Système musculosquelettique

Les souris utilisées portent une ostéogenèse imparfaite, la maladie des os de verre, et s'exposent donc à des fractures spontanées accompagnées de douleurs modérées. 800 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant onze injections et deux radiographies sous anesthésie. Le médicament testé vise à corriger la petite taille associée à la maladie, que les bisphosphonates prescrits aux patients ne traitent pas. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" d'étudier la croissance dans un "organisme entier", et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.

Objectifs

L'ostéogenèse imparfaite, ou « maladie des os de verre », est une maladie génétique rare caractérisée par une fragilité osseuse. Les personnes atteintes se fracturent des os facilement tout au long de leur vie. Cette fragilité osseuse est due à l'anomalie d'une protéine essentielle à la structure des os. Quand cette protéine est défectueuse, les os deviennent plus fragiles et moins résistants aux chocs. Les personnes atteintes sont souvent de plus petite taille que la moyenne, et mesurent entre 92 et 108 cm à l'âge adulte. Les causes de cette petite taille ne sont toutefois pas encore comprises. Pour traiter cette maladie, la plupart des patients reçoivent des médicaments appelés bisphosphonates. Ces médicaments aident à limiter les fractures en réduisant la perte osseuse. Cependant, ils ne favorisent pas la croissance des os ni leur bonne qualité. De plus, environ 20 % des patients ne réagissent pas à ce traitement. Il est donc important de trouver de nouveaux traitements qui favorisent la croissance et la solidité des os. Ce projet vise à tester un nouveau médicament sur des souris atteintes d’ostéogenèse imparfaite, afin de déterminer s’il améliore la croissance des os, en particulier dans la zone responsable de l’allongement des os longs. Parallèlement, l’étude portera sur l’évolution du cartilage dans cette zone afin de mieux comprendre les mécanismes responsables de la petite taille observée chez les personnes atteintes.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont au nombre de deux : - mettre en évidence un traitement permettant de corriger la petite taille observée chez les patients atteints d'ostéogénèse imparfaite - comprendre comment la plaque de croissance est altérée suite à une anomalie de la protéine

Procédures

Contention et injection : 5 secondes, 11 fois/souris. Radiographie : 5 minutes, 2 fois/souris.

Impact sur les animaux

- La contention peut causer un stress léger de courte durée - Injections causent un stress léger et une douleur légère de courte durée - Risque de fractures spontanées avec douleurs modérés dû à la pathologie.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever leurs organes et de les étudier.

Remplacement

La croissance est un phénomène dynamique impliquant plusieurs types cellulaires. Or, à ce jour, aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la croissance dans son ensemble. Il est donc impératif d'étudier ce processus au sein d'un organisme entier afin d'étudier les communications entre ces différentes cellules, plutôt que de se limiter à l’étude d’un seul type cellulaire.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les radiographies et les injections seront effectuées sous anesthésie générale afin d'éviter tout stress supplémentaire pour l'animal. Des points limites spécifiques ont été définis. Toutefois, tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.

Choix des espèces

La croissance chez la souris est très similaire de celle chez l'homme. Le mécanisme de croissance est un processus dynamique faisant intervenir plusieurs types cellulaires et donc il est indispensable de pouvoir l'étudier dans un organisme entier. Les analyses seront réalisées à deux âges clés : à 5 semaines, correspondant à la fin de l’enfance chez l’être humain, à 11 semaines, correspondant à la fin de l’adolescence et donc à la fin de la croissance. Certaines souris seront étudiées à différents moments de la formation de la plaque de croissance, afin de mieux comprendre son développement et son rôle dans la croissance osseuse.

Tuées à la fin du projet pour que leurs muscles plantaires soient prélevés et analysés, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs leur sectionnent des tendons au cours d'une chirurgie de dix minutes sous anesthésie, afin de mettre le muscle plantaire en surcharge, et le porteur admet des douleurs modérées et un inconfort possibles les jours suivants. Six groupes reçoivent ensuite une injection quotidienne, pendant trois ou dix jours selon le groupe. Le projet cherche à comprendre pourquoi certaines fibres musculaires rapides ne grossissent jamais, et le porteur écarte les cultures cellulaires au motif qu'il reste "encore impossible" d'obtenir des fibres musculaires adultes in vitro.

Objectifs

Les muscles adultes peuvent être plus ou moins forts, et plus ou moins résistants à la fatigue, lors d’activités d’endurance. Ces caractéristiques dépendent de leur composition. En effet, il existe quatre types de fibres musculaires qui ont chacune des fonctions différentes : les fibres de type I ont une bonne résistance à la fatigue, tandis que les fibres IIb apportent de la force aux muscles. Les fibres IIa et IIx ont des capacités intermédiaires en termes de force et de résistance à la fatigue. Notre étude s’intéresse aux fibres IIb et IIx car ces fibres ne grossissent jamais beaucoup, même à l’entraînement. De plus, avec l'âge ou dans certaines maladies graves comme la sclérose latérale amyotrophique ou l’amyotrophie spinale infantile, ces fibres s'affaiblissent et disparaissent rapidement, entrainant une grande perte de force. Comprendre pourquoi ces deux fibres sont sensibles à l'affaiblissement et peu réactives à l'augmentation de volume est très important, notamment dans la lutte contre les effets du vieillissement. A la suite d’une surcharge d'activité sur le muscle plantaire, les fibres de type I et IIa grossissent, mais pas les fibres IIb. A sept jours de surcharge, deux substances sont libérées qui se lient à des récepteurs sur les différents types de fibres musculaires et pourraient aider à augmenter la masse musculaire. L’objectif de ce projet est de déterminer si ces molécules jouent un rôle clé dans le contrôle de la masse musculaire en bloquant leurs récepteurs dans les muscles soumis à un effort intense.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le contrôle de la masse et de la fonction musculaire impliqués dans plusieurs pathologies et d’améliorer la prise en charge des patients pour permettre à plus long terme d’améliorer la qualité de vie (favoriser le bien vieillir et l’autonomie). De manière plus large, nous nous intéressons à la résistance à l’hypertrophie des fibres musculaires glycolytiques à contraction rapide qui sont également touchées préférentiellement au cours du jeûne, dans les cachexies cancéreuses, la sclérose latérale amyotrophique, les insuffisances cardiaques.

Procédures

Les souris sont divisées en 6 groupes (G1,G2, G3, G4, G5, G6) et seront soumises aux interventions suivantes : - une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie d'une durée de 10 min (tous les Groupes) - Une injection 1 fois par jour d'une durée de 1 minute pendant 10 jours (G1, G2 et G3), et pendant 3 jours (G4, G5 et G6)

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une douleur légère liée et de courte durée liée aux injections. Les animaux opérés pourront ressentir des douleurs modérées et de l’inconfort liées à la lésion des tendons, la surcharge du muscle plantaire ainsi qu’à l’inflammation les jours suivant l’opération.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du projet afin de récupérer les muscles plantaires et réaliser des analyses d'anatomie et de biologie moléculaire

Remplacement

Compte tenu du fait qu'il est encore impossible d'obtenir des fibres musculaires adultes en culture, le modèle animal reste indispensable pour étudier les effets de médicaments sur des organes.

Réduction

Les effectifs ont été calculés en utilisant une étude statistique garantissant la validité des données obtenues et l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris sont opérées sous anesthésie, analgésique pré et post opératoire. Les souris sont placées sur un plateau chauffant (37°C) pendant la période de réveil post opératoire. Une grille de score adaptée a été mise en place afin d’assurer cette surveillance durant toute toute la période du protocole. Un enrichissement sous forme de tubes et de maisons sera mis dans les cages. Les souris sont hébergées par groupe de 4 par cages et une visite par jour est effectuée entre les jours J0 et J13 puis une fois tous les 2 jours entre les jours 14 et 21.

Choix des espèces

L’hypertrophie musculaire induite par la surcharge d'activité est bien démontrée dans le modèle souris et il retrace ce qu'on observe chez l'homme. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte (8 semaines) pour s’acquitter de l'effet de croissance chez des souris plus jeune qui sont encore en train de grandir.

Jusqu'à six injections par animal, des tests de suspension et d'agrippement répétés treize fois sur quatre mois, puis une chirurgie de vingt minutes sans réveil pour mesurer la contractilité du muscle : 1 008 souris porteuses d'une mutation myopathique vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses moléculaires et histologiques des muscles injectés. Le projet vise à optimiser une thérapie génique que l'équipe dit avoir déjà validée dans le muscle, l'administration par voie sanguine ayant échoué lors des essais antérieurs. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de poursuivre dans ce modèle et que seule l'injection dans le sang permettra de vérifier l'effet à l'échelle d'un "organisme entier". La lignée fait l'objet d'une autorisation d'élevage pour phénotype dommageable, alors que le même document décrit des souris au comportement locomoteur, au poids, à la longévité et à la fertilité comparables à ceux des souris non modifiées.

Objectifs

Nous développons des approches thérapeutiques pour une maladie génétique rare du muscle, causée par des mutations dans un gène codant une protéine impliquée l’entrée et le transport de vésicules à l’intérieur de la cellule. Nous avons démontré que l'injection dans le muscle d’un virus thérapeutique exprimant une molécule ciblant la forme mutée de la protéine permet de restaurer la structure et la fonction du muscle dans un modèle murin de la maladie, lorsqu’elle est administrée à l’âge d’un mois. Cependant, le traitement est moins efficace chez les souris plus âgées qui présentent une atteinte musculaire plus prononcée. Par ailleurs, les essais d’administration systémique visant à traiter l’ensemble des muscles via la circulation sanguine se sont révélés inefficaces, même chez les souris âgées d’un mois. L’expression de la molécule thérapeutique dans la cellule par l’intermédiaire d’un vecteur viral est dépendante de son entrée dans la cellule et de son transport jusqu’au noyau. Nos travaux antérieurs ont montré que le vecteur est moins bien acheminé chez les souris malades et que ce phénomène s’empire avec la progression de la maladie. Ainsi la pathologie elle-même, semble compromettre l’efficacité de l’administration du traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer des stratégies thérapeutiques alternatives permettant d’acheminer efficacement la molécule de thérapie génique, notamment à travers l’utilisation de différentes combinaisons de vecteurs viraux ou non viraux.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une maladie neuromusculaire rare et invalidante (prévalence estimée inférieure à 1 pour 100 000 naissances), pour laquelle aucun traitement curatif n’est actuellement disponible. La faiblesse musculaire progressive entraîne une perte d’autonomie, altérant significativement la qualité de vie des patients et nécessitant une prise en charge pluridisciplinaire. La réussite de ce projet représentera une avancée cruciale dans l’évaluation préclinique de notre molécule et permettra d’envisager le développement de traitements qui, à ce jour, n’existent pas pour les patients atteints de cette maladie. Par ailleurs, ce travail enrichira notre compréhension des différentes voies d’administration (virale et non virale) de thérapies géniques dans un contexte où la transduction virale est altérée. Les stratégies optimisées et les données générées pourront être extrapolées à d’autres pathologies caractérisées par des défauts similaires de délivrance du vecteur, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques

Procédures

Toutes les souris participant à cette étude recevront une thérapie via différentes voies d’injections (entre 1 à 6 injections maximum par souris selon le protocole suivi) réparties sur plusieurs semaines. Suivant la voie, les animaux seront vigiles ou anesthésiés. L’acte technique dure 2 minutes maximum et sera répété 6 fois maximum. Afin d’évaluer la force musculaire des animaux et donc l’efficacité des thérapies testées, certains animaux suivront des tests de force non invasifs (capacité à s’agripper ou à se suspendre). Les animaux seront vigiles lors de ces tests, chaque test pourra durer 5 minutes maximum et ils seront répétés 13 fois maximum sur 4 mois. Tous les animaux auront une chirurgie en phase terminale sans réveil afin de tester la contractilité musculaire. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie et durera 20 minutes. Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La lignée de souris présente un phénotype dommageable. Les souris hétérozygotes développent progressivement une atrophie et une faiblesse musculaire (mais sur certain muscle uniquement et après mesure spécifique de la force). Elles n’ont pas d’autre signe clinique, et présentent un comportement locomoteur, un poids, une longévité et une fertilité comparables à ceux des souris non génétiquement altérées. Les manipulations nécessaires aux différentes procédures peuvent provoquer un léger stress chez l’animal. Les différentes injections dureront quelques minutes et sont susceptibles d’occasionner une douleur au moment de l’injection et, secondairement, un saignement et/ou hématome, une inflammation locale et rarement une infection. Les administrations répétées comportent un faible risque de péritonite. L’anesthésie gazeuse utilisée peut entraîner une perturbation de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardio respiratoire. Les tests comportementaux de 5 minutes maximum pourront engendrer de la fatigue musculaire. Enfin, une chirurgie sans réveil sera effectuée sur certains animaux, l'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

L’efficacité et l’absence de toxicité de notre approche thérapeutique ont été démontrées au préalable sur des cellules de patients en culture. La validité du modèle de souris de la maladie est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons préalablement démontré l’efficacité et l’innocuité de l’approche dans le muscle de souris du modèle en utilisant un vecteur de type virus thérapeutique. Le but de ce projet est l’optimisation de cette thérapie dans le modèle de souris en testant différent véhicule pour délivrer le médicament dans tout l’organisme. Il est indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude dans ce modèle. Seule l’administration du traitement dans le système sanguin permettra de vérifier son efficacité et sa potentielle toxicité à l’échelle d’un organisme entier.

Réduction

Le nombre maximal théorique de souris impliquées si toutes les procédures sont réalisées est de 1008. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et nos études précédentes afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. La réalisation des procédures et des étapes à l’intérieur des procédures seront réalisées de manière successive et adaptative, dans un ordre permettant de limiter le nombre d’animaux en fonction des résultats positifs ou négatifs. Les organes et tissus de souris issus de ce projet seront conservés en banque pour d’autres projets de l’équipe, évitant ainsi de nouveau prélèvements. Grâce à ces mesures de réduction, nous limitons au strict nécessaire le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant la validité statistique et scientifique de chaque protocole.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Un enrichissement de leur environnement est mis place avec au moins 2 éléments aux choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’entretien des animaux ainsi que les expériences seront réalisés par un personnel titulaire des autorisations et formations nécessaires. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse pour éviter toute douleur ou gêne, elles durent moins d’une minute par souris. Une analgésie sera pratiquée avant certaines injections pour éviter toute gêne. L’anesthésie gazeuse est réalisée en maintenant la thermorégulation en utilisant un tapis chauffant. Les jours suivants les injections une surveillance renforcée des souris sera exercée par l’animalier en charge de la lignée ou les personnes en charge des protocoles. Les mesures de forces sont non invasives et seront réalisés entre 1 et 13 fois maximum par souris afin de limiter un stress répété. Les mesures de forces en fin de projet seront réalisées sous anesthésie et analgésie et sans réveil. Les animaux ne développent habituellement pas de phénotype conduisant à une diminution de leur locomotion mais le cas échéant, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. La lignée fait l’objet d’une autorisation d’élevage pour phénotype dommageable. Dans toutes les procédures, des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme points limites et critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux concernés.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé est le plus adapté pour développer et tester notre traitement, car la molécule étudiée cible précisément la mutation génétique présente chez ces animaux. Il s’agit du plus petit modèle de mammifère reproduisant cette myopathie, reconnu par les experts du domaine et largement utilisé dans des études publiées et présentées lors de congrès internationaux. Nous avons déjà montré que le vecteur viral thérapeutique que nous utilisons est sûr et efficace dans le muscle de ces souris. Il est donc indispensable, à ce stade du développement préclinique, de poursuivre les tests dans ce modèle afin d’optimiser l’efficacité du traitement et de vérifier l’absence d’effets indésirables sur l’ensemble de l’organisme, après une injection dans le sang. Les souris de ce modèle développent progressivement des symptômes musculaires à partir d’un mois, qui s’aggravent jusqu’à environ huit mois. Cependant, leur déplacement, leur fertilité et leur durée de vie restent normaux. Nos travaux précédents ont montré qu’entre un et deux mois, un défaut apparaît dans le transport du vecteur thérapeutique à l’intérieur des cellules, et que ce défaut s’accentue avec la progression de la maladie. Les procédures seront réalisées sur des souris adultes âgées de 1 à 6,5 mois. Les souris âgées d’un mois serviront à évaluer la capacité de nos approches à améliorer la diffusion du traitement dans tout l’organisme, tandis que celles de trois mois, présentant des signes intermédiaires de la maladie, permettront de mesurer l’efficacité du traitement pour stopper ou inverser son évolution.

À dix semaines de vie, le ménisque médial du genou droit est déstabilisé par une chirurgie d'un quart d'heure pour déclencher une arthrose. À douze semaines suivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, cinq jours de suite, sur 2 004 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'arthrose qui s'installe peut faire souffrir les animaux, les conduire à la prostration, à s'isoler de leurs congénères et à cesser le toilettage social, et les injections de tamoxifène peuvent provoquer une péritonite. Toutes sont ensuite tuées pour prélever le sang, la colonne vertébrale, les pattes, la trachée, les poumons et l'aorte.

Objectifs

L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation correspond à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). A un stade plus avancé de la maladie, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés se met en place, via un mécanisme nommé « angiogenèse ». Cette invasion vasculaire accélère fortement la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Nos premiers résultats indiquent qu’une protéine ligand est spécifiquement produite par les chondrocytes hypertrophiques et que l’interaction avec son récepteur, présent à la surface des cellules endothéliales vasculaire, favorise l’angiogenèse. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le rôle de l’interaction entre cette protéine ligand et son récepteur dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Pour ce faire, nous utiliserons une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant à la fois d’induire une invalidation du gène codant pour le récepteur spécifiquement au niveau des cellules endothéliales vasculaires mais aussi de visualiser cette population cellulaire grâce à une protéine fluorescente. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’invasion vasculaire du cartilage articulaire sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement l’interaction entre la protéine d’intérêt et son récepteur.

Bénéfices attendus

Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle que tiennent les chondrocytes hypertrophiques dans le développement de cette maladie. Ce projet comporte également une partie dédiée à évaluer des modes d’administrations du traitement moins invasif et stressant pour les souris, ce qui permettra, in fine, une amélioration et un raffinement de ce protocole, dans un souci de respecter les 3Rs de l’expérimentation animale. Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représentent des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongés et aux interventions) exercées par l’arthrose sur notre société.

Procédures

A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Les animaux âgés de 12 semaines recevront des injections quotidiennes du composé d’intérêt de quelques secondes sur une période de 5 jours. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal.

Impact sur les animaux

Lors du développement de l’arthrose post-traumatique, de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Dans le cas du modèle chirurgical DMM, une douleur pourrait être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Les injections intrapéritonéales, bien que ne durant que quelques secondes, peuvent entraîner une irritation au niveau du site d’injection. De même, les injections de tamoxifène et plus généralement la technique d’injection intrapéritonéale en elle-même peuvent entrainer des nuisances chez l’animal : stress/anxiété, perte d’appétit, inflammation du péritoine (péritonite), injection mal placée conduisant à l’accumulation du produit au niveau d’un site non ciblé (i.e. organes présents dans le péritoine) avec conséquences multiples.

Devenir

L’ensemble des animaux de ce projet seront utilisés afin de réaliser des prélèvements multi-organes post-mortem. Ces prélèvements sont indispensables pour la validation de notre modèle murin génétiquement modifié et pour mener à bien notre étude visant à déterminer l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques contre le développement de l’arthrose.

Remplacement

Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communications cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Pour ce projet scientifique, les nombres de 9 et 35 animaux de chaque sexe par groupe ont été calculés par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvements multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.

Raffinement

Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Deux semaines post-DMM, les souris seront à nouveau observées quotidiennement le temps des injections puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 10 à 22 semaines. La procédure chirurgicale sera réalisée à 10 semaines de vie, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial

144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant une biopsie de la queue à trois semaines puis, à huit semaines, une injection de cellules tumorales, avant huit injections supplémentaires étalées sur quatre semaines. Une partie reçoit ces cellules par voie intracardiaque sous anesthésie gazeuse, d'autres dans la glande mammaire au cours d'une chirurgie, et la croissance des tumeurs se mesure au pied à coulisse à chaque manipulation. Le porteur indique que les tumeurs pourraient causer une douleur et une perte de poids, et que les souris sont tuées en fin de procédure ou à l'atteinte d'un point limite pour récupérer des échantillons. Le bénéfice annoncé, identifier de nouveaux marqueurs de prédisposition au cancer du sein et les valider comme cibles thérapeutiques, reste formulé au conditionnel.

Objectifs

Nous avons fait la découverte surprenante que les ostéoblastes (les cellules qui synthétisent les os) sont capables de stimuler à distance la croissance de tumeurs mammaires ainsi que leur dissémination métastatique dans l’ensemble de l’organisme. Nous avons découvert que les ostéoblastes sécrètent des molécules pro tumorales qui circulent dans le sang et stimulent la croissance des tumeurs partout où elles se trouvent. Nous avons identifié une molécule sécrétée par les ostéoblastes potentiellement responsables de ces effets : RANKL. Notre hypothese est que la secretion de RANKL par les osteoblastes puisse etre un facteur pro-tumoral direct favorisant la croissance tumoral a distance de l'os, supprimer ca secretion nous informera du role de RANKL issu des osteoblastes. Cependant, les données de la littérature indiquent que RANKL produit dans l'os pourrait egalement réguler la production cellules immunosuppressives provenant du lignage lymphocytaire B qui produisent de l’IL10. Nous supposons alors que le RANKL, lorsqu’il est produit par les ostéoblastes, exerce un contrôle négatif sur la production de ces cellules immunodépressives, de manière directe ou indirecte. Ainsi, lorsque la production de RANKL est interrompue, ces cellules deviennent plus nombreuses et favorisent la croissance du cancer du sein. Le premier objectif est de tester le rôle de RANKL produite par les ostéoblastes dans la progression du cancer du sein, à l’aide de modèles génétiques murins où la formation osseuse est augmentée par la réduction de la résorption osseuse du a labsence de RANKL, facteur d'osteoclastogenese. Notre deuxième objectif est de tester l’hypothèse selon laquelle RANKL produite par les ostéoblastes participent au contrôle systémique de la progression du cancer du sein en modulant la réponse immunitaire antitumorale via les cellules B IL10+. Ces travaux sont nécessaires afin de déterminer si le ciblage des molécules produites par les ostéoblastes est capable de limiter, voire prévenir le développement des cancers du sein.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra d’identifier de nouveaux marqueurs de prédisposition aux cancers du sein et de valider ces marqueurs en tant que cibles thérapeutiques. Ceci pourrait permettre de prévenir l’apparition, ou du moins de limiter la progression de tumeurs mammaires métastatiques. Ce travail pourrait notamment permettre d’améliorer les traitements visant à activer l’immunité antitumorale.

Procédures

À l’âge de trois semaines, chaque souris subira une biopsie de la queue afin de permettre l’identification des modifications génétiques présentes chez l’individu. À huit semaines, une partie des souris sera soumise à une injection de cellules tumorales. L’intervention dure environ dix minutes par individu et n’est réalisée qu’une seule fois. Au cours de la croissance tumorale, les souris pourront être injectées à une fréquence de deux fois par semaine pendant quatre semaines, avant d’être euthanasiées. La mesure de la croissance tumorale se fait à l’aide d’un pied à coulisse, ne dure que quelques secondes et est réalisée en même temps que les injections durant la phase de croissance.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des tumeurs ce qui pourrait causer une douleur et une perte de poids. Les manipulations successives des animaux (anesthésies, injections, mesures des tumeurs au pied à coulisse) peuvent engendrer un stress chez les animaux

Devenir

En fin de procedure ou lors d'atteinte de point limite, euthanasie des souris, et recuperation d'echantillions biologiques.

Remplacement

Le tissu osseux comprend de nombreux types cellulaires en plus des cellues qui fabriques l'os, qui interagissent et s’influencent mutuellement. Des travaux visant au développement de modèles synthétiques capables de récapituler l’environnement osseux sont en cours, mais les versions existantes restent très rudimentaires. De plus, notre projet vise à évaluer les effets directs et indirects des ostéoblastes sur la croissance de tumeurs primitives et la dissémination de la tumeur. Tous ces processus sont d’une grande complexité et ne peuvent être reproduits de façon fidèle synthétiquement.

Réduction

La principale méthode de réduction du nombre d’animaux utilisés dans notre projet repose sur un calcul statistique de taille d’effectif nécessaire pour chaque expérience afin d’avoir une puissance d’au moins 80 % pour détecter une différence correspondant à une taille d’effet estimée pour chaque expérience, grâce aux données préliminaires disponibles. Nos expériences sont réalisées séquentiellement avec des groupes relativement petits de souris contrôles et mutantes (2 à 5 animaux/groupe) car il nous est impossible de générer des groupes importants d’animaux du même âge en une seule fois. Ceci permet éventuellement de réduire en cours de projet le nombre de souris impliquées dans une expérience donnée, en arrêtant plus tôt que prévu cette expérience, une fois que le test statistique démontre que la/les différences observées sont significatives. Le suivi longitudinal de la croissance tumorale par imagerie de bioluminescence in vivo permet d’éviter de devoir euthanasiés...

Raffinement

Les injections intracardiaques se feront sous anesthésie gazeuse permettant un réveil rapide, moins impactant que l’anesthésie par injection. Les animaux inoculés dans la glande mammaire subiront une chirurgie mineure et seront anesthésiés ayant des propriétés analgésiques. Un gel oculaire sera appliqué sur ces animaux afin d’éviter l’assèchement durant la phase de sommeil. Le lendemain de la chirurgie, les animaux présentant des signes de souffrance recevront une dose d’analgésique. De la nourriture gélifiée sera en outre ajoutée dans les cages concernées. Tous les animaux seront observés pendant les deux heures suivant la procédure afin de confirmer une activité cardio-respiratoire normale et une bonne reprise de la mobilité. Dans tous les cas, un examen clinique et comportemental sera réalisé quotidiennement lors de la première semaine après l’intervention, puis tous les 2 à 3 jours jusqu'à la fin de la procédure, afin de détecter tout signe de souffrance animale. La croissance tumorale est monitorée par bioluminescence, permettant d’évaluer l’état des animaux et de surveiller les points limites par une méthode non invasive. Au cours de cet examen, les animaux sont anesthésiés par gaz, ce qui permet un réveil plus rapide et moins stressant que l’anesthésie chimique. Des points limites précis ont été définis et seront surveillés tout au long des procédures. En cas d’atteinte d’un point limite, les mesures décidées seront mises en place immédiatement.

Choix des espèces

L’influence des ostéoblastes présents dans notre squelette sur la croissance et la dissémination métastatique de tumeurs mammaires doit être étudiée dans un modèle animal vertébré (présence d’un squelette) et mammifère (présence de glandes mammaires). De plus, notre projet requiert l’utilisation d’animaux transgéniques et la souris est le mammifère de choix pour cela. Il est relativement facile d’évaluer les troubles comportementaux et les signes de souffrance de la souris du fait des nombreuses études préalables réalisées avec ce modèle animal (recherches en cancérologie notamment). Nous possédons une expérience importante de l’utilisation de la souris en recherche et les protocoles que nous prévoyons d’utiliser ont été mis au point pour cette espèce. La souris constitue donc l’espèce la plus adaptée pour répondre à nos questions scientifiques et éviter la souffrance de nos animaux du fait de l’expérience que nous avons déjà acquise. Toutes nos expériences seront réalisées à partir d’animaux âgés de 8 semaines, stade auquel le phénotype osseux des animaux mutants est bien marqué et où les glandes mammaires et le système immunitaire sont correctement développés.

Enfermées quatre jours dans des cages de 330 cm² sans possibilité de se suspendre, des souris reçoivent des chimiothérapies utilisées contre le cancer du sein, par injections espacées d'une à trois semaines. 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent des tests de force et de fonction musculaire ainsi que des tests d'effort maximal de dix à vingt minutes, avant et après le traitement. Le porteur décrit la réduction de l'espace comme une "altération mineure du bien-être animal" à "faible nuisance physiologique", alors que le projet l'organise pour aggraver la fonte musculaire provoquée par la chimiothérapie.

Objectifs

La chimiothérapie utilisée pour traiter le cancer du sein précoce entraîne de nombreux effets secondaires sur le muscle squelettique, affectant à la fois sa quantité et sa qualité. Les patientes traitées présentent diverses altérations musculaires, comme une atrophie, qui contribuent à la diminution des capacités fonctionnelles. Ces altérations, observées après un traitement par chimiothérapie, varient en fonction de la molécule utilisée. Par ailleurs, la réduction de l’activité physique, fréquemment observée chez les patientes, aggrave probablement ces altérations musculaires. En effet, la diminution des contraintes mécaniques et métaboliques exercées sur les muscles entraîne des effets similaires à ceux induits par la chimiothérapie. L'interaction entre ces deux facteurs reste difficile à dissocier chez la patiente, ce qui justifie l’utilisation d’un modèle animal. À l'inverse, l’exercice, qui augmente les stimuli mécaniques et métaboliques, pourrait prévenir ces altérations, bien que ces bénéfices n’aient été observés que chez des sujets sains avec des preuves scientifiques robustes. Cependant, les effets aigus, chroniques et différés de l'exercice dans le contexte de l'atrophie musculaire induite par la chimiothérapie demeurent largement méconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier, dans un modèle murin, l'impact de la modulation de l’activité physique sur l’atrophie musculaire induite par la chimiothérapie. L’étude 1 caractérisera les effets combinés de la réduction de l’activité physique et des chimiothérapies sur les altérations musculaires, tandis que l’étude 2 explorera les effets aigus, chroniques et différés de l’exercice sur ces altérations. MODIFICATION : PLUS PRECISEMENT, LE TURNOVER PROTEIQUE, QUI COMPREND LA SYNTHESE ET LA DEGRADATION PROTEIQUE), SERONT ETUDIES AFIN D’AVOIR DE COMPRENDRE LES MECANISMES QUI REGULENT LA MASSE MUSCULAIRE.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples au niveau fondamental et au niveau de l’application clinique possible. Tout d’abord, la caractérisation de l’interaction entre la réduction du niveau d’activité physique et la chimiothérapie sur les altérations musculaires permettra de proposer un modèle murin plus proche de la réalité clinique. En effet, étant donné que les patientes atteintes d’un cancer du sein ont une réduction de leur niveau d’activité physique après l’administration de chimiothérapie, il est probable que cette réduction, induite dans le modèle murin, exacerbe les effets de la chimiothérapie sur le tissu musculaire. D’autre part, l’étude des effets aigus, chroniques et différés de l’exercice permettra d’un point de vue fondamental de caractériser les voies de signalisation cellulaires sous-jacentes et d’un point de vue clinique d’adapter la prise en charge des patientes. En effet, nous pensons que de manière aigue, l’exercice pourrait prévenir une partie des altérations musculaires. Si nous montrons ces bénéfices, cela aboutira à une preuve de concept et un changement de prise en charge clinique. Il sera alors recommandé de pratiquer de l’exercice juste avant l’administration de chaque dose de chimiothérapie. Enfin, la caractérisation des effets différés de l’exercice et de la chimiothérapie permettra d’indiquer aux patientes si la pratique d’exercice spécifique doit se poursuivre au-delà du traitement.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous allons administrer des traitements de chimiothérapies. Pour l'étude avec administration aigu : une injection sur animal vigile, d'une durée de quelques secondes, sera effectuée sur les animaux. Lorsque les chimiothérapies seront administrées par injection de manière chronique, celles-ci seront espacées de 1 à 3 semaines selon le type de molécule administrée. Pour répondre aux questions scientifiques, les souris de l’étude avec administration aigue seront placées dans des cages individuelles, tandis que celles du groupe "réduction d’activité" seront hébergées dans des cages de dimensions réduites (330 cm², sans possibilité de suspension). la durée de ce maintien cage individuelle avec ou non réduction de la surface au sol disponible sera de 4 jours. Deux tests de force et de fonction musculaire seront réalisés, pour une durée inférieure à 5 minutes. Ces tests seront effectués avant et 4 jours après l’administration de la chimiothérapie dans le cadre des expérimentations aiguës, ou avant et après l’ensemble du traitement par chimiothérapie pour les expérimentations chroniques et différées. Dans le cadre des expérimentations chroniques et différées, des tests d’effort maximaux seront réalisés, d’une durée de 10 à 20 minutes, avant et après l’ensemble du traitement par chimiothérapie. MODIFICATION : POUR L’ENSEMBLE DES EXPERIMENTATIONS, UNE INJECTION D'UNE MOLECULE PERMETTANT DE MESURER LES FLUX DE PROTEINES DE 1 A 2 SECONDES SERA REALISEE SUR ANIMAL VIGILE.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, l'administration des chimiothérapies entraîne une douleur légère à modérée au site d'injection, de courte durée MODIFICATION : ET PEUT ENTRAINER DES PERTES DE POIDS. La répétition des injections, bien qu’alternées entre les côtés injectés et espacées d’au minimum 1 semaine, pourrait induire une légère induration locale et un stress modéré lié à la contention, d’intensité croissante avec le nombre de manipulations. Les manipulations répétées pour les séances d’exercice et les évaluations (force, fonction musculaire et vitesse maximale à l'exercice) induisent un stress modéré, de durée variable selon la fréquence des manipulations. Dans l’étude 1, le placement des animaux dans des cages individuelles pendant une courte durée entraîne une altération mineure du bien-être animal, sans impact significatif sur l’anxiété ou les capacités cognitives. Le placement en cage individuelle sera limité à 4 jours, réduisant ainsi son impact potentiel. Pour le groupe de réduction d’activité, le placement dans des cages de dimensions réduites (330 cm² sans possibilité de suspension) entraîne une réduction des opportunités de mouvement, avec une faible nuisance physiologique et une intensité limitée sur le bien-être, en accord avec les études précédentes.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem nécessaires aux analyses prévues.

Remplacement

Pour comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité physique dans le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, il n’existe pas à ce jour un modèle in vitro permettant de réduire le niveau d’activité physique et les modèles d’électrostimulation utilisés pour mimer l’exercice sont incomplets. De plus, pour comprendre les aspects fonctionnels (force et fonction musculaire), le recours à un modèle in vivo est nécessaire.

Réduction

L'équipe de recherche bénéficie de l’expérience et de l’expertise nécessaire pour permettre la mise en place d’expérimentations de qualité avec un nombre de souris réduit au minimum mais suffisant pour les analyses statistiques. Pour rappel, l’étude 1 vise à caractériser la contribution de la réduction du niveau d’activité physique dans le déconditionnement musculaire induit par une administration de chimiothérapie. Pour calculer mathématiquement le nombre d'animaux par groupe, le critère de jugement principal sest basé sur le degré d’atrophie mesuré au niveau histologique par la surface de section des fibres musculaires encore appelé taille de l'effet. Sur la base de la littérature, la chimiothérapie peut en moyenne induire une atrophie de 17, 9%. Les résultats obtenus seront comparés grâce à des analyses statistiques adaptées permettant de mettre en évidence l'effet de la réduction d'activité physique sur l'atrophie induite par la chimiothérapie.

Raffinement

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont maitrisées. Le bien-être des animaux sera constamment surveillé, et toute modification du comportement, telle que la manifestation de souffrance ou d'angoisse, sera immédiatement rapportée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour mettre en place les mesures correctives nécessaires. En cas de signes de douleurs, un avis au vétérinaire sera demandé.Avant le début des procédures, les animaux seront habitués aux conditions environnementales et manipulés pour les habituer aux expérimentateurs ainsi qu'à la contention nécessaire à la réalisation des injections. Pour enrichir l’environnement des souris, les cages seront équipées de matériaux et d'objets adaptés pour leur permettre de nidifier et ronger. Les souris seront maintenues en groupes sociaux et, pour une des études, individualisées uniquement lorsque cela sera nécessaire pour atteindre les objectifs et la durée du placement en cage individuelle sera de durée très limitée (4j). Nous observerons attentivement la locomotion des souris afin de détecter tout signe de boitement ou de difficulté à se déplacer, ce qui pourrait indiquer des effets secondaires inattendus de la chimiothérapie. En parallèle, nous évaluerons régulièrement l'aspect général des animaux, incluant leur posture, leur tonus musculaire, leur comportement dans la cage, l'état de leur pelage et leur poids corporel via des grilles de scoring pour lesquelles des mesures correctives ainsi que des points limites ont été définies pour interrompre les procédures et limiter la souffrance animale. Pour exemples, en cas de signes de faiblesse musculaire, affectant potentiellement leur capacité à s'alimenter ou à se mouvoir, nous fournirons de la nourriture en gel en complément de leur régime alimentaire standard. Une réhydratation sous-cutanée pourra également être mise en place.

Choix des espèces

L’utilisation de modèles cellulaires est impossible pour comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité dans le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie. Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. La souris présente un intérêt particulier du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l’Homme (99% d’identité de gènes avec l’Homme), tant au niveau histologique et cellulaire qu’au niveau du type de réponses aux traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de la modulation du niveau d’activité physique sur le déconditionnement musculaire induit par la chimiothérapie utilisée chez les patientes atteintes d’un cancer du sein. Ainsi, pour se rapprocher de la réalité clinique, nous travaillerons sur des souris adultes (8 mois post natal environ). En effet, dans nos études cliniques, aucune patiente n’était âgée de moins de 26 ans. Conformément aux équivalences entre âge souris/humain, une souris de 8 mois correspond à un humain d’âge moyen.