatrisation anormale du tissu pulmonaire (bronchioles, alvéoles et vaisseaux sanguins pulmonaires) à la suite à une agression violente (par exemple une infection virale ou bactérienne) et/ou chronique. Le tissu pulmonaire s’épaissit et se rigidifie et des cicatrices non fonctionnelles apparaissent que l’on appelle fibrose. La conséquence est principalement l’insuffisance respiratoire puis dans des stades plus avancés une insuffisance cardiaque droite. Elle peut nécessiter à terme la transplantation pulmonaire et/ou cardiaque. Aujourd’hui les causes de la maladie ne sont pas connues, d’où le terme idiopathique, mais la pollution semble être un facteur privilégié. Elle concerne aujourd’hui 5500 patients et 1800 nouveaux patients sont concernés par an en France. La maladie touche davantage les hommes et le risque augmente avec l’âge et les maladies métaboliques. Les deux traitements actuellement sur le marché, la pirfénidone et le nintedanib, ont pour but de ralentir la progression de la fibrose et donc de la maladie mais n’atténue pas les symptômes. Il est donc nécessaire de mettre en place des modèles animaux d’études précliniques dans le but de développer de nouvelles thérapies mais également comprendre les mécanismes moléculaires mis en place.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes mis en place dans le développement de la maladie, tout comme le développement de nouvelles thérapies

Procédures

Afin d’induire le développement de fibrose pulmonaire, nous devons instiller dans la trachée des souris, sous anesthésie gazeuse, la bléomycine, un anti-cancéreux utilisé en clinique actuellement et qui induit de la fibrose pulmonaire chez l’homme. Les animaux contrôles seront instillés avec de la solution saline. Les animaux sont ensuite replacés au milieu de leurs congénères dans leur cage d’origine placée sur un tapis chauffant. Une surveillance particulière est réalisée jusqu’au réveil de l’animal afin de déceler au plus tôt tout signe de souffrance ou de douleur (étouffement, détresse respiratoire, etc.). Tous les animaux du projet seront soumis à ce geste. Afin de tester les molécules de nos clients, les souris seront traités de façon chronique afin de montrer l'efficacité des dits traitements. Tous les animaux du projet seront soumis à cette phase de traitement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont des difficultés respiratoires des animaux et la perte de poids massive qui est telle qu’elle mène généralement à la mort et le stress chronique liée à l'administration chronique des traitements. La perte de poids observée dans ce modèle est corrélée significativement au niveau d’atteinte pulmonaire et reste un criète à la fois d'acceptation de la pathologie et un critère d'exclusion si celle ci devenait trop importante.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Des alternatives non animale sont envisageable aujourd'hui comme la mise en place de culture de cellules pulmonaires in vitro mais ce modèle reste limitée car ne mime par l'organisation structurelle et cellulaire du poumons comme décrit dans un organisme. Cette dernière technique va être testée puis mise en place au sein de l'entreprise dans les prochains mois. Les tests de molécules peuvent être réalisé sur des coupes de poumons issue de l'animal évitant ainisi de traiter chroniquement ces derniers. Cependant, avec cette technique, la pathologie doit être induite chez l'animal vivant avant de réaliser les coupes de poumons. Bien que ces alternatives existent, elles ne sont pas suffisantes pour démontrer l'efficacité des traitements de façon complète. Comme la plupart des maladies et la validation des nouveaux traitements il est nécessaire d’utiliser des animaux à des fins expérimentales. En effet, les maladies qui se développent sont souvent la conséquence d’altérations multi-organes qui nécessitent l’utilisation d’un organisme dans son entier. De plus, ceci permet d’évaluer les conséquences des nouveaux traitements sur l’état général d’un individu et les possibles atteintes de certains organes.

Réduction

Afin d'obtenir des résultats interprétables et de montrer l'efficacité d'un traitement, il est nécessaire d'avoir un nombre d'animaux par groupe égale à 10 minimum.

Raffinement

La perte de poids tolérée pour ce modèle est de 30%. En effet, comme mentionné ci-dessous il s’agit d’un critère important pour évaluer l’atteinte pulmonaire. La mesure du poids étant faite 3 fois par semaine, le suivi est rapproché.Pour limiter la souffrance liée à la perte de poids, afin de faciliter la prise alimentaire, des croquettes humidifiées seront positionnées en fond de cages. Pour les souris âgées et obèses, des mangeoires suspensdus seront utilisés pour favoriser la prise alimentaire. Un ajout d'aspen brik permettra au souris âgées et obèses d'user leur dent et de favoriser la prise alimentaire. Pour favoriser la nidification et permettre une bonne régulation de la température corporelle souvant dérégulée en cas de perte de poids, de l'enirchissement supplémentaire sera apporté (sizzlenest, coton). Après l’instillation et pendant la phase de réveil, les animaux sont placés sur tapis chauffant. Enfin, lors de l'euthanasie, pour limiter la souffrance lors du prélèvement terminal du sang effectué par ponction intracardiaque ou en veine cave sera réalisé de deux possibles façon: en option 1, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane, une injection de lidocaine sera effectué en sous cutané à plusieurs endroits le long de la zone d'incision et une injection de buprénorphine en sous cutanée 60 minutes avant; en option 2, les animaux seront anesthésiés avec un mélange kétamine/xylasine en i.p. et une injection de lidocaine sera effectué en sous cutané à plusieurs endroits le long de la zone d'incision.

Choix des espèces

Trois types de souris seront utilisées : Des souris C57Bl6 mâles âgées de 8 semaines. Des souris mâles sont utilisées car la fibrose pulmonaire touche plus les hommes que les femmes. L’utilisation de souris jeunes permet d’avoir un modèle de souris moins fragiles pour subir l’instillation. Des souris C57Bl6 mâles âgées de 22 semaines et rendues obèses par ingestion d’un régime gras pendant 16 semaines. En effet, les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques du développement de la maladie. Des souris C57Bl6 mâles âgées de 22 mois. Afin de limiter le transport de souris trop âgées, elles seront livrées à 18 mois puis hébergées jusqu’à 22 mois dans nos locaux. L’utilisation de souris âgées est totalement adaptée car le risque de fibrose pulmonaire est accru lorsque l’on vieillit. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte afin de se rapprocher de ce qui est observé chez l'homme à l'âge adulte.

150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

1 215 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur les immunise quatre fois par voie nasale ou intramusculaire contre des virus respiratoires comme le SARS-CoV-2, la grippe ou le VRS, avec des prélèvements répétés de sang, de fèces et de sécrétions vaginales. Il décrit une hausse de température, une baisse d'activité et une inflammation possible au site d'injection, puis une mise à mort pour prélever poumons, tissu nasal et rate. Ce projet mesure seulement l'immunogénicité des formulations, la protection devant être testée ensuite sur d'autres animaux, et le porteur affirme que seul un "organisme entier" permet ces observations.

Objectifs

L’objectif est d’évaluer l’immunogénicité de formulations vaccinales contre des pathogènes respiratoires administrées par voie intranasale chez la souris.

Bénéfices attendus

Les vaccins contre les virus respiratoires sont actuellement peu efficaces pour induire une réponse immunitaire dans les tissus respiratoires qui permette une protection à long-terme contre les infections. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus respiratoires. Ce projet permettra de mettre en place de nouvelles formulations vaccinales administrées par voie intranasale qui induisent de fortes réponses immunitaires dans les tissus respiratoires, dont des réponses résidentes mémoire, et systémiques contre des virus respiratoires tels que SARS-CoV-2, influenza ou RSV. Ces données d’immunogénicité générées dans ce projet sont essentielles pour ensuite tester la protection induite par les formulations les plus prometteuses dans d’autres modèles de souris ou rongeurs. De plus, ce projet permettra d’apporter des nouvelles connaissances sur le développement des réponses résidentes mémoire au niveau des muqueuses. Il existe à ce jour peu d’adjuvants qui ont été testés pour l’induction des réponses mémoire. Les études d’immunogénicité sont très souvent concentrées sur les réponses IgA au niveau des muqueuses uniquement.

Procédures

1) Le marquage des souris sera réalisé à leur arrivée. 2) Les souris seront immunisées par voie intranasale (douleur modérée) sous anésthesie par isoflurane et/ou par voie intramusculaire (douleur modérée) dans le muscle d’une cuisse et sous anesthésie par isoflurane aussi. En tout, il y aura 4 immunisations soit par voie intranasale ou par voie intramusculaire. 3) Le prélèvement de sang en sous mandibulaire est un geste qui dure 30 secondes quand il est réalisé par une personne expérimentée. Ce geste sera réalisé avant chaque immunisation et avant la mise à mort sur souris vigile: 5 fois au total. 4) Les souris isolées pour le prélèvement des fèces seront maintenues dans des boîtes qui n’entravent pas leurs mouvements jusqu’à récupérer suffisamment de fèces, et ne seront pas gardées au-delà de 20 minutes dans ces boîtes. Le prélèvement se déroulera avant chaque immunisation et avant la mise à mort sur souris vigile: 5 fois au total. 5) Des prélèvements vaginaux (douleur légère) durent environ 5 min quand c'est réalisé par une personne expérimentée. Ce geste sera réalisé avant chaque immunisation et avant la mise à mort sur souris vigile: 5 fois au total. 6) Une injection intraveineuse avec un anticorps sera réalisée 3-5 minutes avant la mise à mort. Cette injection se fera à l’aide d’un tunnel fixé à la paillasse. La queue sera légèrement chauffée avec de l’eau à 37 degrés durant 2 minutes. Ensuite, la queue sera rapidement désinfectée et l’anticorps sera injecté. Cette injection sera réalisée sur souris vigile une fois avant la mise à mort. Tous les animaux subiront ces techniques sur une durée totale de 7 semaines.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables peuvent survenir chez les souris après la vaccination comme une augmentation de la température du corps et une diminution de l’activité ainsi que du poids. Si une administration par voie intramusculaire est réalisée, une inflammation au site d’administration peut aussi survenir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever des organes (poumons, tissu lymphoide nasal, rate) et des fluides muqueux comme les lavages bronchoalvéolaires et nasaux. Ces prélévements permettront d’analyser les réponses anticorps et cellulaires post-vaccination.

Remplacement

Le passage intra muqueux des antigènes avec ou sans vecteur sera aussi étudié dans des modèles in vitro de tissus respiratoires afin de sélectionner les antigènes les plus prometteurs. Cependant, il n’existe pas de méthode in vitro pour tester l’efficacité des adjuvants à induire des réponses adaptatives spécifiques. Les analyses in vitro ne permettent pas d’analyser l’effet de différentes formulations vaccinales sur les réponses immunitaires humorales et cellulaires dont les réponses mémoire. Seule l’utilisation d’un modèle animal permet d'observer ces effets sur un organisme entier.

Réduction

Le design des expériences sera optimisé afin de minimiser le nombre de souris utilisé dans les groupes contrôles. Lors de chaque expérience, nous inclurons donc le maximum de groupes expérimentaux pour un groupe contrôle, tout en se veillant que les expériences restent réalisables par les expérimentateurs vu le nombre d’analyses qui sera effectué et que ce soit robuste statistiqument. La répétition des expériences sera réalisée au maximum trois fois lorsque des résultats positifs seront observés dans un ou plusieurs groupes expérimentaux par rapport au groupe contrôle. Les résultats positifs sont définis comme des réponses immunitaires significativement plus élevées dans le groupe experimental que dans le groupe contrôle.

Raffinement

Les souris seront observées dans les heures suivant l’administration de la formulation vaccinale (examen à 3h, 24h, 48h et 72h) pour vérifier qu’il n’y ait pas d’installation d’un état de prostration et l’absence de douleur au site d’administration du vaccin par voie intramusculaire (difficulté à se déplacer, voire boitement, sensibilité importante au toucher des sites d’injection manifesté par un vif retrait de la patte). La température corporelle et le poids des souris seront suivis après chaque immunisation aux temps indiqués ci-dessus. L’immobilité, la prostration, l’apathie, une inflammation excessive au niveau des sites d’injection et/ou de prélèvements, ainsi qu’une perte de poids de plus de 20% du poids avant immunisation, seront considérées comme critères de points limites qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal par dislocation cervicale. Etant donné que l’on analyse des réponses immunitaires post-vaccination, nous ne pouvons pas donner d’analgésiques ou anti-inflammatoires qui pourraient perturber les réponses immunitaires naturelles des souris.

Choix des espèces

La souris est le modèle le mieux adapté pour évaluer les réponses immunitaires spécifiques à un candidat vaccin. Nous avons sélectionné le modèle de souris C57BL/6 qui génère de bonnes réponses anticorps mais aussi de fortes réponses cellulaires étant donné que notre but est d'étudier les réponses cellulaires mémoire. De plus, les modèles de souris qui nous permettront dans le futur de tester la protection de nos formulations vaccinales prometteuses seront dans cette meme lignée de souris. Cependant, il reste nécessaire de confirmer l’immunogénicité de notre formulation qui donne les résultats les plus prometteurs dans une autre lignée et nous avons aussi sélectionné le modèle BALB/c qui génère globalement de fortes réponses immunitaires. Les experiences d’immunogénicité seront réalisées avec des souris agées entre 7 semaines et 6 mois car avant 7 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complétement developpé et après 6 mois la réponse immunitaire risque d’être altérée. Etant donné qu’il a été démontré que l’âge pouvait avoir un impact sur les réponses immunitaires post-vaccination, certaines expériences d’immunogénicité avec la formulation la plus prometteuse chez les jeunes souris sera répétée chez des souris de plus de 2 ans.

2 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires puis une infection nasale par le virus Influenza sous anesthésie, avant des traitements de chimiothérapie ou d'immunothérapie, la croissance tumorale pouvant provoquer détresse respiratoire et perte de mobilité. Le porteur affirme qu'il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et justifie le choix de la souris parce que "toutes les études similaires sont menées chez cet animal". Les bénéfices avancés pour les patients atteints de cancer du poumon restent une meilleure connaissance des facteurs de résistance aux traitements.

Objectifs

Nous souhaitons caractériser l’impact d’un virus respiratoire sur la progression tumorale de cellules tumorales pulmonaires et comprendre les mécanismes mise en oeuvre lors de la reconnaissance virale. Pour ce faire, nous utiliserons des lignées cellulaires présentant ou non des adaptateurs moléculaires impliqués dans le processus de reconnaissance du virus respiratoire Influenza A. Nous nous interessons également à la réponse aux différents traitements.

Bénéfices attendus

Les traitements actuellement préconisées dans le cadre d'un cancer pulmonaire sont la radiothérapie ou la chimiothérapie et éventuellement en association avec l'immunothérapie ou thérapie ciblée. Cependant, il est nécessaire de poursuivre des recherches pour mieux connaître les facteurs pouvant impacter la progression tumorale et la résistance au traitements. C'est pourquoi, nous souhaiterions déterminer le rôle des adaptateurs ou récepteurs de la reconnaissance virale en combinaison avec de la chimiothérapie ou immunothérapie.

Procédures

Pour l'ensemble des procédures, la durée de l'expérience est de 1 mois. Les animaux recevront une injection de cellules tumorale (2250 animaux) par voie intraveineuse avec au préalable une anesthésie générale. La durée de l'acte est de quelques secondes à une minute. De plus, avant l'infection respiratoire, les souris sont anesthésiées à l'aide de cette même préparation puis l'infection par voie nasale (2250 animaux) peut avoir lieu. Le temps nécessaire une infection est de 20 minutes maximum. Nous testerons également la résistance aux médicaments et la voie d'administration du traitement (chimiothérapie ou anti-monoclonal) est une injection intra-veineuse (1800 animaux) et l'acte prend moins de 10 secondes. Les souris recevront une anesthesie gazause. Lors des traitements par chimiothérapie : deux à 5 injections sont prévues pour les sels de platine. Enfin, lors du traitement par immunothérapie, 5 injections d'anticorps seront réalisées. De plus, lors de l'imagerie du petit animal, nous utilisons un anesthesique gazeux pendant 10 min (2250 animaux).

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse peut causer une douleur ou un inconfort d’où l’utilisation d’une anesthésie injectable. Les souris peuvent souffrir de faim ou de soif lors d’une infection virale et lors d’une croissance rapide de la tumeur instillée, l’animal peut présenter des signes de souffrances, d’une détresse respiratoire et une diminution de la mobilité de l’animal. De plus, les effets indésirables liés à l’infection virale peuvent être multiples. Lorsque nous procédons à une infection virale par voie nasale, il est nécessaire d’endormir les souris à l’aide d’une anesthésie injectable pouvant entrainer une hypothermie. Enfin, l’administration de médicaments se fait par voie intra-veineuse Et, l’animal recevra une anesthésie gazeuse pour limiter toute souffrance, et ensuite, l’injection intra-veineuse peut être entrepris.

Devenir

Les souris sont euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les poumons dans le but d’analyser par des techniques multiparamétriques, l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral et la réponse virale.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. En effet, les cellules en culture ne permettent pas d'appréhender le processus de progression tumorale et l’infiltrat immunitaire dans sa globalité

Réduction

Les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous avons établi 15 souris/groupe. Nous utiliserons un pied à coulisse pour mesurer le volume tumoral aux cours du temps et des techniques d'imagerie non invasive pour l’apparition des métastases. Le nombre d’animaux impliqué dans l’étude est de 2250. Nous utiliserons un test statistique permettant de comparer les moyennes des souris instillées par rapport aux contrôles.

Raffinement

Raffiner, la méthodologie utilisée, ce qui implique la notion de points limites, si des signes de souffrances sont visibles. De plus, les animaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne et seront gardés en groupes de 5 et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris. Notre stratégie d’observation consiste en une surveillance quotidienne par les animaliers d’une part et nous assurons en plus une surveillance suivi d’un contrôle 3 fois par semaine dès que les souris ont été infectée par injection intra-nasale avec recherche de signes d’altération de l’état général (souris recroquevillée, amaigrissement (3 pesées hebdomadaires) et de difficultés respiratoires. Lors des injections de cellules tumorales pulmonaires et au moment de l’infection intra-nasale, les animaux seront sous anesthesie générale. Afin d'éviter que les animaux ne soient en hypothermie, nous les plaçons sur un tapis à 37°C. En cas de signe de souffrance les souris seront euthanasiées. Nous utiliserons une anesthesie gazeuse afin d’observer l’apparition des tumeurs par une technique d’imagerie pour éviter d’euthanasier l’animale. Nous utiliserons également de l’anesthesie gazeuse lors des injections intra-veineuses.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour conduire nos expériences avec avant tout dans un souci d’intégration de nos recherches dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Il s’agit d’une espèce pour laquelle notre animalerie est parfaitement adaptée, qui se manipule facilement. Nous utilisons des souris C57Bl/6 albinos qui est une lignée de souris dont la mutation provient d’une mutation spontanée dans la lignée C57Bl/6. Cette lignée est couramment utilisée pour les expériences de bioluminescence. Les animaux commerciaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature.